JPH11206385A - ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子及び該遺伝子破壊株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子
破壊株を提供する。 【解決手段】 配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮ
Ａ断片もしくはその一部、又はこのＤＮＡと生理的条件
下でハイブリダイズし得るＤＮＡ断片もしくはその一部
がベクターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを、
微生物細胞に導入し、この微生物細胞の染色体ＤＮＡ上
のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と前記ＤＮＡ断片
との相同組換えによりラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子を破壊する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラクテートデヒド
ロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片及びそれを用いたラ
クテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作成方法に関
する。更に詳しくは、ブレビバクテリウム・フラバム等
のコリネ型細菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼをコ
ードするＤＮＡ断片及びそれを用いた染色体ＤＮＡとの
相同性組換えの原理による、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ遺伝子破壊株の作成方法に関する。

【０００２】乳酸は、アミノ酸、有機酸等の各種ファイ
ンケミカルズを製造する場合の副生物である。

【０００３】

【従来の技術】ラクテートデヒドロゲナーゼは、ニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補
酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素
であるが、大腸菌あるいはコリネ型細菌等の微生物を用
いて、リジン、トレオニン、イソロイシン、グルタミン
酸等のアミノ酸、および、コハク酸、フマル酸、クエン
酸等の有機酸等の各種ファインケミカルズを製造しよう
という場合は、副生物として乳酸等を生成する原因とな
る。そこで、従来は、例えばリジン製造において副生物
の乳酸生成を抑える方法として、培養中の酸素供給濃度
を十分に保つことにより乳酸の生成を抑える方法などが
知られていた（K.Akashi et al., Agric.Biol. Chem.,
43, 2087, 1979）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記方
法は、ファインケミカルズの製造に用いる微生物の培養
中の、酸素濃度をコントロールするという煩雑な操作等
が必要となり、ファインケミカルズを製造しようとする
場合において作業効率が低減する結果となる。そこで、
このように乳酸生成を抑えるために酸素濃度をコントロ
ールする必要のない、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性
の低減あるいは欠如した菌株を取得することが望まれて
いた。

【０００５】ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊
された微生物菌株としては、大腸菌(Escherichia coli)
(J.Bacteriol., Vol.153, p.588-596)等で知られている
が、これらの菌株を得る方法は、ランダム変異導入法に
より変異導入した菌株の中からスクリーニングするとい
う煩雑な実験操作を要する方法であり、これまでに、ア
ミノ酸、あるいは、有機酸等のファインケミカルズ製造
において産業上重要なコリネ型細菌において取得された
例はなく、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊さ
れたコリネ型細菌の簡便な取得方法が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手
法を駆使することにより、コリネ型細菌からラクテート
デヒドロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡを単離することに成功
し、該ＤＮＡ断片を用いることにより効率的にラクテー
トデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を作製することが可能
であることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明の要旨は、下記（Ａ）又
は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡにある。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつ、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ活性を有するタンパク質。

【０００８】上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）
又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、ラクテート
デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ。

【０００９】また本発明は、前記ＤＮＡがベクターに連
結されてなる組換えベクターＤＮＡ、及び、配列番号１
記載のＤＮＡもしくはこのＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、又はその一部がベ
クターに連結されてなる組換えベクターＤＮＡを提供す
る。

【００１０】本発明はさらに、前記ＤＮＡ又は組換えベ
クターＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のラクテ
ートデヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えによりラク
テートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、微生物の
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を提供する。

【００１１】本発明はまた、前記ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子破壊株を培地で培養し、その培養物からア
ミノ酸または有機酸（有機酸を除く）を採取することを
特徴とする、アミノ酸または有機酸の製造方法を提供す
る。

【００１２】上記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破
壊株の親株としては、コリネ型細菌、より具体的には、
ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株が挙げ
られる。本発明の「ラクテートデヒドロゲナーゼ（L-la
ctate dehydrogenase：EC 1.1.1.27）」とは、ニコチン
アミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵
素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する酵素を
意味する。また、本明細書では、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼをコードするＤＮＡを、便宜上「ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子」ということがある。以下、本発明
について詳細に説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡは、ラクテートデ
ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、前記（Ａ）
又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡであ
る。

【００１４】本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、こ
の配列に基づいて合成することも可能であるが、本発明
においてはコリネ型細菌からクローニングすることによ
り、初めて得られたものである。ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子の供給源としては、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ活性を有するコリネ型細菌であれば特に制限はな
い。

