WO2011059031A1 - 非アミノ有機酸の製造方法 - Google Patents

非アミノ有機酸の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011059031A1
WO2011059031A1 PCT/JP2010/070121 JP2010070121W WO2011059031A1 WO 2011059031 A1 WO2011059031 A1 WO 2011059031A1 JP 2010070121 W JP2010070121 W JP 2010070121W WO 2011059031 A1 WO2011059031 A1 WO 2011059031A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sucrose
amino organic
organic acid
succinic acid
activity
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/070121
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
誠 村瀬
倫子 小林
大助 城戸
砂奈恵 小池
Original Assignee
三菱化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 三菱化学株式会社 filed Critical 三菱化学株式会社
Priority to BR112012011416-6A priority Critical patent/BR112012011416B1/pt
Priority to JP2011540537A priority patent/JP5810412B2/ja
Publication of WO2011059031A1 publication Critical patent/WO2011059031A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a non-amino organic acid such as succinic acid using a microorganism.
  • Non-Patent Document 1 When producing non-amino organic acids such as succinic acid by fermentation, anaerobic bacteria such as Anaerobiospirillum genus and Actinobacillus genus are usually used (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Document 1).
  • anaerobic bacteria When anaerobic bacteria are used, the yield of the product is high, but on the other hand, a large amount of organic nitrogen sources such as CSL (corn steep liquor) in the medium because it requires many nutrients to grow. Need to be added. Adding a large amount of these organic nitrogen sources not only leads to an increase in culture medium cost, but also increases the purification cost when taking out the product, which is not economical.
  • Patent Documents 3 and 4 A production method is also known (Patent Documents 3 and 4). In this case, it is economical because the amount of organic nitrogen added is small and sufficient growth can be achieved using a simple medium. However, the amount of non-amino organic acid produced, the concentration, and the amount per cell There was room for improvement, such as improvement in production speed and simplification of the manufacturing process.
  • Patent Document 5 discloses a method in which sucrose (sucrose) is decomposed into glucose and fructose with an acid and succinic acid fermentation is performed using this as a carbon source.
  • Patent Document 6 discloses a method of performing succinic acid fermentation using sucrose (sucrose) as a carbon source after heat sterilization.
  • Non-Patent Document 2 discloses a method in which sucrose fermentation is performed using a carbon source as a carbon source after heat-treating a solution in which sucrose (sucrose), a nitrogen source and an inorganic salt are simultaneously mixed.
  • sucrose solution was used as a carbon source after heating so that the decomposition rate of sucrose after heating was 14% or less and mixing the sucrose-containing solution with a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt.
  • An object of the present invention is to improve production efficiency in a method for producing a non-amino organic acid such as succinic acid using a microorganism.
  • sucrose-containing aqueous solution obtained by heating a sucrose-containing aqueous solution so that the sucrose decomposition rate after heating is 14% or less is carbon.
  • the yield to sugars of non-amino organic acids such as succinic acid was improved, and the present invention was completed.
  • the sucrose-containing aqueous solution is heated so that the sucrose decomposition rate after the heating step is 14% or less, the obtained sucrose-containing aqueous solution is mixed with a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt, and the resulting mixture is obtained.
  • a method for producing a non-amino organic acid which comprises causing a liquid to act on a microorganism or a processed product thereof to produce and accumulate a non-amino organic acid, and collecting the non-amino organic acid.
  • non-amino organic acids such as succinic acid can be produced efficiently.
  • a sucrose-containing aqueous solution is heated so that the sucrose decomposition rate after the heating step is 14% or less, and the resulting sucrose-containing aqueous solution, a nitrogen source and an inorganic salt are included. It is characterized in that the liquid is mixed, the resulting mixed liquid is allowed to act on microorganisms or processed products thereof to generate and accumulate non-amino organic acids, and the non-amino organic acids are collected.
  • the non-amino organic acid is not particularly limited except that it means an organic acid other than an amino acid. Acids are preferred, dicarboxylic acids such as succinic acid, malic acid and fumaric acid are more preferred, and succinic acid is particularly preferred.
  • sucrose-containing aqueous solution heating step of the method of the present invention will be described.
