WO2005113744A1 - コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法 - Google Patents

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WO2005113744A1
WO2005113744A1 PCT/JP2005/009232 JP2005009232W WO2005113744A1 WO 2005113744 A1 WO2005113744 A1 WO 2005113744A1 JP 2005009232 W JP2005009232 W JP 2005009232W WO 2005113744 A1 WO2005113744 A1 WO 2005113744A1
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activity
strain
succinic acid
coryneform bacterium
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PCT/JP2005/009232
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Keita Fukui
Jun Nakamura
Hiroyuki Kojima
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Ajinomoto Co., Inc.
Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02001—Acetyl-CoA hydrolase (3.1.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/16—Dicarboxylic acids and dihydroxy compounds

Definitions

  • the present invention relates to the fermentation industry, and relates to a method for efficiently producing succinic acid by a fermentation method using coryneform bacteria.
  • Anaerobic bacteria such as the genus Anaerobiospirillum (Anaerobiospirillum) and the genus Actinobacillus (Actinobacillus) have been used (see Patent Documents 1 and 2 or Non-Patent Document 1).
  • anaerobic bacteria When anaerobic bacteria are used, the product yield is high, but on the other hand, large amounts of organic compounds such as CSL (corn steep liquor) are required in the medium due to the need for many nutrients to grow. It is necessary to add a nitrogen source. Adding a large amount of these organic nitrogen sources not only raises the cost of culture but also raises the cost of refining when extracting products, which is not economical.
  • Aerobic bacteria such as coryneform bacteria
  • the cells are grown, then collected, washed, and produced as quiescent cells without aeration with oxygen to produce succinic acid.
  • Patent Documents 3 and 4 There is also a known method (see Patent Documents 3 and 4).
  • the amount of organic succinic acid to be produced, the production concentration, and the cell concentration are economical because the amount of organic nitrogen added is small and the cells can be sufficiently grown in a simple medium.
  • improvement such as improvement of the production speed per unit and simplification of the manufacturing process.
  • Patent Document 8 a method for producing succinic acid using Escherichia coli deficient in phosphoacetyltransferase (pta) and ratate dehydrogenase (ldh) ( Patent Document 8), an amino acid production method using an intestinal bacterial group deficient in pyruvate oxidase (poxB), and D-pantothenic acid using an enteric bacterial group deficient in pyruvate oxidase (poxB) A method for producing is known (see Patent Document 9).
  • Acetate kinase (ack) and phosphotransacetylase (pta) have been reported as enzymes involved in acetic acid utilization of coryneform bacteria.
  • a plurality of enzymes such as pyruvate oxidase (poxB) (see Patent Document 10), acyl phosphatase (acp), aldehyde dehydrogenase, acetyl CoA-noidase and the like are involved. It is clear that which enzymes are contributing to acetic acid synthesis. Therefore, until now, there has been no known method for producing succinic acid by using a coryneform bacterium with a reduced acetic acid biosynthetic enzyme.
  • Acetyl-CoA nodose is an enzyme that produces acetic acid from acetyl-CoA and water
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,143,833
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,504,004
  • Patent Document 3 JP-A-11-113588
  • Patent Document 4 JP-A-11 196888
  • Patent Document 5 JP-A-11-206385
  • Patent Document 6 JP-A-6-14781
  • Patent Document 7 JP-A-7-67683
  • Patent Document 8 International Publication No. 99Z06532 pamphlet
  • Patent Document 9 International Publication No. 02Z36797 pamphlet
  • Patent Document 10 European Patent Application Publication No. 1096013
  • Patent Document 11 European Patent Application Publication No. 1108790
  • Non-Patent Document 2 Microbiology.1999 Feb; 145 (Pt 2): 503-13
  • An object of the present invention is to provide a coryneform bacterium having an improved ability to produce succinic acid.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that reducing acetyl-CoA hydrase activity in coryneform bacteria improves succinic acid-producing ability. I found it. In addition, they have found that by reducing phosphotransacetylase and acetate kinase activities in addition to acetyl-CoA nodulase activity, by-products of acetic acid are reduced, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a coryneform bacterium having a succinic acid-producing ability the coryneform bacterium being modified so that the activity of acetyl CoA nodose is reduced.
  • Coryneform bacterium according to (3) which is the DNA according to the following (a) or (b), (A) DNA containing a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1037 to 2542 of SEQ ID NO: 44, or
  • coryneform bacterium according to any one of (1) to (4), further modified so that the activity of one or both of phosphotransacetylase and acetate kinase is reduced.
  • the coryneform bacterium according to any one of (1) to (7) or a treated product thereof is allowed to act on an organic raw material in a reaction solution containing carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide, whereby the reaction is carried out.
  • a method for producing succinic acid comprising producing and accumulating succinic acid in a solution, and collecting succinic acid from the reaction solution.
  • a method for producing a succinic acid-containing polymer comprising a step of producing succinic acid by the method of (8) or (9) and a step of polymerizing the obtained succinic acid.
  • FIG. 1 shows a procedure for constructing plasmid pBS3.
  • FIG. 2 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS4S.
  • FIG. 3 is a view showing a procedure for constructing a plasmid pBS5T.
  • FIG. 4 is a view showing a procedure for constructing a plasmid p ⁇ ldh-l.
  • FIG. 5 is a diagram showing a procedure for constructing plasmid pBS5T :: ⁇ ack.
  • FIG. 6 is a diagram showing a procedure for constructing plasmid pBSCT :: ⁇ ptaack.
  • FIG. 7 is a view showing a procedure for constructing plasmid pBS5T :: ⁇ poxB.
  • FIG. 8 is a view showing a procedure for constructing plasmid pBS4S :: ⁇ ach.
  • coryneform bacterium includes bacteria which are conventionally classified into the genus Brevipacterium and are currently classified into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255). (1981)), and also includes bacteria of the genus Brevibataterirum, which is closely related to the genus Corynebacterium. Examples of such coryneform bacteria include the following.
  • succinic acid-producing ability refers to the ability to accumulate succinic acid in a medium when the coryneform bacterium of the present invention is cultured. This succinic acid-producing ability may be a property of a wild-type coryneform bacterium or a property imparted by breeding. Good.
  • coryneform bacterium having the ability to produce succinic acid include Brevibataterim. Flavam MJ233 ⁇ ldh strain having reduced ratatate dehydrogenase activity (JP-A-11-206385) and pyruvate carboxylase. Alternatively, Brevibataterum flavum MJ233 / pPCPYC strain (WO 01/27258 pamphlet, JP-A-11-196887) in which phosphoenol pyruvate carboxylase activity is enhanced, or Brevibatate terium flavum MJ-233 (FERM) BP—1497), MJ—233 AB—41 (FERM
  • Brevibataterim 'Ammoniagenes ATCC6872 Corynebacterium' Glutamicum ATCC31831 '
  • Brevibataterim' ratatofarmentum ATC C 13869 Brevibataterum 'Flavum' may now be classified as Corynebataterum 'glutamicum (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, KH, International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol.
  • the coryneform bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having the succinic acid-producing ability as described above, and a coryneform bacterium modified so as to reduce acetyl-CoA-noid-mouth enzyme activity.
  • ACH activity refers to an activity that catalyzes a reaction for producing acetic acid from acetyl-CoA and water.
  • Modified to reduce acetyl-CoA hydratase activity means that the activity of acetyl-CoA hydridase is lower than the specific activity of an unmodified strain, for example, a wild-type coryneform bacterium.
  • the ACH activity is preferably reduced to 50% or less per cell, preferably 30% or less, and more preferably 10% or less per cell, as compared to the unmodified strain.
  • a control wild type coryneform bacterium for example, as a wild type strain, Brevibataterium 'ratatofarmentum ATCC13869, and as a non-modified strain, as a wild type strain, Brevibataterium' ratatofarmentum Alddh Strains.
  • Acetyl CoA hydrase activity can be measured with reference to the method of Gergely J., et al. (Gergely J., Hele. P. & Ramkrishnan, CV (1952) J. Biol. Chem.
  • the coryneform bacterium of the present invention preferably has a lower acetyl-CoA-noidase activity than a wild-type strain or a non-modified strain, but further has an improved accumulation of succinic acid as compared to these strains. It is more desirable! / ,.
  • Examples of the acetyl CoA hydrase having the above activity include a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45.
  • a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45 As long as it has acetyl CoA nodulase activity, it has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 45. There may be. Here, several means, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5.
  • Modified to reduce acetyl-CoA hydrase activity means, for example, that the number of acetyl-CoA nodose enzymes per cell is reduced, or that acetyl-CoA hydrase per molecule is reduced. This corresponds to the case where the oral enzyme activity is reduced. Specifically, it can be achieved by deleting a gene encoding acetyl-CoA or idolase on a chromosome, or modifying an expression control sequence such as a promoter Shine-Dalgarno (SD) sequence.
  • SD Shine-Dalgarno
  • Examples of the acetyl-CoA noidal mouth gene on the chromosome include a DNA containing a base sequence consisting of base numbers 1037 to 2542 of SEQ ID NO: 44. Further, as long as it encodes a protein having acetyl CoA hydrolase activity, a base sequence consisting of base numbers 1037 to 2542 of SEQ ID NO: 44 or a base sequence having the same base sequence strength can be prepared. It may be DNA that hybridizes under lob and stringent conditions! “Stringent conditions” refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. It is difficult to numerically express this condition, but one example is 60. C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and a salt concentration corresponding to 0.1%, more preferably 2 to 3 times.
  • the acquisition of the acetyl CoA noidal mouth gene (hereinafter referred to as the ach gene) is carried out by the sequence of Corynebatadium 'glutamicum registered in GenBank (NCgl2480 of GenBank Accession No. NC_003450 (2729376..2730884th of NC_003450). Based on the complementary strand))), synthetic oligonucleotides can be synthesized and cloned by performing a PCR reaction using the chromosome of Corynebacterium 'daltamicum' as type I.
  • sequences of coryneform bacteria such as Brevibatatellium 'ratatofamentum, whose base sequence has been determined by the genome project in recent years, can also be used.
  • Chromosomal DNA can be obtained from bacteria that are DNA donors, for example, by the method of Saito and Miura. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Bioengineering Experiments, Japan Society for Biotechnology. Ed., Pp. 97-98, Baifukan, 1992).
  • the ach gene prepared as described above or a part thereof can be used for gene disruption.
  • the gene to be used for gene disruption is such that it undergoes homologous recombination with the ach gene on the chromosome DNA of the coryneform bacterium to be disrupted (for example, a gene having the nucleotide sequence of nucleotides 1037 to 2542 of SEQ ID NO: 44).
  • Such a homologous gene can also be used, as long as it has the same homology.
  • the homology at which homologous recombination occurs is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • homologous recombination can occur between DNAs capable of hybridizing with the above genes under stringent conditions.
  • Stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. It is difficult to clearly numerically I spoon this condition causes shows an example ⁇ or ,, 60 ° C, 1 X SSC , 0. 1 0/0 SDS, preferably ⁇ or, 0. 1 X SSC, 0.1 0/0 Ne th at those salt concentrations SDS, preferably include conditions of washing 2-3 times than once.
  • a modified ach gene modified so as not to produce a functional acetyl CoA hydrolase is produced, and a coryneform bacterium is transformed with the DNA containing the gene.
  • a coryneform bacterium is transformed with the DNA containing the gene.
  • the ach gene on the chromosome can be disrupted.
  • Such gene disruption by gene replacement using homologous recombination has already been established, and there are a method using linear DNA and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin (US Pat. No. 6,303,383). Specification or JP-A-05-007491).
  • Gene disruption by gene replacement using homologous recombination as described above can also be performed using a plasmid that does not have a replication ability on a host.
  • a plasmid for recombination is prepared by inserting a temperature-sensitive replication origin, a deletion type ach gene, a sacB gene encoding levan sucrose, and a marker gene showing drug resistance such as chloramuecole.
  • the SacB gene encoding levan sucrose is a gene used to efficiently select a strain from which the vector portion has been eliminated from the chromosome (Schafer. A. et al. Gene 145). (1994) 69-73). That is, in the case of coryneform bacterium, when levan eucase is expressed, levan produced by assimilating sucrose works lethally and cannot grow. Therefore, if the strain carrying the levan cyclase-loaded vector remaining on the chromosome is cultured on a sucrose-containing plate, it cannot grow, and only the strain from which the vector has been removed can be selected on the sucrose-containing plate.
  • sacB gene or its homologous gene a gene having the following sequence can be used.
  • Bacillus' subtilis sacB GenBank Accession Number X02730 (SEQ ID NO: 35)
  • Bacillus ami liquorifaciens sacB GenBank Accession Number X52988
  • Zymomonas mobilis sacB GenBank Accession Number L33402
  • Notyl's stearothermophilus surB GenBank Accession Number U34874 Lactobacillus ⁇ San Francisensis: frfA GenBank Accession Number AJ508391 acetopacta ⁇ ⁇ ⁇ Xylinas: lsxA GenBank Accession Number AB034152
  • a coryneform bacterium is transformed with the above-mentioned recombinant plasmid. Transformation may be performed according to the transformation method reported so far. For example, as described in Escherichia coli K-12, a method for increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with salt calcium (Mandel, M. and Higa. , J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), and a method for preparing DNA and introducing DNA by preparing a cell in a growth stage, such as that reported for Bacillus' subtilis (Dancan, CH, Wilson. GA and Young.
  • coryneform bacterium can also be transformed by the electric pulse method (Sugimoto et al., JP-A-2-207791).