【００１５】上記のようなコリネ型細菌としては、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム等が挙げられ
る。さらに具体的には、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株が挙げられる。本菌株は、昭和５
０年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（現生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第３
０６８号として寄託され、昭和５６年５月１日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管され、微工研条寄第１
４９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）の受託番号で寄
託されている。

【００１６】以下に、上記微生物からラクテートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を取得する方法、該遺伝子
ＤＮＡ断片を用いたラクテートデヒドロゲナーゼ破壊株
の作製方法の一例を説明する。

【００１７】本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子ＤＮＡ断片は、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡ、具体的
には、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１４９７）株等の染色体ＤＮＡから以下に述
べる方法で単離、塩基配列決定することができる。

【００１８】まず、上記コリネ型細菌、例えばブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３を常法［例えば、特
開昭５１−１３０５９２参照］に従い培養し、培養物か
ら菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染
色体ＤＮＡは、例えば、特開平５−１５３７８の実施例
１（Ａ）に記載の方法等により菌体から容易に抽出する
ことができる。

【００１９】上記菌株より染色体ＤＮＡを抽出する際に
は、適当な培地で培養した該菌株の菌体を使用すること
ができるが、培養した菌体を集菌後に凍結保存した保存
試料を使用することも可能である。

【００２０】枯草菌（バチルス・サチリス）等のラクテ
ートデヒドロゲナーゼの一次構造（アミノ酸配列）の相
同性の高い部分から逆翻訳したオリゴデオキシリボヌク
レオチドをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を行い、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部
分断片を得る。このようなプライマーとしては、配列番
号３および４に示すアミノ酸配列に相当する配列番号５
および６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが
挙げられる。配列番号３および４に示すアミノ酸配列
は、後記実施例で詳述するように、枯草菌（バチルス・
サチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)）、ラ
クトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニア
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ラクトバチルス・
カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）間
で、それらが持つラクテートデヒドロゲナーゼのアミノ
酸配列において保存されている領域から選択したもので
ある。

【００２１】ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を適当なクロ
ーニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社
製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１
０９株（宝酒造製）を形質転換する。この形質転換株を
適当な抗生物質選択下で培養し、培養物から菌体を回収
し、菌体から常法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドを抽出する。このプラスミドに挿入されたＤＮ
Ａの塩基配列を決定することにより、本発明のラクテー
トデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得する
ことができる。

【００２２】得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例え
ば、ジデオキシヌクレオチド酵素法［Dideoxy chain te
rmination 法；Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad.
sci.U.S.A., Vol.74, p.5463, (1977)］により決定す
ることができる。

【００２３】上記のようにして、後記実施例で得られた
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片の塩基配
列を決定し、アミノ酸配列に翻訳して解析した結果、ラ
クテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片は、配列番
号２記載のアミノ酸配列の８６番目から１７９番目まで
で示されるアミノ酸配列にあたる部分からなり、またそ
れをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１記載の塩
基配列中の２５６番目から５３７番目までの塩基配列で
示される部分にあたるものであった。

【００２４】ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子全体を
含むＤＮＡ断片を得るには、遺伝子の単離に関する公知
のいずれの方法もが使用できるが、例えば、ブレビバク
テリウム・フラバム ＭＪ２３３等のコリネ型細菌の染
色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子部分断片をプローブとするハイブリ
ダイゼーションにより、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子全体を含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられ
る。以下にその一例を説明する。

【００２５】（Ａ）染色体ＤＮＡライブラリーの作製：
上記菌株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＳａｕ３ＡＩを用いて部分分解し、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主
−ベクター系を用いて染色体ＤＮＡのライブラリーを作
製する。具体的に使用し得るベクターとしては、例えば
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）等のラムダファージ
ベクター、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２
（宝酒造製）、コスミドｐＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）等のプラスミドベクターが挙げられる。

【００２６】上記部分分解により得られる様々なＤＮＡ
断片の上記ベクターへの挿入、例えばファージベクター
λＦＩＸＩＩ（東洋紡績（株）製）への挿入は、適当な
制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩで開裂したベクターと部
分分解ＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
することにより行うことができる。かくして染色体ＤＮ
Ａライブラリーが得られる。

【００２７】（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むベクターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体
ＤＮＡライブラリーからラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子を含むベクターを選別するには、この染色体ＤＮＡ
ライブラリーを用いて宿主微生物、例えばエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質導
入あるいは形質転換を行い、得られる形質導入体あるい
は形質転換体から、適当な手段によりラクテートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子を保持するクローンを選別すればよ
い。

