WO2005026349A1 - 非アミノ有機酸の製造方法 - Google Patents

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WO2005026349A1
WO2005026349A1 PCT/JP2004/013658 JP2004013658W WO2005026349A1 WO 2005026349 A1 WO2005026349 A1 WO 2005026349A1 JP 2004013658 W JP2004013658 W JP 2004013658W WO 2005026349 A1 WO2005026349 A1 WO 2005026349A1
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WO
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gene
organic acid
acid
dna
reaction
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Application number
PCT/JP2004/013658
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ryusuke Aoyama
Makoto Murase
Kenji Yamagishi
Kiyohiko Nishi
Hiroyuki Kojima
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Chemical Corporation, Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Mitsubishi Chemical Corporation
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Priority to JP2005513981A priority patent/JP4619291B2/ja
Priority to BRPI0414300-0A priority patent/BRPI0414300A/pt
Publication of WO2005026349A1 publication Critical patent/WO2005026349A1/ja
Priority to US11/376,133 priority patent/US7563606B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention relates to production of non-amino organic acids using coryneform bacteria.
  • Anaerobic bacteria such as the genus Anaerobiospirillum and the genus Actinobacillus are used! /, Ru (U.S. Pat.No. 5,142,834, U.S. Pat.No. 5,504,004 or International Journal of Systematic Bacteriology (1999), vol. 49, p207-216).
  • Ru U.S. Pat.No. 5,142,834, U.S. Pat.No. 5,504,004 or International Journal of Systematic Bacteriology (1999), vol. 49, p207-216.
  • CSL corn steep liquor
  • a nitrogen source needs to be added. Adding a large amount of these organic nitrogen sources not only increased the cost of the culture medium, but also increased the purification cost when removing unsatisfactory products.
  • aerobic bacteria such as coryneform bacteria are cultured once under aerobic conditions, and after the cells are grown, the cells are collected and washed, and as non-amino amino acids are passed as static cells without aeration with oxygen.
  • Methods for producing organic acids are also known (JP-A-11-113588, JP-A-11-196888).
  • JP-A-11-113588, JP-A-11-196888 Methods for producing organic acids.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a non-amino organic acid more efficiently by adjusting the pH of a fermentation liquor to a certain range by a fermentation method.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, the coryneform bacterium was neutralized with magnesium carbonate and Z or magnesium hydroxide in an aqueous medium.
  • the aqueous medium By reacting the aqueous medium with an organic material, it has been found that an increase in the volume of the aqueous medium during fermentation can be prevented, and that the non-amino organic acid can be produced while maintaining the pH of the medium in a certain range.
  • they have found that the coexistence of a monovalent cation in an aqueous medium increases the consumption rate of organic raw materials, the production rate of organic acids, and the yield, and has completed the present invention.
  • a method for producing a non-amino organic acid comprising: reacting the cells or treated product with an organic raw material while neutralizing the aqueous medium with magnesium carbonate and Z or magnesium hydroxide.
  • coryneform bacterium is a bacterium modified such that ratatate dehydrogenase activity is reduced to 10% or less as compared with an unmodified strain.
  • coryneform bacterium is a bacterium modified to enhance the activity of fumarate reductase and Z or pyruvate carboxylase.
  • the coryneform bacterium has a ratate dehydrogenase activity of 1
  • a non-amino acid comprising a step of producing a non-amino organic acid by any one of (10) and a step of performing a polymerization reaction using the non-amino organic acid obtained in the above step as a raw material.
  • a method for producing an organic acid-containing polymer A method for producing an organic acid-containing polymer.
  • FIG. 1 is a diagram showing a construction procedure of a plasmid pKMBl and a restriction enzyme map.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for constructing a plasmid ⁇ LDH.
  • FIG. 3 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pTZ4.
  • FIG. 4 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pMJPCl.
  • FIG. 5 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pFRPCl.
  • a coryneform bacterium or a processed product of the bacterium is reacted with an organic raw material in an aqueous medium to generate a non-amino organic acid from the organic raw material.
  • the coryneform bacterium used in the present invention is a non-organic organic acid Although it is not particularly limited as long as it has a productivity, a microorganism belonging to the genus Corynepacterium, a microorganism belonging to the genus Brevinocterium or a microorganism belonging to the genus Arthrobacter can be mentioned.
  • the genus Corynebacterium or Brevi those belonging to the genus Batterium, more preferably Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Brevibacterium flavum (Brevibacterium flavum), Brevibacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes) or Microorganisms belonging to Brevibacterium lactofermentum.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum
  • Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum
  • Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium ammoniagenes
  • Microorganisms belonging to Brevibacterium lactofermentum preferably, those belonging to the genus Batterium, more preferably Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Brevibacterium flavum (Brevibacterium flavum), Brevibacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes) or Microorganisms belonging to
  • Brevibataterum 'Flavum MJ-233 was established on April 28, 1975, by the Institute of Microbial Industry and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary) (Dr. 305-8566 Japan Deposit No. FERM P-3068 at Tsukuba East 1-chome, Ibaraki Pref., Japan 1), transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on May 1, 1981, and received FERM BP-1497 Deposited by number.
  • Brevibataterum 'Flavum' is sometimes classified as Corynebataterimum 'Daltamicum' (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, KH, International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p. 255-260), and in the present invention, the MJ-233 and MJ-233 AB-41 strains of Brevibataterum 'Flavum' are respectively Corynebataterum 'glutamicum. MJ-233 and MJ-233 AB-41.
  • the microorganism used in the method of the present invention may be a mutant obtained by ordinary mutation treatment such as UV irradiation or NTG treatment, or a genetic method such as cell fusion or gene recombination, which can be performed by using only wild-type strains. Any strain such as an induced recombinant strain may be used. As a host of the genetically modified strain, any transformable microorganism can be used. Although it may be of the same genus as the parent strain or of a different genus, it is preferable to use the aerobic bacterium as described above as a host.
  • the ratate dehydrogenase activity is reduced means that the lactate dehydrogenase activity per cell is reduced as compared with a non-modified ratate dehydrogenase strain. It is preferable that the ratate dehydrogenase activity is reduced to 10% or less per bacterial cell, as compared with the unmodified ratate dehydrogenase strain. Further, the ratate dehydrogenase activity may be completely deficient.
  • ratate dehydrogenase activity was reduced was determined by measuring ratate dehydrogenase activity by a known method (L. Kanarek and R ⁇ . Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). Can be confirmed by As a specific method for producing a mutant strain having reduced ratatate dehydrogenase activity of a coryneform bacterium, a method by homologous recombination into a chromosome described in JP-A No. 11-206385 is used. Methods using the SacB gene described in the specification examples (Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73) and the like can be mentioned.
  • a coryneform bacterium modified so as to enhance the activity of fumarate reductase (FRD) and Z or pyruvate carboxylase (PC) can also be used.
  • the term “enhancement” refers to a state in which the activity of these enzymes per cell is increased as compared with the unmodified strain.
  • Escherichia coli fumarate reductase is an enzyme responsible for the reverse reaction of succinate dehydrogenase acting in the TCA cycle, but is involved in fumarate respiration under anaerobic conditions and is aerobic.
  • the PC gene used to enhance the PC activity may be a gene whose base sequence has already been determined, or a DNA fragment encoding a protein having a PC activity by a conventional method, which is obtained by removing chromosomes from microorganisms, animals and plants. Those which have been more isolated and whose nucleotide sequence has been determined can be used. After the nucleotide sequence is determined, a gene synthesized according to the sequence can also be used.
  • the DNA fragment containing the PC gene is present on chromosomes derived from microorganisms, animals and plants.
  • the basic operation for preparing a PC gene from these source microorganisms, animals and plants is as follows, as an example, using a coryneform bacterium whose sequence is known.
  • the PC gene is present on the chromosome of the above-mentioned coryneform bacterium, Corynebacterium dartamicam ATCC13032 (Peters-Wendisch, PG et al. Because of this (GenBank Database Accession No. AP005276) (SEQ ID NO: 15), the PC gene can be isolated and obtained by the PCR method.
  • a chromosome derived from Corynebacterium dalmatamicum is used as a primer with an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 or 14 as a primer for PCR
  • PCR is performed, the resulting DNA is about 3.7 kb.
  • a powerful PC gene can be amplified.
  • by adding an appropriate restriction enzyme site to the 5 'end of the primer used for PCR it can be ligated to an appropriate site of the vector described later, and the obtained recombinant vector can be used. Can be introduced into coryneform bacteria.
  • the protein is purified using the PC activity as an index, and a probe or primer is synthesized from the N-terminal amino acid sequence and the partially degraded sequence.
  • Gene fragments can be isolated by the technique of Chillon.
  • a probe or primer is synthesized based on the amino acid sequence of the region conserved between PC proteins, and Fragments can be obtained by bridging or PCR. The DNA sequence of the obtained fragment can be determined by an ordinary method.
  • the DNA of the Escherichia coli 'lambda' phage can be obtained by digesting the DNA with the restriction enzyme Hindlll.
  • Escherichia coli coli 174 phage DNA fragments of known molecular weight obtained by cleaving DNA with the restriction enzyme Haelll based on the standard line drawn by the migration distance on the same polyacrylamide gel. The size can be calculated.
  • the DNA fragment containing the PC gene used in the present invention is not limited to that isolated from Corynebate terridium 'Daltam chromosome chromosomal DNA', but also a commonly used DNA synthesizer such as Applied 'Biosystems (Applied Biosystems). Biosystems) 394 DNA / RNA synthesizer.
  • the PC gene obtained from the coryneform bacterial chromosome DNA has the sequence of SEQ ID NO: 15 as long as it does not substantially impair the function of the encoded PC, that is, the property involved in immobilizing carbon dioxide.
  • some bases may be replaced or deleted with other bases, or a new base may be inserted.
  • DNA that hybridizes with DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 under stringent conditions or 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 DNA encoding a protein having PC activity and having PC activity can also be suitably used.
  • stringent conditions 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1 ⁇ SSC, which is a normal condition for washing southern hybridizations, are used.
  • PC genes derived from bacteria other than Corynebacterium 'daltamicum, or from other microorganisms or animals and plants can also be used.
  • sequences of PC genes derived from microorganisms or animals and plants shown below are known (the references are shown in parentheses), and their ORFs can be replaced by hybridization or PCR as described above. It can be obtained by amplification.
  • the obtained gene can be inserted downstream of the TZ4 promoter in the vector prepared in Example 3 described later.
  • An aerobic coryneform bacterium can be transformed with the inserted plasmid according to the method of Example 4 (C) and used for production of a non-amino organic acid.
  • the DNA fragment containing the PC gene is inserted into an appropriate expression plasmid, for example, pUC118 (Takara Shuzo), and introduced into an appropriate host microorganism, for example, Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo).
  • an appropriate expression plasmid for example, pUC118 (Takara Shuzo)
  • Escherichia coli JM109 Teakara Shuzo
  • SEQ ID NO: 16 was carried out by extracting a crude enzyme solution from the transformant and using the method of Magasanik [J. Bacteriol., 158, 55-62, (1984) ] Can be confirmed by directly measuring the PC activity and comparing it with the PC activity of the crude enzyme solution which has not been transformed.
  • the DNA fragment containing the PC gene is introduced into a suitable plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene that controls the replication and growth function of the plasmid in the coryneform bacterium.
  • a suitable plasmid for example, a plasmid vector containing at least a gene that controls the replication and growth function of the plasmid in the coryneform bacterium.
  • An expressible recombinant plasmid can be obtained.
  • the promoter for expressing the PC gene is a force S that can be a promoter possessed by a coryneform bacterium, and is not limited to such a base sequence for initiating transcription of the PC gene. If so, a suitable promoter may be used.
  • a TZ4 promoter as shown in Example 3 can be mentioned.
  • the plasmid vector into which the PC gene can be introduced is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication and growth function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include, for example, plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmids pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • pCRY31, pCRY3KE and pCRY3KX plasmids pCRY2 and pCRY3 described in JP-A-1-191686; JP-A-58-67679; pAM330 described herein; JP-A-58-77895; pHM1519 described PAJ655, pAJ611 and pAJ1844 described in JP-A-58-192900; pCGl described in JP-A-57-134500; pCG2 described in JP-A-58-35197; Examples include pCG4 and pCGll described in 183799.
  • plasmid vectors used in a coryneform bacterium host vector system include a gene that controls replication and propagation of a plasmid in a coryneform bacterium and a gene that controls a plasmid stabilization function in a coryneform bacterium.
  • plasmids having plasmids pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, and pCRY3KX are preferably used.
  • a coryneform bacterium with enhanced PC gene expression used in the present invention can be obtained.
  • the PC activity can also be enhanced by introducing, replacing, or amplifying a PC gene on a chromosome by a known homologous recombination method to increase the expression. Transformation, for example For example, it can be performed by the electric pulse method (Res. Microbiol, Vol. 144, p. 181-185, 1993).
  • the bacterium with enhanced FRD activity used in the present invention can be obtained by introducing an FRD gene into the bacterium.
  • the FRD gene that can be used is not particularly limited as long as it encodes a protein having fumarate reductase activity, and examples thereof include a gene derived from Escherichia coli having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19. This gene contains the genes encoding the four subunits (frdA, frdB, frdC, and frdD; SEQ ID NOs: 20 and 23) that constitute the FRD (SEQ ID NO: 19, 440—2245,2241—2975,2986—3381, and And operon genes including 3392-3751), respectively.
  • Each subunit gene may be a DNA that hybridizes with a DNA having the above nucleotide sequence under stringent conditions, or a DNA that hybridizes, as long as it encodes a subunit protein capable of forming a complex having FRD activity. It may be a homolog having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more homology with the nucleotide sequence.
  • stringent conditions 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0 ° C., which is a condition for washing ordinary Southern hybridizations, are used.
  • FRD gene homologs those encoding a protein in which the amino acid corresponding to the 17th amino acid of the B subunit (frdB) of FRD (SEQ ID NO: 21) is lysine are preferable.
  • the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 or a homolog thereof can be obtained by a PCR method or a hybridization method. Further, if necessary, a mutation such that the amino acid corresponding to the 17th amino acid of frdB is lysine can be introduced by a known method.
  • FRD genes derived from bacteria other than Escherichia coli, or from other microorganisms or animals and plants can also be used.
  • the FRD gene derived from a microorganism or animal or plant has its nucleotide sequence already determined, and, based on the gene, homology, etc., isolates a gene encoding a protein having FRD activity from the chromosome of the microorganism, animal or plant, etc. Those whose base sequence has been determined can be used. After the base sequence has been determined, a gene synthesized by force according to the sequence can also be used. These are based on the hybridization method or P It can be obtained by amplifying the region containing the promoter and the ORF portion by the CR method.
  • the FRD of the FRD gene is introduced in the coryneform bacterium.
  • a recombinant plasmid capable of enhancing expression can be obtained.
  • the plasmid vector into which the FRD gene can be introduced into the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication growth function in the coryneform bacterium, and the above-described pCRY30, pCRY21, etc. may be used. be able to.
  • the FRD activity can also be enhanced by introducing, replacing, or amplifying the FRD gene on the chromosome by a known homologous recombination method to thereby achieve high expression.
  • the fumarate reductase activity is desirably enhanced to such an extent that the growth of the bacterial cells is not significantly inhibited, so that a plasmid having an appropriate copy number should be selected. It is preferable to control the expression level of the FRD gene by selecting a promoter having an appropriate expression intensity.
  • the promoter for expressing the FRD gene may be any promoter as long as it functions in coryneform bacteria, and may be the promoter of the FRD gene itself to be used.
  • a bacterium having enhanced PC and FRD activities when used, these genes may be individually introduced into the bacterium, or may be introduced simultaneously using a vector containing both genes. You may.
  • a bacterium modified so that the activity of ratate dehydrogenase is reduced and the activity of PC and Z or FRD is enhanced Such a bacterium can be obtained, for example, by preparing a coryneform bacterium in which the LDH gene has been disrupted, and transforming the obtained bacterium with a recombinant vector containing the PC gene and the FRD gene. Any modification operation using these genes may be performed first.
  • a cultivation of the bacterium in a solid medium such as an agar medium on a slant may be used directly for the reaction. It is preferable to use one that has been used.
  • Non-amino organic acids are produced by reacting the seed-cultured bacteria with the organic materials while growing them in a medium containing the organic materials. can do.
  • the cells can be produced by reacting the cells obtained by the propagation with an organic material in an aqueous solution containing the organic material.
  • a medium usually used for culturing microorganisms can be used.
  • a general medium in which a natural nutrient such as a meat extract, a yeast extract, and peptone is added to a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate can be used.
  • the cultured cells are recovered by centrifugation, membrane separation, etc., and used for the reaction.
  • a processed product of bacterial cells can also be used.
  • the processed cells are, for example, immobilized cells obtained by immobilizing cells with acrylamide, carrageenan, etc., cell extracts, for example, crushed cells obtained by crushing cells, centrifuged supernatant thereof, or Fractions obtained by partially purifying the supernatant by ammonium sulfate treatment or the like can be given.
  • the organic raw material used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a carbon source capable of assimilating the non-amino organic acid by the present microorganism, and usually, galactose, ratatose, gnorecose, funolectose, and glycerolone are used.
  • Carbohydrates such as sucrose, sucrose, starch, and cellulose; and fermentable sugars such as polyalcohols such as glycerin, mannitol, xylitol, and ribitol, and glucose, sucrose, fructose, or glycerol is preferred.
  • glucose or sucrose is preferred.
  • starch saccharified solution, molasses and the like containing the above-mentioned fermentable carbohydrate are also used.