  • the temperature-sensitive plasmids of coryneform bacteria include p48K and pSFKT2 (the
  • JP-A-2000-262288 pHSC4 (see French Patent Publication 1992 2667875, JP-A-5-7491), and the like.
  • These plasmids are capable of autonomous replication at least at 25 ° C in coryneform bacteria and cannot replicate autonomously at the power of 37 ° C.
  • Escherichia coli _112571 which retains pHSC4, was established on October 11, 1990 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Microorganisms Depositary) (Dai 305-5466 Japan).
  • the transformant obtained as described above is cultured at a temperature (25 ° C) in which the temperature-sensitive replication origin does not function, and a strain into which the plasmid has been introduced is obtained. Incubate the plasmid-introduced strain at high temperature to remove the temperature-sensitive plasmid, and spread the strain on a plate containing antibiotics. Since temperature-sensitive plasmids cannot replicate at high temperatures, strains from which plasmids have been eliminated cannot grow on plates containing antibiotics, but, with very low frequency, acetic acid biosynthesis genes on plasmids and chromosomes. A strain that has undergone recombination with the ach gene Appear.
  • the strain in which the recombinant DNA has been integrated into the chromosome thus undergoes recombination with the ach gene sequence originally present on the chromosome, and two fusion genes of the chromosomal ach gene and the deletion type ach gene are obtained. It is inserted into the chromosome with the other part of the recombinant DNA (vector part, temperature-sensitive replication origin and drug resistance marker) interposed therebetween.
  • the normal ach gene is left on the chromosomal DNA and the deleted ach gene is cut out, and conversely, the deleted ach gene is left on the chromosome DNA and the normal ach gene is cut out.
  • the cut DNA is retained in the cells in the form of a plasmid.
  • the ach gene on the plasmid loses its cellular power along with the plasmid. Then, a strain in which the ach gene has been disrupted can be obtained by selecting a strain in which the deletion type ach gene remains on the chromosome by PCR, Southern hybridization, or the like.
  • the same gene disruption can be performed by using a plasmid having no replication ability in coryneform bacteria instead of the above-mentioned temperature-sensitive plasmid.
  • a plasmid having no replication ability in coryneform bacteria a plasmid capable of replication in Escherichia coli is preferred, for example, pHSG299 (manufactured by Takara Bio Inc.) and pHSG399 (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • acetyl-CoA noidal mouth enzyme in addition to the above-described gene manipulation method, for example, coryneform bacteria are irradiated with ultraviolet light or N-methyl-N'-two-trough N-- A method may be used in which the strain is treated with a mutagen used in the usual mutagenesis treatment such as torsogazine (NTG) or nitrite, and the strain having reduced acetyl-CoA noidose activity is selected.
  • a mutagen used in the usual mutagenesis treatment such as torsogazine (NTG) or nitrite
  • phosphotransacetylase hereinafter referred to as PTA
  • ACK acetate kinase
  • phosphotransacetylase (PTA) activity refers to the conversion of phosphate to acetyl CoA.
  • Acetate kinase (ACK) refers to the activity that catalyzes the reaction that produces acetic acid from acetyl phosphate and ADP (EC: 2.3.1.8). 2.7.2.1).
  • the gene disruption method can be performed in the same manner as the above-described ach gene disruption method.
  • each enzyme is, for example, Corynebacterium registered in GenBank.
  • PTA activity has been reduced means that PTA activity has been reduced as compared to a non-modified PTA strain.
  • the PTA activity may be reduced as compared with the non-modified PTA strain or the wild strain, but is preferably reduced to 50% or less per cell, more preferably 10% or less. Further, the PTA activity may be completely deleted.
  • the decrease in PTA activity was determined by the method of Klotzsch et al. (Klotzsch, HR, Meth Enzymol. 12,
  • a coryneform bacterium with reduced ACH and PTA activities can be obtained by preparing a coryneform bacterium with reduced ACH activity and further modifying it to reduce PTA activity. However, the modification for decreasing PTA activity and the modification for decreasing ACH activity should be performed first.
  • ACK activity is decreased means that ACK activity is decreased as compared with a wild-type strain or an ACK-unmodified strain.
  • the ACK activity may be reduced as compared to the ACK non-modified strain or the wild-type strain, but is 50% lower per cell than the ACK non-modified strain.
  • concentration be reduced to 10% or less per cell.
  • the ACK activity may be completely lost.
  • the decrease in ACK activity can be confirmed by measuring ACK activity according to the method of Ramponi et al. (Ramponi G., Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)).
  • a coryneform bacterium with reduced ACH and ACK activities can be obtained by constructing a coryneform bacterium with reduced ACH activity and further modifying it to reduce ACK activity.
  • any of the modification for decreasing the ACK activity and the modification for decreasing the ACH activity may be performed first.
  • Ratate dehydrogenase activity refers to the activity of catalyzing the reaction of reducing pyruvic acid to produce lactic acid using NADH as a coenzyme.
  • the ratate dehydrogenase activity is reduced means that the LDH activity is reduced as compared to the LDH non-modified strain.
  • the LDH activity may be reduced as compared to the non-modified LDH strain or the wild strain, but is preferably reduced to 50% per cell, desirably 10% or less per cell.
  • LDH activity is completely deficient!
  • the decrease in LDH activity can be confirmed by measuring LDH activity by the method of Kanarek et al. (L. Kanarek and R ⁇ . Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)). it can.
  • the coryneform bacterium of the present invention can be obtained by producing a coryneform bacterium having a reduced LDH activity and further modifying the coryneform bacterium so that the ACH activity is reduced.
  • the modification for reducing the LDH activity and the modification for reducing the ACH activity may be performed first.
  • the ldh gene for example, a gene having the sequence shown in SEQ ID NO: 37 can be used, and gene disruption and the like can be performed in the same manner as in the ach gene.
  • a bacterium modified so as to increase the activity of pyruvate carboxylase (hereinafter, referred to as PC) in addition to decreasing the activity of ACH may be used.
  • PC pyruvate carboxylase
  • the activity of pyruvate carboxylase is enhanced means that the activity of PC is increased with respect to a wild-type strain or an unmodified strain such as a parent strain.
  • the activity of PC can be measured by the method of Peters-Wendisch PG et al. (Peters-Wendisch PG et al. Microbiology 143, 1095-1103 (1997)).
  • the pc gene encoding the PC protein used in the method of the present invention encodes a gene whose base sequence has already been determined or a protein having PC activity by the method described below.
  • a DNA fragment isolated from a chromosome of a microorganism, animal, plant, or the like and having a determined base sequence can be used.
  • a gene synthesized according to the sequence can also be used.
  • the pyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 GenBank Accession No. NCgl0659 gene SEQ ID NO: 46
  • PC genes derived from the following organisms can also be used.
  • the DNA fragment containing the pc gene is inserted into an appropriate expression plasmid, for example, pUC118 (manufactured by Takara Bio), and introduced into an appropriate host microorganism, for example, Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio). Can be expressed.
  • the expression of pyruvate carboxylase, which is the expressed pc gene product, is confirmed by measuring the PC activity of the transformant by the above-mentioned known method and comparing the non-transforming activity with the PC activity of the extracted crude enzyme solution. , Can be confirmed.
  • a DNA fragment containing the pc gene into an appropriate plasmid, for example, a plasmid vector containing at least a gene responsible for the replication and replication function of the plasmid in a coryneform bacterium, recombination capable of highly expressing pc in a coryneform bacterium
  • a promoter for expressing the pc gene in the recombinant plasmid was used.
  • the promoter is not limited to the power that can be the promoter possessed by the coryneform bacterium, but may be any promoter as long as it is a nucleotide sequence that initiates transcription of the pc gene.
  • the plasmid vector into which the pc gene can be introduced is not particularly limited as long as it contains at least a gene that controls the replication and growth function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmids pCRY21, pCRY2KE and pCRY2KX described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • the plasmid vector used in the coryneform bacterium host vector system includes a gene that controls the replication replication function of the plasmid in the coryneform bacterium and a gene that controls the plasmid stabilization function in the coryneform bacterium.
  • plasmids having plasmids pCRY30, pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, and pCRY3KX are preferably used.
  • the recombinant vector is a coryneform bacterium, for example, brevinocacterium.ratatofarmentum ( Brevibacterium lactofermentum) 2256 strains (
  • a coryneform bacterium with enhanced pc gene expression can be obtained. Transformation can be performed, for example, by the electric pulse method (Res. Microbiol, Vol. 144, p. 181-185, 1993).
  • the PC activity can also be enhanced by introducing, replacing, or amplifying a pc gene on the chromosome by a known homologous recombination method to achieve high expression. By disrupting the ach gene in the thus obtained PC gene highly expressing strain, the PC activity is enhanced and the ACH activity is reduced. Bacterial strains can be obtained. Either reduction of ACH activity or enhancement of PC activity may be performed first.
  • ACH activity or ACH, PTA activity, or ACK activity is modified so as to be reduced, LDH activity is further modified so as to be further reduced, or PC activity is further enhanced.
  • the use of a bacterium that has been modified to be particularly effective is particularly effective in producing substances, particularly in producing succinic acid.
  • succinic acid By culturing the coryneform bacterium obtained as described above in a medium, producing and accumulating succinic acid in the medium, and collecting succinic acid from the medium, succinic acid can be efficiently produced.
  • the above bacteria are used in the production reaction of succinic acid, those obtained by slant culture on a solid medium such as an agar medium may be directly used for the reaction, but the above bacteria are preliminarily cultured in a liquid medium (seed culture). It is preferable to use one that has been used. Bacteria that have been seed-cultured in this way can be produced by reacting the bacteria with an organic material while growing the same in a medium containing the organic material. Alternatively, the cells can be produced by collecting the cells obtained by growing the cells and reacting the cells with an organic material in a reaction solution containing an organic material.
  • the bacterium be cultured under ordinary aerobic conditions and then used in the reaction.
  • a medium used for the culture a medium usually used for culturing a microorganism can be used.
  • a general medium obtained by adding a natural nutrient source such as a meat extract, a yeast extract, or peptone to a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate. it can.
  • a natural nutrient source such as a meat extract, a yeast extract, or peptone
  • a composition comprising inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate, and magnesium sulfate.
  • a processed product of bacterial cells can also be used.
  • the treated cells include immobilized cells in which the cells are immobilized with acrylamide, carrageenan, etc., crushed cells, crushed cells, centrifuged supernatant, or supernatant treated with ammonium sulfate. A partially purified fraction and the like can be mentioned.
  • the organic raw material used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a carbon source capable of assimilating succinic acid by assimilation of the present microorganism, and usually, galactose, ratatose, and dal Carbohydrates such as kose, funolectose, glyceronole, sucrose, saccharose, starch, cenorexose; fermentable carbohydrates such as polyalcohols such as glycerin, mannitol, xylitol, ribitol, and glucose and fructose are used. Glycerol is preferred, and glucose is particularly preferred.
  • a starch saccharified solution, molasses, or the like containing the above fermentable carbohydrate is also used.
  • These fermentable carbohydrates can be used alone or in combination.
  • the concentration of the organic raw material used is not particularly limited, but it is advantageous to make it as high as possible without impairing the production of succinic acid, usually 5 to 30% ( 1 ⁇ ⁇ 7), preferably 10 to 10%.
  • the reaction is performed within the range of 20% ( 1 ⁇ 7). Further, the organic raw material may be additionally added in accordance with the decrease of the organic raw material with the progress of the reaction.
  • the reaction solution containing the organic raw material is not particularly limited, and a force medium using water, a buffer, a medium, or the like is most preferable.
  • the reaction solution is preferably a reaction solution containing a nitrogen source, an inorganic salt, and the like.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as the microorganism can assimilate and produce succinic acid, and specific examples thereof include ammonium salts, nitrates, urea, soybean hydrolyzate, and casein hydrolyzate. , Peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, and other various organic and inorganic nitrogen compounds.
  • the inorganic salt various phosphates, sulfates, and metal salts such as magnesium, potassium, manganese, iron, and zinc are used.
  • growth promoting factors such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol and nicotinic acid, nucleotides and amino acids are added as necessary.
  • the pH of the reaction solution is adjusted by adding sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, or the like. be able to. Since the pH in this reaction is usually pH 5 to 10, preferably pH 6 to 9.5, the pH of the reaction solution may be adjusted within the above range depending on the need for alkaline substances, carbonates, urea, etc., even during the reaction. Adjust within.
  • the medium preferably contains carbonate ions, bicarbonate ions or carbon dioxide (carbon dioxide).
  • Carbonate or bicarbonate ions also provide magnesium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate and potassium bicarbonate which can also be used as neutralizing agents. However, if necessary, it can be supplied from carbonic acid or bicarbonate or a salt or carbon dioxide gas.
  • Specific examples of the carbonate or bicarbonate salts include magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate and the like.
  • the carbonate ions and bicarbonate ions are added at a concentration of 0.001 to 5M, preferably 0.1 to 3M, and more preferably 1 to 2M. When carbon dioxide is contained, 50 mg to 25 g, preferably 100 mg to 15 g, and more preferably 150 mg to 10 g per liter of the solution is contained.
  • the optimal growth temperature of the bacteria used in this reaction is usually 25 ° C to 35 ° C.
  • the temperature during the reaction is usually 25 ° C to 40 ° C, preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the amount of the cells used for the reaction is not particularly limited, but 1 to 700 gZL, preferably 10 to 500 gZL, more preferably 20 to 400 gZL is used.
  • the reaction time is preferably 1 hour to 168 hours, more preferably 3 hours to 72 hours.