【００２８】具体的には、上記ファージベクターをエシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＰ２３９２株［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏ
ｌ．７， ｐ．１５１３ （１９７９）］に感染させ、
これを寒天培地上に重層することによりプラークを形成
させる。次いでこのプラーク中のファージＤＮＡをニト
ロセルロース膜に移し取り、このファージＤＮＡを該ニ
トロセルロース膜に固定し、前記のラクテートデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いたプラ
ークハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）］
を行う。こうして、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３株の染色体ＤＮＡ由来のラクテートデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子を有するファージベクターを含む形質導入体
を検出し、選別することが可能である。

【００２９】あるいは上記プラスミドベクターを用いて
染色体ＤＮＡライブラリーを調製した場合には、このラ
イブラリーＤＮＡでエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質
転換し、得られた形質転換体から前記のラクテートデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の部分断片をプローブとして用いた
コロニーハイブリダイゼーション法［Ｒ． Ｂｒｕｃｅ
Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， Ｖｏｌ．９， ｐ．８７９
（１９８１）］を行うことによっても選別可能である。

【００３０】更に、上記のようにして選別された形質導
入体あるいは形質転換体よりファージＤＮＡ、あるいは
プラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を適当な制限酵素
でベクターから切り出すことで本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。

【００３１】上記操作によって切り出されたＤＮＡ断片
につき、前記のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部
分断片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼー
ション［Ｅ． Ｍ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．９８， ｐ．５０３
（１９７５）］を行うことにより、ラクテートデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子が挿入ＤＮＡ断片内に存在することを再
確認できる。

【００３２】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３
株染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断して得ら
れる、大きさが約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を挙げること
ができる。さらに、上記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
たところ、両断片中にはオープンリーディングフレーム
の存在が確認され、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
２３３株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のコード
領域は、後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中
のアミノ酸番号１〜３１４の３１４個のアミノ酸配列を
コードする９４５塩基対から構成されることがわかっ
た。また、得られた塩基配列（配列番号１）には、前記
のＰＣＲに用いたプライマーに相当する配列（配列番号
５及び６）を含むことが確認された。

【００３３】本発明におけるラクテートデヒドロゲナー
ゼ遺伝子は、天然の細菌、例えばコリネ型細菌の染色体
ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられる
ＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製／オリゴ１００
０Ｍ ＤＮＡ合成装置（Oligo 1000M DNA Synthesize
r）を用いて合成されたものであってもよい。

【００３４】また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を
損なわない範囲で、配列番号２に示すアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明
に含まれる。ここで「数個」とは、好ましくは４０個以
下、より好ましくは２０個以下である。

【００３５】上記のようなＤＮＡの一態様として、例え
ば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤ
ＮＡであって、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値
化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高
い核酸同士、例えば、６０％以上、好ましくは８０％以
上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、そ
れより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条
件が挙げられる。

【００３６】尚、後述するように、本発明のＤＮＡをコ
リネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株
の作製に用いる場合には、該ＤＮＡはラクテートデヒド
ロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする必要は
なく、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体
上のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを
起こすことができ、それによってラクテートデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有
していればよい。このような相同性としては、好ましく
は９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性が挙
げられる。また、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破
壊株の作製に用いるＤＮＡは、染色体上のラクテートデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子と相同組換えを起こすことがで
き、それによってラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を
破壊することができる程度の大きさであれば、本発明の
ＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好まし
くは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長
さを有するものが挙げられる。

【００３７】本発明のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子は、例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼやリンゴ酸
の製造に用いることができる。すなわち、本発明のＤＮ
Ａが導入された微生物、例えば本発明のＤＮＡがベクタ
ーに連結されてなる組換えベクターＤＮＡで形質転換さ
れた微生物は、ラクテートデヒドロゲナーゼを高生産す
ることが予想される。

【００３８】また、本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌の
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製に用い
ることができる。本発明のＤＮＡ又はその一部を用いた
コリネ型細菌のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊
法としては、該ＤＮＡをカナマイシン耐性遺伝子あるい
はクロラムフェニコール耐性遺伝子等のマーカーと結合
した後、電気パルス法(Electroporation)等により菌体
内に導入した後、マーカーで選択することにより、相同
組換えによって該ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部
分断片を宿主微生物染色体上へ組み込むことが可能とな
る（Biosci. Biotech. Biochem., Vol.57, p.2036-203
8, 1993）。