  • the use concentration of the organic raw material is not particularly limited !, but it does not inhibit the production of organic acid! It is advantageous to use as high as possible in the range, and usually, it can be used within the range of 5 to 30% (WZV), preferably 10 to 20% (WZV). Further, an additional organic material may be added in accordance with the decrease in the amount of the organic material as the reaction proceeds.
  • the aqueous medium used in the production method of the present invention is not particularly limited, and includes, for example, water, a buffer solution, and a liquid medium.
  • the liquid medium as described above is most preferable.
  • the aqueous medium of the present invention preferably contains a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as the microorganism can assimilate and produce a non-amino organic acid.
  • Specific examples include, but are not limited to, various organic and inorganic nitrogen compounds such as ammonium salts, nitrates, urea, soybean hydrolysates, hydrolyzed zein, peptone, yeast extract, meat extract, and corn steep liquor.
  • vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol and nicotinic acid, nucleotides, amino acids and other factors promoting growth may be added as necessary. It is also desirable to add an appropriate amount of a commercially available antifoaming agent to the aqueous medium in order to suppress foaming during the reaction.
  • an aqueous medium is reacted while being neutralized by adding magnesium carbonate.
  • Magnesium carbonate exists as magnesium tetracarbonate monohydroxide magnesium pentahydrate and is relatively insoluble in water.
  • Magnesium carbonate added to an aqueous medium can be added by adding a solution dissolved in a solid such as powder or water, etc.It was possible to prevent an increase in volume due to the added solution of the solution. Therefore, it is preferable to add it as a solid such as a powder.
  • Magnesium carbonate added as a powder has a low solubility, so that even if it is added in excess, it is possible to maintain a constant pH without being too alkaline.
  • the initial pH is about pH8-8.5, and then the pH decreases as the reaction proceeds. Is maintained at about pH 6-7. This is considered to prevent the magnesium carbonate, which was added in excess and remained dissolved during the reaction, from gradually dissolving and preventing the pH from dropping sharply.
  • the aqueous medium may be reacted while neutralizing the aqueous medium by adding magnesium hydroxide.
  • the addition of magnesium hydroxide to an aqueous medium can be carried out, for example, in the form of a solid such as a powder or a solution dissolved in water or the like. In this case, it is preferable to carry out the reaction while supplying carbon dioxide gas in order to increase the production amount of the target organic acid.
  • the reaction may be carried out while neutralizing the aqueous medium by adding magnesium carbonate and magnesium hydroxide.
  • the addition of magnesium carbonate and magnesium hydroxide may be performed simultaneously for neutralization, or magnesium carbonate may be added and then magnesium hydroxide added for neutralization. Oxidation After adding gnesium, magnesium carbonate may be added to neutralize the mixture.
  • neutralization means that the non-amino organic acid produced by the reaction is reacted with magnesium carbonate and Z or magnesium hydroxide to adjust the pH of the aqueous medium to a certain range, for example, pH 5 to 10%. 10, preferably maintaining the pH at 6-9.5.
  • magnesium carbonate and / or magnesium hydroxide may be added first, or may be further removed as needed during the reaction.
  • another pH adjusting substance for example, an alkaline substance, a carbonate, or urine may be added.
  • the aqueous medium contains carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide gas, and is reacted under aerobic or anaerobic conditions.
  • the carbonate ion or bicarbonate ion is also supplied with magnesium carbonate power used as a neutralizing agent, but may be supplied with carbonic acid or bicarbonic acid or salts thereof or carbon dioxide gas power as required.
  • Specific examples of salts of carbonic acid or bicarbonate include, for example, magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate and the like.
  • the carbonate ion and bicarbonate ion may be added at a concentration of 0.001 to 5M, preferably 0.1 to 3M, and more preferably 12 to 12M.
  • carbon dioxide When carbon dioxide is contained, 50 mg to 25 g, preferably 100 mg to 15 g, and more preferably 150 mg to 10 g per 1 L of the solution may be contained.
  • the generation rate or yield of an organic acid such as succinic acid can be increased.
  • an ammonium ion such as an ammonium ion, a sodium ion or a potassium ion is preferably used.
  • a monovalent cation hydroxide such as sodium hydroxide, sodium hydroxide, calcium hydroxide, etc.
  • a salt of an ammonium ion which is preferably added as a salt
  • sodium bicarbonate is used as a salt of an ammonium bicarbonate, an ammonium salt of a salt, an ammonium salt of a sulfate, etc.
  • Isopotassium Salts of potassium ions include potassium bicarbonate.
  • a salt of a monovalent cation When a salt of a monovalent cation is added, it is usually added in the form of a powder or a suspension thereof. Alternatively, it is preferably added as an aqueous solution. In addition, when adding hydroxylamine, it may be added as aqueous ammonia, or may be added as a gas by aeration in the reaction solution.
  • the concentration of the monovalent cation added is 0.001M to 2M, preferably 0.01M to 1M, as the ammonium ion, and 0.001M to 2M, preferably 0.01M to 1M as the sodium ion.
  • the potassium ion is 0.001M-2M, preferably 0.01M-1M.
  • the monovalent cation may be added at the start of the reaction, or may be added continuously, sequentially or intermittently during the reaction.
  • the reaction solution is used continuously, considering the amount of the monovalent cation already added to the reaction solution, add it so that the concentration of the monovalent cation in the reaction solution becomes the above-mentioned concentration, preferably. I prefer that.
  • the optimal growth temperature of the microorganism used in this reaction is usually 25 ° C to 35 ° C.
  • the temperature during the reaction is usually 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the amount of the cells used in the reaction is not particularly limited, but is used in an amount of 1 to 700 gZL, preferably 10 to 500 gZL, and more preferably 20 to 400 gZL.
  • the reaction time is preferably 1 hour to 168 hours, more preferably 3 hours to 72 hours.
  • the production reaction of the organic acid may be carried out with aeration and stirring, but may be carried out without aeration and without supplying oxygen, or may be carried out in an anaerobic atmosphere in which the ventilation is restricted and the oxygen supply amount is restricted.
  • the term "under an anaerobic atmosphere” as used herein means that the reaction is carried out while keeping the dissolved oxygen concentration in the solution low. In this case, it is desirable to carry out the reaction at a dissolved oxygen concentration of 0 to 2 ppm, preferably 0 to 1 ppm, more preferably 0 to 0.5 ppm.
  • Methods for this purpose include, for example, a method in which the container is sealed and reacted without aeration, a reaction is performed by supplying an inert gas such as nitrogen gas, a method in which an inert gas containing carbon dioxide gas is passed, and stirring is reduced. Can be used.
  • the reaction for producing an organic acid can be usually terminated when an organic raw material such as glucose in a culture solution is consumed. At this time, an organic acid such as succinic acid, malic acid or fumaric acid is generated in the reaction solution. Of these, succinic acid has the highest accumulation and is preferred as a product.
  • succinic acid has the highest accumulation and is preferred as a product.
  • an organic acid such as succinic acid, malic acid or fumaric acid can be obtained.
  • This organic acid-containing composition itself is also within the scope of the present invention.
  • the organic acid-containing composition those having a high accumulation concentration of cono and citric acid are particularly preferable.
  • the organic acid accumulated in the reaction solution or the culture solution can be separated and purified according to a conventional method. Specifically, after removing solids such as bacterial cells by centrifugation, filtration, etc., desalting with ion-exchange resin, etc., and the organic acid is separated and purified by crystallization or column chromatography. Can be done
  • a non-amino organic acid-containing polymer is produced by producing a non-amino organic acid by the above-mentioned method of the present invention and then conducting a polymerization reaction using the obtained non-amino organic acid as a raw material.
  • the non-amino organic acids produced in the present invention are processed into polymers such as polyesters and polyamides. It can be used.
  • the non-amino organic acid or the composition containing the non-amino organic acid obtained by the production method of the present invention can be used as a food additive, a pharmaceutical, or a cosmetic.
  • Bacillus subtilis ISW1214 was cultured in 10 mL of LB medium [composition: 10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, and 5 g of NaCl in 1 L of distilled water] until the late logarithmic growth phase, and the cells were collected. The obtained cells were suspended in 0.15 mL of 10 mM NaC1 20 mM Tris buffer (pH 8.0) -lmM EDTA'2Na solution containing lysozyme at a concentration of 10 mgZmL.
  • proteinase K was added to the above suspension so that the final concentration became 100 gZmL, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Further, sodium dodecyl sulfate was added to a final concentration of 0.5%, and the cells were lysed by keeping the temperature at 50 ° C for 6 hours. Add an equal volume of phenol to this lysate Add the Z-chloroform solution, gently shake at room temperature for 10 minutes, then centrifuge the whole (5,000 X g, 20 minutes, 10-12 ° C), collect the supernatant fraction, and add sodium acetate Was added to a concentration of 0.3 M, and then twice the amount of ethanol was mixed with the mixture.
  • the precipitate collected by centrifugation (15,000 ⁇ g, 2 minutes) was washed with 70% ethanol and air-dried. 5 mL of a 10 mM Tris buffer solution (pH 7.5) —ImM EDTA ′ 2Na solution was added to the obtained DNA, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for use as a type I DNA for subsequent PCR.
  • the Bacillus subtilis SacB gene was obtained by converting the DNA prepared in (A) above into type III and designing a synthetic DNA (SEQ ID NO: 2) designed based on the previously reported base sequence of the gene (GenBank Database Accession No. X02730). PCR was performed using 1 and SEQ ID NO: 2).
  • Reaction solution composition Type 1 DNA 1 ⁇ L, Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) 0.2 ⁇ L, 1-fold concentration attached buffer, 0.3 M each primer, ImM MgSO
  • MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 L.
  • Reaction temperature conditions Using a DNA Thermal Cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 2 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separating it by 0.75% agarose (SeaKem G TG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and then visualizing it by staining with bromide chidium to detect a fragment of about 2 kb.
  • the target DNA fragment was recovered using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4 Polynucleotide Kinase: manufactured by Takara Shuzo), and then ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli DH5a strain
  • was transformed with the obtained plasmid DNA by binding to the EcoRV site of an E. coli vector (pBluescriptll: manufactured by STRATEGENE). The recombinant E.
  • coli thus obtained is spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g ZmL X-Gal [dissolve 10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl, and 15 g of agar in 1 L of distilled water]. did.
  • Escherichia coli plasmid vector PHSG396 (Takara Shuzo: chloramuecole resistance marker) 500 ng of the restriction enzyme PshBI 1 Ounits was reacted at 37 ° C for 1 hour, and then recovered by phenol Z chloroform extraction and ethanol precipitation. After blunting both ends with a tarenow fragment (K1 enow Fragment: manufactured by Takara Shuzo), Mlul linker (Takara Shuzo) was ligated and cyclized using a ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo), E. coli (DH5a strain) was transformed.
  • K1 enow Fragment manufactured by Takara Shuzo
  • Mlul linker (Takara Shuzo) was ligated and cyclized using a ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo), E. coli (DH5a strain) was transformed.
  • Plasmid DNA was prepared from the obtained clones by a conventional method, and a clone having a restriction enzyme Mlul cleavage site was selected and named pHSG396 Mlu.
  • This SacB gene fragment was digested with the restriction enzyme Mlul, and ligated with a pHSG396Mlu fragment whose terminal was dephosphorylated with alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase Calf intestine: Takara Shuzo) using a ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo). DH5a strain).
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 34 gZmL chloramphene-coal. The colonies thus obtained were then transferred to LB agar medium containing 34 / z gZmL chloramphenicol and 10% sucrose and cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • the kanamycin resistance gene was obtained by PCR using the DNA of Escherichia coli plasmid vector PHSG299 (Takara Shuzo: kanamycin resistance marker) as type III and the synthetic DNAs shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers.
  • Reaction solution composition ⁇ type DNAlng, Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.1 ⁇ l 1x concentration attached buffer, 0.5 ⁇ each primer and 0.25 ⁇ MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ L.
  • Reaction temperature conditions 20 cycles of 94 ° C for 20 seconds, 62 ° C for 15 seconds, and 72 ° C for 1 minute and 20 seconds were performed using DNA Thermal Cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research). Repeated. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and visualization by chidium bromide staining to detect a fragment of about 1. 1kb. did.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN). The recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 ′ end with T4 Polynucleotide Kinase (Takara Shuzo).
  • the approximately 3.5 kb DNA fragment obtained by cleaving the pCMBl constructed in the above (C) with restriction enzymes Van91I and Seal was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis. This was mixed with the kanamycin resistance gene prepared in (D) above, ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. .
  • the recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 gZmL kanamycin.
  • a medium (urea 2g, (NH) SO 7g, KH PO 0.5g, K HPO 0.5g, MgSO-7
  • the MJ233 strain ratatate dehydrogenase gene was obtained by using the DNA prepared in (A) above as a type III and synthesizing DNA (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 5) designed based on the nucleotide sequence of the gene described in JP-A-11-206385. PCR was performed using No. 6). Reaction solution composition: Type I DNA1 / zL, Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.2 l 1x concentration attached buffer, 0.2 M each primer, 0.25 ⁇ M dNTPs were mixed to make a total volume of 20 ⁇ .
  • Reaction temperature conditions Using DNA Thermal Cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle of 94 ° C for 20 seconds, 55 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 1 minute was repeated 30 times. . However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 5 minutes.
  • the amplified product was confirmed by separation by gel electrophoresis of 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts), and visualization by staining with sodium bromide to detect a fragment of about 0.95 kb.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIA Quick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was mixed with PCR product closing vector pGEM-TEasy (manufactured by Promega) and ligated using Ligation Kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo).
  • E. coli DH5a strain
  • the recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g ZmL X-Gal. Clones that formed white colonies on this medium were subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified. By cutting the obtained plasmid DNA with restriction enzymes Sacl and Sphl, an insert fragment of about 1. Okb was recognized, which was named pGEMTZCgLDH. Named.
  • pGEMTZCgLDH prepared in (B) above with restriction enzymes EcoRV and Xbal
  • a coding region for ratate dehydrogenase of about 0.25 kb was cut out.
  • the end of the remaining DNA fragment of about 3.7 kb was blunt-ended with a sauce fragment, circularized using Ligation Kit ver.2 (Takara Shuzo), and transformed into Escherichia coli (DH5a strain). .
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 gZmL ampicillin.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the resulting plasmid DNA was digested with restriction enzymes Sacl and Sphl to select a clone in which an inserted fragment of about 0.75 kb was recognized, which was named pGEM TZALDH.
  • a DNA fragment of about 0.75 kb generated by digesting the above pGEMTZ A LDH with restriction enzymes Sacl and Sphl was separated and recovered by 0.75% agarose gel electrophoresis, and the ratate containing the defective region was recovered.
  • a dehydrogenase gene fragment was prepared. This DNA fragment was mixed with pKMBl constructed in Example 1 digested with restriction enzymes Sacl and Sphl, and ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). E. coli (DH5a strain) was transformed. The recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin and 50 ⁇ g ZmLX-Gal.
  • a clone that formed a white colony on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified.
  • the obtained plasmid DNA was cut with restriction enzymes Sacl and Sphl, and those having an inserted fragment of about 0.75 kb were selected and named pKMBlZALDH (FIG. 2).
  • Plasmid DNA used for transformation of Brevibatadium 'Flavum MJ-233 strain was also prepared using the E. coli JM110 strain transformed by the calcium chloride method (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970) using pKMBlZ A LDH. did.
  • Brevibacterium flavum strain MJ-233 (FERM BP-1497) is prepared by a conventional method (Wolf Het). al "J. Bacteriol. 1983, 156 (3) 1165-1170, Kurusu Y et al, Agric Biol Chem. 1990, 54 (2) 443-7) to remove (curing) the endogenous plasmid. Plasmid clearing strain Brevibataterum 'Flavum MJ233-ES strain was used for the subsequent transformation. Brevibataterum' Flavum MJ233-ES strain was transformed by an electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144).
  • the resulting transformant was transformed into an LBG agar medium containing 50 ⁇ g ZmL of kanamycin (10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl, 20 g of glucose, and 15 g of agar) in distilled water. [Dissolve in 1L].
  • the strain grown on this medium is a plasmid in which pKMBl / ALDH is not replicable in the strain Brevibataterum 'Flavum MJ233-ES, the rat with the ratate dehydrogenase gene and Brevibacterium •
  • the homologous recombinant strain was liquid-cultured in an LBG medium containing 50 g / mL of kanamycin. About 1 million cells of this culture solution were spread on an LBG medium containing 10% sucrose. As a result, about 10 strains that were considered to be sucrose-insensitive by dropping the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
  • the strains thus obtained include those that have been replaced with a mutant derived from the ratate dehydrogenase gene 3 ⁇ 413 ⁇ 4 ⁇ Bl / ⁇ LDH and those that have returned to the wild type. .
  • the cells obtained by liquid culture in LBG medium should be directly subjected to the PCR reaction to detect the ratate dehydrogenase gene. Can be easily confirmed.
  • Analysis using the primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8) for amplifying the ratate dehydrogenase gene should reveal a DNA fragment of 720 bp for the wild type and 47 lbp for the mutant having the deletion region. It is.
  • a strain having only the mutant gene was selected, and this strain was named Brevibatatellium flavum MJ233Z ALDH.
  • This promoter fragment was obtained by synthesizing the Brevibataterium flavum MJ233 genomic DNA prepared in (A) of Example 2 into a ⁇ type and designing it based on the sequence described in SEQ ID NO: 4 of JP-A-7-95891. This was performed by PCR using DNA (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10).
  • Reaction solution composition 1 ⁇ L of type I DNA, 0.2 ⁇ L of Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), 1-fold concentration attached buffer, 0.3 M of each primer, ImM MgSO, 0.25 MdNTPs were mixed to make a total volume of 20 / zL.
  • Reaction temperature conditions Using DNA Thermal Cycler PTC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle of 94 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 20 seconds, and 72 ° C for 30 seconds was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 72 ° C in the final cycle was 2 minutes.