  • the reaction for producing succinic acid may be carried out with aeration and stirring, or may be carried out under anaerobic conditions without aeration and without supply of oxygen.
  • the anaerobic condition means that the reaction is performed with the dissolved oxygen concentration in the solution kept low.
  • a method for this purpose for example, a method in which the reaction is carried out with the container hermetically sealed and air-free, a method in which an inert gas such as nitrogen gas is supplied and the reaction is performed, or a method in which an inert gas containing carbon dioxide gas is passed is used. it can.
  • Succinic acid accumulated in the reaction solution can be separated and purified from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, after removing solids such as bacterial cells by centrifugation, filtration, etc., desalting with ion-exchange resin, etc., the succinic acid is separated and purified by crystallization or column chromatography. Can be.
  • a succinic acid-containing polymer can be produced by producing succinic acid by the above-mentioned method of the present invention and then conducting a polymerization reaction using the obtained succinic acid as a raw material.
  • the succinic acid-containing polymer may be a homopolymer or a copolymer with another polymer raw material.
  • succinic acid-containing polymer examples include a succinic polyester obtained by polymerizing a diol such as butanediol and ethylene glycol and succinic acid, and a succinic acid obtained by polymerizing a diamine such as hexamethylene diamine and succinic acid. Acid polyamide and the like.
  • succinic acid or a composition containing the succinic acid obtained by the production method of the present invention can be used for food additives, pharmaceuticals, cosmetics, and the like.
  • the sacB gene (SEQ ID NO: 35) was obtained by PCR using Bacillus subtilis chromosomal DNA as type I and SEQ ID NOs: 1 and 2 as primers.
  • LA taq (TaKaRa) was used for one cycle of incubation at 94 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, association at 49 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 2 minutes. Repeated 25 times.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Bglll and BamHI, and blunt-ended. This fragment was digested with Avail of pHSG299 and inserted into the blunted site.
  • a plasmid in which the Smal site in the kanamycin resistance gene sequence present on PBS3 was disrupted by base substitution without amino substitution was obtained by crossover PCR.
  • the synthetic DNA of SEQ ID NOS: 3 and 4 was And perform PCR to obtain an amplification product on the N-terminal side of the kanamycin resistance gene.
  • PCR was performed using pBS3 as type III and the synthesized DNAs of SEQ ID NOS: 5 and 6 as type III.
  • the PCR reaction was performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) for 1 cycle at 98 ° C for 5 minutes, followed by denaturation at 98 ° C for 10 seconds, association at 57 ° C for 30 seconds, and extension at 72 ° C for 1 minute.
  • the desired PCR product can be obtained by repeating the following cycle 25 times.
  • SEQ ID NOS: 4 and 5 are partially complementary, and the Smal site present in this sequence is destroyed by base substitution without amino acid substitution.
  • the above kanamycin resistance gene N-terminal and C-terminal gene products are mixed so as to be approximately equimolar, and this is mixed.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 3 and 6 as primers to obtain a mutated Km-resistant gene amplification product.
  • the PCR reaction uses Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio Inc.), after one cycle of incubation at 98 ° C for 5 minutes, denaturation 98 ° C 10 seconds, association 57 ° C 30 seconds, extension 72 ° C 1.5 minutes.
  • the desired PCR product can be obtained by repeating the cycle 25 times.
  • the PCR product was purified by a conventional method, digested with Banll, and inserted into the Banll site of pBS3 described above.
  • the temperature-sensitive replication origin of coryneform bacteria obtained by BamHI and Smal treatment of 1 "[3-4 (see Patent Publication 5-7491) was obtained by smoothing the Ndel site of PBS4S.
  • transformation was performed using a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), applied to an LB medium containing 25 g / ml of Km, and cultured overnight. Thereafter, the emerged colonies were picked up, a single colony was separated to obtain a transformant, a plasmid was extracted from the obtained transformant, and the target PCR product was inserted.
  • PBS5T The temperature-sensitive replication origin of coryneform bacteria obtained by BamHI and Smal treatment of 1 "[3-4 (see Patent Publication 5-7491) was obtained by smoothing the
  • Figure 3 shows the construction of pBS5T.
  • ldh gene The gene fragment from the ORF of ratate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as ldh gene) derived from Brevibatadium ratatofamentum 2256 strain is a previously released corynebate teratium 'glutamicum ATCC13032 (GenBank Database Accession
  • NC_003450 was obtained by crossover PCR using a synthetic DNA designed with reference to the nucleotide sequence of the gene (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 37). Specifically, PCR was performed by a conventional method using the chromosomal DNA of Brevibatarum 'ratatophamentum 2256 strain' as ⁇ type and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 7 and 8 as primers to obtain an amplification product on the N-terminal side of the ldh gene.
  • PCR was performed by a conventional method using the genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentum 2256 strain genomic DNA and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 9 and 10 as primers. .
  • SEQ ID NOS: 8 and 9 are complementary to each other and have a structure in which the entire sequence of the ORF of ldh is deleted.
  • the 2256 strains of Brevi Bata Terimu 'Ratoto Armamentum' can be obtained from the American 'Type-Carcia I' collection (ATCC) (Address ATCC, PO Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America) .
  • ATCC American 'Type-Carcia I' collection
  • PCR was performed by a conventional method using the synthetic DNAs of Nos. 11 and 12 as primers to obtain a mutated ldh gene amplification product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Sail, and inserted into the above-mentioned Sail site of PBS4S.
  • FIG. 4 shows a construction diagram of the plasmid.
  • p ⁇ ldh56-l obtained in (A) above does not contain a region that enables autonomous replication in coryneform bacterium cells, the frequency is extremely low when transforming coryneform bacterium with this plasmid.
  • a strain in which this plasmid has been integrated into the chromosome by homologous recombination appears as a transformant.
  • Brevibata terium 'ratatofarmentum 2256 strain was transformed by the electric pulse method using a high-concentration plasmid P ⁇ ldh56-l, and CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin (glucose 5 g / L, polypeptone) was used.
  • these first fibrils were cultured overnight at 31.5 ° C in a CM-Dex liquid medium containing no kanamycin and appropriately diluted, and then kanamycin-free 10% Dex-S10 medium containing sucrose (sucrose 10 g / L, polypeptone 10 g / L, yeast extratato 10 g / L, KH
  • the strains thus obtained include those in which the ldh gene has been replaced by a mutant derived from pAldh56-l and those which have returned to the wild type. Whether the ldh gene is mutant or wild-type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the ldh gene. it can. When the ldh gene was analyzed using primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10) for PCR amplification, the ldh-deficient PCR product was found to have a smaller PCR product size than the chromosomal DNA of the 2256 strain. The strain was used in subsequent experiments.
  • ack a gene fragment in which the ORF of the acetate kinase gene (hereinafter referred to as ack) of Brevibatatermium ratatophamentum 2256 strain has been obtained is based on the previously published Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (GenBank Database Accession
  • NC_003450 was obtained by crossover PCR using a synthetic DNA designed as a primer with reference to the nucleotide sequence of the gene (1945 to 3135 of SEQ ID NO: 39). Specifically, PCR was performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as a type I and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 13 and 14 as primers to obtain an amplification product on the N-terminal side of the ack gene.
  • PCR was performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentumum 2256 strain type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 15 and 16 as primers.
  • SEQ ID NOs: 14 and 15 are partially complementary.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, and then N-terminal side was denatured at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extended 68
  • the cycle at 30 ° C for 30 seconds and the cycle for denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 2 minutes were repeated 30 times on the C-terminal side.
  • PCR was performed using 18 synthetic DNAs as primers to obtain mutated ack gene amplification products.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) after one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 2.5 minutes. This cycle was repeated 30 times to obtain the target mutated ack gene amplification product.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS5T constructed in Example 1 (C) above.
  • transformation was performed using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and an LB medium containing IPTG 100 ⁇ M, X-Gal 40 ⁇ g / ml and kanamycin 25 g / ml. And cultured. afterwards, Appeared white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants. Plasmids were extracted from the obtained transformants, and those into which the desired PCR product had been inserted were named pBS5T :: Aack.
  • the construction process of pBS5T :: A ack is shown in FIG.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T :: ⁇ ack obtained in (A) above is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacteria at 25 ° C, but not at 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain was transformed by an electric pulse method, applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin, and incubated at 25 ° C. ⁇ After culturing, the colonies that appeared were isolated and used as transformants. This transformant carries the plasmid.
  • CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin, and incubate at 34 ° C. Culture was performed for about 30 hours. The strain grown on this medium underwent homologous recombination between the ack gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain, and as a result, The kanamycin resistance gene and SacB gene derived from the plasmid have been inserted.
  • the strains thus obtained include those in which the ack gene has been replaced with a mutant type derived from pBS5T :: Aack and those in which the ack gene has returned to the wild type. Whether the ack gene is mutant or wild type can be easily confirmed by directly subjecting the cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the ack gene. it can. ack gene Analysis using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 16) should reveal a 3.7 kb DNA fragment for the wild type and a 2.5 kb DNA fragment for the mutant with the deletion region. As a result of analyzing the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (Wh, ack).
  • the ORF of acetate kinase (ack) and phosphotransacetylase gene (hereinafter referred to as pta) of Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain has an operon structure, and these ORFs are deleted simultaneously. It is possible to do. Acquisition of these gene fragments was performed by referring to the nucleotide sequence (pta-ack gene; SEQ ID NO: 39) of the gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (GenBank Database Accession No. NC_003450) which has already been published. The DNA was obtained by crossover PCR using DNA as a primer.
  • PCR was performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as type I and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 19 and 20 as primers to obtain an amplification product at the N-terminal end of the pta gene.
  • PCR was performed using Brevi Batterellium 'ratatophamentum 2256 genomic DNA as a type I and the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 21 and 16 as primers.
  • SEQ ID NOs: 20 and 21 are partially complementary.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, and then the N-terminal side was denatured at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extended 68 A cycle consisting of 30 ° C. for 30 seconds and a cycle consisting of denaturation at 94 ° C. for 10 seconds, association at 55 ° C. for 30 seconds, and extension at 68 ° C. for 2 minutes were repeated 30 times on the C-terminal side.
  • KOD-plus- TOYOBO
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 22 and 18 as primers to obtain the amplified pta-ack gene amplification product.
  • the PCR reaction was performed using KOD-plus- (TOYOBO), one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C.
  • the cycle with 2.5 minutes of force was repeated 30 times to obtain the target mutagenized pta-ack gene amplified product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of pBS5T.
  • transformation was carried out using a competent cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and an LB medium containing IPTG 100 M, X-Gal 40 g / ml and kanamycin 25 g / ml was used. And cultured overnight. Thereafter, the emerged white mouth was caught and single colonies were separated to obtain a transformant.
  • a plasmid was extracted from the obtained transformant, and the one into which the desired PCR product had been inserted was named pBS5T :: A pta-ack.
  • the construction process of pBS5T :: ⁇ pta-ack is shown in FIG.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacteria at 25 ° C, but not at 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • the plasmid was used to transform Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 A (ldh) strain by the electric pulse method, and the transformant was applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin and incubated at 25 ° C. ⁇ After culturing, the colonies that appeared were isolated and used as transformants. This transformant carries the plasmid.
  • transformants were cultured at ⁇ 34 ° C. in a CM-Dex liquid medium without kanamycin, diluted appropriately, and spread on a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were cultured at ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium undergoes homologous recombination between the pta-ack gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (Wh) strain, resulting in the same genome.
  • the kanamycin resistance gene and SacB gene derived from the plasmid have been inserted.
  • these first fibrils were cultured in a kanamycin-free! / ⁇ ⁇ CM-Dex liquid medium at 31.5 ° C, diluted appropriately, and then kanamycin-free 10%
  • the cells were applied to sucrose-containing Dex-S10 medium, and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours.
  • about 50 strains that were considered to be sucrose-insensitive by dropping the SacB gene by the second homologous recombination were obtained.
  • the strains thus obtained include those in which the pta and ack genes have been replaced with a mutant derived from pBS5T :: A pta-ack and those in which the pta and ack have reverted to the wild type.
  • ack gene is mutated Whether it is a type or a wild type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to a PCR reaction and detecting pta and ack genes.
  • sucrose-insensitive strain As a result of analysis of the sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (ldh, pta, ack).
  • PCR was performed using Brevibacterium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as a type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 23 and 24 as primers to obtain an amplification product on the N-terminal side of poxB gene.
  • PCR is performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentum 2256 strain type II and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 25 and 26 as primers.
  • SEQ ID NOS: 24 and 25 are complementary to each other.
  • KOD-plus- TOYOBO
  • the cycle of elongation at 68 ° C for 40 seconds was repeated 30 times.
  • the above-mentioned poxB N-terminal and C-terminal gene products were mixed so as to be approximately equimolar, respectively, and the resulting mixture was designated as ⁇ type and SEQ ID NO: 27.
  • PCR was performed using the synthetic DNAs of the above and primers as primers to obtain a mutated poxB gene amplification product.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) after one cycle of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 70 seconds.
  • the generated PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and inserted into the Xbal site of PBS5T constructed in Example 1 (C) above. Using this DNA, transformation was carried out using a combinatorial cell of Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Bio Inc.), and LB medium containing IPTG 100 ⁇ ⁇ , X-Gal 40 ⁇ g / ml and kanamycin 25 g / ml was used. And cultured overnight. After that, the emerged white colonies were picked and separated into single colonies to obtain transformants. Plasmids were extracted from the resulting transformants, and those into which the desired PCR product had been inserted were named pBS5T :: ⁇ poxB. The construction process of pBS5T :: ⁇ is shown in FIG.