【００３９】かくして得られる微生物から、ラクテート
デヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を効率的に取得すること
ができる。上記のようにして得られるラクテートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子破壊株は、実質的に活性のあるラクテ
ートデヒドロゲナーゼを産生しないので、アミノ酸、有
機酸等の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副
生を低減することができる。

【００４０】本発明の方法により製造されるアミノ酸と
しては、特に限定されないが、具体的にはリジン、トレ
オニン、イソロイシン、グルタミン酸等が挙げられる。
また、本発明の方法により製造される有機酸としては乳
酸以外のものであれば特に限定されないが、具体的には
コハク酸、フマル酸、クエン酸等が挙げられる。

【００４１】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的な認識を得る一助とみなすべきのも
のであり、本発明の範囲を何等限定するものではない。

【００４２】〔実施例１〕ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子断片の一部（Ａ断片）のクローン化およびその塩基配
列の決定

【００４３】（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、Ｍｎ
ＳＯ₄・４〜６Ｈ₂Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２０
０μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１Ｌ］１Ｌに、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集
めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチー
ムを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍ
ｌに懸濁した。

【００４４】次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最
終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃
で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最
終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間
保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／
クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に
存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノー
ルで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡと
して、ＰＣＲに使用した。

【００４５】（Ｂ）プライマーの選択 ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、原核生物では、
バチルス・サチリス（Microbiology, 142, 3047-3056,
1996）、ラクトコッカス・ラクティス（J. Bacteriol.,
174, 6956-6964, 1992）、マイコプラズマ・ハイオニ
ューモニア（J.Gen. Microbiol., 139, 317-323, 199
3）、ストレプトコッカス・ミュータンス（GenBank Dat
abase Accession No. M72545）、ラクトバチルス・カゼ
イ（Appl.Environ. Microbiol., 57, 2413-2417, 199
1）等のものが知られている。これら５種の微生物のラ
クテートデヒドロゲナーゼにおいて保存されている領域
を検討し、配列番号３および４のアミノ酸配列を基に、
配列番号５および６に示す塩基配列を有する２つのプラ
イマーを選択し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮ
Ａ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）
を用いて合成した。

【００４６】（配列番号５）CARAARCCNG GNGARAC （配列番号６）TCNCCRTGYT CNCCNAT （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、
Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、
Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）

【００４７】これら２つのプライマーを用いて上記
（１）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、
ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が存在する限り、
（ａ）と（ｂ）の組み合わせで約３００ｂｐの反応産物
が得られると期待される。

【００４８】（Ｃ）ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサ
ーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。

【００４９】反応液： ５０ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔ
ｓ 以上を混合し、１００μｌとした。

【００５０】ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：５５℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００５１】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行って約３００ｂｐの断片の検出
を行った。

【００５２】（Ｅ）増幅断片のクローン化 上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌと、ＰＣＲ産物クロー
ニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市
販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００５３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、
イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００５４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認められ
た。

【００５５】（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定 （Ｅ）項で得られた長さが約３００ｂｐの増幅断片につ
いて、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ, ７４，５４６３，
１９７７）により決定した。その結果得られたＤＮＡ塩
基配列およびその翻訳アミノ酸配列を配列表配列番号１
および２に示す。本アミノ酸配列は、枯草菌、あるい
は、ラクトバシルスのラクテートデヒドロゲナーゼのア
ミノ酸配列の一部分と高い相同性を示し、本ＤＮＡ断片
がブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ−２３３株由来
のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の部分断片である
ことが明らかになった。

【００５６】［実施例２］ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子全体のクローン化およびその塩基配列の決定 （Ｇ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII、５０Ｕ（ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１
時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供
した後、アガロースゲルよりＤＮＡをナイロン膜上に移
し取った。前記（Ｅ）項で取得したラクテートデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子部分断片を、宝酒造製 Random Primer D
NA Labeling Kit Ver.2 を用いて、Exo-free Klenow Fr
agment 及び［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰによりラジオアイソ
トープラベル［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５８，
３０７−３１５（１９８６）］した。アイソトープラベ
ルされたプローブを用い、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］
に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。

【００５７】その結果、ＨｉｎｄIII処理したものは上
記ナイロン膜上の約４．８ｋｂの位置に、上記プローブ
が強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の存在を確認し
た。