  • the amplification products were confirmed by separation by 2.0% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and visualization by chidium bromide staining, and a fragment of about 0.25 kb was detected. .
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase (T4 Polynucleotide Kinase: manufactured by Takara Shuzo), and then used the ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo) to produce the E.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g ZmL X-Gal.
  • a DNA fragment prepared by cleaving pUCZTZ4 with restriction enzymes BamHI and Pstl was composed of a synthetic DNA (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) phosphorylated at the 5 ′ end, and BamHI was added to both ends.
  • a DNA linker having a sticky end to Pstl were mixed and ligated using a ligation kit ver. 2 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the obtained plasmid DNA.
  • the present DNA linker contains a ribosome binding sequence (A GGAGG) and a closing site (Pad, NotI, Apal) arranged downstream thereof.
  • a clone that formed a white colony on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified.
  • the obtained plasmid DNA was also selected from those which were cleaved by the restriction enzyme Notl, and named PUCZTZ4-SD.
  • the thus constructed pUCZTZ4-SD was digested with the restriction enzyme Pstl, and the ends were blunt-ended with a tarenow fragment. Then, a promoter fragment of about 0.3 kb generated by digestion with the restriction enzyme Kpnl was separated and recovered by 2.0% agarose gel electrophoresis.
  • PHSG298par-rep described in JP-A No. 12-93183 is used as a plasmid capable of autonomously replicating stably in coryneform bacteria.
  • This plasmid contains the replication region and stabilizing function of the natural plasmid pBY503 carried by Brevibacterium 'statis IFO 12144 strain, the kanamycin resistance gene derived from the E. coli vector PHSG298 (Takara Shuzo) and the replication of E. coli. With an area.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the resulting plasmid DNA which was cleaved by the neutral restriction enzyme Notl was selected, and the plasmid was named pTZ4 (the construction procedure is shown in FIG. 3).
  • Brevibata terium 'Flavum MJ233 strain-derived pyruvate carboxylase gene was obtained using the DNA prepared in (A) of Example 2> as a type I, and the whole genome sequence was reported for the corynebate terium.
  • the PCR was performed using synthetic DNAs (SEQ ID NOs: 13 and 14) designed based on the sequence of the gene of Glutamicum ATCC 13032 (GenBank Database Accession No. AP005276).
  • reaction solution 1 ⁇ L of type I DNA, 0.2 ⁇ L of Pfx DNA polymerase (manufactured by Invitrogen), 1x attached buffer, 0.3 ⁇ M each primer, ImM MgSO
  • DNA thermal cycler Using TC-200 (manufactured by MJ Research), a cycle consisting of 20 seconds at 94 ° C and 4 minutes at 68 ° C was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 10 minutes. After completion of the PCR reaction, 0.1 L of Takara Ex Taq (Takara Shuzo) was added, and the mixture was further incubated at 72 ° C for 30 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis and visualization by chidium bromide staining. Detected.
  • the target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was mixed with a PCR product closing vector pGEM-TEasy (Promega), ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo), and Escherichia coli (DH5a strain ) Was transformed.
  • the recombinant Escherichia coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g ZmL X-Gal.
  • the base sequence of the inserted fragment of pGEMZMJPC was determined using a base sequence decoding device (Model 377XL) manufactured by Applied Biosystems and a big-die terminator one-cycle sequence kit ver3.
  • the resulting DNA nucleotide sequence and deduced amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 15. Since this amino acid sequence shows extremely high homology (99.4%) with that of the strain Corynebacterium 'Dartamica ATCC13032', the inserted fragment of pGE M / MJPC was derived from the strain Brevibataerium flavum MJ233 It was determined that the gene was a pyruvate carboxylase gene.
  • a pyruvate carboxylase gene fragment having a power of about 3.7 kb generated by cleaving pGEMZMJPC prepared in (A) above with restriction enzymes Pacl and Apal was separated and collected by 0.75% agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment was mixed with pTZ4 constructed in Example 3>, which was to be cleaved with restriction enzymes Pacl and Apal, and ligated. After ligation using Ver. 2 (Takara Shuzo), Escherichia coli (DH5a strain) was transformed with the obtained plasmid DNA. The recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 gZmL kanamycin.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the restriction enzymes Pacl and ApaI By cutting the obtained plasmid DNA with the restriction enzymes Pacl and ApaI, those having an inserted fragment of about 3.7 kb were selected and named pMJPCI (FIG. 4).
  • Plasmid DNA for transformation with pMJPCl capable of replication in Brevibatadium 'Flavum MJ233 strain was prepared from E. coli (DH5a strain) transformed in the above (B).
  • Brevibacterium flavum strain MJ233Z ⁇ LDH was transformed by the electric pulse method (Res.Microbiol., Vol. 144, p. 181-185, 1993), and the resulting transformant was transformed into 50 ⁇ g ZmL Was spread on a LBG agar medium containing 10 g of tryptone, 5 g of yeast extratato, 5 g of NaCl, 20 g of glucose, and 15 g of agar in 1 L of distilled water.
  • the transformed Brevibatate terimum 'Flavam MJ233ZPCZ ⁇ LDH strain obtained in (C) above was cultured overnight in 100 mL of A medium containing 2% dulcose and 25 mg / L kanamycin.
  • the obtained cells were collected, washed with 50 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and suspended again in 20 ml of a buffer having the same composition.
  • the suspension was crushed with SONIFIER 350 (manufactured by BRANSON), and the supernatant obtained by centrifugation was used as a cell-free extract.
  • the pyruvate carboxylase activity was measured using the obtained cell-free extract.
  • Enzyme activity was measured using lOOmM Tris / HCl buffer (pH 7.5), O. lmg / lOmL biotin, 5mM magnesium chloride, 50mM sodium bicarbonate, 5mM sodium pyruvate, 5mM adenosine triphosphate, 0.32mM NADH
  • the reaction was carried out at 25 ° C. in a reaction solution containing 20 units / 1.5 ml malate dehydrogenase (manufactured by WAKO, derived from yeast) and the enzyme. 1 U was the amount of enzyme that catalyzes the reduction of 1 ⁇ mol NADH per minute.
  • Escherichia coli (Eschericia coli) strain JM109 was cultured in 10 mL of LB medium until the late logarithmic growth phase. Genomic DNA was prepared from the obtained cells by the method shown in Example 1 (A) above.
  • the Escherichia coli fumarate reductase gene was obtained based on the DNA prepared in (A) above as type III and the sequence of the gene of Escherichia coli K12-MG1655 (GenBank Database Accession No. U00096), for which the entire genome sequence was reported. PCR was performed using the synthetic DNA (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) designed in the above. Reaction solution composition: Type DN Al / z L, Pfx DNA polymerase (Invitrogen) 0.2 L, 1x concentration buffer, 0.3 ⁇ Mix primer, ImM MgSO, 0.25 ⁇ MdNTPs , The whole amount
  • Reaction temperature conditions DNA Thermal Cycler Using PTC-200 manufactured by MJ Research, a cycle consisting of 94 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 4 minutes was repeated 35 times. However, the heat retention at 94 ° C in the first cycle was 1 minute and 20 seconds, and the heat retention at 68 ° C in the final cycle was 10 minutes. After completion of the PCR reaction, 0.1 L of Takara Ex Taq (Takara Shuzo) was added, and the mixture was further incubated at 72 ° C for 30 minutes.
  • the amplification product was confirmed by separation by 0.75% agarose (SeaKem GTG agarose: manufactured by FMC BioProducts) gel electrophoresis, and visualization by chidium bromide staining. Detected. The target DNA fragment was recovered from the gel using a QIAQuick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the recovered DNA fragment was mixed with a PCR product closing vector pT7Blue T—Vector (manufactured by Novagen) and ligated using a ligation kit ver. 2 (manufactured by Takara Shuzo).
  • a ligation kit ver. 2 manufactured by Takara Shuzo
  • the recombinant E. coli thus obtained was cultured on LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL ampicillin and 50 ⁇ g ZmL X-Gal. Was smeared.
  • a clone that formed a white colony on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then plasmid DNA was purified.
  • By cutting the obtained plasmid DNA with the restriction enzymes Hindlll and Kpnl, an inserted fragment of about 3.9 kb was observed, which was named pFRD6.0.
  • nucleotide sequence of the inserted fragment of pFRD6.0 was determined using a nucleotide sequence analyzer (Model 377XL) manufactured by Applied Biosystems and a Big Dye Terminator One Cycle Sequence Kit Ver3. The resulting DNA base sequence and deduced amino acid sequence are described in SEQ ID NOs: 19 and 20-23.
  • PMJPC1 constructed in Example 3 was completely cleaved with the restriction enzyme Kpnl, and then reacted with Alkaline Phosphatase Calf intestine (Takara Shuzo). The fragment was mixed with a DNA linker that also had the ability to synthesize 5, phosphorylated synthetic DNA (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25), and ligated using Ligation Kit ver. 2 (Takara Shuzo). Escherichia coli (DH5 ⁇ strain) was transformed with the DNA. The recombinant E. coli thus obtained was spread on an LB agar medium containing 50 ⁇ g ZmL kanamycin. The strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified. From the obtained plasmid DNA, those cut by the restriction enzyme Ndel were selected and named pMJPCl.1.
  • the strain grown on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, and then the plasmid DNA was purified.
  • the obtained plasmid DNA was fragmented with 505, 2132, 2675, 3775 and 4193 bp by the restriction enzyme Hindlll digestion with the ⁇ 1 '' restriction enzyme. Therefore, it was judged that the structure shown in FIG. was named pFRPCl.1.
  • the transformed Brevibatate terium 'Flavam MJ233 / FRD / PC / ALDH strain obtained in the above (B) was cultured overnight in 100 mL of A medium containing 2% glucose and 25 mg / L kanamycin.
  • the obtained cells were collected, washed with 50 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and resuspended in 20 mL of a buffer having the same composition.
  • the suspension was crushed with SONIFIER 350 (manufactured by BR ANSON), and the supernatant obtained by centrifugation was used as a cell-free extract.
  • the fumarate reductase activity was measured using the obtained cell-free extract.
  • Enzyme activity was measured using 33 mM Tris HCl buffer (pH 7.5), O.lmM EDTA, 20 mM Na succinate, 2 mM KFe (CN) and enzyme
  • reaction was carried out at 25 ° C in a reaction solution containing 36. 1U is 2 mol K per minute
  • the specific activity of fumarate reductase in the effluent was 0.02 U / mg-protein.
  • the specific activity was 0.01 U / mg-protein in the cells of the parent strain, MJ233 / ALDH strain, similarly cultured in A medium.
  • Urea 4 g, ammonium sulfate: 14 g, potassium monophosphate: 0.5 g, potassium diphosphate 0.5 g, Magnesium sulfate ⁇ heptahydrate: 0.5 g, ferrous sulfate ⁇ heptahydrate: 20 mg, manganese sulfate ⁇ hydrate: 20 mg, D-biotin: 200 ⁇ g, thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, yeast extract : Lg, power Zamino acid: lg, and distilled water: lOOOOmL of medium lOOmL was placed in a 500mL Erlenmeyer flask and sterilized by heating at 120 ° C for 20 minutes.
  • the culture solution obtained in the same manner as in Example 7 above was added to the cells collected by centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes, and the OD (660 nm) was adjusted to 200. Suspended. 200 mL of this suspension and 200 mL of a previously sterilized 30% glucose solution were placed in a 1 L jar armmenter, and kept at 35 ° C. A 4M aqueous solution of magnesium hydroxide was added intermittently to keep the pH at 6.8, and the reaction was carried out with aeration at 100 mL / min and stirring at 400 rpm. The average sugar consumption rate at 46 hours after the start of the reaction was 3.22 gZLZh, the succinic acid production rate was 1.38 g / L / h, and the yield was 72%.
  • a reaction suspension was prepared in the same manner as described above, and kept at 35 ° C.
  • a 4M aqueous solution of magnesium hydroxide was added intermittently so that the pH was maintained at 6.8, and the reaction was carried out with stirring at 200 revolutions per minute without aeration.
  • the average sugar consumption rate at 50 hours after the start of the reaction was 2.6 OgZLZh, the succinic acid production rate was 0.90 g / L / h, and the yield was 55%.
  • Seed culture was carried out on the Brevibateridium flavum MJ233ZPCZ ⁇ LDH strain prepared in Example 4 in the same manner as in Example 7.
  • Glucose 100g
  • magnesium sulfate ⁇ heptahydrate 0.5g
  • orthophosphoric acid 0.65g
  • soybean protein hydrolyzate 0.65g
  • ammonium sulfate 1.0g
  • sulfuric acid first Iron ⁇ heptahydrate 20 mg
  • manganese sulfate 'hydrate 2 Omg
  • D-pyotin lmg
  • thiamine hydrochloride lmg
  • defoamer GD-113: manufactured by NOF Corporation
  • the medium was placed in a 300 L jar armmenter and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, 450 mL of the above seed culture was inoculated and kept at 30 ° C. Aeration was performed at 113 L / min, pressure was set at 50 kPa, stirring was performed at 280 rpm, and preculture was performed for 20 hours while adjusting the pH to 7.6 with ammonia gas.
  • Glucose 100 g
  • magnesium sulfate ⁇ heptahydrate 0.5 g of a sugar solution containing 0.5 g in 1 L. Measure each component in an amount equivalent to 260 L, dissolve in 50 L, and heat at 120 ° C for 20 minutes.
  • the above-mentioned pre-culture solution was cultivated with 70 L to make a total volume of 260 L, and kept at 30 ° C. Aeration was performed at 113 L / min, pressure was set at 50 kPa, stirring was performed at 140 rpm, and the culture was carried out for 24 hours while adjusting the pH to 7.6 with ammonia gas to obtain cells having a succinic acid-producing ability.
  • the bacterial cell solution was concentrated about 4 times with an MF membrane (manufactured by Asahi Kasei Corporation) to obtain a bacterial cell suspension having a dry bacterial body weight of about 60 gZL. The cell suspension was stored at 4 ° C.
  • the cell suspension was further concentrated by centrifugation and prepared using the centrifugal supernatant so that the dry cell weight was about 120 gZL.
  • Glucose 150 g
  • magnesium sulfate ⁇ heptahydrate 0.5 g was dissolved in distilled water to make 300 mL, and sterilized by heating at 120 ° C. for 20 minutes.
  • orthophosphoric acid 0.65 g
  • ferrous sulfate heptahydrate 20 mg
  • manganese sulfate 'hydrate 20 mg
  • D-Piotin Lmg
  • thiamine hydrochloride lmg
  • defoamer GD-113: Dissolve 0.05 mL in about 300 mL of distilled water, adjust the pH to 6.5 with 5N hydroxide solution, and then add distilled water.
  • the sample was made up to 450 mL with, and sterilized by heat at 120 ° C for 20 minutes.
  • a reaction suspension was prepared in the same manner as in Example 7 above, and the bicarbonate ammonium carbonate was added thereto so that the final concentration was 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mol / L.
  • the reaction was carried out by adding kamu.
  • Table 2 shows the sugar consumption rate, succinic acid production rate, and yield at 20 hours after the start of the reaction. As a result, it was clarified that in the neutralization reaction of magnesium carbonate, by adding an appropriate amount of ammonium bicarbonate, the sugar consumption rate and the succinic acid production rate were significantly increased.
  • Adekinol L G294 Asahi Denka
  • the sugar consumption rate was 9.80 g / L, h
  • the succinic acid production rate was 8.78 g / L / h
  • the yield was 96%.
  • a suspension for reaction was prepared in the same manner as in Example 12, and ammonium bicarbonate was added thereto so that the final concentration became 0.1 ImolZL, and the reaction was carried out in the same manner.
  • glucose was almost consumed.
  • the sugar consumption rate was 15.2 gZLZh, and the succinic acid production rate was 12.6 g / L / yield 92%.
  • the rate of sugar consumption, the rate of succinic acid production, and the yield were significantly increased by adding an appropriate amount of ammonium bicarbonate in the magnesium carbonate neutralization reaction.
  • Adekinol L G294 Asahi Denka
  • Urea 4 g, ammonium sulfate: 14 g, 1 potassium phosphate: 0.5 g, 2 potassium phosphate. 5g, magnesium sulfate ⁇ 7hydrate: 0.5g, ferrous sulfate ⁇ 7hydrate: 20mg, manganese sulfate ⁇ Hydrate: 20 mg, D-Piotin: 200 ⁇ g, Thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, Yeast extract: lg, force Zamino acid: lg, and distilled water: 100 mL of culture medium lOOmL into a 500 mL Erlenmeyer flask, 120 ° C, heat sterilized for 20 minutes.
  • Urea 12 g, ammonium sulfate: 42 g, monopotassium phosphate: 1.5 g, dipotassium phosphate 1.5 g, magnesium sulfate ⁇ 7 hydrate: 1.5 g, ferrous sulfate ⁇ 7 hydrate : 60mg, manganese sulfate ⁇ Hydrate: 60mg, D-Piotin: 600 ⁇ g, Thiamine hydrochloride: 600g, yeast extract 3g, casamino acid 3g, antifoaming agent (ADEKINOL LG294: made by Asahi Denki): lmL and Distilled water: 2500 mL of the medium was placed in a 5 L fermentor, and sterilized by heating at 120 ° C.
  • a reaction suspension was prepared in the same manner as in Comparative Example 1, and the pH was maintained at 7.6 using 2M sodium carbonate, and the reaction was carried out in the same manner. About 12 hours after the start of the reaction, glucose is almost consumed. Had been. The sugar consumption rate was 13 gZLZh and the succinic acid production rate was 7.2 g / L / yield 95%.