  • the origin of replication of coryneform bacteria in pBS5T :: ⁇ poxB obtained in (B) above is temperature-sensitive.
  • the plasmid is capable of autonomous replication in coryneform bacterium cells at 25 ° C and becomes incapable of autonomous replication at a power of 31.5 ° C (or 34 ° C).
  • the plasmid was used to transform Brevibataterium 'ratatophamentum 2256 A (ldh, pta, ack) strain by the electric pulse method, and the transformant was applied to a CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the cells were cultured at 25 ° C for 2 ⁇ , and the resulting colonies were isolated and used as transformants. This transformant should carry the plasmid.
  • CM-Dex liquid medium containing no kanamycin at 34 ° C and diluted appropriately, and then CM-Dex medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin was appropriately diluted. And cultured at 34 ° C for about 30 hours.
  • the strain grown on this medium was the result of homologous recombination between the poxB gene fragment of the plasmid and the same gene on the genome of Brevibataterium 'ratatophamentum 2256A (ldh, pta, ack) strain.
  • a kanamycin resistance gene and a SacB gene derived from the plasmid were inserted.
  • these first recombinants were cultured in CM-Dex liquid medium without kanamycin at 31.5 ° C, diluted appropriately, and kanamycin-free! / ⁇ Dex containing 10% sucrose.
  • the cells were applied to -S10 medium and cultured at 31.5 ° C for about 30 hours. As a result, about 50 strains that were considered to be sucrose-insensitive due to the loss of the SacB gene due to the second homologous recombination were obtained.
  • the strains thus obtained include those in which the poxB gene has been replaced with a mutant derived from pBS5T :: A poxB and those in which the poxB has returned to the wild-type. Whether the acetate kinase gene is mutant or wild type can be confirmed by culturing on Dex-S10 agar medium. The obtained cells can be easily confirmed by directly subjecting them to a PCR reaction and detecting the poxB gene. When the poxB gene is analyzed using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26), a DNA fragment of 2.4 kb can be detected in the wild type and a 1.2 kb DNA fragment can be detected in the mutant having the deletion region. As a result of analyzing a sucrose-insensitive strain by the above method, a strain having only the mutant gene was selected, and the strain was named 2256A (Wh, pta, ack, poxB).
  • Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain's acetyl-CoA-noid-mouth-lase gene (hereinafter referred to as “ach”) was obtained by deleting the gene fragment of ORF from the previously published corynebacterium.
  • ach acetyl-CoA-noid-mouth-lase gene
  • NC_003450 was obtained by crossover PCR using a synthetic DNA designed with reference to the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 44) of the gene. Specifically, PCR is performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 strain genomic DNA as a type I and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 29 and 30 as primers to obtain an amplification product on the C-terminal side of the ach gene. On the other hand, in order to obtain an amplification product on the N-terminal side of the ach gene, PCR is performed using genomic DNA of Brevibata terium 'ratatofamentum 2256 strain ⁇ as a type III and synthetic DNAs of SEQ ID NOS: 31 and 32 as primers.
  • SEQ ID NOS: 30 and 31 are complementary to each other.
  • KOD-plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • both N-terminal side and C-terminal side were incubated at 94 ° C for 2 minutes for 1 cycle, denaturation 94 ° C for 10 seconds, association 55 ° C A cycle of 30 seconds and an extension of 68 ° C for 50 seconds was repeated 30 times.
  • the above ach N-terminal and C-terminal gene products were mixed so as to be almost equimolar, respectively, and the resulting mixture was designated as type I and SEQ ID NO: 33.
  • PCR was performed using 34 synthetic DNAs as primers to obtain mutated ach gene amplification products.
  • the PCR reaction was carried out using KOD-plus- (TOYOBO) for 2 cycles of incubation at 94 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 10 seconds, association at 55 ° C for 30 seconds, and extension at 68 ° C for 90 seconds. Another cycle was repeated 30 times to obtain the desired mutated ach gene amplification product.
  • the resulting PCR product was purified by a conventional method, digested with Xbal, and the pBS4S constructed in Example 1 (B) above was purified. Inserted at Xbal site.
  • the strains grown on this medium were the ach gene fragment of the plasmid and the Brevibataterium 'lactofermentum 2256 ⁇ (ldh), 2256 ⁇ (ldh, pta, ack), 2256 ⁇ (ldh, pta, ack, poxB) strain and 2256 ⁇ (ldh, pta, ack, poxB, acp) strain.Homologous recombination with the same gene on the genome resulted in a kanamycin resistance gene derived from the plasmid in the same genome. And the SacB gene has been inserted!
  • the strains thus obtained include those in which the ach gene has been replaced with a mutant derived from pBS4S :: A ach and those in which the ach gene has returned to the wild type. Whether the ach gene is mutant or wild type can be easily confirmed by directly subjecting cells obtained by culturing on Dex-S10 agar medium to PCR and detecting the ach gene. it can. ach gene Analysis using primers for PCR amplification (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 32) should reveal a DNA fragment of 2.9 kb in the wild type and 1.4 kb in the mutant with the deletion region.
  • Culture for succinic acid production was carried out as follows using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256 ⁇ (ldh) strain and 2256 ⁇ (ldh, ach) strain.
  • Cells of 2256 ⁇ (ldh) strain and 2256 ⁇ (ldh, ack) strain obtained by culturing in CM-Dex plate medium were seeded with 3 ml of seed medium (Dalcos 10 g / L ⁇ (NH) SO 2.5 g / L, KH PO 0.5g / L, MgSO-7H O 0.25g / L, urea 2g / L,
  • shaking culture was performed in a test tube at 31.5 ° C under aerobic conditions for about 15 hours.
  • succinic acid production culture was carried out with a silicone stopper tightly closed. The culture was shaken at 31.5 ° C for about 24 hours to terminate the culture before the sugar in the medium was exhausted.
  • Culture for succinic acid production was performed using Brevibata terium 'ratatophamentum 2256A (ldh) strain and 2256A (ldh, ach, pta, ack) strain as follows.
  • the cells of the 2256 A (ldh) strain and the 2256 A (ldh, ack, pta, ack) strain obtained by culturing in the CM-Dex plate medium were inoculated into 3 ml of the above-described seed medium, and subjected to aerobic conditions. At 31.5 ° C for about 15 hours in a test tube.
  • test tube was inoculated with 3 ml of the above-mentioned main medium, and sealed with a silicon stopper to prevent aeration, and succinic acid production culture was performed.
  • the culture was shaken at 31.5 ° C for about 24 hours to terminate the culture before the sugar in the medium was exhausted.
  • Brevibataterium 'ratatofu amentum 2256 ⁇ (Idh) strain, 2256 A (Wh, pta-ack, ach) strain, 2256 ⁇ (ldh, pta-ack, poxB) strain, and 2256 ⁇ (ldh, pta-ack , poxB, ach) strain was cultured for succinic acid production as follows.
  • the test tube was inoculated with 3 ml of the above-mentioned main medium, and sealed with a silicon stopper to prevent aeration, and succinic acid production culture was performed.
  • the culture was shaken at 31.5 ° C for about 24 hours to terminate the culture before the sugar in the medium was exhausted.
  • the accumulated amount of succinic acid and by-product acetic acid in the culture solution was analyzed by liquid chromatography after appropriately diluting the culture solution.
  • the column used was two Shim-pack SCR-102H (Simazu) connected in series, and the sample was eluted at 40 ° C using 5 mM p-toluenesulfonic acid.
  • the eluate was neutralized with a 20 mM Bis-Tris aqueous solution containing 5 mM p-toluenesulfonic acid and 100 ⁇ M EDTA.
  • Succinic acid is useful as a raw material for biodegradable polymers and the like.

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Abstract

　コリネ型細菌をアセチルCoAハイドロラーゼ活性が低下するように改変することにより、コハク酸生産能を向上させ、該細菌を用いてコハク酸を製造する。

Description

明 細 書
コハク酸生産菌及びコハク酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、発酵工業に関し、コリネ型細菌を利用した発酵法によりコハク酸を効率 よく製造する方法に関する。
背景技術
[0002] コハク酸などの非ァミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、
Anaerobiospirillum (アナエロビォスピリラム）属、 Actinobacillus (ァクチノバチルス）属 等の嫌気性細菌が用いられている (特許文献 1、 2、又は非特許文献 1参照)。嫌気 性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多 くの栄養素を要求するために、培地中に多量の CSL (コーンスティープリカ一）などの 有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培 地コストの上昇をもたらすだけでなぐ生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつ ながり経済的でない。
[0003] コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させ た後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずにコハク酸を生産する方法も知 られている（特許文献 3又は 4参照)。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有 機窒素の添加量が少なくてよぐ簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではある 力 目的とするコハク酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、 製造プロセスの簡略ィ匕等改善の余地があった。
[0004] また、コリネ型細菌を代表とする好気性細菌を酸素制限条件で培養を行うと乳酸、 酢酸等の目的物質以外の有機酸が副生物として過剰に蓄積し、菌体生育が抑制さ れ、発酵生産性が大幅に低下する。また、副生物の有機酸を中和するためのカウン ターイオンも過剰に必要となり、経済的でない。このような課題を解決するために、副 生乳酸に関してはラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低減したコリネ型細菌を用いるこ とにより、その低減ィ匕が行われている（特許文献 5参照)。
[0005] しかし、上記ラタテートデヒドロゲナーゼ活性の低減したコリネ型細菌でも酢酸が著 量副生する。これまでに培養液中の酢酸低減の解決手段として、ェシエリヒア属細菌 で酢酸資化遺伝子 (aceP)の発現を強化する方法 (特許文献 6参照）、エシ リヒア属 細菌で ACEタンパク質をコードする遺伝子の発現を強化する方法 (特許文献 7参照） 等が知られている。これらは培養液中に放出された酢酸を積極的に資化させることに より酢酸の副生減を図るものである。また、酢酸の生合成を弱化することにより副生酢 酸を抑制する方法として、フォスフォアセチルトランスフェラーゼ (pta)とラタテートデヒ ドロゲナーゼ (ldh)を欠損させたェシエリヒア'コリを用いたコハク酸の製造方法 (特許 文献 8参照）、ピルべートォキシダーゼ (poxB)を欠損させた腸内細菌群を用いたアミ ノ酸産法、ピルべートォキシダーゼ (poxB)を欠損させた腸内細菌群を用いた D パ ントテン酸の製造方法が知られて 、る (特許文献 9参照)。
[0006] コリネ型細菌の酢酸資化に関与する酵素としてアセテートキナーゼ (ack)、フォスフ オトランスァセチラーゼ (pta) (非特許文献 2参照）が報告されている。一方、酢酸生成 に関与する酵素としては、上記の他にピルべートォキシダーゼ (poxB) (特許文献 10 参照）、ァシルフォスファターゼ（acp)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ァセチル CoAノヽ イド口ラーゼ等複数が関与することが推定されるが、どの酵素が酢酸合成に寄与して いるか明確でな力つた。従って、今まで、コリネ型細菌で酢酸生合成系酵素を低下さ せた菌株を用いてコハク酸生産を行う方法は知られて 、なかった。
[0007] ァセチル CoAノヽイド口ラーゼは、ァセチル CoAと水から酢酸を生成する酵素（
3.1.2.1)であり、コリネバタテリゥム 'ダルタミカムでも遺伝子配列は推定されていた (特 許文献 11参照)。しかし、当該遺伝子をクローユングしたり、発現して解析した報告は なぐ実際の機能は確認されていな力つた。
特許文献 1 :米国特許第 5, 143, 833号明細書
特許文献 2 :米国特許第 5, 504, 004号明細書
特許文献 3：特開平 11― 113588号公報
特許文献 4：特開平 11 196888号公報
特許文献 5：特開平 11― 206385号公報
特許文献 6：特開平 6— 14781号公報
特許文献 7：特開平 7— 67683号公報 特許文献 8：国際公開第 99Z06532号パンフレット
特許文献 9：国際公開第 02Z36797号パンフレット
特許文献 10 :欧州特許出願公開第 1096013号明細書
特許文献 11 :欧州特許出願公開第 1108790号明細書
特干文献 1 international Journal of systematic Bacteriology, vol. 49, p207— 216、 1999年
非特許文献 2 : Microbiology. 1999 Feb; 145 (Pt 2):503- 13
発明の開示
[0008] 本発明は、コハク酸を生産する能力が向上したコリネ型細菌を提供することを課題 とする。