【００５８】（Ｈ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡライブラリーの作製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｓ
ａｕ３ＡＩ ５ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１０分間反
応させて部分分解した。この様々な長さの部分分解ＤＮ
Ａと、制限酵素ＸｈｏＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼ
クレノーフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）を用いてｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−
トリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチ
ジン５’−トリフォスフェート）で切断末端を埋めたフ
ァージベクターλＦＩＸＩＩ（λＦＩＸＩＩ／ＸｈｏＩ
−ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ
ＤＮＡ：東洋紡績（株）社製）とを混合し、５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、および、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成
分の濃度は最終濃度である）、１６℃で１０時間反応さ
せて部分分解ＤＮＡとベクターとを連結させ、染色体Ｄ
ＮＡのλＤＮＡライブラリーを得た。

【００５９】（Ｉ）目的組換え体ＤＮＡの選別 上記（Ｈ）項で作製したλＤＮＡライブラリーファージ
溶液（２〜５×１０⁴ｐｆｕ；ＳＭ緩衝液希釈）と、エ
シェリヒア・コリＰ２３９２の培養液を当量混合し、３
７℃で１５分間保温した。これに５０℃にて保温してお
いた３〜４ｍｌのλ培地（１％ トリプトン、０．５％
酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％ ＭｇＳ
Ｏ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５％ 寒天）を加え、λプレート
（１％ トリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、０．２％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１％ 寒天）に均一に塗布し、３
７℃で１２〜１６時間培養した。

【００６０】この培地上にニトロセルロースフィルター
を載せ、培地上に形成されたプラークをフィルターに吸
着させ、順次５分間ずつ以下イ）〜ハ）の試薬に浸した
濾紙上にフィルターをのせて処理した。

【００６１】イ）０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ ロ）０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．
５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ハ）２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ；ＮａＣｌ １７５．３
ｇ，クエン酸三ナトリウム二水和物 ８８．２ｇを蒸留
水１Ｌに溶解） 上記フィルターを風乾後、８０℃にて２時間乾熱処理を
してＤＮＡを固定した。

【００６２】前記ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子部
分断片をプローブとして用い、上記で作製したフィルタ
ーにつきプラークハイブリダイゼーションを常法［Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ（１９８９）］に従って行った。

【００６３】この結果、上記ラクテートデヒドロゲナー
ゼ遺伝子部分断片をプローブとしてハイブリダイゼーシ
ョン陽性のプラークＬＤＨ２３３を選択した。ＬＤＨ２
３３からファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄII
Iにより切断したところ、ゲノミック・サザンハイブリ
ダイゼーションの結果と一致する、長さ約４．８ｋｂの
ＨｉｎｄIII挿入断片をアガロースゲル電気泳動により
確認することができた。

【００６４】（Ｊ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子
のサブクローニング：上記（Ｉ）項で得られた長さが約
４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片上に存在するラ
クテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の位置をさらに特定す
るために、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐＵ
Ｃ１１８（宝酒造（株）社製）へサブクローニングし
た。

【００６５】上記ＬＤＨ２３３から抽出したファージＤ
ＮＡからＨｉｎｄIIIで切り出されるＤＮＡ断片と、ク
ローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造（株）製）
を、各々制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、脱リン酸
化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＨｉｎｄII
I断片とベクターを連結させた。

【００６６】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］
に塗抹した。

【００６７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを各々制限酵素ＨｉｎｄIIIにより切断し、ハイブリ
ダイゼーション法を用いて挿入断片を調べたところ、プ
ラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂのＤＮＡ断片に
加え、長さ約４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＤＮＡ断片が
確認された。

【００６８】上記で得られたプラスミドを各々ｐＵＣ１
１８−ＬＤＨ２３３と命名し、該プラスミドで形質転換
されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）
製）を各々、ＥＣＬＤＨ２３３と命名した。

【００６９】（Ｋ）塩基配列の決定 上記（Ｊ）項で得られたラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子を含む長さが約４．８ｋｂのＤＮＡ（ＨｉｎｄIII
−ＨｉｎｄIII）断片について、その塩基配列をｐＵＣ
１１８（宝酒造（株）社製）を用いるジデオキシヌクレ
オチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｏｎ法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］に
より決定した。

【００７０】塩基配列決定の結果、約４．８ｋｂのＤＮ
Ａ（ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）断片は、その塩基配列
中のオープンリーデイングフレームの存在から、ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、後記配列表の配列番号
１に示す塩基配列を有し、３１４個のアミノ酸をコード
する９４５塩基対より構成されることが判明した。この
遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示
す。尚、この塩基配列の中には、実施例２の（Ｆ）項で
決定した塩基配列に相当する配列が含まれていることが
確認された。