  • a non-amino organic acid can be produced while keeping the pH of the aqueous medium within a certain range that hardly causes an increase in the volume of the fermentation reaction solution. Furthermore, by adding a monovalent cation to the aqueous medium, the production rate or the yield of the non-amino organic acid can be greatly increased.

Abstract

　炭酸マグネシウム及び／又は水酸化マグネシウム、並びに一定範囲の濃度の１価カチオンを含む水性媒体中で、コリネ型細菌の菌体または該細菌の処理物を有機原料に反応させることにより、水性媒体の体積の増加を起こすことなく、ｐＨを一定の範囲に保った状態で、コハク酸、リンゴ酸又はフマル酸等の非アミノ有機酸を製造する。                                    

Description

明 細 書
非ァミノ有機酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、コリネ型細菌を用いた非ァミノ有機酸の製造に関するものである。
背景技術
[0002] コハク酸などの非ァミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、
Anaerobiospirillum属、 Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられて!/、る（米国特許 第 5, 142, 834号公報、米国特許第 5, 504, 004号公報又は International Journal of Systematic Bacteriology (1999), vol. 49, p207- 216)。嫌気性細菌を用いた場合は 、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求する ために、培地中に多量の CSL (コーンスティープリカ一）などの有機窒素源を添加す る必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもた らすだけでなぐ生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でなか つた o
[0003] また、コリネ型細菌などの好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖さ せた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非ァミノ有機酸を生産する 方法も知られている（特開平 11— 113588号公報、特開平 11— 196888号公報)。こ の場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよぐ簡単な 培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃 度、菌体当たりの生産速度の向上、または、製造プロセスの簡略ィ匕等について改善 の余地があった。
[0004] さらに非ァミノ有機酸を発酵生産する場合には、非ァミノ有機酸の生成とともに pH が低下するため、中和により pHを調整しながら反応させる必要があった。そこで、 pH の調整に炭酸ナトリウム、炭酸アンモ-ゥムなどが用いられてきたが、中和液の添カロ により反応液の体積が増加するという問題点があった。一方で、炭酸マグネシウムや 水酸ィ匕マグネシウムは水に溶けにくい等の理由から、コリネ型細菌を用いた非ァミノ 有機酸の発酵生産における pH調整には用いられてこなかった。 発明の開示
[0005] 本発明の課題は、発酵法により、発酵液の pHを一定の範囲に調節しながら、非ァ ミノ有機酸をより効率よく製造する方法を提供することにある。
[0006] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、水性媒体中で、 該水性媒体を炭酸マグネシウム及び Z又は水酸ィ匕マグネシウムで中和しながらコリ ネ型細菌と有機原料とを反応させることにより、発酵中の水性媒体の体積の増加を防 ぎ、かつ、該媒体の pHを一定の範囲に保った状態で非ァミノ有機酸を製造できるこ とを見出した。さらに、 1価カチオンを水性媒体中に共存させることにより、有機原料 の消費速度、有機酸の生産速度および、収率が高まることを見出し、本発明を完成 するに至った。
[0007] すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1)水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて 該有機原料から非ァミノ有機酸を生成させ、該非ァミノ有機酸を採取する工程を含む 非ァミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び Z又は 水酸ィ匕マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させ ることを特徴とする方法。
(2) 1価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を 有機原料に反応させて該有機原料から非ァミノ有機酸を生成させ、該非ァミノ有機 酸を採取する工程を含む非ァミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸 マグネシウム及び Z又は水酸ィ匕マグネシウムで中和しながら前記菌体または処理物 を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
(3) 1価カチオンがアンモ-ゥムイオンまたはナトリウムイオンである、（2)の方法。
(4)嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴 とする、（1)一（3)のいずれかの方法。
(5)前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特 徴とする、（1)一（4)のいずれかの方法。
(6) 有機原料がグルコース又はシユークロースである、（1)一（5)のいずれかの方 法。 (7) 非ァミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、（1)一（6)のいずれ かの方法。
(8) 前記コリネ型細菌が、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて 10 %以下に低減ィ匕するように改変された細菌である、 (1)一 (7)のいずれかの方法。
(9) 前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび Z又はピルビン酸カルボキ シラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、 (1)一 (7)のいずれかの方 法。
(10) 前記コリネ型細菌が、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて 1
0%以下に低減ィ匕し、さらにフマル酸レダクターゼおよび Z又はピルビン酸カルボキ シラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、 (1)一 (7)のいずれかの方 法。
(11) (1)一（10)のいずれかの方法により非ァミノ有機酸を製造する工程、及び 前記工程で得られた非ァミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミ ノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]プラスミド pKMBlの構築手順と制限酵素地図を示す図。
[図 2]プラスミド ρΚΜΒΐΖ Δ LDHの構築手順を示す図。
[図 3]プラスミド pTZ4の構築手順を示す図。
[図 4]プラスミド pMJPClの構築手順を示す図。
[図 5]プラスミド pFRPCl. 1の構築手順を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
[0010] 本発明の製造方法は、水性媒体中、コリネ型細菌の菌体または該細菌の処理物を 有機原料に反応させて該有機原料から非ァミノ有機酸を生成させ、該非ァミノ有機 酸を採取する非ァミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシゥ ム及び Z又は水酸ィ匕マグネシウムで中和しながら菌体または処理物を有機原料に 反応させることを特徴とする、非ァミノ有機酸の製造方法である。
[0011] 本発明に使用されるコリネ型細菌（coryneform bacterium)は、非ァミノ有機酸の生 産能を有すれば特に限定されないが、コリネパクテリゥム属に属する微生物、ブレビ ノ クテリゥム属に属する微生物又はアースロバクター属に属する微生物が挙げられ、 このうち好ましくは、コリネバタテリゥム属又はブレビバタテリゥム属に属するものが挙 げられ、更に好ましくは、コリネバタテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium glutamicum)、ブレビノ クテリゥム ·フラノくム (Brevibacterium flavum)、ブレビノ クテリ ゥム ·アンモニアゲネス (Brevibacterium ammoniagenes)又はブレビバタテリゥム ·ラタ トフアーメンタム（Brevibacterium lactofermentum)に属する微生物が挙げられる。
[0012] 上記微生物の特に好ましい具体例としては、ブレビバタテリゥム 'フラバム（
Brevibacterium flavum) MJ-233 (FERM BP— 1497)、同 MJ— 233 AB— 41 (FE RM BP— 1498)、ブレビバタテリゥム.アンモニアゲネス（Brevibacterium
ammoniagenes) ATCC6872、コリネバタテリゥム 'グルタミカム（Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、ブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム（
Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869力挙げ、られる。
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233は、 1975年 4月 28日に通商産業省工業技術 院微生物工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センター）（干 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番 号 FERM P-3068として寄託され、 1981年 5月 1日にブダペスト条約に基づく国際寄託 に移管され、 FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
[0013] なお、ブレビバタテリゥム 'フラバムは、現在、コリネバタテリゥム'ダルタミカムに分類 される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H.， International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255- 260)、本発明 においては、ブレビバタテリゥム 'フラバムの MJ— 233株及び MJ— 233 AB— 41株は それぞれ、コリネバタテリゥム 'グルタミカムの MJ— 233株及び MJ— 233 AB— 41株と 同一の株であるものとする。
[0014] 本発明の方法において用いられる上記微生物は、野生株だけでなぐ UV照射や NTG処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組 換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であっても よい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば 、親株と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のよう な好気性細菌を宿主とするのが好まし 、。
[0015] 本発明の製造方法においては、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減ィ匕するよう に改変された変異株を用いることが好ま 、。「ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低 減化する」とは、ラタテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して菌体当たりのラクテ一 トデヒドロゲナーゼ活性が低下して ヽることを ヽぅ。ラタテートデヒドロゲナーゼ活性は 、ラタテートデヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり 10%以下に低減化さ れていることが好ましい。また、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損してい てもよい。ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減ィ匕されたことは、公知の方法（ L.Kanarek and R丄. Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964))によりラタテートデヒドロゲ ナーゼ活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のラタテート デヒドロゲナーゼ活性の低減化された変異株の具体的な製造方法としては、特開平 11—206385号公報に記載されて 、る染色体への相同組換えによる方法、ある 、は 、本明細書実施例に記載の SacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)等が挙げられる。
[0016] また、本発明の製造方法にお!、ては、フマル酸リダクターゼ (FRD)および Zまたは ピルビン酸カルボキシラーゼ (PC)の活性が増強するように改変されたコリネ型細菌を 用いることもできる。ここで、「増強」とは、非改変株と比較してこれらの酵素の菌体当 たりの活性が増加している状態をいう。フマル酸リダクターゼについて、大腸菌のフマ ル酸リダクターゼは TCA回路の正回りで作用するコハク酸デヒドロゲナーゼの逆反応 を担う酵素であるが、嫌気的条件下におけるフマル酸呼吸に関与しており、好気的 条件下にお 、ては転写レベルでその遺伝子発現が抑制されて ヽることが知られて ヽ る（Jones, H. M., Gunsalus, R. P., J. BacterioL, 1985, Vol. 164, pllOO— 1109)。従つ て、フマル酸リダクターゼはその活性が増強されすぎると、菌体の生育が悪くなること が考えられるため、本発明においては、フマル酸リダクターゼ活性は菌体の生育が 大きく阻害されな 、程度に増強されて 、ることが望ま 、。
[0017] なお、 PCおよび FRDの活性が増強されたことは、それぞれ後述するような NADHの 減少または K Fe(CN)の減少を測定する方法により、これらの酵素活性を測定するこ とによって確認することができる。フマル酸リダクターゼあるいはピルビン酸カルボキ シラーゼの発現が増強されたコリネ型細菌は、フマル酸リダクターゼ (FRD)遺伝子ま たはピルビン酸カルボキシラーゼ (PC)遺伝子を、特開平 11—196888号公報に記 載された方法と同様にして遺伝子組み換え技術を用い、コリネ型細菌中で高発現さ せること〖こより作製することができる。
[0018] PC活性を増強させるために用いる PC遺伝子は、既にその塩基配列が決定されて いる遺伝子、もしくは、通常の方法により PC活性を有するタンパク質をコードする DN A断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用す ることができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した 遺伝子を使用することもできる。
[0019] PC遺伝子を含む DNA断片は、微生物、動植物由来の染色体上に存在している。
これらの供給源微生物、動植物から PC遺伝子を調製するための基本操作を、配列 が既知である、コリネ型細菌由来のものを一例として述べれば次のとおりである。
[0020] PC遺伝子は、上記コリネ型細菌コリネバタテリゥム.ダルタミカム ATCC13032株 の染色体上に存在し（Peters- Wendisch, P.G. et al. Microbiology 144 (1998) 915-927)、それらの配列が既知であるため（GenBank Database Accession No.AP005276) (配列番号 15)、 PCR法により、 PC遺伝子を分離'取得することがで きる。
[0021] 例えば、 PCRに用いるプライマーとして、配列番号 13及び 14に示す塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドを用いてコリネバタテリゥム 'ダルタミカム由来の染色体を铸型 として PCRを行うと、約 3. 7kb力もなる PC遺伝子を増幅させることができる。このとき 、PCRに使用するプライマーの 5'末端に適当な制限酵素サイトを付加しておくことに より、後述するベクターの適当な部位に連結させることができ、得られる組換えべクタ 一を用いてコリネ型細菌に導入することができる。
[0022] また、遺伝子配列が不明であっても、 PC活性を指標に蛋白質を精製し、その N末 アミノ酸配列、部分分解配列よりプローブまたはプライマーを合成し、通常用いられる ノ、イブリダィゼーシヨンの手法により遺伝子断片を単離できる。また、 PC蛋白質間で 保存されて 、る領域のアミノ酸配列をもとにプローブまたはプライマーを合成し、ハイ ブリダィゼーシヨン、 PCR法により断片を取得することが可能である。取得した断片は 通常の手法によりその DNA塩基配列を決定することができる。
[0023] 本明細書において、切断 DNA断片の大きさ及びプラスミドの大きさは、ァガロース ゲル電気泳動を用いる場合には、ェシエリヒア 'コリのラムダ'ファージ（ λ phage)の D NAを制限酵素 Hindlllで切断して得られる分子量既知の DNA断片の同一ァガロ ースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を用いる場合には、ェシエリヒア'コリのフアイ'エックス 174ファージ（Φ Χ174 phage)の DNAを制限酵素 Haelllで切断して得られる分子量既知の DNA断片の 同一ポロアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断 DNA 断片またはプラスミドの各 DNA断片の大きさを算出することができる。尚、各 DNA断 片の大きさの決定において、 lkb以上の断片の大きさについては、 1%ァガロースゲ ル電気泳動によって得られる結果を採用し、約 0. lkbから lkb未満の断片の大きさ については 4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用した。
[0024] 上記 PC遺伝子を含む本発明に用いる DNA断片は、コリネバタテリゥム 'ダルタミ力 ム染色体 DNAから分離されたもののみならず、通常用いられる DNA合成装置、例 えばアプライド 'バイオシステムズ (Applied Biosystems)社製 394DNA/RNAシンセ サイザ一を用いて合成されたものであってもよい。また、前記のようにコリネ型細菌染 色体 DNAから取得される PC遺伝子は、コードされる PCの機能、すなわち二酸化炭 素固定に関与する性質を実質的に損なうことがない限り、配列番号 15の塩基配列に おいて、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよぐ又は削除されていてもよぐ 或いは新たに塩基が挿入されて 、てもよく、さらに塩基配列の一部が転位されて!、る ものであってもよぐこれらの誘導体のいずれも力 本発明に用いることができる。例 えば、配列番号 15の塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズ する DNA、または配列番号 15の塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上、より好 ましくは 99%以上の相同性を有する DNAであって、 PC活性を有するタンパク質をコ ードする DNAも好適に用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通 常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X SSC, 0. 1%SDS 、好ましくは、 0. 1 X SSC、0. 1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件 が挙げられる。
[0025] また、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム以外の細菌、または他の微生物又は動植物 由来の PC遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由 来の PC遺伝子は、その配列が既知 (括弧内に文献を示す)であり、上記と同様にし てハイブリダィゼーンシヨンにより、あるいは PCR法によりその ORF部分を増幅するこ とによって、取得することができる。得られた遺伝子は、後記実施例 3作製のベクター の TZ4プロモーター下流に挿入することができる。挿入したプラスミドを実施例 4 (C) の方法に従って好気性コリネ型細菌を形質転換し、非ァミノ有機酸の製造に使用す ることがでさる。
[0026] ヒト [Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009—1014, (1994)]
マウス [Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)]
ラッド [GENE, 165, 331-332, (1995)]
酵母；
サッカロマ セス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス ·ボンべ (Schizosaccharomyces pombe)
[DDBJ Accession No.; D78170]
ノ チルス'ステア口サーモフィルス (Bacillus stearothermophilus)
[GENE, 191, 47-50, (1997)]
リゾビゥム 'エトリ (Rhizobium etli)
[j.Bacteriol, 178, 5960-5970, (1996)]
[0027] PC遺伝子を含む DNA断片は、適当な発現プラスミド、例えば pUCl 18 (宝酒造製 )へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばェシエリヒア'コリ JM109 (宝酒造製)へ導入 すること〖こより発現させることができる。発現した PC遺伝子産物であるピルビン酸カル ボキシラーゼ (配列番号 16)の確認は、該形質転換体から粗酵素液を抽出し、 Magasanikの方法 [J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]により直接 PC活性を測定し、非 形質転 ·力 抽出した粗酵素液の PC活性と比較することにより、確認することがで きる。 [0028] PC遺伝子を含む DNA断片は、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミ ドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することに より、コリネ型細菌内で PCの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここ で、上記組み換えプラスミドにおいて、 PC遺伝子を発現させるためのプロモーターは コリネ型細菌が保有するプロモーターであることができる力 S、それに限られるものでは なぐ PC遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であれば 、かなるプロモーター であっても良い。例えば、実施例 3に示すような TZ4プロモーターが挙げられる。
[0029] PC遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での 複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その 具体例としては、例えば、特開平 3— 210184号公報に記載のプラスミド pCRY30 ;特 開平 2— 72876号公報及び米国特許 5, 185, 262号明細書公報に記載のプラスミド pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KE及び pCRY3KX;特 開平 1—191686号公報に記載のプラスミド pCRY2および pCRY3 ;特開昭 58— 676 79号公報【こ記載の pAM330 ;特開日召 58— 77895号公報【こ記載の pHM1519 ;特 開昭 58— 192900号公報に記載の pAJ655、pAJ611及び pAJ1844 ;特開昭 57— 1 34500号公報に記載の pCGl ;特開昭 58— 35197号公報に記載の pCG2 ;特開昭 57— 183799号公報に記載の pCG4および pCGl l等を挙げることができる。
[0030] それらの中でもコリネ型細菌の宿主 ベクター系で用いられるプラスミドベクターとし ては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内で プラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましぐ例えば、プラスミド p CRY30、 pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KEおよび pCR Y3KX等が好適に使用される。
[0031] PC遺伝子を好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位 に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバタテリゥム 'フ ラバム (Brevibacterium flavum)MJ— 233 (FERM BP— 1497)を开質転換することによ り、本発明で用いる PC遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。なお、 PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上で PC遺伝子を導入、置換 、増幅等によって高発現化させることによつても行うことができる。形質転換は、例え ば、電気パルス法（Res. Microbiol, Vol.144, p.181- 185, 1993)等によって行うことが できる。
[0032] 本発明において使用する FRD活性が増強された細菌は、 FRD遺伝子を細菌に導 入することによって得ることができる。用いることのできる FRD遺伝子はフマル酸リダク ターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列 番号 19に示す塩基配列を有する大腸菌由来の遺伝子を挙げることができる。この遺 伝子は FRDを構成する 4つのサブユニット（frdA、 frdB、 frdC及び frdD ;配列番号 20 一 23)をコードする遺伝子（配列番号 19の 440— 2245,2241— 2975,2986— 3381,及 び 3392— 3751)をそれぞれ含む、オペロン遺伝子である。この遺伝子の全長を細菌 に導入してもよいし、サブユニット遺伝子ごとに導入してもよい。各サブユニット遺伝 子は、 FRD活性を有する複合体を形成することのできるサブユニットタンパク質をコ ードする限り、上記塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズす る DNA、または上記塩基配列と 90%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 99% 以上の相同性を有するようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件と しては、通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X SSC, 0 . 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダィ ズする条件が挙げられる。なお、このような FRD遺伝子ホモログの中でも、 FRDの Bサ ブユニット (frdB) (配列番号 21)の 17番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンであ るようなタンパク質をコードするものが好ましい。配列番号 19に示す塩基配列を有す る遺伝子又はそのホモログは、 PCR法やハイブリダィゼーシヨン法によって得ることが できる。また、必要に応じて、 frdBの 17番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がリジンに なるような突然変異を、公知の方法により導入することもできる。