[0009] 本研究者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌に おいてァセチル CoAハイド口ラーゼ活性を低下させることにより、コハク酸生産能が向 上することを見出した。また、ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ活性に加えて、ホスホトラン スァセチラーゼ、アセテートキナーゼ活性を低下させることにより、酢酸の副生が低減 することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] 即ち本発明は、以下のとおりである。
(1) コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ の活性が低下するように改変されたコリネ型細菌。
(2) 前記ァセチル CoAノ、イド口ラーゼカ 下記 (A)又は（B)に記載のタンパク質で ある（1)のコリネ型細菌、
(A)配列番号 45に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号 45に示すアミノ酸配列にお 、て、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、挿入、または付カ卩を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ァセチル CoAノヽイド口ラー ゼ活性を有するタンパク質。
(3) 染色体上のァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子が破壊されたことによりァセチ ル CoAハイド口ラーゼ活性が低下した、（1)又は（2)のコリネ型細菌。
(4) 前記ァセチル CoAノ、イド口ラーゼ遺伝子力 下記（a)又は (b)に記載の DNA である（3)のコリネ型細菌、 (a)配列番号 44の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列を含む DNA、又は
(b)配列番号 44の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列又は同塩基配列か ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ、ァセチ ル CoAハイド口ラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
(5)さらに、ホスホトランスァセチラーゼ及びアセテートキナーゼのいずれかまたは 両方の活性が低下するように改変された（ 1)〜 (4)の 、ずれかのコリネ型細菌。
(6) さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された（1)〜（5 )の！、ずれかのコリネ型細菌。
(7)さらに、ピルべ一トカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変された（1)〜（6 )の！、ずれかのコリネ型細菌。
(8) (1)〜（7)のいずれかのコリネ型細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭 酸イオンまたは二酸化炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、 該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取することを特徴 とするコハク酸の製造方法。
(9) 有機原料を嫌気的条件下で作用させることを特徴する (8)の製造方法。
(10) (8)または（9)の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸 を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]プラスミド pBS3の構築手順を示す図。
[図 2]プラスミド pBS4Sの構築手順を示す図。
[図 3]プラスミド pBS5Tの構築手順を示す図。
[図 4]プラスミド p Δ ldh -lの構築手順を示す図。
[図 5]プラスミド pBS5T:: Δ ackの構築手順を示す図。
[図 6]プラスミド pBSCT:: Δ pta- ackの構築手順を示す図。
[図 7]プラスミド pBS5T:: Δ poxBの構築手順を示す図。
[図 8]プラスミド pBS4S:: Δ achの構築手順を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する [0013] < 1 >本発明に用いられるコリネ型細菌
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビパクテリゥム属に分類されていた 力 現在コリネバタテリゥム属に分類されている細菌も含み（Int. J. Syst. BacterioL, 41, 255(1981))、またコリネバタテリゥム属と非常に近縁なブレビバタテリゥム属細菌を 含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバタテリゥム ·ァセトァシドフィラム
コリネバタテリゥム ·ァセトグルタミカム
コリネバタテリゥム ·アル力ノリティカム
コリネバタテリゥム ·カルナェ
コリネバタテリゥム ·ダルタミカム
コリネバタテリゥム 'リリウム
コリネバタテリゥム 'メラセコーラ
コリネバタテリゥム ·サーモアミノゲネス
コリネバタテリゥム 'ノヽーキユリス
ブレビバタテリゥム .ディバリカタム
ブレビバタテリゥム 'フラバム
ブレビバタテリゥム ·インマリオフィラム
ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム
ブレビバタテリゥム 'ロゼゥム
ブレビバタテリゥム.サッカロリティカム
ブレビバタテリゥム .チォゲ二タリス
コリネバタテリゥム ·アンモニアゲネス
ブレビバタテリゥム ·アルバム
ブレビバクテリウム'セリヌム
ミクロバタテリゥム ·アンモニアフィラム
[0014] 本発明において、「コハク酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、 培地中にコハク酸を蓄積する能力をいう。このコハク酸生産能は、コリネ型細菌の野 生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与される性質であっても よい。
[0015] 育種によってコハク酸生産能を付与するには、代謝制御変異株の取得、 目的物質 の生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌の育種に採用 されてきた方法を適用することが出来る（アミノ酸発酵、（株)学会出版センター、 1986 年 5月 30日初版発行、第 77〜100頁参照)。これらの方法において、付与される代謝 制御変異や増強される目的物質生合成系酵素の増強等の性質は、単独でもよぐ 2 種又は 3種以上であってもよい。代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の 増強が組み合わされてもよ!/、。
[0016] コハク酸生産能を有するコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ラタテートデ ヒドロゲナーゼ活性が低下したブレビバタテリゥム .フラバム MJ233 Δ ldh株（特開平 11 - 206385号公報）や、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼ活性が強化されたブレビバタテリゥム ·フラバム MJ233/pPCPYC株（ 国際公開第 01/27258号パンフレット、特開平 11— 196887号公報）、またブレビバタ テリゥム ·フラバム MJ— 233 (FERM BP— 1497)、同 MJ— 233 AB— 41 (FERM
BP— 1498)、ブレビバタテリゥム 'アンモニアゲネス ATCC6872、コリネバタテリ ゥム 'グルタミカム ATCC31831、及びブレビバタテリゥム'ラタトフアーメンタム ATC C 13869等が挙げられる。なお、ブレビバタテリゥム 'フラバムは、現在、コリネバタテリ ゥム 'グルタミカムに分類される場合もあり（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260)、上記ブレビバタテリゥム 'フラバム MJ— 233株、及びその変異株 MJ— 2 33 AB— 41株は、それぞれ、コリネバタテリゥム 'グルタミカム MJ— 233株及び MJ - 233 AB— 41株と同一の株であるものとする。
[0017] < 2 >本発明のコリネ型細菌の構築
本発明のコリネ型細菌は、上記のようなコハク酸生産能を有するコリネ型細菌であ つて、かつァセチル CoAノヽイド口ラーゼ活性が低下するように改変されたコリネ型細 菌である。
本発明のコリネ型細菌の育種において、コハク酸生産能の付与とァセチルー CoAノヽ イド口ラーゼ (EC 3.1.2.1)活性を低下させる改変は、どちらを先に行ってもよい。 [0018] 「ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ (ACH)活性」は、ァセチル CoAと水から酢酸を生成す る反応を触媒する活性を ヽぅ。「ァセチル CoAハイド口ラーゼ活性が低下するように改 変された」とは、ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ活性力 非改変株、例えば野生株のコリ ネ型細菌の比活性よりも低くなつたことをいう。 ACH活性は非改変株と比較して、菌 体当たり 50%以下、好ましくは 30%以下、さらに望ましくは菌体当たり 10%以下に低 下されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株のコリネ型細菌としては、例え ば、野生株としてはブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム ATCC13869、非改変株と しては、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム A ldh株が挙げられる。ァセチル CoA ハイド口ラーゼ活性は、 GergelyJ.,らの方法（GergelyJ., Hele.P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334)を参考にして測定することが出来る。尚、「低下」 には活性が完全に消失した場合も含まれる。本発明のコリネ型細菌は、野生株又は 非改変株よりァセチル CoAノヽイド口ラーゼ活性が低下して 、ればよ 、が、さらにこれら の株に比べてコハク酸の蓄積が向上して 、ることがより望まし!/、。
[0019] 上記活性を有するァセチル CoAハイド口ラーゼとしては、例えば、配列番号 45に示 すアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、ァセチル CoAノヽイド口 ラーゼ活性を有する限りにおいて、配列番号 45に示すアミノ酸配列において、 1若し くは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するもの であってもよい。ここで、数個とは、例えば、 2〜20個、好ましくは 2〜10個、より好ま しくは 2〜5個を意味する。
[0020] 「ァセチル CoAハイド口ラーゼ活性が低下するように改変された」とは、例えば、細胞 あたりのァセチル CoAノヽイド口ラーゼの分子数が低下した場合や、分子あたりのァセ チル CoAハイド口ラーゼ活性が低下した場合等が該当する。具体的には、染色体上 のァセチル CoAノ、イド口ラーゼをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターゃシ ャインダルガルノ (SD)配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成 される。染色体上のァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号 4 4の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列を含む DNAを挙げることができる。ま た、ァセチル CoAハイド口ラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号 44の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列又は同塩基配列力も調製され得るプ ローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであってもよ!/、。「ストリン ジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイプリ ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難であるが、 一例を示せば、 60。C、 1 X SSC, 0. 1%SDS、好ましくは、 0. 1 X SSC、 0. 1%SD Sに相当する塩濃度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
[0021] ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子（以下 ach遺伝子と呼ぶ）の取得は、 GenBankに 登録のコリネバタテリゥム 'グルタミカムの配列（GenBank Accession No.NC_003450の NCgl2480 (NC_003450の 2729376..2730884番目の相補鎖） )に基づき、合成オリゴヌ クレオチドを合成し、コリネバタテリゥム 'ダルタミカムの染色体を铸型として PCR反応 を行うことによってクローユングできる。また、近年ゲノムプロジェクトにより、塩基配列 が決定されているブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム等のコリネ型細菌の配列も 利用できる。染色体 DNAは、 DNA供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方 法 . Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験 書、 日本生物工学会編、 97〜98頁、培風館、 1992年参照)等により調製することが できる。
[0022] 上記のようにして調製した ach遺伝子又はその一部を遺伝子破壊に使用することが できる。ただし、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象のコリネ型細菌の染色体 D NA上の ach遺伝子（例えば、配列番号 44の塩基番号 1037〜2542番目の塩基配 列を有する遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有して ヽればよ ヽため、こ のような相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相 同性とは、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 、特に好ましくは 95%以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でノ、 イブリダィズし得る DNA同士であれば、相同組換えは起こり得る。「ストリンジェントな 条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形 成されない条件をいう。この条件を明確に数値ィ匕することは困難であるが、一例を示 せ ίま、、 60°C、 1 X SSC, 0. 10/0SDS、好ましく ίま、 0. 1 X SSC、 0. 10/0SDSにネ目当 する塩濃度で、 1回より好ましくは 2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
[0023] 上記のような遺伝子を使用し、例えば、 ach遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機 能するァセチル CoAハイド口ラーゼを産生しな ヽように改変した欠失型 ach遺伝子を 作製し、該遺伝子を含む DNAでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色 体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の ach遺伝子を破壊すること が出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確 立しており、直鎖上 DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用 いる方法などがある（米国特許第 6303383号明細書、又は特開平 05-007491号公報） 。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により遺伝子破壊は、宿主上 で複製能力を持たな 、プラスミドを用いても行うことが出来る。
[0024] 欠失型の ach遺伝子を宿主染色体上の ach遺伝子と置換するには、例えば以下のよ うにすればよい。まず、温度感受性複製起点、欠失型 ach遺伝子、レバンシユークラ ーゼをコードする sacB遺伝子及びクロラムフエ-コール等の薬剤耐性を示すマーカ 一遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。
[0025] ここで、レバンシユークラーゼをコードする SacB遺伝子は、染色体上からベクター部 分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer.A.et al.Gene 145 (1994)69-73)。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシユークラ一ゼを発 現させると、シユークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、 生育することが出来ない。従って、レバンシユークラーゼを搭載したベクターが染色 体上に残ったままの菌株をシユークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベ クタ一が脱落した菌株のみシユークロース含有プレートで選択することが出来る。
[0026] sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出 来る。
バチルス 'ズブチルス： sacB GenBank Accession Number X02730 (配列番号 35) バチルス ·アミ口リキュファシエンス： sacB GenBank Accession Number X52988 ザィモモナス ·モビリス： sacB GenBank Accession Number L33402
ノ チルス'ステアロサーモフィラス： surB GenBank Accession Number U34874 ラクトバチルス ·サンフランシセンシス： frfA GenBank Accession Number AJ508391 ァセトパクタ^ ~ ·キシリナス： lsxA GenBank Accession Number AB034152
ダルコンァセトバクタ^ ~ ·ジァゾトロフィカス： lsdA GenBank Accession Number L41732 [0027] 次に、上記組換えプラスミドでコリネ型細菌を形質転換する。形質転換は、これまで に報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、ェシエリヒア'コリ K— 12 につ 、て報告されて 、るような、受容菌細胞を塩ィ匕カルシウムで処理して DNAの透 過性を増加させる方法（Mandel,M.and Higa.A., J.Mol.Biol.,53 ,159 (1970) )があり、 バチルス'ズブチルスについて報告されているような、増殖段階の細胞カゝらコンビテン トセルを調整し DNAを導入する方法（Dancan,C.H.， Wilson.G.A and Young.F.E , Gene ,1,153 (1977) )がある。あるいは、バチルス'ズブチルス、放線菌類及び酵母に つ！、て知られて 、るような DNA受容菌の細胞を組換え DNAを DNA受容菌に導入 する方法（Chang.S. and Choen.S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);
Bibb.M.J., WardJ.M. and Hopwood.O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen.A., HicksJ.B. and Fink'G.R" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978))も応用できる 。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法 (杉本ら、特開平 2-207791号公報 )によっても行うことができる。
[0028] コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、 p48K及び pSFKT2 (以上、特開
2000-262288号公報参照）、 pHSC4 (フランス特許公開 1992年 2667875号公報、特開 平 5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少な くとも 25°Cでは自律複製することができる力 37°Cでは自律複製できない。 pHSC4を 保持するェシエリヒア .コリ _112571は、 1990年 10月 11日に通商産業省工業技術院生 命工学工業技術研究所 (現独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託 センター）（干 305-5466 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番 号 FERM P-11763として寄託され、 1991年 8月 26日にブダペスト条約に基づく国際寄 託に移管され、 FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
[0029] 上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能しな!、温度（ 25°C)で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を高温で培養 し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布 する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は 、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、ごくわずかの頻度であるが、プ ラスミド上の酢酸生合成系遺伝子と染色体上の ach遺伝子と組換えを起こした菌株が 出現する。
[0030] こうして染色体に組換え DNAが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在する ach遺伝子配列との組換えを起こし、染色体の ach遺伝子と欠失型の ach遺伝子との 融合遺伝子 2個が組換え DNAの他の部分 (ベクター部分、温度感受性複製起点及 び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されて ヽる。
[0031] 次に、染色体 DNA上に欠失型の ach遺伝子のみを残すために、ベクター部分 (温 度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体 DNAから脱落さ せる。その際、正常な ach遺伝子が染色体 DNA上に残され、欠失型 ach遺伝子が切 り出される場合と、反対に欠失型 ach遺伝子が染色体 DNA上に残され、正常な ach 遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能す る温度で培養すれば、切り出された DNAはプラスミド状で細胞内に保持される。次 に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上の ach遺伝子 は、プラスミドとともに細胞力も脱落する。そして、 PCRまたはサザンノヽイブリダィゼー シヨン等により、染色体上に欠失型 ach遺伝子が残った株を選択することによって、 ach遺伝子が破壊された株を取得することができる。
