JPWO2005026349A1 - 非アミノ有機酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び/又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
(2)1価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び/又は水酸化マグネシウムで中和しながら前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
(3)1価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、(2)の方法。
(4)嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5)前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、(1)〜(4)のいずれかの方法。
(6)有機原料がグルコース又はシュークロースである、(1)〜(5)のいずれかの方法。
(7)非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、(1)〜(6)のいずれかの方法。
(8)前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて10%以下に低減化するように改変された細菌である、(1)〜(7)のいずれかの方法。
(9)前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび/又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、(1)〜(7)のいずれかの方法。
(10)前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて10%以下に低減化し、さらにフマル酸レダクターゼおよび/又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、(1)〜(7)のいずれかの方法。
(11)(1)〜(10)のいずれかの方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター)(〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P−3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP−1497の受託番号で寄託されている。
マウス[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90,1766−1779,(1993)]
ラット[GENE,165,331−332,(1995)]
酵母;
サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
[Mol.Gen.Genet.,229,307−315,(1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)
[DDBJ Accession No.;D78170]
バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)
[GENE,191,47−50,(1997)]
リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)
[J.Bacteriol.,178,5960−5970,(1996)]
1価カチオン添加の際は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等、1価カチオンの水酸化物として添加することができるが、1価カチオンの塩として添加することが好ましく、アンモニウムイオンの塩としては、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等が、ナトリウムイオンの塩としては、炭酸水素ナトリウム等が、カリウムイオンの塩としては、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
1価カチオンの塩を添加する場合は、通常、粉末状態で添加するか、その懸濁液または水溶液として添加することが好ましい。また、水酸化アンモニウムを添加する場合は、アンモニア水として添加してもよいし、気体として反応液中に通気することにより添加することもできる。
1価カチオンの添加濃度としては、アンモニウムイオンとしては、0.001M〜2M、好ましくは0.01M〜1Mであり、ナトリウムイオンとしては、0.001M〜2M、好ましくは0.01M〜1Mであり、カリウムイオンとしては、0.001M〜2M、好ましくは0.01M〜1Mである。
1価カチオンの添加時期としては、反応開始時に添加してもよいし、反応途中で連続的、逐次的あるいは間欠的に添加してもよい。連続的に反応液を使用する場合は、反応液に既に添加されている1価カチオンの量を考慮し、1価カチオンの反応液中の濃度が前記した好ましい濃度になるように添加することが好ましい。
実施例1
(A)枯草菌ゲノムDNAの抽出
LB培地[組成:トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5gを蒸留水1Lに溶解]10mLに、枯草菌(Bacillus subtilis ISW1214)を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を10mg/mLの濃度にリゾチームを含む10mM NaCl−20mMトリス緩衝液(pH8.0)−1mM EDTA・2Na溶液0.15mLに懸濁した。
枯草菌SacB遺伝子の取得は、上記(A)で調製したDNAを鋳型とし、既に報告されている該遺伝子の塩基配列(GenBank Database Accession No.X02730)を基に設計した合成DNA(配列番号1および配列番号2)を用いたPCRによって行った。
大腸菌プラスミドベクターpHSG396(宝酒造:クロラムフェニコール耐性マーカー)500ngに制限酵素PshBI10unitsを37℃で一時間反応させた後、フェノール/クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント(Klenow Fragment:宝酒造製)により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いてMluIリンカー(宝酒造)を連結、環状化させ、大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を34μg/mLクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドDNAを調製し、制限酵素MluIの切断部位を有するクローンを選抜し、pHSG396Mluと命名した。