[0033] また、大腸菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来の FRD遺伝子を使 用することもできる。微生物または動植物由来の FRD遺伝子は、既にその塩基配列 が決定されて 、る遺伝子、ホモロジ一等に基 、て FRD活性を有するタンパク質をコ ードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したもの などを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にした 力 て合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダィゼーシヨン法や P CR法によりそのプロモーターおよび ORF部分を含む領域を増幅することによって、 取得することができる。
[0034] 得られた FRD遺伝子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内 でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入 することにより、コリネ型細菌内で FRDの発現増強が可能な糸且換えプラスミドを得るこ とができる。コリネ型細菌に FRD遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとし ては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば 特に制限されず、上述の pCRY30、 pCRY21等を用いることができる。なお、 FRD活 性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上で FRD遺伝子を導入、置換、増 幅等によって高発現ィ匕させることによつても行うことができる。
[0035] 前述したように、本発明にお 、てフマル酸リダクターゼ活性は、菌体の生育が大きく 阻害されない程度に増強されていることが望ましいため、適当なコピー数のプラスミド を選択するか、適当な発現強度のプロモーターを選択することにより、 FRD遺伝子の 発現量を調節することが好ましい。ここで、 FRD遺伝子を発現させるためのプロモータ 一はコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良 く、用いる FRD遺伝子自身のプロモーターであってもよ ヽ。
[0036] 本発明にお 、て、 PC及び FRD活性が増強した細菌を用いる場合は、これらの遺伝 子を個別に細菌に導入してもよいし、両遺伝子を含むベクターを用いて同時に導入 してもよい。本発明においては、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減ィ匕し、かつ PC 及び Zまたは FRD活性が増強するように改変された細菌を用いることが特に好ま ヽ 。このような細菌は、例えば、 LDH遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を作製し、得られ た細菌を PC遺伝子及び FRD遺伝子を含む組換えベクターでそれぞれ形質転換す ることにより得ることができる。なお、これらの遺伝子を用いた改変操作はいずれの操 作を先に行ってもよい。
[0037] 本発明の製造方法に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で 斜面培養したものを直接反応に用いても良 ヽが、上記細菌を予め液体培地で培養 ( 種培養）したものを用いるのが好ま ヽ。このように種培養した細菌を有機原料を含 む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって非ァミノ有機酸を製造 することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む水溶液中で有機 原料と反応させることによつても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を 本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用 いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用 いることができる。例えば、硫酸アンモ-ゥム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の 無機塩カゝらなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した 一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって 回収され、反応に用いられる。
[0038] 本発明においては菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物とは、例え ば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体抽出物、例 えば、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部 分精製した画分等を挙げることができる。
[0039] 本発明の製造方法において用いる有機原料は、本微生物が資化して非ァミノ有機 酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラタトー ス、グノレコース、フノレクトース、グリセローノレ、シユークロース、サッカロース、デンプン 、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マン-トール、キシリトール、リビトール等のポ リアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、シユークロース、フ ルクトース又はグリセロールが好ましぐ特にグルコース又はシユークロースが好まし い。また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの 有機原料は、単独でも組み合わせても使用できる。
[0040] 上記有機原料の使用濃度は特に限定されな!、が、有機酸の生成を阻害しな！、範 囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、 5— 30% (WZV)、好ましくは 10— 2 0% (WZV)の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記有機原料 の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良 、。
[0041] 本発明の製造方法に用いる水性媒体としては特に限定されず、例えば、水、緩衝 液、液体培地等が挙げられるが、既述したような液体培地が最も好ましい。また、本 発明の水性媒体には、窒素源や無機塩などが含まれることが好ましい。ここで、窒素 源としては、本微生物が資化して非ァミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に 限定されないが、具体的には、アンモニゥム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、力 ゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカ一などの各種 の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マ グネシゥム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ピオチン、 パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの 生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるた めに、水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ま U、。
[0042] 本発明の製造方法の一形態にお!、ては、水性媒体を、炭酸マグネシウムを添加す ることによって中和しながら反応させる。炭酸マグネシウムは、 4炭酸マグネシウム 1水 酸ィ匕マグネシウム 5水和物として存在しており、比較的水に溶けにくい。水性媒体へ 炭酸マグネシウムの添カ卩は、粉末等の固体あるいは水等に溶力した溶液を加えるこ とにより行うことができる力 溶液の添カ卩による体積の増加を防ぐことが可能であるた め、粉末等の固体のまま添加することが好ましい。粉末で添加した炭酸マグネシウム は、溶解度が低いため、過剰に添加しても、アルカリ性に傾きすぎることなく一定の p Hを保つことが可能である。例えば、コリネ型細菌の菌体懸濁液に、炭酸マグネシゥ ムを過剰に添カ卩した場合の初期 pHは、 pH8— 8. 5程度であり、その後反応が進む につれて pHは低下する力 反応後の pHは、 pH6— 7程度に保持されている。これ は、反応中、過剰に添加されて溶け残った炭酸マグネシウムが次第に溶解し、 pHが 急激に下がることを防ぐためと考えられる。
[0043] 本発明の製造方法の他の形態においては、水酸ィ匕マグネシウムを添加することに よって、水性媒体を中和しながら反応させてもよい。水酸ィ匕マグネシウムの水性媒体 への添カ卩は、例えば粉体等の固体あるいは水等に溶かした溶液の状態で行うことが できる。この場合、 目的とする有機酸の生産量を増加させるため、炭酸ガスを供給し つつ反応を行うことが好まし 、。
[0044] 本発明の製造方法の他の形態においては、炭酸マグネシウム及び水酸ィ匕マグネシ ゥムを添加することにより水性媒体を中和しながら反応させてもよい。炭酸マグネシゥ ム及び水酸化マグネシウムの添加は、同時に行って中和してもよいし、炭酸マグネシ ゥムを添加した後に水酸ィ匕マグネシウムを添加して中和してもよいし、また、水酸化マ グネシゥムを添カ卩した後に炭酸マグネシウムを添カ卩して中和してもよい。
[0045] 本反応において、中和するとは、反応により生じた非ァミノ有機酸を炭酸マグネシゥ ム及び Zまたは水酸ィ匕マグネシウムと反応させることにより、水性媒体の PHを一定の 範囲、例えば pH5— 10、好ましくは pH6— 9. 5に保つことをいう。本発明において は、炭酸マグネシウム及び/または水酸ィ匕マグネシウムを最初に添加してもよ 、し、 反応中も必要に応じてさらにカ卩えてもよい。また、炭酸マグネシウム及び Zまたは水 酸ィ匕マグネシウムに加えて、他の pH調節物質、例えばアルカリ性物質、炭酸塩、尿 素などを添加してもよい。
[0046] 水性媒体には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガスを含有させ、好気的条件ま たは嫌気的条件で反応させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和 剤として用いる炭酸マグネシウム力も供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭 酸又はこれらの塩或 、は炭酸ガス力 供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の 具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモ-ゥム、炭酸ナトリウム、炭酸 カリウム、重炭酸アンモ-ゥム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そ して、炭酸イオン、重炭酸イオンは、 0. 001— 5M、好ましくは 0. 1— 3M、さらに好ま しくは 1一 2Mの濃度で添加するとよい。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液 1L当た り 50mg— 25g、好ましくは lOOmg— 15g、さらに好ましくは 150mg— 10gの炭酸ガ スを含有させるとよい。
[0047] また、本発明で用いる水性媒体に 1価カチオンを添加することによりコハク酸等の有 機酸の生成速度あるいは収率を上昇させることができる。 1価カチオンとしては、アン モ -ゥムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等が挙げられる力 アンモ-ゥムィォ ンが好ましく用いられる。
1価カチオン添力卩の際は、水酸ィ匕アンモ-ゥム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシゥ ム等、 1価カチオンの水酸ィ匕物として添加することができるが、 1価カチオンの塩とし て添加することが好ましぐアンモ-ゥムイオンの塩としては、炭酸水素アンモ-ゥム、 塩ィ匕アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム等力 ナトリウムイオンの塩としては、炭酸水素 ナトリウム等力 カリウムイオンの塩としては、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
1価カチオンの塩を添加する場合は、通常、粉末状態で添加するか、その懸濁液ま たは水溶液として添加することが好ましい。また、水酸ィ匕アンモ-ゥムを添加する場 合は、アンモニア水として添加してもよいし、気体として反応液中に通気することによ り添カロすることちでさる。
1価カチオンの添加濃度としては、アンモ-ゥムイオンとしては、 0. 001M— 2M、 好ましくは 0. 01M— 1Mであり、ナトリウムイオンとしては、 0. 001M— 2M、好ましく は 0. 01M— 1Mであり、カリウムイオンとしては、 0. 001M— 2M、好ましくは 0. 01 M— 1Mである。
1価カチオンの添カ卩時期としては、反応開始時に添加してもよいし、反応途中で連 続的、逐次的あるいは間欠的に添加してもよい。連続的に反応液を使用する場合は 、反応液に既に添加されている 1価カチオンの量を考慮し、 1価カチオンの反応液中 の濃度が前記した好まし 、濃度になるように添加することが好ま 、。
[0048] 本反応に用いる微生物の生育至適温度は、通常、 25°C— 35°Cである。反応時の 温度は、通常、 25°C— 40°C、好ましくは 30°C— 37°Cである。反応に用いる菌体の 量は、特に規定されないが、 1一 700gZL、好ましくは 10— 500gZL、さらに好まし くは 20— 400gZLが用いられる。反応時間は 1時間一 168時間が好ましぐ 3時間 一 72時間がより好ましい。
[0049] 細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、有機酸の 生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない、又は、 通気を絞り酸素供給量を制限した嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここでいう嫌気的 雰囲気下とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場 合、溶存酸素濃度として 0— 2ppm、好ましくは 0— lppm、さらに好ましくは 0— 0. 5p pmで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無 通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有 の不活性ガスを通気する、攪拌を少なくする等の方法を用いることができる。
[0050] 有機酸の生成反応は、通常、培養液中のグルコース等の有機原料が消費された時 点で反応終了とすることができる。このとき、反応液中には、コハク酸、リンゴ酸または フマル酸等の有機酸が生成している。このうち、コハク酸が最も蓄積度が高く生産物 としては好ましい。 [0051] 上記の反応により、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸等の有機酸を得ることができ る。この有機酸含有組成物自体も本発明の範囲内である。有機酸含有組成物として はコノ、ク酸の蓄積濃度が高いものが特に好ましい。また、反応液又は培養液中に蓄 積した有機酸は常法に従って、分離'精製することができる。具体的には、遠心分離 、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換榭脂等で脱塩し、その溶液 力も結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより有機酸を分離'精製することができ る。
[0052] さらに本発明においては、上記した本発明の方法により非ァミノ有機酸を製造した 後に、得られた非ァミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非ァミノ有機酸 含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中 、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製 造される非ァミノ有機酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用 いる事が出来る。また、本発明の製造法により得られる非ァミノ有機酸または該非アミ ノ有機酸を含有する組成物は、食品添加物や医薬品、化粧品として用いることができ る。
[0053] [実施例]
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例により制限されるものではない。
実施例 1
[0054] <遺伝子破壊用ベクターの構築 >
(A)枯草菌ゲノム DNAの抽出
LB培地 [組成：トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 NaCl 5gを蒸留水 1Lに溶 解] 10mLに、枯草菌（Bacillus subtilis ISW1214)を対数増殖期後期まで培養し、 菌体を集めた。得られた菌体を lOmgZmLの濃度にリゾチームを含む 10mM NaC 1 20mMトリス緩衝液（pH8. 0)—lmM EDTA' 2Na溶液 0. 15mLに懸濁した。
[0055] 次に、上記懸濁液にプロテナーゼ Kを、最終濃度が 100 gZmLになるように添 加し、 37°Cで 1時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が 0. 5%に なるように添加し、 50°Cで 6時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフエノール Zクロロフオルム溶液を添加し、室温で 10分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心 分離（5, 000 X g、 20分間、 10— 12°C)し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを 0. 3Mとなるように添カ卩した後、 2倍量のエタノールをカ卩ぇ混合した。遠心分離（15, 00 0 X g、 2分）により回収した沈殿物を 70%エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ た DNAに 10mMトリス緩衝液（pH7. 5)— ImM EDTA' 2Na溶液 5mLをカ卩え、 4 °Cでー晚静置し、以後の PCRの铸型 DNAに使用した。
[0056] (B) PCRによる SacB遺伝子の増幅およびクローユング
枯草菌 SacB遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNAを铸型とし、既に報告さ れている該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No.X02730)を基に 設計した合成 DNA (配列番号 1および配列番号 2)を用いた PCRによって行った。
[0057] 反応液組成：铸型 DNA1 μ L、 PfxDNAポリメラーゼ (インビトロジェン社製） 0. 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 M各々プライマー、 ImM MgSO
4、 0. 25
MdNTPsを混合し、全量を 20 Lとした。反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC— 200 (MJResearch社製）を用い、 94°Cで 20秒、 68°Cで 2分からなるサイク ルを 35回繰り返した。但し、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクル の 68°Cでの保温は 5分とした。増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem G TG agarose : FMCBioProducts製）ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム 染色により可視化することにより行い、約 2kbの断片を検出した。ゲル力もの目的 DN A断片の回収は、 QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0058] 回収した DNA断片は、 T4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase：宝 酒造製）により 5'末端をリン酸ィ匕した後、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用 V、て大腸菌ベクター (pBluescriptll： STRATEGENE製）の EcoRV部位に結合し、 得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られ た組換え大腸菌を 50 μ gZmLアンピシリンおよび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒 天培地 [トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 NaCl 5g及び寒天 15gを蒸留水 1L に溶解]に塗抹した。
[0059] この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に 50 μ gZmLアンピシリン および 10%ショ糖を含む LB寒天培地に移し 37°C24時間培養した。これらのクロー ンのうち、ショ糖を含む培地で生育できな力つたものについて、常法により液体培養し た後、プラスミド DNAを精製した。 SacB遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株 は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミド DNAを制限 酵素 Sailおよび Pstlで切断することにより、約 2kbの挿入断片が認められ、該プラス ミドを pBSZSacBと命名した。
[0060] (C)クロラムフエ-コール而性 SacBベクターの構築
大腸菌プラスミドベクター PHSG396 (宝酒造：クロラムフエ-コール耐性マーカー） 500ngに制限酵素 PshBI 1 Ounitsを 37°Cで一時間反応させた後、フエノール Zクロ ロフオルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、タレノウフラグメント (K1 enow Fragment :宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーシヨンキット ver . 2 (宝酒造製)を用いて Mlulリンカ一（宝酒造)を連結、環状化させ、大腸菌 (DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 34 μ gZmLクロラムフ ェ-コールを含む LB寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミ ド DNAを調製し、制限酵素 Mlulの切断部位を有するクローンを選抜し、 pHSG396 Mluと命名した。
[0061] 一方、上記 (B)にて構築した pBSZSacBを制限酵素 Sailおよび Pstlで切断した 後、タレノウフラグメントにて末端を平滑ィ匕した。これにライゲーシヨンキット ver. 2 (宝 酒造製）を用いて Mlulリンカ一を連結したのち、 0. 75%ァガロースゲル電気泳動に より SacB遺伝子を含む約 2. Okbの DNA断片を分離、回収した。この SacB遺伝子 断片を、制限酵素 Mlul切断後、アルカリフォスファターゼ（Alkaline Phosphatase Calf intestine :宝酒造）にて末端を脱リン酸化した pHSG396Mlu断片とライゲーシ ヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結させ、大腸菌 (DH5 a株)を形質転換した 。この様にして得られた組換え大腸菌を 34 gZmLクロラムフエ-コールを含む LB 寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に 34 /z gZmLクロラムフエニコ ールおよび 10%ショ糖を含む LB寒天培地に移し 37°C24時間培養した。これらのク ローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できな力つたものについて、常法によりプラス ミド DNAを精製した。こうして得られたプラスミド DNAを Mlul切断により解析した結 果、約 2. Okbの挿入断片を持つことが確認され、これを pCMBlと命名した。 [0062] (D)カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクター PHSG299 (宝酒造： カナマイシン耐性マーカー）の DNAを铸型とし、配列番号 3および配列番号 4で示し た合成 DNAをプライマーとした PCR法によって行った。反応液組成：铸型 DNAlng 、 PyrobestDNAポリメラーゼ（宝酒造） 0. l μ 1倍濃度添付バッファー、 0. 5 μ Μ各々プライマー、 0. 25 μ MdNTPsを混合し、全量を 20 μ Lとした。
[0063] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC—200 (MJResearch社製）を用い 、 94°Cで 20秒、 62°Cで 15秒、 72°Cで 1分 20秒からなるサイクルを 20回繰り返した。 但し、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 5 分とした。
[0064] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioProduc ts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することにより行 い、約 1. lkbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQuick Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。回収した DNA断片は、 T4ポリヌ クレオチドキナーゼ（T4 Polynucleotide Kinase :宝酒造製）により 5'末端をリン酸化し た。
[0065] (E)カナマイシン而性 SacBベクターの構築
上記 (C)で構築した pCMBlを制限酵素 Van91Iおよび Sealで切断して得られた 約 3. 5kbの DNA断片を 0. 75%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。こ れを上記 (D)で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結し、得られたプラスミド DNAで大腸菌 (DH5 a株)を形質 転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 gZmLカナマイシンを含む L B寒天培地に塗抹した。