【００７１】〔実施例３〕 ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子（ｌｄｈ遺伝子）の発現 （Ｌ）ＭＪ−２３３由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子発現ベクターの構築 実施例３で確認された９４５塩基対より構成される、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来ラクテー
トデヒドロゲナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレ
ームについて、エシェリヒア・コリ菌体内での発現を確
認するため、該ＤＮＡ断片を下記のようにプラスミドｐ
ＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）へサブクローニン
グした。

【００７２】まず、上記オープンリーディングフレーム
の両端に制限酵素ＳｍａＩの切断部位を連結したＤＮＡ
断片を、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲにより、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体
ＤＮＡを鋳型として増幅した。該ＰＣＲ断片とクローニ
ングベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）
を、各々制限酵素ＳｍａＩで切断した後、脱リン酸化処
理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂およびＴ４ＤＮＡリガーゼ １ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１６℃で１０時間反応させ、上記ＳｍａＩ断片と
ベクターを連結させた。

【００７３】 （配列番号７）TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC （配列番号８）TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG

【００７４】得られた連結反応液を用い、塩化カルシウ
ム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留
水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００７５】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素ＳｍａＩにより切断し、アガロース電気泳
動法を用いて挿入断片を調べたところ、プラスミドｐＫ
Ｋ２２３−３の長さ４．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約１ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。

【００７６】これらのプラスミドについて、１ｋｂの挿
入断片の方向性の確認を行った。その結果、プラスミド
ｐＫＫ２２３−３上に存在するｔａｃプロモーターに対
して、ｌｄｈ遺伝子のオープンリーディングフレームが
順方向に挿入断片が挿入されたプラスミドを選択し、ｐ
ＫＫ２２３−ＬＤＨ２３３と命名した。プラスミドｐＫ
Ｋ２２３−ＬＤＨ２３３でエシェリヒア・コリＪＭ１０
９株を形質転換して得られた形質転換株をエシェリヒア
・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３と命名した。

【００７７】（Ｍ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の
製造および活性の確認 上記（Ｌ）で作製したエシェリヒア・コリＥＣｔａｃＬ
ＤＨ２３３株をアンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含むＬ
Ｂ培地［トリプトン１０ｇ，酵母エキス ５ｇ，ＮａＣ
ｌ ５ｇ）に植菌し、３７℃で１５時間好気的に振とう
培養した。得られた培養物を遠心分離（３，０００×
ｇ、４℃、２０分間）して菌体を回収後、ナトリウム−
リン酸緩衝液［組成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.3)］で洗浄した。

【００７８】次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上
記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で
超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得
た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３
０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、
エシェリヒア・コリＪＭ１０９株の粗酵素液を同様に調
製し、以下の活性測定に供した。

【００７９】ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確
認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳
酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に酸化され
るのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Ka
narek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (196
4)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.
2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在
下、３７℃にて行った。その結果、エシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９株から調製された粗酵素液に対し、エシェリ
ヒア・コリＥＣｔａｃＬＤＨ２３３から調製された粗酵
素液は、約５０倍ラクテートデヒドロゲナーゼ活性を有
していた。

【００８０】〔実施例４〕ラクテートデヒドロゲナーゼ
遺伝子部分断片を用いたブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３由来染色体ラクテートデヒドロゲナーゼ遺
伝子の破壊 （Ｎ）遺伝子破壊に用いるプラスミドベクターの構築 上記（Ｅ）項で得たプラスミドを２０μｌについて、５
０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2_、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌＩ １ｕｎｉｔ
の各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、
３７℃で１時間反応させ、ラクテートデヒドロゲナーゼ
遺伝子部分断片約３００ｂｐとｐＧＥＭ−Ｔベクター領
域約３ｋｂの２つの断片を得た。 得られたＤＮＡ溶液
からＧｅｎｅ ＣｌｅａｎＩＩ（フナコシ社製）を用い
て３００ｂｐ断片の回収を行い、該ＤＮＡ溶液１０μｌ
と、クロラムフェニコール耐性のクローニングベクター
ｐＨＳＧ３９６（宝酒造社製）１μｌのＳｐｈＩ、Ｓａ
ｌＩ分解物と混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂及びＴ4 ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００８１】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、
アンピシリン５０ｍｇを含む培地［トリプトン１０ｇ、
イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天
１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００８２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この
結果、プラスミドｐＨＳＧ３９６の長さ２．２ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ約３００ｂｐの挿入断片が認めら
れた。