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターpHSG299(宝酒造:カナマイシン耐性マーカー)のDNAを鋳型とし、配列番号3および配列番号4で示した合成DNAをプライマーとしたPCR法によって行った。反応液組成:鋳型DNA1ng、PyrobestDNAポリメラーゼ(宝酒造)0.1μL、1倍濃度添付バッファー、0.5μM各々プライマー、0.25μMdNTPsを混合し、全量を20μLとした。
上記(C)で構築したpCMB1を制限酵素Van91IおよびScaIで切断して得られた約3.5kbのDNA断片を0.75%アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記(D)で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いて連結し、得られたプラスミドDNAで大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地に塗抹した。
実施例2
(A)ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株ゲノムDNAの抽出
A培地[尿素2g、(NH4)2SO47g、KH2PO40.5g、K2HPO40.5g、MgSO4・7H2O0.5g、FeSO4・7H2O6mg、MnSO4・4−5H2O6mg、ビオチン200μg、チアミン100μg、イーストエキストラクト1g、カザミノ酸1g、グルコース20g、蒸留水1Lに溶解]10mLに、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例1の(A)に示す方法にてゲノムDNAを調製した。
MJ233株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記(A)で調製したDNAを鋳型とし、特開平11−206385に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成DNA(配列番号5および配列番号6)を用いたPCRによって行った。反応液組成:鋳型DNA1μL、TaqDNAポリメラーゼ(宝酒造)0.2μL、1倍濃度添付バッファー、0.2μM各々プライマー、0.25μMdNTPsを混合し、全量を20μLとした。
上記(B)で作製したpGEMT/CgLDHを制限酵素EcoRVおよびXbaIで切断することにより約0.25kbからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約3.7kbのDNA断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いて環状化させ、大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を50μg/mLアンピシリンを含むLB寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドDNAを制限酵素SacIおよびSphIで切断することにより、約0.75kbの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをpGEMT/ΔLDHと命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233株の形質転換に用いるプラスミドDNAは、pKMB1/ΔLDHを用いて塩化カルシウム法(Journal of Molecular Biology,53,159,1970)により形質転換した大腸菌JM110株から調製した。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233−ES株の形質転換は、電気パルス法(Res.Microbiol.、Vol.144,p.181−185,1993)によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mLを含むLBG寒天培地[トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5g、グルコース20g、及び寒天15gを蒸留水1Lに溶解]に塗抹した。
上記(D)で作製したブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔLDH株をA培地に植菌し、30℃で15時間好気的に振とう培養した。得られた培養物を遠心分離(3,000×g、4℃、20分間)して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液[組成:50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)]で洗浄した。
実施例3
(A)コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平7−95891の配列番号4に記載のDNA断片(以降TZ4プロモーターと称する)を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、実施例2の(A)で調製したブレビバクテリウム・フラバムMJ233ゲノムDNAを鋳型とし、特開平7−95891の配列番号4に記載の配列を基に設計した合成DNA(配列番号9および配列番号10)を用いたPCRによって行った。
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平12−93183記載のpHSG298par−repを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスIFO12144株が保有する天然型プラスミドpBY503の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターpHSG298(宝酒造)に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。
実施例4
(A)ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、<実施例2>の(A)で調製したDNAを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株の該遺伝子の配列(GenBank Database Accession No.AP005276)を基に設計した合成DNA(配列番号13および配列番号14)を用いたPCRによって行った。