[0066] このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能である ことが確認された。また、同株力も調製したプラスミド DNAは、制限酵素 Hindlll消化 により 354、 473、 1807、 1997bpの断片を生じたこと力ら、図 1に示した構造に間違 V、がな 、と判断し、該プラスミドを pKMBlと命名した。
実施例 2 [0067] く LDH遺伝子破壊株の作製〉
(A)ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株ゲノム DN Aの抽出
A培地 [尿素 2g、 (NH ) SO 7g、 KH PO 0. 5g、 K HPO 0. 5g、 MgSO - 7
4 2 4 2 4 2 4 4
H O 0. 5g、 FeSO - 7H O 6mg、 MnSO - 4-5H 06mg、ビォチン 200 g、チ
2 4 2 4 2
ァミン 100 g、イーストエキストラタト lg、カザミノ酸 lg、グルコース 20g、蒸留水 1 Lに溶解] 10mLに、ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ-233株を対数増殖期後期まで 培養し、得られた菌体を上記実施例 1の (A)に示す方法にてゲノム DNAを調製した
[0068] (B)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローユング
MJ233株ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNA を铸型とし、特開平 11—206385に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合 成 DNA (配列番号 5および配列番号 6)を用いた PCRによって行った。反応液組成： 铸型 DNAl /z L、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造） 0. 2 レ 1倍濃度添付バッファー 、0. 2 M各々プライマー、 0. 25 μ MdNTPsを混合し、全量を 20 μ とした。
[0069] 反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC—200 (MJResearch社製）を用い 、 94°Cで 20秒、 55°Cで 20秒、 72°Cで 1分力 なるサイクルを 30回繰り返した。但し 、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 5分とし た。増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose : FMCBioPr oducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することに より行い、約 0. 95kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIA Quick Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0070] 回収した DNA断片を、 PCR産物クロー-ングベクター pGEM— TEasy (Promega 製)と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたブラ スミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸 菌を 50 μ gZmLアンピシリンおよび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒天培地に塗抹し た。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、 プラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Saclおよび Sphlで 切断することにより、約 1. Okbの挿入断片が認められ、これを pGEMTZCgLDHと 命名した。
[0071] (C)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（B)で作製した pGEMTZCgLDHを制限酵素 EcoRVおよび Xbalで切断す ることにより約 0. 25kbからなるラタテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り 出した。残った約 3. 7kbの DNA断片の末端をタレノウフラグメントにて平滑ィ匕し、ライ ゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて環状化させ、大腸菌 (DH5 a株)を形質 転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 gZmLアンピシリンを含む LB 寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、ブラ スミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Saclおよび Sphlで切断 することにより、約 0. 75kbの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これを pGEM TZ A LDHと命名した。
[0072] 次に、上記 pGEMTZ A LDHを制限酵素 Saclおよび Sphlにて切断して生じる約 0. 75kbの DNA断片を、 0. 75%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損 領域を含むラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。この DNA断片を、制 限酵素 Saclおよび Sphlにて切断した実施例 1にて構築した pKMBlと混合し、ライ ゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸 菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ g/mL カナマイシンおよび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒天培地に塗抹した。
[0073] この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Saclおよび Sphlで切 断することにより、約 0. 75kbの挿入断片が認められたものを選抜し、これを pKMBl Z A LDHと命名した（図 2)。
[0074] (D)ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233-ES株由来ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝 子破壊株の作製
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株の形質転換に用いるプラスミド DNAは、 p KMBlZ A LDHを用いて塩化カルシウム法 (Journal of Molecular Biology, 53, 159, 1970)により形質転換した大腸菌 JM110株力も調製した。
[0075] ブレビバクテリウム'フラバム MJ—233株（FERM BP—1497)は、常法 (Wolf H et al" J. Bacteriol. 1983, 156(3) 1165—1170、 Kurusu Y et al, Agric Biol Chem. 1990, 54(2) 443-7)に従って内在性プラスミドを除去 (キュアリング)し、得られたプラスミドキ ユアリング株ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233— ES株を以後の形質転換に用いた ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233— ES株の形質転換は、電気パルス法 (Res. M icrobiol.、 Vol.144, p.181-185, 1993)によって行い、得られた形質転換体をカナマ イシン 50 μ gZmLを含む LBG寒天培地 [トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5g、 NaCl 5g、グルコース 20g、及び寒天 15gを蒸留水 1Lに溶解]に塗抹した。
[0076] この培地上に生育した株は、 pKMBl/ A LDHがブレビバタテリゥム 'フラバム MJ 233— ES株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのラタテートデ ヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム ·フラバム MJ— 233株ゲノム上の同遺伝子 との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマ イシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相 同組み換え株をカナマイシン 50 g/mLを含む LBG培地にて液体培養した。この 培養液の菌体数約 100万相当分を 10%ショ糖含有 LBG培地に塗抹にした。結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えら れる株約 10個得た。
[0077] この様にして得られた株の中には、そのラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子カ¾1¾^ Bl/ Δ LDHに由来する変異型に置き換わつたものと野生型に戻ったものが含まれ る。ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、 L BG培地にて液体培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、ラタテートデヒドロ ゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラタテートデヒドロゲナ ーゼ遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 7および配列番号 8)を用い て分析すると、野生型では 720bp、欠失領域を持つ変異型では 47 lbpの DNA断片 を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変 異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233Z A LDHと命名した。
[0078] (E)ラタテートデヒドロゲナーゼ活性の確認 上記（D)で作製したブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/ Δ LDH株を A培地に植 菌し、 30°Cで 15時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離（3, 000 X g、 4°C、 20分間）して菌体を回収後、ナトリウム リン酸緩衝液 [組成: 50mMリン酸 ナトリウム緩衝液 (PH7.3)]で洗浄した。
[0079] 次 、で、洗浄菌体 0. 5g (湿重量)を上記ナトリウム リン酸緩衝液 2mLに懸濁し、 氷冷下で超音波破砕器 (ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得た。該破砕物を遠 心分離（10, OOO X g, 4°C, 30分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、ブ レビバタテリゥム 'フラバム MJ233— ES株の粗酵素液を同様に調製し、以下の活性 測定に供した。
[0080] ラタテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確認は、両粗酵素液について、ピルビン酸 を基質とした乳酸の生成に伴い、補酵素 NADHが NAD+に酸ィ匕されるのを、 340η mの吸光度変化として測定した [し Kanarek and R丄. Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)] o反応は、 50mMカリウム リン酸緩衝液 (pH7.2)、 10mMピルビン酸、 0. 4 mMNADH存在下、 37°Cにて行った。その結果、ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ2 33— ES株力も調製された粗酵素液におけるラタテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、 ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/ Δ LDH株力も調製された粗酵素液におけるラ クテートデヒドロゲナーゼ活性は、 10分の 1以下であった。
実施例 3
[0081] <コリネ型細菌発現ベクターの構築 >
(A)コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平 7— 9589 1の配列番号 4に記載の DNA断片（以降 TZ4プロモーターと称する）を利用すること とした。本プロモーター断片の取得は、実施例 2の (A)で調製したブレビバタテリゥム •フラバム MJ233ゲノム DNAを铸型とし、特開平 7— 95891の配列番号 4に記載の 配列を基に設計した合成 DNA (配列番号 9および配列番号 10)を用いた PCRによ つて行った。
[0082] 反応液組成：铸型 DNA1 μ L、 PfxDNAポリメラーゼ (インビトロジェン社製） 0. 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 M各々プライマー、 ImM MgSO、 0. 25 MdNTPsを混合し、全量を 20 /z Lとした。反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 PTC— 200 (MJResearch社製）を用い、 94°Cで 20秒、、 60°Cで 20秒、、 72°Cで 30 秒力もなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20 秒、最終サイクルの 72°Cでの保温は 2分とした。
[0083] 増幅産物の確認は、 2. 0%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioProd ucts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することにより 行い、約 0. 25kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。回収した DNA断片は、 T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (T4 Polynucleotide Kinase :宝酒造製）により 5'末端を リン酸ィ匕した後、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて大腸菌ベクター pU C19 (宝酒造）の Smal部位に結合し、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株 )を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ gZmLアンピシリンお よび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒天培地に塗抹した。
[0084] この培地上で白色のコロニーを形成した 6クローンについて、常法により液体培養し た後、プラスミド DNAを精製し、塩基配列を決定した。これ中で TZ4プロモーターが PUC19の lacプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを 選抜し、これを PUCZTZ4と命名した。
[0085] 次に、 pUCZTZ4を制限酵素 BamHIおよび Pstlで切断して調製した DNA断片 に、 5 '末端がリン酸化された合成 DNA (配列番号 11および配列番号 12)から成り、 両末端にそれぞれ BamHIと Pstlに対する粘着末端を有する DNAリンカ一を混合し 、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで 大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。本 DNAリンカ一には、リボソーム結合配列 (A GGAGG)およびその下流に配したクローユングサイト（上流から順に、 Pad, NotI、 Apal)が含まれている。
[0086] この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAの中力も制限酵素 Notlによって切 断されるものを選抜し、これを PUCZTZ4— SDと命名した。この様にして構築した p UCZTZ4— SDを制限酵素 Pstlで切断後、タレノウフラグメントにて末端を平滑ィ匕し 、次いで制限酵素 Kpnlで切断することにより生じた約 0. 3kbのプロモーター断片を 、 2. 0%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
[0087] (B)コリネ型細菌発現ベクターの組み立て
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平 12— 93183記 載の pHSG298par— repを利用する。本プラスミドは、ブレビバタテリゥム 'スタチォ- ス IFO 12144株が保有する天然型プラスミド pBY503の複製領域および安定化機 能を有する領域と大腸菌ベクター PHSG298 (宝酒造）に由来するカナマイシン耐性 遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。
[0088] pHSG298par— repを制限酵素 Sselで切断後、タレノウフラグメントにて末端を平 滑化し、次いで制限酵素 Kpnlで切断することによって調製した DNAを、上記 (A)で 調製した TZ4プロモーター断片と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を 用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この 様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ gZmLカナマイシンを含む LB寒天培地に塗 抹した。
[0089] この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAの中力 制限酵素 Notlによって切断されるものを選抜し 、該プラスミドを pTZ4と命名した（図 3に構築手順を示した)。
実施例 4
[0090] <ピルべ一トカルボキシラーゼ活性増強株の作製 >
(A)ピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株由来ピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子の 取得は、く実施例 2 >の (A)で調製した DNAを铸型とし、全ゲノム配列が報告され ているコリネバタテリゥム.グルタミカム ATCC 13032株の該遺伝子の配列（GenBa nk Database Accession No. AP005276)を基に設計した合成 DNA (配列番 号 13および配列番号 14)を用いた PCRによって行った。
[0091] 反応液組成：铸型 DNA1 μ L、 PfxDNAポリメラーゼ（インビトロジェン社製） 0. 2 μ L、 1倍濃度添付バッファー、 0. 3 ^ M各々プライマー、 ImM MgSO
4、 0. 25 ^ Μ dNTPsを混合し、全量を 20 μ Lとした。反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 Ρ TC— 200 (MJResearch社製）を用い、 94°Cで 20秒、 68°Cで 4分からなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 6 8°Cでの保温は 10分とした。 PCR反応終了後、 Takara Ex Taq (宝酒造）を 0. 1 Lカロえ、さらに 72°Cで 30分保温した。
[0092] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose： FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行い、約 3. 7kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。回収した DNA断片を、 PC R産物クロー-ングベクター pGEM— TEasy (Promega製）と混合し、ライゲーシヨン キット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ gZmLアンピシリ ンおよび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒天培地に塗抹した。
[0093] この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プ ラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Paclおよび Apalで切 断することにより、約 3. 7kbの挿入断片が認められ、これを pGEMZMJPCと命名し た。
[0094] pGEMZMJPCの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイォシステム社製塩基配 列解読装置（モデル 377XL)およびビックダイターミネータ一サイクルシークェンスキ ット ver3を用いて決定した。その結果得られた DNA塩基配列および推測されるアミ ノ酸配列を配列番号 15に記載する。本アミノ酸配列はコリネバタテリゥム'ダルタミ力 ム ATCC13032株由来のそれと極めて高い相同性（99. 4%)を示すことから、 pGE M/MJPCの挿入断片がブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233株由来のピルべートカ ルボキシラーゼ遺伝子であること断定した。
[0095] (B)ピルべ一トカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記 (A)で作製した pGEMZMJPCを制限酵素 Paclおよび Apalで切断すること により生じる約 3. 7kb力もなるピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子断片を、 0. 75% ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この DNA断片を、制限酵素 Paclお よび Apalにて切断したく実施例 3 >にて構築した pTZ4と混合し、ライゲーシヨンキッ ト ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH5 a株) を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 gZmLカナマイシンを 含む LB寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した 後、プラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Paclおよび Apa Iで切断することにより、約 3. 7kbの挿入断片が認められたものを選抜し、これを pMJ PC Iと命名した（図 4)。
[0096] (C)ブレビバタテリゥム.フラバム MJ233Z A LDH株への形質転換
ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233株内で複製可能な pMJPC lによる形質転換用 のプラスミド DNAは、上記 (B)で形質転換した大腸菌 (DH5 a株)から調製した。ブ レビバタテリゥム ·フラバム MJ233Z Δ LDH株への形質転換は、電気パルス法 (Res . Microbiol.、 Vol.144, p.181- 185, 1993)によって行い、得られた形質転換体を力 ナマイシン 50 μ gZmLを含む LBG寒天培地 [トリプトン 10g、イーストエキストラタト 5 g、 NaCl 5g、グルコース 20g、及び寒天 15gを蒸留水 1Lに溶解]に塗抹した。
[0097] この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを抽出、 制限酵素切断による解析を行った結果、同株力 ¾MJPC1を保持していることを確認 し、該株をブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/PC/ Δ LDH株と命名した。
[0098] (D)ピルべ一トカルボキシラーゼ酵素活性
上記 (C)で得られた形質転赚ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233ZPCZ Δ LD H株をダルコース 2%、カナマイシン 25mg/Lを含む A培地 lOOmLで終夜培養を行つ た。得られた菌体を集菌後、 50mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 50mlで洗浄し、 同組成の緩衝液 20mLに再度懸濁させた。懸濁液を SONIFIER 350 (BRANSO N製)で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を 用いピルべ一トカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は lOOmM Tris/HCl緩衝液（pH7.5)、 O. lmg/lOmLビォチン、 5mM 塩化マグネシウム、 50mM 炭酸水素ナトリウム、 5mMピルビン酸ナトリウム、 5mMアデノシン 3リン酸ナトリウム、 0. 32 mM NADH、 20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（WAKO製、酵母由来）及 び酵素を含む反応液中で 25°Cで反応させることにより行った。 1Uは 1分間に 1 μ mol の NADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルべ一トカルボキシラーゼを発現させた 無細胞抽出液における比活性は 0.2U/mg-蛋白質であった。なお親株である MJ233/ △LDH株を A培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピル ベートカルボキシラーゼ活性は検出されな力つた。
実施例 5
[0099] <大月昜菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング>
(A)大腸菌 DNA抽出
LB培地 10mLに、大腸菌（Eschericia coli)JM109株を対数増殖期後期まで培 養し、得られた菌体を上記実施例 1 (A)に示す方法にてゲノム DNAを調製した。
[0100] (B)大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクロー-ング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記 (A)で調製した DNAを铸型 とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌 K12— MG1655株の該遺伝子の配列（ GenBank Database Accession No. U00096)を基に設計した合成 DNA (配 列番号 17および配列番号 18)を用いた PCRによって行った。反応液組成:铸型 DN Al /z L、 PfxDNAポリメラーゼ (インビトロジェン社製） 0. 2 L、 1倍濃度添付バッフ ァー、 0. 3 Μ各々プライマー、 ImM MgSO、 0. 25 ^ MdNTPsを混合し、全量