【００８３】（Ｏ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の
作成 上記（Ｎ）項で得られたプラスミドはＭＪ−２３３菌体
内で複製不可能なプラスミドである。該プラスミドを、
電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.14
4, p.181-185, 1993）によりブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３に導入し、クロラムフェニコール ５
μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ６
ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２０
０μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラク
ト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、及
び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

【００８４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上
のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊を確認し
た。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で分解した後、ナイ
ロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ アマシャム社製）
にブロッティングし、上記で得た３００ｂｐのラクテー
トデヒドロゲナーゼ部分断片をプローブとしてランダム
プライマーラベリングキット（³²Ｐ［ｄＣＴＰ］使用）
（宝酒造社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハ
イブリダイゼーションを行った。野生株より抽出した染
色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼー
ションのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターン
は（Ｎ）項で導入したプラスミド２．５ｋｂ分長いバン
ドが検出され、染色体上のラクテートデヒドロゲナーゼ
遺伝子の破壊が確認できた。このようにして得られたラ
クテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株をブレビバク
テリウム・フラバム ＥＳΔｌｄｈ：ｃａｔ１と命名し
た。

【００８５】（Ｐ）ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の
製造および活性の確認 上記（Ｏ）で作製したブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：ｃａｔ１株をクロラムフェニコ
ール ５μｇ／ｍｌを含む培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ₄）
₂ＳＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．
５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・４−５Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、ビオチ
ン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキ
ストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２
０ｇ、及び、寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、ナトリウム−リン酸緩衝液［組
成：50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)］で洗浄し
た。

【００８６】次いで、洗浄菌体０．５ｇ（湿重量）を上
記ナトリウム−リン酸緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で
超音波破砕器（ブランソン社製）にかけ菌体破砕物を得
た。該破砕物を遠心分離（１０，０００×ｇ，４℃，３
０分間）し、上清を粗酵素液として得た。対照として、
ブレビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株の
粗酵素液を同様に調製し、以下の活性測定に供した。

【００８７】ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素活性の確
認は、両粗酵素液について、ピルビン酸を基質とした乳
酸の生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に酸化され
るのを、３４０ｎｍの吸光度変化として測定した［L.Ka
narek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (196
4)］。反応は、５０ｍＭ カリウム−リン酸緩衝液(pH7.
2)、１０ｍＭ ピルビン酸、０．４ｍＭＮＡＤＨ存在
下、３７℃にて行った。その結果、ブレビバクテリウム
・フラバム ＭＪ２３３−ＥＳ株から調製された粗酵素
液におけるラクテートデヒドロゲナーゼ活性に対し、ブ
レビバクテリウム・フラバム ＭＪ２３３−Δｌｄｈ：
ｃａｔ１株から調製された粗酵素液におけるラクテート
デヒドロゲナーゼ活性は、１０分の１以下であった。

【００８８】

【発明の効果】本発明のＤＮＡおよびそれを含む組換え
ベクターは、微生物のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝
子破壊株の作製に用いることができる。ラクテートデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子破壊株を用いると、培養中の酸素濃
度の調節等の操作を行わなくても、アミノ酸、有機酸等
の各種ファインケミカルズの製造の際の乳酸の副生を低
減することができる。