[0032] なお、上記温度感受性プラスミドに換えて、コリネ型細菌内で複製能を持たないプ ラスミドを用いても、同様の遺伝子破壊を行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能 を持たないプラスミドは、ェシエリヒア'コリで複製能力を持つプラスミドが好ましぐ例 えば、 pHSG299(宝バイオ社製) pHSG399(宝バイオ社製)等が挙げられる。
[0033] さらに、ァセチル CoAノヽイド口ラーゼの活性を低下させる方法としては、上述の遺伝 子操作法以外に、例えば、コリネ型細菌を紫外線照射または、 N—メチルー N'—二 トロー N— -トロソグァ-ジン (NTG)もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられて いる変異剤によって処理し、ァセチル CoAノヽイド口ラーゼの活性が低下した菌株を選 択する方法が挙げられる。
[0034] 本発明にお ヽては、 ACH活性の低下に加えて、ホスホトランスァセチラーゼ (以下 PTA)、アセテートキナーゼ (以下 ACK)の 、ずれか又は両方の活性が低下するように 改変された細菌株を用いるとより有効である。
[0035] 本発明で、ホスホトランスァセチラーゼ (PTA)活性とは、ァセチル CoAにリン酸を転 移し、ァセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性 (EC:2.3.1.8)を意味し、ァセテ ートキナーゼ (ACK)とは、ァセチルリン酸と ADPから酢酸を生成する反応を触媒する 活性を意味 (EC:2.7.2.1)する。
[0036] これらの活性を低下させるには、上述の各酵素をコードする遺伝子を破壊すること により、または、各酵素をコードする遺伝子のプロモーターや、シャインダルガルノ（
SD)配列等発現調節配列を改変することによって達成される。遺伝子破壊方法は上 述の ach遺伝子破壊方法と同様の方法で行うことが出来る。
[0037] 各酵素をコードする遺伝子は、例えば GenBankに登録されているコリネバタテリゥム
•ダルタミカムの以下の遺伝子が利用できる。
pta遺伝子（ホスホアセチルトランスフェラーゼ） GenBank Accession No. NCgl2657 (NC— 003450の 2936506-2937495番目の相補鎖）（配列番号 39の塩基番号 956〜 1942)
ack遺伝子（アセテートキナーゼ）、 GenBank Accession No. NCgl2656
(NC— 003450の 2935313-2936506番目の相補鎖）（配列番号 39の塩基番号 1945〜
3135)
[0038] 「ホスホトランスァセチラーゼ (以下 PTA)活性が低下した」とは、 PTA非改変株と比較 して PTA活性が低下していることをいう。 PTA活性は、 PTA非改変株や野生株と比較 して低下していればよいが、菌体当たり 50%以下、さらに望ましくは 10%以下に低下 されていることが好ましい。また、 PTA活性は完全に欠損していてもよい。 PTA活性が 低下したことは、 Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12,
381-386(1969))により、 PTA活性を測定することによって確認することができる。 ACH 及び PTA活性が低下したコリネ型細菌は、 ACH活性が低下したコリネ型細菌を作製 し、さらに、 PTA活性が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、 PTA活性低下のための改変と ACH活性低下のための改変は、 、ずれを先に行って ちょい。
[0039] 「アセテートキナーゼ (以下 ACK)活性が低下した」とは、野生株または、 ACK非改変 株と比較して ACK活性が低下していることをいう。 ACK活性は、 ACK非改変株や野 生株と比較して低下していればよいが、 ACK非改変株と比較して、菌体当たり 50% 以下、さらに望ましくは菌体当たり 10%以下に低下されていることが好ましい。また、 ACK活性は完全に欠損していてもよい。 ACK活性が低下したことは、 Ramponiらの方 法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975))〖こより、 ACK活性を測定すること によって確認することができる。 ACH及び ACK活性が低下したコリネ型細菌は、 ACH 活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらに ACK活性が低下するように改変するこ とより得ることができる。ただし、 ACK活性低下のための改変と、 ACH活性低下のため の改変は、いずれを先に行ってもよい。
[0040] 本反応においては、上記 ACH活性の低下に加えて、ラタテートデヒドロゲナーゼ（ 以下 LDHと呼ぶことがある）活性が低下するように改変された細菌株を用いるとより有 効である。ラタテートデヒドロゲナーゼ活性とは、 NADHを補酵素として、ピルビン酸を 還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性を意味する。「ラタテートデヒドロゲナー ゼ活性が低下された」とは、 LDH非改変株と比較して LDH活性が低下していることを いう。 LDH活性は、 LDH非改変株や野生株と比較して低下していればよいが菌体当 たり 50%、望ましくは、菌体当たり 10%以下に低下していることが好ましい。また、 LDH活性は完全に欠損して!/、てもよ!/、。 LDH活性が低下したことはし Kanarekらの方 法（L.Kanarek and R丄. Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964))により LDH活性を測定 すること〖こよって確認することができる。本発明のコリネ型細菌は、 LDH活性が低下し たコリネ型細菌を作製し、さらに ACH活性が低下するように改変することにより得るこ とができる。ただし、 LDH活性を低下させるための改変と、 ACH活性を低下させるた めの改変はいずれを先に行ってもよい。 ldh遺伝子としては、例えば配列番号 37に示 す配列を有する遺伝子を使用することができ、上記 ach遺伝子と同様の方法により遺 伝子破壊等を行うことができる。
[0041] また、本反応においては、 ACHの活性の低下に加えて、ピルべ一トカルボキシラー ゼ（以下 PCと呼ぶ）の活性が上昇するように改変された細菌を用いてもょ ヽ。「ピルべ 一トカルボキシラーゼの活性が増強される」とは、 PCの活性が野生株又は親株等の 非改変株に対して上昇していることをいう。 PCの活性は Peters-Wendisch P.Gらの方 法方法（Peters- Wendisch P.G. et al. Microbiology 143, 1095-1103(1997))〖こより測 定することができる。 [0042] 本発明の方法に使用される PCタンパク質をコードする pc遺伝子は、既にその塩基 配列が決定されている遺伝子、もしくは、下記に示すような方法により PC活性を有す るタンパク質をコードする DNA断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配 列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その 配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。例えばコリネバクテリウム' グルタミカム ATCC13032のピルべ一トカルボキシラーゼ遺伝子 GenBank Accession No. NCgl0659遺伝子（配列番号 46)を使用することが出来る。その他にも以下の生物 由来の PC遺伝子を使用することもできる。
ヒト [Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009—1014, (1994)]
マウス [Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)]
ラッド [GENE, 165, 331-332, (1995)]
酵母；サッカロマイセス .セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッ 7ロマ セス ·ホンぺ (Schizosaccharomyces pombe)
[DDBJ Accession No.; D78170]
ノ チルス'ステア口サーモフィルス (Bacillus stearothermophilus)
[GENE, 191, 47-50, (1997)]
リゾビゥム 'エトリ (Rhizobium etli)
[j.Bacteriol, 178, 5960-5970, (1996)]
[0043] pc遺伝子を含む DNA断片は、適当な発現プラスミド、例えば pUC118 (宝バイオ社 製)へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばェシエリヒア'コリ JM109 (宝バイオ社製)へ 導入すること〖こより発現させることができる。発現した pc遺伝子産物であるピルビン酸 カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体力も上記の公知の方法により PC活性を測 定し、非形質転赚力も抽出した粗酵素液の PC活性と比較することにより、確認する ことができる。 pc遺伝子を含む DNA断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内 でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入 することにより、コリネ型細菌内で pcの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができ る。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、 pc遺伝子を発現させるためのプロモー ターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができる力 それに限られるも のではなぐ pc遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であれば 、かなるプロモ 一ターであっても良い。
[0044] pc遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複 製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具 体例としては、例えば、特開平 3— 210184号公報に記載のプラスミド pCRY30 ;特 開平 2— 72876号公報及び米国特許 5, 185, 262号明細書公報に記載のプラスミ ド pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KE及び pCRY3KX; 特開平 1― 191686号公報に記載のプラスミド 0^^2ぉょび 0^¾；特開昭 58— 67679号公報【こ記載の pAM330 ;特開日召 58— 77895号公報【こ記載の pHM1519 ；特開昭 58— 192900号公報に記載の pAJ655、 pAJ611及び pAJ1844；特開昭 5 7— 134500号公報に記載の pCGl ;特開昭 58— 35197号公報に記載の pCG2 ; 特開昭 57— 183799号公報に記載の pCG4および pCGl l等を挙げることができる
[0045] それらの中でもコリネ型細菌の宿主 ベクター系で用いられるプラスミドベクターと しては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内 でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましぐ例えば、プラスミド pCRY30、 pCRY21、 pCRY2KE、 pCRY2KX、 pCRY31、 pCRY3KEおよび pC RY3KX等が好適に使用される。
[0046] pc遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクター の適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビ ノ クテリゥム.ラタトフアーメンタム (Brevibacterium lactofermentum)2256株 (
ATCC13869)を形質転換することにより、 pc遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌 が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol, Vol.144, p.181-185, 1993)等によって行うことができる。なお、 PC活性の増強は、公知の相同 組換え法によって染色体上で pc遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させ ること〖こよっても行うことができる。このようにして得られる PC遺伝子高発現株におい て ach遺伝子を破壊することにより、 PC活性が増強され、且つ ACH活性が低減化され た細菌株を得ることが出来る。なお、 ACH活性の低減化と PC活性の増強はどちらを 先に行っても良い。
[0047] さらに、本発明にお ヽては、 ACH活性または、 ACH、 PTA活性、 ACK活性が低下す るように改変され、さらに LDH活性が低下するように改変され、さらに又は PC活性が 増強するように改変された細菌を用いると、物質生産、特にコハク酸の製造に特に有 効である。
[0048] < 3 >本発明の微生物を用いたコハク酸の生産
上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にコハク酸を生 成蓄積させ、該培地からコハク酸を採取することにより、コハク酸を効率よく製造する ことができる。
[0049] コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で 斜面培養したものを直接反応に用いても良 ヽが、上記細菌を予め液体培地で培養 ( 種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を、有機原料を含 む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって製造することができる。 また、増殖させて得られた菌体を回収し、該菌体を、有機原料を含む反応液中で有 機原料と反応させることによつても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌 を本発明の方法に用いるためには、細菌を通常の好気的な条件で培養した後、反応 に用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培 地を用いることができる。例えば、硫酸アンモ-ゥム、リン酸カリウム、硫酸マグネシゥ ム等の無機塩カゝらなる組成物に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を 添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体を回収して用いる場合、 菌体は遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
[0050] 本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、 例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破 砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画 分等が挙げられる。
[0051] 本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生 成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラタトース、ダル コース、フノレクトース、グリセローノレ、シユークロース、サッカロース、デンプン、セノレ口 ース等の炭水化物；グリセリン、マン-トール、キシリトール、リビトール等のポリアルコ ール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロール が好ましぐ特にグルコースが好ましい。
[0052] また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発 酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特 に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利 であり、通常、 5〜30% (1\^7 ）、好ましくは10〜20% (1^7 ）の範囲内で反応が 行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加 添加を行っても良い。
[0053] 上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、水、緩衝液、培地等が用い られる力 培地が最も好ましい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む反応液である ことが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる 窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニゥム塩、硝酸塩、尿素、 大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティー プリカ一などの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リ ン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられ る。また、ピオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオ チド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の 発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
[0054] 反応液の pHは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、 炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸ィ匕マグネシウム等を添 加することによって調整することができる。本反応における pHは、通常、 pH5〜10、 好ましくは pH6〜9. 5であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液の p Hはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
[0055] 培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガス（二酸化炭素）を含有させること が好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸 マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム力も供 給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから 供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシ ゥム、炭酸アンモ-ゥム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモ-ゥム、重炭酸 ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、 0. 001〜5M、好ましくは 0. 1〜3M、さらに好ましくは 1〜2Mの濃度で添加する。炭酸 ガスを含有させる場合は、溶液 1L当たり 50mg〜25g、好ましくは 100mg〜15g、さ らに好ましくは 150mg〜 10gの炭酸ガスを含有させる。
[0056] 本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、 25°C〜35°Cである。反応時の温 度は、通常、 25°C〜40°C、好ましくは 30°C〜37°Cである。反応に用いる菌体の量 は、特に規定されないが、 l〜700gZL、好ましくは 10〜500gZL、さらに好ましく は 20〜400gZLが用いられる。反応時間は 1時間〜 168時間が好ましぐ 3時間〜 72時間がより好ましい。
[0057] 細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸 の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的 条件下で行ってもよい。ここで言う嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑 えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として 0〜2ppm、好ましくは 0 〜lppm、さらに好ましくは 0〜0. 5ppmで反応させることが望ましい。そのための方 法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを 供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることが できる。
[0058] 反応液 (培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離'精製す ることができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後 、イオン交換榭脂等で脱塩し、その溶液力も結晶化あるいはカラムクロマトグラフィー によりコハク酸を分離 ·精製することができる。
[0059] さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、 得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造 することができる。コハク酸含有ポリマーはホモポリマーであってもよいし、他のポリマ 一原料との共重合ポリマーであってもよい。近年、環境に配慮した工業製品が数を増 す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明におい て製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用い る事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレン グリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、へ キサメチレンジァミンなどのジァミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミド などが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物 は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
[0060] [実施例]
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する.