4
を 20 μ Lとした。反応温度条件： DNAサーマルサイクラ一 MJResearch社製 PTC —200を用い、 94°Cで 20秒、 68°Cで 4分からなるサイクルを 35回繰り返した。但し、 1 サイクル目の 94°Cでの保温は 1分 20秒、最終サイクルの 68°Cでの保温は 10分とし た。 PCR反応終了後、 Takara Ex Taq (宝酒造）を 0. 1 Lカロえ、さらに 72°Cで 3 0分保温した。
[0101] 増幅産物の確認は、 0. 75%ァガロース（SeaKem GTG agarose :FMCBioPro ducts製)ゲル電気泳動により分離後、臭化工チジゥム染色により可視化することによ り行い、約 3. 8kbの断片を検出した。ゲルからの目的 DNA断片の回収は、 QIAQui ck Gel Extraction Kit (QIAGEN製）を用いて行った。
[0102] 回収した DNA断片を、 PCR産物クロー-ングベクター pT7Blue T— Vector (No vagen製)と混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られ たプラスミド DNAで大腸菌（DH5 α株）を形質転換した。この様にして得られた組換 え大腸菌を 50 μ gZmLアンピシリンおよび 50 μ gZmLX- Galを含む LB寒天培地 に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培 養した後、プラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAを制限酵素 Hindlll および Kpnlで切断することにより、約 3. 9kbの挿入断片が認められ、これを pFRD6 . 0と命名した。
[0103] pFRD6. 0の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解 読装置（モデル 377XL)およびビッグダイターミネータ一サイクルシークェンスキット V er3を用いて決定した。その結果得られた DNA塩基配列および推測されるアミノ酸 配列を配列番号 19、 20— 23に記載する。
実施例 6
[0104] <ピルべ一トカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強株の作製 >
(A) pMJPC 1の制限酵素部位改変
実施例 3にて構築した pMJPC 1を制限酵素 Kpnlにて完全に切断した後、アル力リ フォスファターゼ（Alkaline Phosphatase Calf intestine：宝酒造）を反応させて 5，末端を脱リン酸化処理して調製した DNA断片に、 5，末端がリン酸化された合成 DNA (配列番号 24および配列番号 25)力も成る DNAリンカ一を混合し、ライゲーシ ヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌（DH 5 α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 μ gZmLカナマ イシンを含む LB寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体 培養した後、プラスミド DNAを精製した。得られたプラスミド DNAから制限酵素 Ndel によって切断されるものを選抜し、これを pMJPCl. 1と命名した
[0105] (B)ピルべ一トカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミド の構築
実施例 5にて作製した pFRD6. 0を制限酵素 Hindlllで切断後、タレノウフラグメン トにて末端を平滑ィ匕し、次いで制限酵素 Kpnlで切断して生じた約 3. 9kbの DNA断 片を 0. 75%ァガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した 大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記 (A)で作製した pMJPCl. 1を制限酵素 Ndelで切断後、タレノウフラグメントにて末端を平滑ィ匕し、次いで制限 酵素 Kpnlで切断することによって調製した DNAと混合し、ライゲーシヨンキット ver. 2 (宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミド DNAで大腸菌 (DH5 a株)を形 質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を 50 gZmLカナマイシンを含む LB寒天培地に塗抹した。
[0106] この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミド DNAを精製し た。得られたプラスミド DNAを帘1』限酵素 Hindlll消ィ匕により 505、 2132、 2675、 377 5、 4193bpの断片を生じたことから、図 5に示した構造に間違いがないと判断し、該 プラスミドを pFRPCl . 1と命名した。
[0107] (B)ブレビバタテリゥム .フラバム MJ233Z Δ LDH株の形質転換
pFRPCl . 1を用いたブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/ Δ LDH株の形質転換 は、実施例 4の（C)に記載の方法にて行い、プラスミド pFRPCl . 1を保持することが 確認された株を得、これをブレビノ クテリゥム ·フラバム MJ233/FRD/PC/ Δ LD H株と命名した。
[0108] (C) FRD酵素活性測定
上記（B)で得られた形質転 ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/FRD/PC / A LDH株をグルコース 2%、カナマイシン 25mg/Lを含む A培地 lOOmLで終夜培 養を行った。得られた菌体を集菌後、 50mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 50mLで 洗浄し、同組成の緩衝液 20mlに再度懸濁させた。懸濁液を SONIFIER 350 (BR ANSON製)で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞 抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は 33mM Tris 塩酸緩衝液 (pH7.5)、 O.lmM EDTA、 20mM コハク酸 Na、 2mM K Fe(CN)及び酵素
3 6 を含む反応液中で 25°Cで反応させることにより行った。 1Uは 1分間に 2 molの K
3
Fe(CN)の減少を触媒する酵素量とした。プラスミド pFRPCl.1を発現させた無細胞抽
6
出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は 0.02U/mg-蛋白質であった。なお親株 である MJ233/ALDH株を A培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は 0.01U/mg-蛋白質であった。
実施例 7
[0109] <炭酸マグネシウム中和による反応 >
尿素： 4g、硫酸アンモ-ゥム： 14g、リン酸 1カリウム： 0. 5g、リン酸 2カリウム 0. 5g、 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 5g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン · 水和物： 20mg、 D—ピオチン： 200 μ g、塩酸チアミン： 200 μ g、酵母エキス： lg、力 ザミノ酸： lg、及び蒸留水： lOOOmLの培地 lOOmLを 500mLの三角フラスコにいれ 、 120°C、 20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あら力じめ滅菌した 50%ダル コース水溶液を 4mL、無菌濾過した 5%カナマイシン水溶液を 50 L添カ卩し、実施 例 6で作製したブレビバタテリゥム 'フラバム MJ233/FRD/PC/ Δ LDH株を接種 して 24時間 30°Cにて種培養した。尿素： 12g、硫酸アンモ-ゥム: 42g、リン酸 1力リウ ム： 1. 5g、リン酸 2カリウム 1. 5g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 1. 5g、硫酸第一鉄' 7水和物： 60mg、硫酸マンガン ·水和物： 60mg、 D—ピオチン： 600 μ g、塩酸チアミ ン： 600 8、酵母エキス 3g、カザミノ酸 3g、消泡剤（アデ力ノール LG294 :旭電化製 ) : lmL及び蒸留水： 2500mLの培地を 5Lの発酵糟に入れ、 120°C、 20分加熱滅 菌した。これを室温まで冷やした後、あら力じめ滅菌した 12%グルコース水溶液を 50 OmL添カ卩し、これに前述の種培養液を全量加えて、 30°Cに保温した。通気は毎分 5 00mL、攪拌は毎分 500回転で培養を行った。 12時間後にグルコースがほぼ消費さ れていた。
[0110] 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン. 水和物： 8mg、 D—ピオチン： 80 g、塩酸チアミン： 80 μ g及び蒸留水： 200mLの培 地を 500mLの三角フラスコに入れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした 後、上記の培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. (660nm)力 0になるように再懸濁した。この懸濁液 25mLとあらかじめ滅菌した 24%グルコース溶液 25mLを lOOmLの三角フラスコに入れ、 4炭酸マグネシウム 1 水酸ィ匕マグネシウム 5水和物: 4. 215gを添加して混合した。この反応用懸濁液を 30 °Cに保温し、毎分 120回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後 20時間にお ける糖消費速度は 2. 08gZLZhであり、コハク酸生産速度は 1. 61g/L/h,収率 は 77%であった。なお、糖消費速度及びコハク酸生産速度は、反応開始時から反応 終了時までの平均値で表して 、る。
実施例 8
[0111] <水酸ィ匕マグネシウム中和による反応（1) > 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン · 水和物： 8mg、 D—ピオチン： 80 g、塩酸チアミン： 80 g、消泡剤（アデ力ノール L G294 :旭電化製）： lmL及び蒸留水： 200mLの培地を 500mLの三角フラスコに入 れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記実施例 7と同様の方法 により得られた培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. (660nm)が 200になるように再懸濁した。この懸濁液 200mLとあらかじめ滅 菌した 30%グルコース溶液 200mLを 1Lのジャーフアーメンターに入れ、 35°Cに保 温した。 pHが 6. 8に保たれるように 4M水酸ィ匕マグネシウム水溶液を断続的に添カロし 、毎分 lOOmLで通気、毎分 400回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後 46 時間における平均糖消費速度は 3. 22gZLZhであり、コハク酸生産速度は 1. 38g /L/h,収率は 72%であった。
[0112] 上記と同様に反応用懸濁液を調製し、 35°Cに保温した。 pHが 6. 8に保たれるよう に 4M水酸ィ匕マグネシウム水溶液を断続的に添加し、通気は行わず、毎分 200回転 で攪拌しながら反応を行った。反応開始後 50時間における平均糖消費速度は 2. 6 OgZLZhであり、コハク酸生産速度は 0. 90g/L/h,収率は 55%であった。 実施例 9
[0113] <水酸化マグネシウム中和による反応（2) (ジャーフアーメンター） >
(A)菌体の調製
実施例 4で作製したブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233ZPCZ Δ LDH株を実施 例 7と同様にして種培養を行った。グルコース： 100g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 0 . 5g、正リン酸： 0. 65g、大豆タンパク加水分解液（全窒素含量 35gZL) : 14. 3mL 、硫酸アンモニゥム： 1. 0g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン '水和物： 2 Omg、 D—ピオチン： lmg、塩酸チアミン： lmg及び消泡剤（GD— 113 :日本油脂社 製）： 0. 05mLを 1L中に含む培地を 150L作製し、 pHを IN KOHで 6. 5に調整し た後、 300Lのジャーフアーメンターに入れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。冷却後、 前述の種培養液を 450mL接種して 30°Cに保温した。通気は毎分 113L、圧力は 50 kPa、攪拌は毎分 280回転で、 pHをアンモニアガスにて 7. 6に調整しながら 20時間 前培養を行った。 [0114] グルコース： 100g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 5gを 1L中に含む糖溶液 260L 分に相当する量の各成分を計量し、 50Lに溶解して、 120°C、 20分加熱滅菌した。 また、正リン酸: 0. 65g、大豆タンパク加水分解液 (全窒素含量 35g/L) : 2. 9mL、 硫酸アンモ-ゥム： 1. Og、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン ·水和物： 20 mg、 D—ピオチン： lmg、塩酸チアミン： lmg及び消泡剤（GD— 113) : 0. 05mLを 1 L中に含む培地 260L分に相当する量の各成分を計量し、 140Lに溶解して、 pHを 1 N KOHで 6. 5に調整した後、 120°C、 20分加熱滅菌した。滅菌した糖溶液と培地 を 500Lのジャーフアーメンターに入れ、冷却後、前述の前培養液を 70Lカ卩えて全量 を 260Lとした後、 30°Cに保温した。通気は毎分 113L、圧力は 50kPa、攪拌は毎分 140回転で、 pHをアンモニアガスにて 7. 6に調整しながら 24時間培養を行い、コハ ク酸生産能を有する菌体を得た。 MF膜 (旭化成社製）により、約 4倍に菌体液を濃 縮し、乾燥菌体重が約 60gZLの菌体懸濁液を得た。菌体懸濁液は 4°Cにて保存し た。
[0115] (B)コハク酸の生産
菌体懸濁液を遠心分離してさらに濃縮し、乾燥菌体重が約 120gZLとなるように遠 心上清を用いて調製した。グルコース： 150g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 5gを 蒸留水に溶解して 300mLとし、 120°C、 20分加熱滅菌した。また、正リン酸: 0. 65g 、大豆タンパク加水分解液 (全窒素含量 35gZL) : 2. 9mL、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン '水和物： 20mg、 D—ピオチン： lmg、塩酸チアミン： lmg及び 消泡剤（GD— 113) : 0. 05mLを約 300mLの蒸留水に溶解し、 pHを 5Nの水酸化力 リウム溶液で 6. 5に調整した後、蒸留水で 450mLにメスアップし、 120°C、 20分力口 熱滅菌した。上記のグルコース溶液 120mLと培地 180mLを混合して 1Lのジャーフ アーメンターに入れ、前述の乾燥菌体重が約 120gZLの懸濁液を lOOmL接種して 30°Cに保温した。液上面より二酸ィ匕炭素を毎分 20mL通気し、攪拌は毎分 400回転 で、 pHを 2. 5Mの水酸化マグネシウム溶液、 5Mの水酸化ナトリウム溶液、 5Mの水 酸化カリウム溶液、または 5Mのアンモニア水で、それぞれ 7. 3に調整しながら反応 を行った。反応開始後 14時間目のコハク酸蓄積、コハク酸生産速度及び収率は以 下の表のとおりであった。 [0116] [表 1]
Figure imgf000035_0001
[0117] 水酸ィ匕カリウム、水酸ィ匕ナトリウム又はアンモニア水を用いた場合と比較して、水酸 化マグネシウムを用いて中和しながら反応を行った場合、コハク酸蓄積、コハク酸生 成速度及び収率が顕著に高 、ことが確かめられた。
実施例 10
[0118] <炭酸水素アンモニゥムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応 >
上記実施例 7と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を 0. 05、 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8mol/Lとなるように炭酸水素アンモ-ゥムを添カ卩して反応を行った。 反応開始後 20時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表 2の通りにな つた。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニゥムを適 量添加することにより、糖消費速度及びコハク酸生産速度が大幅に上昇することが明 らかになつた。
[0119] [表 2]
Figure imgf000035_0002
実施例 11
く炭酸水素ナトリウムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応 (フラスコ）〉 上記実施例 7と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を 0. 05、 0. 1、 0. 2、 0. 4、 0. 8molZLとなるように炭酸水素ナトリウムを添加して反応を行った。反応 開始後 20時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表 3の通りになった 。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素ナトリウムを適量添加す ることにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が大幅に上昇することが明ら かになつた。
[表 3]
Figure imgf000036_0001
実施例 12
<炭酸マグネシウム中和による反応 (ジャーフアーメンター） >
硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン' 水和物： 8mg、 D—ピオチン： 80 g、塩酸チアミン： 80 μ g、消泡剤（アデ力ノール L G294 :旭電化製）： lmL及び蒸留水： 200mLの培地を 500mLの三角フラスコに入 れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記 7と同様の方法により得 られた培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. ( 660nm)が 200になるように再懸濁した。この懸濁液 200mLとあらかじめ滅菌した 3 0%グルコース溶液 200mLを 1Lのジャーフアーメンターに入れ、 4炭酸マグネシウム 1水酸化マグネシウム 5水和物： 58. 284gを添加して混合した。この反応用懸濁液を 35°Cに保温し、毎分 lOOmLで通気、毎分 400回転で攪拌しながら反応を行った。 反応開始後約 16時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 9. 80g/ L,hであり、コハク酸生産速度は 8. 78g/L/h,収率は 96%であった。これにより 、炭酸マグネシウム中和反応によって、糖消費速度、コハク酸生産速度、収率が顕著 に上昇することがジャー培養において確認された。 実施例 13
[0123] <炭酸水素アンモ-ゥムを添加した炭酸マグネシウム中和による反応 (ジャーファー メンター） >
上記実施例 12と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を 0. ImolZLと なるように炭酸水素アンモ-ゥムを添加して同様に反応を行った。反応開始後約 10 時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 15. 2gZLZhであり、コハ ク酸生産速度は 12. 6g/L/ 収率は 92%であった。これにより、炭酸マグネシゥ ム中和反応において、炭酸水素アンモニゥムを適量添加することにより、糖消費速度 、コハク酸生産速度及び収率が顕著に上昇することがジャー培養にぉ 、て確認され た。
実施例 14
[0124] <シユークロースを有機原料とした炭酸マグネシウム中和による反応（ジャーファーメ ンター） >
硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン · 水和物： 8mg、 D—ピオチン： 80 g、塩酸チアミン： 80 g、消泡剤（アデ力ノール L G294 :旭電化製）： ImL及び蒸留水： 200mLの培地を 500mLの三角フラスコに入 れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記 7と同様の方法により得 られた培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. ( 660nm)が 60になるように再懸濁した。この懸濁液 200mLとあらかじめ滅菌した 20 %シユークロース溶液 200mLを 1Lのジャーフアーメンターに入れ、 4炭酸マグネシゥ ム 1水酸化マグネシウム 5水和物： 38. 8g、炭酸水素アンモニゥム 3. 2gを添カ卩して混 合した。この反応用懸濁液を 35°Cに保温し、毎分 400回転で攪拌しながら反応を行 つた。反応開始後約 20時間でシユークロースがほぼ消費されていた。糖消費速度は 5gZLZhであり、コハク酸生産速度は 4. 6g/L/h,収率は 91%であった。
[0125] [比較例 1]
<炭酸アンモ -ゥム中和による反応 (ジャーフアーメンター） >
尿素： 4g、硫酸アンモ-ゥム： 14g、リン酸 1カリウム：0. 5g、リン酸 2カリウム。. 5g、 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 5g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 20mg、硫酸マンガン · 水和物： 20mg、 D—ピオチン： 200 μ g、塩酸チアミン： 200 μ g、酵母エキス： lg、力 ザミノ酸： lg、及び蒸留水： lOOOmLの培地 lOOmLを 500mLの三角フラスコにいれ 、 120°C、 20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あら力じめ滅菌した 50%ダル コース水溶液を 4mL、無菌濾過した 5%カナマイシン水溶液を 50 L添カ卩し、実施 例 6 (B)で作製したブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233ZFRDZPCZ Δ LDH株を 接種して 24時間 30°Cにて種培養した。尿素： 12g、硫酸アンモ-ゥム: 42g、リン酸 1 カリウム： 1. 5g、リン酸 2カリウム 1. 5g、硫酸マグネシウム · 7水和物： 1. 5g、硫酸第 一鉄 · 7水和物： 60mg、硫酸マンガン ·水和物： 60mg、 D—ピオチン： 600 μ g、塩酸 チアミン： 600 g、酵母エキス 3g、カザミノ酸 3g、消泡剤（アデ力ノール LG294 :旭 電化製）： lmL及び蒸留水： 2500mLの培地を 5Lの発酵糟に入れ、 120°C、 20分 加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あら力じめ滅菌した 12%グルコース水溶 液を 500mL添カ卩し、これに前述の種培養液を全量加えて、 30°Cに保温した。通気 は毎分 500mL、攪拌は毎分 500回転で培養を行った。 12時間後にグルコースがほ ぼ消費されていた。
[0126] 硫酸マグネシウム · 7水和物： 0. 2g、硫酸第一鉄 · 7水和物： 8mg、硫酸マンガン. 水和物： 8mg、 D—ピオチン： 80 g、塩酸チアミン： 80 μ g及び蒸留水： 200mLの培 地を 500mLの三角フラスコに入れ、 120°C、 20分加熱滅菌した。室温まで冷やした 後、上記の培養液を 8000rpm、 5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、 O. D. (660nm)力 00になるように再懸濁した。この懸濁液 200mLとあらかじめ滅菌し た 30%グルコース溶液 200mLを 1Lのジャーフアーメンターに入れて混合し、 35°C に保温した。 pHは 2M炭酸アンモ-ゥムを用いて 7. 6に保ち、毎分 lOOmLで通気、 毎分 400回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約 14時間でグルコースが ほぼ消費されていた。糖消費速度は l lgZLZhであり、コハク酸生産速度は 5. 3g L 収率は 72%であった。
[0127] [比較例 2]
く炭酸ナトリウム中和による反応 (ジャーフアーメンター） >
上記比較例 1と同様に反応用懸濁液を調製し、 pHを 2M炭酸ナトリウムを用いて 7 . 6に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約 12時間でグルコースがほぼ消費さ れていた。糖消費速度は 13gZLZhであり、コハク酸生産速度は 7. 2g/L/ 収 率は 95%であった。
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、発酵反応液の体積の増加をほとんど起こすことなぐ水性 媒体の pHを一定の範囲に保持したまま、非ァミノ有機酸を製造することができる。さ らに、水性媒体に 1価カチオンを添加することにより非ァミノ有機酸の生成速度あるい は収率を大幅に上げることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有 機原料から非ァミノ有機酸を生成させ、該非ァミノ有機酸を回収する工程を含む非ァ ミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び Z又は水酸 化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させること を特徴とする方法。
[2] 1価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機 原料に反応させて該有機原料力 非ァミノ有機酸を生成させ、該非ァミノ有機酸を採 取する工程を含む非ァミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネ シゥム及び Z又は水酸ィ匕マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有 機原料に反応させることを特徴とする方法。
[3] 1価カチオンがアンモ-ゥムイオンまたはナトリウムイオンである、請求項 2に記載の 方法。
[4] 嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする
、請求項 1一 3のいずれか一項に記載の方法。
[5] 前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とす る、請求項 1一 4のいずれか一項に記載の方法。
[6] 前記有機原料がグルコース又はシユークロースである、請求項 1一 5のいずれか一項 に記載の方法。
[7] 非ァミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、請求項 1一 6のいずれか一 項に記載の方法。
[8] 前記コリネ型細菌が、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて 10%以 下に低減ィ匕するように改変された細菌である、請求項 1一 7のいずれか一項に記載 の方法。
[9] 前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび Z又はピルビン酸カルボキシラー ゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項 1一 7のいずれか一項に記 載の方法。