上記(A)で作製したpGEM/MJPCを制限酵素PacIおよびApaIで切断することにより生じる約3.7kbからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、0.75%アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このDNA断片を、制限酵素PacIおよびApaIにて切断した<実施例3>にて構築したpTZ4と混合し、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミドDNAで大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドDNAを制限酵素PacIおよびApaIで切断することにより、約3.7kbの挿入断片が認められたものを選抜し、これをpMJPC1と命名した(図4)。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233株内で複製可能なpMJPC1による形質転換用のプラスミドDNAは、上記(B)で形質転換した大腸菌(DH5α株)から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔLDH株への形質転換は、電気パルス法(Res.Microbiol.、Vol.144,p.181−185,1993)によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mLを含むLBG寒天培地[トリプトン10g、イーストエキストラクト5g、NaCl5g、グルコース20g、及び寒天15gを蒸留水1Lに溶解]に塗抹した。
上記(C)で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/PC/ΔLDH株をグルコース2%、カナマイシン25mg/Lを含むA培地100mLで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)50mlで洗浄し、同組成の緩衝液20mLに再度懸濁させた。懸濁液をSONIFIER 350(BRANSON製)で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は100mM Tris/HCl緩衝液(pH7.5)、0.1mg/10mLビオチン、5mM塩化マグネシウム、50mM炭酸水素ナトリウム、5mMピルビン酸ナトリウム、5mMアデノシン3リン酸ナトリウム、0.32mM NADH、20units/1.5mlリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(WAKO製、酵母由来)及び酵素を含む反応液中で25℃で反応させることにより行った。1Uは1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼを発現させた無細胞抽出液における比活性は0.2U/mg−蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△LDH株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、本活性測定方法によりピルベートカルボキシラーゼ活性は検出されなかった。
実施例5
(A)大腸菌DNA抽出
LB培地10mLに、大腸菌(Eschericia coli)JM109株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記実施例1(A)に示す方法にてゲノムDNAを調製した。
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記(A)で調製したDNAを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌K12−MG1655株の該遺伝子の配列(GenBank Database Accession No.U00096)を基に設計した合成DNA(配列番号17および配列番号18)を用いたPCRによって行った。反応液組成:鋳型DNA1μL、PfxDNAポリメラーゼ(インビトロジェン社製)0.2μL、1倍濃度添付バッファー、0.3μM各々プライマー、1mM MgSO4、0.25μMdNTPsを混合し、全量を20μLとした。反応温度条件:DNAサーマルサイクラー MJResearch社製PTC−200を用い、94℃で20秒、68℃で4分からなるサイクルを35回繰り返した。但し、1サイクル目の94℃での保温は1分20秒、最終サイクルの68℃での保温は10分とした。PCR反応終了後、Takara Ex Taq(宝酒造)を0.1μL加え、さらに72℃で30分保温した。
実施例6
(A)pMJPC1の制限酵素部位改変
実施例3にて構築したpMJPC1を制限酵素KpnIにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ(Alkaline Phosphatase Calf intestine:宝酒造)を反応させて5’末端を脱リン酸化処理して調製したDNA断片に、5’末端がリン酸化された合成DNA(配列番号24および配列番号25)から成るDNAリンカーを混合し、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミドDNAで大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドDNAを精製した。得られたプラスミドDNAから制限酵素NdeIによって切断されるものを選抜し、これをpMJPC1.1と命名した
実施例5にて作製したpFRD6.0を制限酵素HindIIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素KpnIで切断して生じた約3.9kbのDNA断片を0.75%アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記(A)で作製したpMJPC1.1を制限酵素NdeIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素KpnIで切断することによって調製したDNAと混合し、ライゲーションキットver.2(宝酒造製)を用いて連結後、得られたプラスミドDNAで大腸菌(DH5α株)を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を50μg/mLカナマイシンを含むLB寒天培地に塗抹した。
pFRPC1.1を用いたブレビバクテリウム・フラバムMJ233/ΔLDH株の形質転換は、実施例4の(C)に記載の方法にて行い、プラスミドpFRPC1.1を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムMJ233/FRD/PC/ΔLDH株と命名した。
上記(B)で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムMJ233/FRD/PC/ΔLDH株をグルコース2%、カナマイシン25mg/Lを含むA培地100mLで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)50mLで洗浄し、同組成の緩衝液20mlに再度懸濁させた。懸濁液をSONIFIER 350(BRANSON製)で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いフマレートリダクターゼ活性を測定した。酵素活性の測定は33mM Tris塩酸緩衝液(pH7.5)、0.1mM EDTA、20mMコハク酸Na、2mM K3Fe(CN)6及び酵素を含む反応液中で25℃で反応させることにより行った。1Uは1分間に2μmolのK3Fe(CN)6の減少を触媒する酵素量とした。プラスミドpFRPC1.1を発現させた無細胞抽出液におけるフマレートリダクターゼ比活性は0.02U/mg−蛋白質であった。なお親株であるMJ233/△LDH株をA培地を用いて同様に培養した菌体では、比活性は0.01U/mg−蛋白質であった。