【００８９】また、本発明のＤＮＡは、ラクテートデヒ
ドロゲナーゼの製造に利用することができる。

【００９０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..945 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG AAA GAA ACC GTC GGC AAT AAG ATT GTC CTT ATT GGC GCA GGA GAT 48 Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile Gly Ala Gly Asp 5 10 15 GTT GGA GTT GCA TAC GCA TAC GCA CTG ATC AAC CAG GGC ATG GCA GAT 96 Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln Gly Met Ala Asp 20 25 30 CAC CTT GCG ATC ATC GAC ATC GAT GAA AAG AAA CTC GAA GGC AAC GTC 144 His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Val 35 40 45 ATG GAC TTA AAC CAT GGT GTT GTG TGG GCC GAT TCC CGC ACC CGC GTC 192 Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser Arg Thr Arg Val 50 55 60 ACC AAG GGC ACC TAC GCT GAC TGC GAG GAC GCA GCC ATG GTT GTC ATT 240 Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ile 65 70 75 80 TGT GCC GGC GCA GCC CAA AAG CCA GGC GAA ACT CGC CTC CAG CTG GTG 288 Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Val 85 90 95 GAC AAA AAC GTC AAG ATT ATG AAG TCC ATC GTT GGC GAT GTC ATG GCC 336 Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly Asp Val Met Ala 100 105 110 AGC GGA TTC GAC GGC ATC TTC CTC GTA GCC TCC AAC CCA GTG GAT ATC 384 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 CTC ACC TAC GCA GTG TGG AAA TTC TCC GGC CTG GAA TGG AAC CGC GTG 432 Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu Trp Asn Arg Val 130 135 140 ATC GGC TCC GGA ACT GTC CTG GAC TCC GCT AGA TTC CGC TAC ATG CTC 480 Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Met Leu 145 150 155 160 GGC GAA CTC TAT GAA GTG GCA CCA AGC TCC GTC CAC GCC TAC ATC ATC 528 Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 GGC GAA CAC GGC GAC ACT GAA CTT CCA GTC CTG TCC TCC GCG ACC ATC 576 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser Ser Ala Thr Ile 180 185 190 GCA GGC GTA TCG CTT AGC CGC ATG CTA GAC AAA GAC CCA GAG CTT GAG 624 Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp Pro Glu Leu Glu 195 200 205 GGC CGT CTA GAG AAA ATT TTC GAA GAC ACC CGC GAC GCC GCC TAT CAC 672 Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His 210 215 220 ATC ATC GAC GCC AAG GGC TCC ACT TCC TAC GGC ATC GGC ATG GGT CTT 720 Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Met Gly Leu 225 230 235 240 GCT CGC ATC ACC CGC GCA ATC CTA CAA AAC CAA GAC GTT GCA GTC CCA 768 Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp Val Ala Val Pro 245 250 255 GTC TCT GCA CTG CTC CAC GGT GAA TAC GGT GAG GAA GAC ATC TAC ATC 816 Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 GGC ACC CCA GCA GTA GTA AAC CGC CGA GGC ATC CGC CGC GTT GTC GAA 864 Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg Arg Val Val Glu 275 280 285 CTA GAA ATC ACG GAC CAT GAG ATG GAA CGC TTC AAG CAT TCC GCA AAT 912 Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys His Ser Ala Asn 290 295 300 ACC CTG CGC GAA ATT CAG AAG CAG TTC TTC TGA 945 Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 314

【００９１】配列番号：２ 配列の長さ：３１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile Gly Ala Gly Asp 5 10 15 Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln Gly Met Ala Asp 20 25 30 His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Val 35 40 45 Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser Arg Thr Arg Val 50 55 60 Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ile 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Val 85 90 95 Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly Asp Val Met Ala 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu Trp Asn Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Met Leu 145 150 155 160 Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser Ser Ala Thr Ile 180 185 190 Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp Pro Glu Leu Glu 195 200 205 Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His 210 215 220 Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Met Gly Leu 225 230 235 240 Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp Val Ala Val Pro 245 250 255 Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg Arg Val Val Glu 275 280 285 Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys His Ser Ala Asn 290 295 300 Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 314

【００９２】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Lys Pro Gly Glu Thr 1 5

【００９３】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Gly Glu His Gly Asp 1 5

【００９４】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：RはA又はG、YはC又はT、NはA、G、C又は
Tを示す。 CARAARCCNG GNGARAC 17

【００９５】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：RはA又はG、YはC又はT、NはA、G、C又は
Tを示す。 配列 TCNCCRTGYT CNCCNAT 17

【００９６】配列番号：７ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCCCCGGGA TGAAAGAAAC CGTCGGC 27

【００９７】配列番号：８ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCCCCGGGT CAGAAGAACT GCTTCTG 27

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 寺沢 真人 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク
   質。 （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつ、ラクテートデヒドロゲナー
   ゼ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、ラクテート
   デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする
   ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡがベクターに連結
   されてなる組換えベクターＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１記載のＤＮＡもしくはこのＤ
   ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
   ＤＮＡ、又はその一部がベクターに連結されてなる組換
   えベクターＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１若しくは請求項２記載のＤＮ
   Ａ、又は請求項３若しくは請求項４記載の組換えベクタ
   ーＤＮＡと、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上のラクテート
   デヒドロゲナーゼ遺伝子との相同組換えによりラクテー
   トデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された、微生物のラク
   テートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株。
6. 【請求項６】 ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊
   株の親株が、コリネ型細菌であることを特徴とする請求
   項５記載のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株。
7. 【請求項７】 コリネ型細菌が、ブレビバクテリウム・
   フラバム ＭＪ−２３３株であることを特徴とする請求
   項５記載のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株。
8. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれか一項に記載のラ
   クテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株を培地で培養
   し、その培養物からアミノ酸または有機酸（乳酸を除
   く）を採取することを特徴とする、アミノ酸または有機
   酸の製造方法。