[10] 前記コリネ型細菌が、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて 10%以 下に低減化し、さら〖こ、フマル酸レダクターゼおよび/又はピルビン酸カルボキシラ ーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項 1一 7のいずれか一項に 記載の方法。
請求項 1一 10のいずれか一項に記載の方法により非ァミノ有機酸を製造する工程、 及び前記工程で得られた非ァミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、 非ァミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046389A1 (ja) * 2005-10-18 2007-04-26 Ajinomoto Co., Inc. コハク酸の製造方法
WO2007099867A1 (ja) * 2006-02-24 2007-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation 有機酸生産菌及び有機酸の製造法
WO2008143015A1 (ja) 2007-05-18 2008-11-27 Ajinomoto Co., Inc. コハク酸およびコハク酸アンモニウム溶液の製造方法
US7763447B2 (en) 2003-08-28 2010-07-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene
US7833763B2 (en) 2003-07-09 2010-11-16 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing organic acid
WO2011059031A1 (ja) * 2009-11-13 2011-05-19 三菱化学株式会社 非アミノ有機酸の製造方法
US7972823B2 (en) 2004-05-20 2011-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid
US7985566B2 (en) * 2005-04-22 2011-07-26 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
WO2011111693A1 (ja) 2010-03-09 2011-09-15 三菱化学株式会社 コハク酸の製造方法
WO2013069786A1 (ja) 2011-11-11 2013-05-16 三菱化学株式会社 コハク酸の製造方法
US9388433B2 (en) 2011-03-18 2016-07-12 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism
WO2019066017A1 (ja) * 2017-09-29 2019-04-04 株式会社親広産業 糖消費促進剤

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7301199B2 (en) * 2000-08-22 2007-11-27 President And Fellows Of Harvard College Nanoscale wires and related devices
EP1669459B1 (en) * 2003-09-30 2014-10-22 Ajinomoto Co., Inc. Method of purifying succinic acid from fermentation liquid
BRPI0510921A (pt) * 2004-05-20 2008-05-20 Ajinomoto Kk bactéria produtora de ácido succìnico e processo para produzir ácido succìnico
WO2008091627A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Genomatica, Inc. Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid
EP2188243A2 (en) 2007-08-10 2010-05-26 Genomatica, Inc. Methods for the synthesis of acrylic acid and derivatives from fumaric acid
EP2192189B1 (en) * 2007-08-23 2018-08-22 Mitsubishi Chemical Corporation Method for production of succinic acid at high temperatures
CN107090424A (zh) 2008-01-22 2017-08-25 基因组股份公司 利用合成气或其它气态碳源和甲醇的方法和有机体
WO2009111672A1 (en) 2008-03-05 2009-09-11 Genomatica, Inc. Primary alcohol producing organisms
EP2265709B1 (en) 2008-03-27 2017-11-08 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
AU2009242615A1 (en) * 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
CA2725549A1 (en) 2008-06-17 2009-12-23 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate
KR101767034B1 (ko) * 2008-12-02 2017-08-10 푸락 바이오켐 비.브이. １가 숙신산 염의 제조방법
BRPI0922276A2 (pt) 2008-12-16 2015-08-04 Genomatica Inc "organismo microbiano de ocorrência não-natural, e , método para produzir isopropanol, 4-hidroxibutirato,e, 1,4-butanodiol."
JP2012525156A (ja) 2009-04-30 2012-10-22 ゲノマチカ， インク． イソプロパノール、ｎ−ブタノール、及びイソブタノールの産生のための微生物
BRPI1013426A2 (pt) 2009-04-30 2016-11-08 Genomatica Inc organismos para produção de 1,3-butanodiol
EP2427544B1 (en) 2009-05-07 2019-07-17 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of adipate, hexamethylenediamine and 6-aminocaproic acid
AU2010248831A1 (en) 2009-05-15 2011-11-24 Genomatica, Inc. Organisms for the production of cyclohexanone
EP2440669A4 (en) 2009-06-10 2013-08-28 Genomatica Inc MICROOGANISMS AND PROCEDURES FOR THE CARBON EFFECTIVE BIOSYNTHESIS MEK AND 2-BUTANOL
WO2011017560A1 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Genomatica, Inc. Semi-synthetic terephthalic acid via microorganisms that produce muconic acid
MX2012003025A (es) 2009-09-09 2012-06-27 Genomatica Inc Microorganismos y metodos para la co-produccion de isopropanol con alcoholes, dioles y acidos primarios.
CN102762735B (zh) 2009-10-13 2016-08-03 基因组股份公司 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法
EP2491125A4 (en) 2009-10-23 2014-04-23 Genomatica Inc MICROORGANISMS FOR ANILINE PRODUCTION
MX2012006602A (es) 2009-12-10 2012-08-01 Genomatica Inc Metodos y organismos para convertir el gas de sintesis u otras fuentes de carbono gaseoso y metanol a 1, 3 - butanodiol.
WO2011082378A2 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Myriant Technologies Llc Purification of succinic acid from the fermentation broth containing ammonium succinate
KR20120123742A (ko) 2010-01-29 2012-11-09 게노마티카 인코포레이티드 Ｐ-톨루에이트 및 테레프탈레이트 생합성 미생물 및 생합성 방법
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US9023636B2 (en) 2010-04-30 2015-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene
EP2566969B1 (en) 2010-05-05 2019-09-04 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of butadiene
CN103025877A (zh) 2010-07-26 2013-04-03 基因组股份公司 用于生物合成芳族化合物、2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯的微生物和方法
CA2807102C (en) * 2010-07-31 2018-08-21 Myriant Corporation Improved fermentation process for the production of organic acids
AU2013334175B2 (en) 2012-10-26 2017-09-28 Massachusetts Institute Of Technology Humidity control in chemical reactors
SG11201502917TA (en) * 2012-10-26 2015-05-28 Massachusetts Inst Technology Control of carbon dioxide levels and ph in small volume reactors
CA3173080A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Sanofi Small volume bioreactors with substantially constant working volumes and associated systems and methods

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0372891A (ja) * 1989-08-11 1991-03-28 Nippon Synthetic Chem Ind Co Ltd:The ソルビン酸の製造方法
JPH11196888A (ja) * 1998-01-16 1999-07-27 Mitsubishi Chemical Corp ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法
JP2000037196A (ja) * 1998-07-24 2000-02-08 Musashino Chemical Laboratory Ltd アンモニア耐性ｌ（＋）−乳酸産生能菌およびｌ（＋）−乳酸の生産方法
JP2003199522A (ja) * 2002-01-09 2003-07-15 Inobakkusu Kk 食用調味料
JP2003235592A (ja) * 2002-02-13 2003-08-26 Mitsubishi Chemicals Corp 有機酸の製造方法

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4282255A (en) * 1979-06-28 1981-08-04 State Of Oregon, By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Method and starter compositions for the growth of acid producing bacteria and bacterial compositions produced thereby
JPS61209596A (ja) 1985-03-12 1986-09-17 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 固定化微生物による有機酸の製法
JPH0636746B2 (ja) 1985-08-24 1994-05-18 味の素株式会社 Ｌ―グルタミン酸の製造方法
JPH0796522B2 (ja) 1986-04-08 1995-10-18 軽質留分新用途開発技術研究組合 カルボン酸アンモニウム水溶液からのカルボン酸の製造法
JPS62238232A (ja) 1986-04-09 1987-10-19 Res Assoc Util Of Light Oil カルボン酸アンモニウム水溶液からのカルボン酸の製造法
ES2036188T3 (es) 1986-06-11 1993-05-16 Michigan Biotechnology Institute Un procedimiento para la produccion de acido succinico por fermentacion anaerobia.
US5143834A (en) 1986-06-11 1992-09-01 Glassner David A Process for the production and purification of succinic acid
US5168055A (en) * 1986-06-11 1992-12-01 Rathin Datta Fermentation and purification process for succinic acid
US5034105A (en) 1989-07-27 1991-07-23 Michigan Biotechnology Institute Carboxylic acid purification and crystallization process
US5142834A (en) * 1990-07-12 1992-09-01 Donnelly Corporation Vehicle trim assembly and fastener therefor
US5132456A (en) * 1991-05-07 1992-07-21 The Regents Of The University Of California Sorption of carboxylic acid from carboxylic salt solutions at PHS close to or above the pKa of the acid, with regeneration with an aqueous solution of ammonia or low-molecular-weight alkylamine
JP2526836B2 (ja) 1991-08-23 1996-08-21 味の素株式会社 酢酸資化性遺伝子
JP2844511B2 (ja) 1993-09-02 1999-01-06 味の素株式会社 酢酸資化性遺伝子及びその利用
JP3394593B2 (ja) 1994-05-11 2003-04-07 昭和高分子株式会社 生分解性脂肪族ポリエステルの製造方法
US5504004A (en) * 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
US5770435A (en) * 1995-11-02 1998-06-23 University Of Chicago Mutant E. coli strain with increased succinic acid production
US5869301A (en) * 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
KR19990013007A (ko) * 1997-07-31 1999-02-25 박원훈 형질전환된 대장균 ｓｓ373(ｋｃｔｃ 8818ｐ)과 이를 이용한숙신산의 생산방법
US5958744A (en) * 1997-08-18 1999-09-28 Applied Carbochemicals Succinic acid production and purification
JP4197754B2 (ja) 1997-10-09 2008-12-17 三菱化学株式会社 乳酸又はコハク酸の製造方法
JP3480274B2 (ja) 1997-10-29 2003-12-15 三菱化学株式会社 脂肪族ポリエステル共重合体の製造方法
JPH11196887A (ja) 1998-01-16 1999-07-27 Mitsubishi Chemical Corp ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法
JP4074365B2 (ja) 1998-01-28 2008-04-09 三菱化学株式会社 ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子及び該遺伝子破壊株
US20030087381A1 (en) * 1998-04-13 2003-05-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
EP1073722B1 (en) 1998-04-13 2010-02-17 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells
DE19951975A1 (de) * 1999-10-28 2001-05-03 Degussa Neue für das poxB-Gen codierende Nuleotidsequenzen
DE19959650A1 (de) 1999-12-10 2001-06-13 Degussa Neue für die Gene sdhA, sdhB und sdhC codierende Nukleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US6670505B1 (en) 2000-03-07 2003-12-30 Eastman Chemical Company Process for the recovery of organic acids from aqueous solutions
US6911329B2 (en) * 2000-09-23 2005-06-28 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of D-pantothenic acid using coryneform bacteria
EP1320586B1 (en) 2000-09-30 2004-08-25 Degussa AG Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria
AU2002215910A1 (en) 2000-11-04 2002-05-15 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
DE10112102A1 (de) 2001-03-14 2002-09-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
US6743610B2 (en) * 2001-03-30 2004-06-01 The University Of Chicago Method to produce succinic acid from raw hydrolysates
JP2002291477A (ja) 2001-03-30 2002-10-08 Mitsubishi Chemicals Corp フマラーゼをコードするｄｎａ及びその利用
DE60216029T2 (de) * 2001-09-26 2007-06-21 Kabushiki Kaisha Toshiba Copolymer-Harzzusammensetzung und Verfahren zu seiner Herstellung
JP3754014B2 (ja) 2001-09-26 2006-03-08 株式会社東芝 共重合体樹脂組成物およびその製造方法
DE10154175A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Homeostase-und Adaptions-Proteine codieren
JP4032765B2 (ja) 2002-02-13 2008-01-16 三菱化学株式会社 有機酸の製造方法
JP4469568B2 (ja) 2003-07-09 2010-05-26 三菱化学株式会社 有機酸の製造方法
CN100575496C (zh) * 2003-08-28 2009-12-30 三菱化学株式会社 产生琥珀酸的方法
EP1669459B1 (en) 2003-09-30 2014-10-22 Ajinomoto Co., Inc. Method of purifying succinic acid from fermentation liquid
WO2005113744A1 (ja) 2004-05-20 2005-12-01 Ajinomoto Co., Inc. コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法
BRPI0510921A (pt) 2004-05-20 2008-05-20 Ajinomoto Kk bactéria produtora de ácido succìnico e processo para produzir ácido succìnico

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0372891A (ja) * 1989-08-11 1991-03-28 Nippon Synthetic Chem Ind Co Ltd:The ソルビン酸の製造方法
JPH11196888A (ja) * 1998-01-16 1999-07-27 Mitsubishi Chemical Corp ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子組み換え菌体による有機酸の製造法
JP2000037196A (ja) * 1998-07-24 2000-02-08 Musashino Chemical Laboratory Ltd アンモニア耐性ｌ（＋）−乳酸産生能菌およびｌ（＋）−乳酸の生産方法
JP2003199522A (ja) * 2002-01-09 2003-07-15 Inobakkusu Kk 食用調味料
JP2003235592A (ja) * 2002-02-13 2003-08-26 Mitsubishi Chemicals Corp 有機酸の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1672067A4 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833763B2 (en) 2003-07-09 2010-11-16 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing organic acid
US7763447B2 (en) 2003-08-28 2010-07-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene
US7972823B2 (en) 2004-05-20 2011-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid
US8021864B2 (en) 2005-04-22 2011-09-20 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
US9080009B2 (en) 2005-04-22 2015-07-14 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
US11732087B2 (en) 2005-04-22 2023-08-22 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
US10870727B2 (en) 2005-04-22 2020-12-22 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
US10287393B2 (en) 2005-04-22 2019-05-14 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
US7985566B2 (en) * 2005-04-22 2011-07-26 Mitsubishi Chemical Corporation Biomass-resource-derived polyester and production process thereof
JP5088136B2 (ja) * 2005-10-18 2012-12-05 味の素株式会社 コハク酸の製造方法
US7829316B2 (en) 2005-10-18 2010-11-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for production of succinic acid
WO2007046389A1 (ja) * 2005-10-18 2007-04-26 Ajinomoto Co., Inc. コハク酸の製造方法
WO2007099867A1 (ja) * 2006-02-24 2007-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation 有機酸生産菌及び有機酸の製造法
US8034975B2 (en) 2007-05-18 2011-10-11 Ajinomoto Co., Inc. Method of manufacturing succinic acid and ammonium succinate solutions
WO2008143015A1 (ja) 2007-05-18 2008-11-27 Ajinomoto Co., Inc. コハク酸およびコハク酸アンモニウム溶液の製造方法
JP5810412B2 (ja) * 2009-11-13 2015-11-11 三菱化学株式会社 非アミノ有機酸の製造方法
WO2011059031A1 (ja) * 2009-11-13 2011-05-19 三菱化学株式会社 非アミノ有機酸の製造方法
WO2011111693A1 (ja) 2010-03-09 2011-09-15 三菱化学株式会社 コハク酸の製造方法
US9388433B2 (en) 2011-03-18 2016-07-12 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism
US10077456B2 (en) 2011-03-18 2018-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism
WO2013069786A1 (ja) 2011-11-11 2013-05-16 三菱化学株式会社 コハク酸の製造方法
WO2019066017A1 (ja) * 2017-09-29 2019-04-04 株式会社親広産業 糖消費促進剤
JPWO2019066017A1 (ja) * 2017-09-29 2020-10-22 株式会社親広産業 糖消費促進剤

Also Published As

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