実施例 1
[0061] < 1 >sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築
(A) pBS3の構築
sacB遺伝子（配列番号 35)をバチルス.ズブチリスの染色体 DNAを铸型として配列 番号 1と 2をプライマーとして用いて、 PCRにより取得した。 PCR反応は、 LA taq(TaKaRa)を用い、 94 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 30秒、会合 49 °C 30秒、伸長 72°C 2分力もなるサイクルを 25回繰り返した。生成した PCR産物を常法 により精製後 Bglllと BamHIで消化し、平滑化した。この断片を pHSG299の Availで消 化後、平滑化した部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコン ピテントセル (宝バイオ社製)を用いて形質転換を行!ヽ、カナマイシン (以下、 Kmと略 す) 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣 り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを 抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS3と命名した。 pBS3の構築過程 を図 1に示す。
[0062] (B) pBS4Sの構築
PBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中の Smal部位をァミノ基置換を伴 わない塩基置換によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバ 一 PCRで取得した。まず、 pBS3を铸型として配列番号 3, 4の合成 DNAをプライマーと して PCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子の N末端側の増幅産物を得る。一方 Km耐 性遺伝子の C末端側の増幅産物を得るために pBS3を铸型として配列番号 5, 6の合 成 DNAを铸型として PCRを行った。 PCR反応は Pyrobest DNA Polymerase (宝バイオ 社製)を用い、 98 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 98°C 10秒、会合 57°C 30 秒、伸長 72°C 1分力もなるサイクルを 25回繰り返すことにより目的の PCR産物を得るこ とができる。配列番号 4と 5は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在する Smal 部位はアミノ酸置換を伴わな 、塩基置換を施すことにより破壊されて 、る。次に Smal 部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイ シン耐性遺伝子 N末端側及び C末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなる ように混合し、これを铸型として配列番号 3, 6の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 い変異導入された Km耐性遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は Pyrobest DNA Polymerase (宝バイオ社)を用い、 98 °Cで 5分保温を 1サイクル行った後、変性 98°C 10 秒、会合 57°C 30秒、伸長 72°C 1.5分力もなるサイクルを 25回繰り返すことにより目的 の PCR産物を得ることができる。
[0063] PCR産物を常法により精製後 Banllで消化し、上記の pBS3の Banll部位に挿入した。
この DNAを用いて、ェシエリヒア 'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ社製宝バイ ォ社製)を用いて形質転換を行 ヽ、カナマイシン 25 μ g/mlを含む LB培地に塗布し、 一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換 体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入され て！、たものを pBS4Sと命名した。 pBS4Sの構築過程を図 2に示す。
[0064] (C) pBS5Tの構築
上記 (B)で構築した pBS4Sにコリネ型細菌の温度感受性複製起点を挿入したプラス ミドの構築方法は、！)1"[3じ4(特許公開平5— 7491参照）の BamHIと Smal処理して平 滑ィ匕して得たコリネ型細菌の温度感受性複製起点を PBS4Sの Ndelサイトを平滑ィ匕し た部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝 バイオ社製)を用いて形質転換を行い、 Km 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩 培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を 得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されてい たものを PBS5Tと命名した。
図 3に pBS5Tの構築図を示す。
実施例 2
[0065] く LDH遺伝子破壊株の構築 >
(A)ラタテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム ·ラタトフアーメンタム 2256株由来のラタテートデヒドロゲナーゼ（ 以下、 ldh遺伝子と略す)の ORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネ バタテリゥム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database Accession
No.NC_003450)の該遺伝子の塩基配列（配列番号 37)を参考に設計した合成 DNA をプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的にはブレビバタテリ ゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株の染色体 DNAを铸型として、配列番号 7、 8の合成 DNAをプライマーとして常法により PCRを行い ldh遺伝子 N末端側の増幅産物を得た 。一方、 ldh遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 9、 10の合成 DNAをプライマーとし て常法により PCRを行った。配列番号 8と 9は互いに相補的であり、 ldhの ORFの全配 列を欠損させた構造となって 、る。
なお、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株は、アメリカン 'タイプ ·カルチヤ 一'コレクション (ATCC)より分譲を受けることができる（住所 ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)。
[0066] 次に内部配列を欠失した ldh遺伝子断片を得るために、上記 ldh N末側および C末 側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸型として配列番 号 11と 12の合成 DNAをプライマーとして常法により PCRを行い変異導入された ldh遺 伝子増幅産物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Sailで消化した後、上 記 PBS4Sの Sail部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビ テントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ M、 X-Gal 40 μ g/mlおよび Km 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した 白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転 換体よりプラスミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを p A ldh56- 1と命 名した。該プラスミドの構築図を図 4に示す。
[0067] (B) ldh破壊株の作成
上記 (A)で得られた p Δ ldh56-lはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領 域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度 であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体とし て出現する。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株を電気パルス法により高 濃度のプラスミド P Δ ldh56-lを用いて形質転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH PO lg/Lゝ MgSO · 7Η O 0.4g/Lゝ FeSO · 7Η O 0.01g/L、 MnSO - 7H O O.Olg/L
2 4 4 2 4 2 4 2
、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、 pH7.5(KOH))に塗布し、 31.5°Cで約 30時間 培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの ldh遺伝子断片とブレビバタテリ ゥム ·ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こし た結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝 子が挿入されて ヽる株である。
[0068] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex- S10培地（ショ糖 10g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH
2
PO lg/Lゝ MgSO · 7Η O 0.4g/L、 FeSO - 7H O O.Olg/L, MnSO -4H O O.Olg/Lゝ尿
4 4 2 4 2 4 2 素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ピオチン 10 /z g/L、 pH7.5(KOH))に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝子 が脱落しシユークロース非感受性となったと考えられる株約 50個得た。
[0069] この様にして得られた株の中には、その ldh遺伝子が p A ldh56-lに由来する変異型 に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ldh遺伝子が変異型であるか 野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR 反応に供し、 ldh遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ldh遺伝子を PCR増幅するためのプライマー (配列番号 7および配列番号 10)を用いて分析した際 、 2256株の染色体 DNAを铸型にしたものよりも PCR産物の大きさが小さいものを ldh欠 損株として以降の実験に使用した。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分 祈した結果、変異型 ldh遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh)株と命名 した。また、以下の酢酸生合成系遺伝子破壊株の親株には該株を用いた。
実施例 3
[0070] くアセテートキナーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)アセテートキナーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のアセテートキナーゼ遺伝子（以下、 該遺伝子を ackとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されている コリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database Accession
No.NC_003450)該遺伝子の塩基配列（配列番号 39の 1945〜3135)を参考に設計 した合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には 、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 13と 14の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 ヽ、 ack遺伝子 N末端側の増幅産物を得た 。一方、 ack遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 15と 16の合成 DNAをプライマー として PCRを行った。配列番号 14と 15は部分的に相補的である。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、 N末端側に関しては 、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 30秒力 なるサイクルを、 C末端側に関 しては変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2分力 なるサイクルをそれぞれ 30 回繰り返した。次に、内部配列を欠失した ack遺伝子断片を得るために、上記 ack N 末側および C末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸 型として配列番号 17と 18の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入された ack遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus- (東洋紡社製)を用い、 94°Cで 2 分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2.5分から なるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された ack遺伝子増幅産物を得た。
[0071] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記の実施例 1 (C)で構築し た PBS5Tの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビ テントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ M、 X-Gal 40 μ g/mlおよびカナマイシン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、ー晚培養した。その後、 出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られ た形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: A ackと命名した。 pBS5T:: A ackの構築過程を図 5に示した。
[0072] (B) ack破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS5T:: Δ ackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受性 である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能 であるが、 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用いて ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株を電気パルス法により形質転換 し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培養し、出現 したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保有して いる。これらの形質転換体をカナマイシンを含まない CM- Dex培地（グルコース 5g/L 、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラタト 10g/L、 KH PO lg/L、 MgSO · 7Η Ο
2 4 4 2
0.4g/L、 FeSO · 7Η Ο 0.01g/L、 MnSO · 7Η Ο 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解
4 2 4 2
物 1.2g/L、 pH7.5(KOH))にて 34°Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシン を 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に塗布し、 34°Cで約 30時間培養した。この培地上に生 育した株は該プラスミドの ack遺伝子断片とブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されて いる。
[0073] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex-S10培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組 み換えにより SacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約 50個得た
[0074] この様にして得られた株の中には、その ack遺伝子が pBS5T:: A ackに由来する変異 型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ack遺伝子が変異型である か野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、 ack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ack遺伝子 を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 13および配列番号 16)を用いて分析す ると、野生型では 3.7kb、欠失領域を持つ変異型では 2.5kbの DNA断片を認めるはず である。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子 のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh, ack)と命名した。
実施例 4
[0075] くアセテートキナーゼ、ホスホトランスァセチラーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)アセテートキナーゼ、ホスホトランスァセチラーゼ遺伝子破壊用断片のクローニン グ
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のアセテートキナーゼ (ack)とホスホト ランスァセチラーゼ遺伝子（以下、該遺伝子を ptaとする）の ORFはオペロン構造をと つており、これらの ORFを同時に欠失させることが可能である。これらの遺伝子断片の 取得は、既に公開されているコリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database Accession No. NC_003450)の該遺伝子の塩基配列（pta- ack遺伝子；配列 番号 39)を参考に設計した合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで 取得した。具体的には、ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを 铸型とし、配列番号 19と 20の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い、 pta遺伝子 N末 端側の増幅産物を得た。一方、 ack遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビ バタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 21と 16の 合成 DNAをプライマーとして PCRを行った。配列番号 20と 21は部分的に相補的であ る。 PCR反応は、 KOD -plus-(TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った 後、 N末端側に関しては、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 30秒からなる サイクルを、 C末端側に関しては変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2分から なるサイクルをそれぞれ 30回繰り返した。
[0076] 次に、 ptaと ackの内部配列を欠失した pta_ack遺伝子断片を得るために、上記 pta N 末側および ackC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これ を铸型として配列番号 22と 18の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入さ れた pta-ack遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus-(TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 2.5分力もなるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された pta-ack遺伝子増幅産 物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、 pBS5Tの Xbal部位 に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（宝バイオ 社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 M、 X- Gal 40 g/mlおよびカナマイシ ン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコ口- 一を釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりブラ スミドを抽出し、 目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: A pta-ackと命名し た。 pBS5T:: Δ pta-ackの構築過程を図 6に示した。
[0077] (B) pta- ack破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS5T:: Δ pta-ackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感 受性である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製 可能であるが、 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用 いてブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh)株を電気パルス法により形質 転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培養し、 出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保 有して 、る。これらの形質転換体をカナマイシンを含まな 、CM- Dex液体培地にて 34 °Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に 塗布し、 34°Cで約 30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの pta-ack遺伝子断片とブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Wh)株ゲノム上 の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来す るカナマイシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。
[0078] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cでー晚培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%シユークロース 含有 Dex-S10培地に塗布し、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相 同組み換えにより SacB遺伝子が脱落しシユークロース非感受性となったと考えられる 株約 50個得た。
[0079] この様にして得られた株の中には、その ptaと ack遺伝子が pBS5T:: A pta-ackに由来 する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ack遺伝子が変異 型であるか野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体 を直接 PCR反応に供し、 ptaと ack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる 。 pta-ack遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 19および配列番号 16) を用いて分析すると、野生型では 5.0kb、欠失領域を持つ変異型では 2.7kbの DNA断 片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有 する株を選抜し、該株を 2256 A (ldh, pta, ack)と命名した。