実施例7
尿素:4g、硫酸アンモニウム:14g、リン酸1カリウム:0.5g、リン酸2カリウム0.5g、硫酸マグネシウム・7水和物:0.5g、硫酸第一鉄・7水和物:20mg、硫酸マンガン・水和物:20mg、D−ビオチン:200μg、塩酸チアミン:200μg、酵母エキス:1g、カザミノ酸:1g、及び蒸留水:1000mLの培地100mLを500mLの三角フラスコにいれ、120℃、20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した50%グルコース水溶液を4mL、無菌濾過した5%カナマイシン水溶液を50μL添加し、実施例6で作製したブレビバクテリウム・フラバムMJ233/FRD/PC/ΔLDH株を接種して24時間30℃にて種培養した。尿素:12g、硫酸アンモニウム:42g、リン酸1カリウム:1.5g、リン酸2カリウム1.5g、硫酸マグネシウム・7水和物:1.5g、硫酸第一鉄・7水和物:60mg、硫酸マンガン・水和物:60mg、D−ビオチン:600μg、塩酸チアミン:600μg、酵母エキス3g、カザミノ酸3g、消泡剤(アデカノールLG294:旭電化製):1mL及び蒸留水:2500mLの培地を5Lの発酵糟に入れ、120℃、20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した12%グルコース水溶液を500mL添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、30℃に保温した。通気は毎分500mL、攪拌は毎分500回転で培養を行った。12時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
実施例8
硫酸マグネシウム・7水和物:0.2g、硫酸第一鉄・7水和物:8mg、硫酸マンガン・水和物:8mg、D−ビオチン:80μg、塩酸チアミン:80μg、消泡剤(アデカノールLG294:旭電化製):1mL及び蒸留水:200mLの培地を500mLの三角フラスコに入れ、120℃、20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記実施例7と同様の方法により得られた培養液を8000rpm、5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、O.D.(660nm)が200になるように再懸濁した。この懸濁液200mLとあらかじめ滅菌した30%グルコース溶液200mLを1Lのジャーファーメンターに入れ、35℃に保温した。pHが6.8に保たれるように4M水酸化マグネシウム水溶液を断続的に添加し、毎分100mLで通気、毎分400回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後46時間における平均糖消費速度は3.22g/L/hであり、コハク酸生産速度は1.38g/L/h、収率は72%であった。
実施例9
(A)菌体の調製
実施例4で作製したブレビバクテリウム・フラバムMJ233/PC/ΔLDH株を実施例7と同様にして種培養を行った。グルコース:100g、硫酸マグネシウム・7水和物:0.5g、正リン酸:0.65g、大豆タンパク加水分解液(全窒素含量35g/L):14.3mL、硫酸アンモニウム:1.0g、硫酸第一鉄・7水和物:20mg、硫酸マンガン・水和物:20mg、D−ビオチン:1mg、塩酸チアミン:1mg及び消泡剤(GD−113:日本油脂社製):0.05mLを1L中に含む培地を150L作製し、pHを1N KOHで6.5に調整した後、300Lのジャーファーメンターに入れ、120℃、20分加熱滅菌した。冷却後、前述の種培養液を450mL接種して30℃に保温した。通気は毎分113L、圧力は50kPa、攪拌は毎分280回転で、pHをアンモニアガスにて7.6に調整しながら20時間前培養を行った。
菌体懸濁液を遠心分離してさらに濃縮し、乾燥菌体重が約120g/Lとなるように遠心上清を用いて調製した。グルコース:150g、硫酸マグネシウム・7水和物:0.5gを蒸留水に溶解して300mLとし、120℃、20分加熱滅菌した。また、正リン酸:0.65g、大豆タンパク加水分解液(全窒素含量35g/L):2.9mL、硫酸第一鉄・7水和物:20mg、硫酸マンガン・水和物:20mg、D−ビオチン:1mg、塩酸チアミン:1mg及び消泡剤(GD−113):0.05mLを約300mLの蒸留水に溶解し、pHを5Nの水酸化カリウム溶液で6.5に調整した後、蒸留水で450mLにメスアップし、120℃、20分加熱滅菌した。上記のグルコース溶液120mLと培地180mLを混合して1Lのジャーファーメンターに入れ、前述の乾燥菌体重が約120g/Lの懸濁液を100mL接種して30℃に保温した。液上面より二酸化炭素を毎分20mL通気し、攪拌は毎分400回転で、pHを2.5Mの水酸化マグネシウム溶液、5Mの水酸化ナトリウム溶液、5Mの水酸化カリウム溶液、または5Mのアンモニア水で、それぞれ7.3に調整しながら反応を行った。反応開始後14時間目のコハク酸蓄積、コハク酸生産速度及び収率は以下の表のとおりであった。
実施例10
上記実施例7と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mol/Lとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して反応を行った。反応開始後20時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表2の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度及びコハク酸生産速度が大幅に上昇することが明らかになった。
上記実施例7と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mol/Lとなるように炭酸水素ナトリウムを添加して反応を行った。反応開始後20時間における糖消費速度、コハク酸生産速度、収率は表3の通りになった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素ナトリウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が大幅に上昇することが明らかになった。
硫酸マグネシウム・7水和物:0.2g、硫酸第一鉄・7水和物:8mg、硫酸マンガン・水和物:8mg、D−ビオチン:80μg、塩酸チアミン:80μg、消泡剤(アデカノールLG294:旭電化製):1mL及び蒸留水:200mLの培地を500mLの三角フラスコに入れ、120℃、20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記7と同様の方法により得られた培養液を8000rpm、5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、O.D.(660nm)が200になるように再懸濁した。この懸濁液200mLとあらかじめ滅菌した30%グルコース溶液200mLを1Lのジャーファーメンターに入れ、4炭酸マグネシウム1水酸化マグネシウム5水和物:58.284gを添加して混合した。この反応用懸濁液を35℃に保温し、毎分100mLで通気、毎分400回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約16時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は9.80g/L/hであり、コハク酸生産速度は8.78g/L/h、収率は96%であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応によって、糖消費速度、コハク酸生産速度、収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例13