実施例 5
[0080] <ピルべートォキシダーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)ピルべートォキシダーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のピルべートォキシダーゼ遺伝子（ 以下、該遺伝子を poxBとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開さ れているコリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database Accession No. NC_003450)の該遺伝子の塩基配列（配列番号 42)を参考に設計した合成 DNA をプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、ブレビバクテ リウム'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 23と 24の合成 DNA をプライマーとして PCRを行 、、 poxB遺伝子 N末端側の増幅産物を得た。
[0081] 一方、 poxB遺伝子 C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 25と 26の合成 DNAをプライマー として PCRを行う。配列番号 24と 25は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 N末端側、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル行 つた後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 40秒力 なるサイクルを 30回繰 り返した。次に、内部配列を欠失した poxB遺伝子断片を得るために、上記 poxB N末 端側および C末端側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを 铸型として配列番号 27と 28の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入され た poxB遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD -plus- (TOYOBO)を用い、 94°C で 2分保温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 70秒か らなるサイクルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された poxB遺伝子増幅産物を得た。 [0082] 生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (C)で構築した PBS5Tの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテ ントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/ml およびカナマイシン 25 g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現 した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形 質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS5T:: Δ poxBと命名した。 pBS5T:: Δ ροχΒの構築過程を図 7に示した。
[0083] (Β) ροχΒ破壊株の作成
上記 (Α)で得られた pBS5T:: Δ poxBにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受 性である。具体的には、該プラスミドは 25°Cではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可 能である力 31.5°C (あるいは 34°C)では自律複製不可能となる。該プラスミドを用い てブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh, pta, ack)株を電気パルス法によ り形質転換し、カナマイシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 25°Cにて 2晚培 養し、出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミド を保有しているはずである。
[0084] これらの形質転換体をカナマイシンを含まな!/、CM- Dex液体培地にて 34°Cでー晚 培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを 25 μ g/ml含む CM-Dex培地に塗布し、 34 °Cで約 30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドの poxB遺伝子断片 とブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh, pta, ack)株株ゲノム上の同遺伝 子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマ イシン耐性遺伝子および SacB遺伝子が挿入されている。次にこれらの一回目の組換 え体をカナマイシンを含まない CM- Dex液体培地にて 31.5°Cでー晚培養し、適当に 希釈した後、カナマイシンを含まな!/ヽ 10%シユークロース含有 Dex-S 10培地に塗布に し、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組み換えにより SacB遺伝 子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約 50個得た。
[0085] この様にして得られた株の中には、その poxB遺伝子が pBS5T:: A poxBに由来する 変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。アセテートキナーゼ遺 伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得 られた菌体を直接 PCR反応に供し、 poxB遺伝子の検出を行うことによって容易に確 認できる。 poxB遺伝子を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 23および配列番 号 26)を用いて分析すると、野生型では 2.4kb、欠失領域を持つ変異型では 1.2kbの DNA断片を検出出来る。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果 、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を 2256 A (Wh, pta, ack, poxB)と命名 した。
実施例 6
<ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子破壊株の構築 >
(A)ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子破壊用断片のクローユング
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株のァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝 子（以下、該遺伝子を achとする）の ORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開 されているコリネバタテリゥム 'グルタミカム ATCC13032 (GenBank Database
Accession No. NC_003450 )の該遺伝子の塩基配列（配列番号 44)を参考に設計し た合成 DNAをプライマーとして用いたクロスオーバー PCRで取得した。具体的には、 ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型とし、配列番号 29と 30の合成 DNAをプライマーとして PCRを行 、、 ach遺伝子 C末端側の増幅産物を得る 。一方、 ach遺伝子 N末端側の増幅産物を得るために、ブレビバタテリゥム 'ラタトファ ーメンタム 2256株ゲノム DNAを铸型として、配列番号 31と 32の合成 DNAをプライマ 一として PCRを行う。配列番号 30と 31は互いに相補的である。 PCR反応は、 KOD -plus- (東洋紡社製)を用い、 N末端側、 C末端側ともに、 94°Cで 2分保温を 1サイクル 行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 50秒力 なるサイクルを 30回 繰り返した。次に、内部配列を欠失した ach遺伝子断片を得るために、上記 ach N末 側および C末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを铸型 として配列番号 33と 34の合成 DNAをプライマーとして PCRを行い変異導入された ach 遺伝子増幅産物を得た。 PCR反応は、 KOD - plus- (TOYOBO)を用い、 94°Cで 2分保 温を 1サイクル行った後、変性 94°C 10秒、会合 55°C 30秒、伸長 68°C 90秒力 なるサ イタルを 30回繰り返し、 目的の変異導入された ach遺伝子増幅産物を得た。生成した PCR産物を常法により精製後 Xbalで消化し、上記実施例 1 (B)で構築した pBS4Sの Xbal部位に挿入した。この DNAを用いて、ェシエリヒア'コリ JM109のコンビテントセル（ 宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、 IPTG 100 μ Μ、 X- Gal 40 μ g/mlおよび力 ナマイシン 25 /z g/mlを含む LB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色 のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体 よりプラスミドを抽出し、目的の PCR産物が挿入されていたものを pBS4S:: A achと命名 した。 pBS4S:: A achの構築過程を図 8に示した。
[0087] (B) ach破壊株の作成
上記 (A)で得られた pBS4S:: Δ achはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする 領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻 度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体と して出現する。ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Idh)株、 2256 A (Wh, pta, ack)株、 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB)株、及び 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB, acp)株 を電気パルス法により高濃度のプラスミド PBS4S:: Δ achを用いて形質転換し、カナマ イシン 25 μ g/mlを含む CM- Dex培地に塗布し、 31.5°Cで約 30時間培養した。この培 地上に生育した株は該プラスミドの ach遺伝子断片とブレビバタテリゥム'ラクトファーメ ンタム 2256 Δ (ldh)株、 2256 Δ (ldh, pta, ack)株、 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB)株、及び 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB, acp)株のそれぞれのゲノム上の同遺伝子との間で相同 組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝 子および SacB遺伝子が挿入されて!、る。
[0088] 次にこれらの一回目の糸且換え体をカナマイシンを含まな!/ヽ CM-Dex液体培地にて 31.5°Cで一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない 10%ショ糖含有 Dex-S10培地に塗布にし、 31.5°Cにて約 30時間培養した。その結果、 2回目の相同組 み換えにより SacB遺伝子が脱落しシユークロース糖非感受性となったと考えられる株 約 50個得た。
[0089] この様にして得られた株の中には、その ach遺伝子が pBS4S:: A achに由来する変異 型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。 ach遺伝子が変異型である か野生型であるかの確認は、 Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接 PCR反応に供し、 ach遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。 ach遺伝子 を PCR増幅するためのプライマー（配列番号 29および配列番号 32)を用いて分析す ると、野生型では 2.9kb、欠失領域を持つ変異型では 1.4kbの DNA断片を認めるはず である。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子 のみを有する株を選抜し、 2256 A (ldh)株力 得られた該株を 2256 A (Wh, ach)株、 2256 A (ldh, pta, ack)株から得られた該株を 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach), 2256 A (ldh, pta, ack, poxB)株から得られた該株を 2256 Δ (ldh, pta, ack, poxB, ach)株と命名した 実施例 7
[0090] < ach欠損株によるコハク酸生産 >
(A) ach欠損株の培養評価
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (ldh)株及び 2256 Δ (ldh, ach)株を用 いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM- Dexプレート培地にて培 養して得た 2256 Δ (ldh)株及び 2256 Δ (ldh, ack)株の菌体をシード培地 3ml (ダルコ一 ス 10g/Lゝ (NH ) SO 2.5g/L、 KH PO 0.5g/L、 MgSO - 7H O 0.25g/L、尿素 2g/L、
4 2 4 2 4 4 2
FeSO · 7H O 0.01g/L、 MnSO · 7H O 0.01g/L、ビォチン 50 μ g/Lゝ VB1 · HC1 100 μ
4 2 4 2
g/L、プロトカテク酸 15mg/L、 CuSO 0.02mg/L、 CaCl 10mg/L、 pH7.0(KOH))に接種
4 2
し、好気条件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。
[0091] その後、その試験管にメイン培地 3ml (グルコース 70g/L、 (NH ) SO 5g/L、 KH PO
4 2 4 2
2g/L、尿素 3g/L、 FeSO - 7H O 0.01g/L、 MnSO - 7H O 0.01g/L、ビォチン 200
4 4 2 4 2
g/L、 VB1 - HC1 200 μ g/L、 MOPS 40g/L、 MgCO 50g/L、 pH6.8(NaOH))を接種し、
3
通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は 31.5°Cで 約 24時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。
[0092] 培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD- lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や酢酸を測定した。このときの結果を表 1に示した。 [0093] 2256 Δ (Wh,ach)株では、その親株の 2256 Δ (Wh)株に比べて、収率は約 6%の向上が 認められた。
[0094] [表 1]
表 1. ACH欠損株のコハク酸と酢酸生産
菌株 OD620nm( x 51) 消費糖 (g/し） コハク酸収率 (％) 酢酸 (/コハク酸、90
2256 A ldh 0.366 35.8 57.1 9.2
2256 AGdh, ach) 0.353 31.4 63.1 17.4
[0095] (B) ach、 pta、 ack欠損株の培養評価
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 A (ldh)株及び 2256 A (ldh, ach, pta, ack)株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM- Dexプレート 培地にて培養して得た 2256 A (ldh)株、、及び 2256 A (ldh, ack, pta, ack)株の菌体を 上述のシード培地 3mlに接種し、好気条件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう 培養を行った。
その後、その試験管に上述のメイン培地 3mlを接種し、通気を防ぐため、シリコン栓 で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は 31.5°Cで約 24時間振とうして培地中 の糖がなくなる前に培養を終了した。
[0096] 培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈し た後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu )を二本直列接続したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40 °Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスルホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、 CDD- lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定 することによりコハク酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表 2に示した。
[0097] 2256 Δ (Wh, ach, pta, ack)ではコハク酸生産に関しては親株である 2256 Δ (ldh)株と 同等であつたが、コハク酸あたりの酢酸は 2256 A (Wh,ach)株の約 1/3、 2256 A (Wh)株 と比較しても約 1/2となり大幅に酢酸副生が低減した。これらの結果と上記 (A)の結果 から、酢酸低減に関しては、 PTA-ACKあるいは ACH活性単独での消失または低下 は有効ではないが、これら全ての活性を消失または低下することにより大幅に減少す ることが示された。また、 ACHを含む PTA, ACKのいずれかの活性を消失または低下 させることが酢酸低減に有効であることが容易に推察される。更に、コハク酸生産は ACH活性の単独での消失または低下が有効であることが示された。
[表 2]
表 2. ACHと PTA, ACKを組み合わせて欠損させた株のコハク酸と酢酸生産
菌株 OD620( 51) 消費糖 (g/L) コハク酸収率 (%) 醉酸 (/コハク酸％)
2256 Δ Idh 0.342 31.8 57.3 11.9
2256 Δ (Idh ach) 0.364 33.0 63.6 17.3
2256 Δ (ldh,ach,pta,ack) 0.347 39.0 58.3 6.1
[0099] (C) ach、 ptaゝ ackゝ poxB欠損株の培養評価
ブレビバタテリゥム 'ラタトフアーメンタム 2256 Δ (Idh)株、 2256 A (Wh, pta-ack, ach)株 、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB)株、及び 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB, ach)株を用いてコ ハク酸生産のための培養を以下のように行った。 CM- Dexプレート培地にて培養して 得た 2256 Δ (ldh)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, ach)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB)株、 2256 Δ (ldh, pta-ack, poxB, ach)株の菌体を上述のシード培地 3mlに接種し、好気条 件にて 31.5°Cにて試験管で約 15時間振とう培養を行った。
[0100] その後、その試験管に上述のメイン培地 3mlを接種し、通気を防ぐため、シリコン栓 で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は 31.5°Cで約 24時間振とうして培地中 の糖がなくなる前に培養を終了した。培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸 の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。力 ラムは Shim-pack SCR-102H (Simazu)を二本直列接続したものを用い、サンプルは 5mM p-トルエンスルホン酸を用いて 40°Cで溶出した。溶出液を 5mM p-トルエンスル ホン酸および 100 μ M EDTAを含む 20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、
CDD-lOAD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生酢酸測定 した。そのときの結果を表 3に示した。
[0101] 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach)株から更に poxBを欠損した 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach, poxB)株の酢酸は更に低減し、親株である 2256 Δ (ldh, pta, ack, ach)株の約 40%低 減した。このことより、 ach及び pta, ack, poxBの全てまたはいずれかの活性が同時に 消失または低下することにより、酢酸低減に有効であることが示された。
[0102] [表 3] 表 3. ACHと PTA, ACK, POXBを組み合わせて弱化した株のコハク酸と酢酸生産
菌株 OD620( x 51) 消費糖 (g L) コハク酸収率 (%) 醉酸 (/コハク酸 %)
2256 A Idh 0.342 31.8 57.3 11.9
2256 A (ldh,pta,ack,ach) 0.347 39 58.4 6.1
2256 Δ (ldh,pta,ack,poxB,ach) 0.372 39.8 56.1 3.6 産業上の利用の可能性
本発明の微生物を用いることにより、コノ、ク酸を効率よく製造することができる。コハ ク酸は生分解性ポリマー等の原料として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ァセチル CoAハイド口ラーゼの活性 が低下するように改変されたコリネ型細菌。
[2] 前記ァセチル CoAハイド口ラーゼが、下記 (A)又は (B)に記載のタンパク質である請 求項 1に記載のコリネ型細菌、
(A)配列番号 45に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B)配列番号 45に示すアミノ酸配列にお 、て、 1若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、挿入、または付カ卩を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ァセチル CoAノヽイド口ラー ゼ活性を有するタンパク質。
[3] 染色体上のァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子が破壊されたことによりァセチル CoA ノ、イド口ラーゼ活性が低下した、請求項 1又は 2に記載のコリネ型細菌。
[4] 前記ァセチル CoAノヽイド口ラーゼ遺伝子力 下記（a)又は（b)に記載の DNAである 請求項 3に記載のコリネ型細菌、
(a)配列番号 44の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列を含む DNA、又は
(b)配列番号 44の塩基番号 1037〜2542からなる塩基配列又は同塩基配列か ら調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、かつ、ァセチ ル CoAハイド口ラーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[5] さらに、ホスホトランスァセチラーゼ及びアセテートキナーゼのいずれかまたは両方の 活性が低下するように改変させされた請求項 1〜4のいずれか一項に記載のコリネ型 細菌
[6] さらに、ラタテートデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された請求項 1〜5の
V、ずれか一項に記載のコリネ型細菌。
[7] さらに、ピルべ一トカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変された請求項 1〜6の
V、ずれか一項に記載のコリネ型細菌。
[8] 請求項 1〜7のいずれか一項に記載のコリネ型細菌またはその処理物を、炭酸ィォ ン、重炭酸イオンまたは二酸ィ匕炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させるこ とにより、該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取する ことを特徴とするコハク酸の製造方法。 有機原料を嫌気的条件下で作用させることを特徴する請求項 8に記載の製造方法。 請求項 8または 9に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク 酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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