上記実施例12と同様に反応用懸濁液を調製し、これに再終濃度を0.1mol/Lとなるように炭酸水素アンモニウムを添加して同様に反応を行った。反応開始後約10時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は15.2g/L/hであり、コハク酸生産速度は12.6g/L/h、収率は92%であった。これにより、炭酸マグネシウム中和反応において、炭酸水素アンモニウムを適量添加することにより、糖消費速度、コハク酸生産速度及び収率が顕著に上昇することがジャー培養において確認された。
実施例14
硫酸マグネシウム・7水和物:0.2g、硫酸第一鉄・7水和物:8mg、硫酸マンガン・水和物:8mg、D−ビオチン:80μg、塩酸チアミン:80μg、消泡剤(アデカノールLG294:旭電化製):1mL及び蒸留水:200mLの培地を500mLの三角フラスコに入れ、120℃、20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記7と同様の方法により得られた培養液を8000rpm、5分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、O.D.(660nm)が60になるように再懸濁した。この懸濁液200mLとあらかじめ滅菌した20%シュークロース溶液200mLを1Lのジャーファーメンターに入れ、4炭酸マグネシウム1水酸化マグネシウム5水和物:38.8g、炭酸水素アンモニウム3.2gを添加して混合した。この反応用懸濁液を35℃に保温し、毎分400回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約20時間でシュークロースがほぼ消費されていた。糖消費速度は5g/L/hであり、コハク酸生産速度は4.6g/L/h、収率は91%であった。
<炭酸アンモニウム中和による反応(ジャーファーメンター)>
尿素:4g、硫酸アンモニウム:14g、リン酸1カリウム:0.5g、リン酸2カリウム0.5g、硫酸マグネシウム・7水和物:0.5g、硫酸第一鉄・7水和物:20mg、硫酸マンガン・水和物:20mg、D−ビオチン:200μg、塩酸チアミン:200μg、酵母エキス:1g、カザミノ酸:1g、及び蒸留水:1000mLの培地100mLを500mLの三角フラスコにいれ、120℃、20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した50%グルコース水溶液を4mL、無菌濾過した5%カナマイシン水溶液を50μL添加し、実施例6(B)で作製したブレビバクテリウム・フラバムMJ233/FRD/PC/ΔLDH株を接種して24時間30℃にて種培養した。尿素:12g、硫酸アンモニウム:42g、リン酸1カリウム:1.5g、リン酸2カリウム1.5g、硫酸マグネシウム・7水和物:1.5g、硫酸第一鉄・7水和物:60mg、硫酸マンガン・水和物:60mg、D−ビオチン:600μg、塩酸チアミン:600μg、酵母エキス3g、カザミノ酸3g、消泡剤(アデカノールLG294:旭電化製):1mL及び蒸留水:2500mLの培地を5Lの発酵糟に入れ、120℃、20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した12%グルコース水溶液を500mL添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、30℃に保温した。通気は毎分500mL、攪拌は毎分500回転で培養を行った。12時間後にグルコースがほぼ消費されていた。
<炭酸ナトリウム中和による反応(ジャーファーメンター)>
上記比較例1と同様に反応用懸濁液を調製し、pHを2M炭酸ナトリウムを用いて7.6に保ち、同様に反応を行った。反応開始後約12時間でグルコースがほぼ消費されていた。糖消費速度は13g/L/hであり、コハク酸生産速度は7.2g/L/h、収率は95%であった。
Claims (11)
- 水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び/又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
- 1価カチオンを含有する水性媒体中でコリネ型細菌の菌体またはその処理物を有機原料に反応させて該有機原料から非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を採取する工程を含む非アミノ有機酸の製造方法であって、前記水性媒体を炭酸マグネシウム及び/又は水酸化マグネシウムで中和しながら、前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする方法。
- 1価カチオンがアンモニウムイオンまたはナトリウムイオンである、請求項2に記載の方法。
- 嫌気的雰囲気下で前記菌体または処理物を有機原料に反応させることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記水性媒体が炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機原料がグルコース又はシュークロースである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 非アミノ有機酸がコハク酸、リンゴ酸又はフマル酸である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて10%以下に低減化するように改変された細菌である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、フマル酸レダクターゼおよび/又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて10%以下に低減化し、さらに、フマル酸レダクターゼおよび/又はピルビン酸カルボキシラーゼの活性が増強するように改変された細菌である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び前記工程で得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行う工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
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