  • sucrose decomposition rate refers to the rate at which sucrose is decomposed into glucose and fructose.
  • the sucrose decomposition rate is preferably 10% or less.
  • the heating process conditions are not particularly limited as long as the sucrose decomposition rate after the heating process is 14% or less, but the temperature, pressure and time of the heating process, and the pH and nitrogen content of the sucrose-containing aqueous solution before the heating process. The above decomposition rate is achieved by controlling the above conditions.
  • the heating process also serves as a sterilization treatment.
  • Liquefied carbon dioxide gas may be mixed, ultrasonic treatment may be performed, or film treatment may be performed.
  • the heating step may be a batch operation or a continuous operation.
  • the temperature of the heating step is not particularly limited, but is usually 60 ° C. or higher, preferably 100 ° C. or higher, and is usually 160 ° C. or lower, preferably 140 ° C. or lower. By making heating process temperature into this range, it is preferable at the point of sterilization.
  • the pressure in the heating step is not particularly limited, but is usually 0.1 MPa or more, preferably 0.2 MPa or more, and is usually 0.6 MPa or less, preferably 0.5 MPa or less.
  • the time for the heating step is not particularly limited, but is usually 1 minute or longer, preferably 3 minutes or longer, and is usually 120 minutes or shorter, preferably 20 minutes or shorter. By making the time of a heating process into this range, it is preferable at the point of sterilization.
  • the concentration of the sucrose-containing aqueous solution before the heating step is not particularly limited, but is usually 5% by weight or more, preferably 10% by weight or more, more preferably 20% by weight or more, while usually 85% by weight or less, preferably Is 80% by weight or less, more preferably 75% by weight or less.
  • the pH of the sucrose-containing aqueous solution before the heating step is usually 6.0 or higher, preferably 6.3 or higher, more preferably 6.6 or higher, still more preferably 6.8 or higher, particularly preferably 7.0 or higher.
  • it is usually 14.0 or less, preferably 13.0 or less, more preferably 12.0 or less, further preferably 11.0 or less, particularly preferably 10.0 or less, and even more preferably 9.0 or less.
  • the nitrogen content of the sucrose-containing aqueous solution before the heating step is usually 5% or less, preferably 4% or less, more preferably 3% or less, still more preferably 2% or less, particularly preferably 1% per 100 weight of carbon content. It is as follows. Setting the nitrogen content of the sucrose-containing aqueous solution before the heating step to 5% or less is preferable because the reaction between sucrose and glucose or fructose, which is a decomposition product of sucrose, and the nitrogen-containing compound is suppressed.
  • the non-amino organic acid production process will be described.
  • the heated sucrose aqueous solution obtained in the sucrose heating step is mixed with a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt, and the resulting mixed solution is allowed to act on microorganisms that can convert sucrose into non-amino organic acids.
  • microorganisms used here are Coryneform Bacterium, Bacillus, Rhizobium, Escherichia, Lactobacillus, or Lactobacillus.
  • Genus bacteria Anaerobiospirillum genus, Actinobacillus genus, filamentous fungi and yeast are preferred, among which coryneform bacteria and yeast are more preferred.
  • Escherichia bacteria include Escherichia coli and the like
  • Lactobacillus bacteria include Lactobacillus helveticus (J Appl Microbiol, 2001, 91, p846-852
  • Bacillus bacteria include Bacillus subtilis
  • Examples include Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus
  • Rhizobium bacteria include Rhizobium etli
  • yeasts include, for example, Saccharomyces. ), Shizosaccharomyces, Candida, Pichia, Kluyveromyces es) and Zygosaccharomyces sp (Zygosaccharomyces) yeasts belonging to such.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces examples include Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ubaram, S. bayanus, and the like.
  • yeast belonging to the genus Shizosaccharomyces examples include Schizosaccharomyces pombe.
  • yeast belonging to the genus Candida examples include Candida albicans, C. sonorensis, C. glabrata and the like.
  • yeast belonging to the genus Pichia examples include Pichia pastoris and P. stapidis.
  • yeast belonging to the genus Kluyveromyces include Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus and Kluywellomyces thermotolerance (K). .. thermotolerans) and the like.
  • yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces include Zygosaccharomyces bailii and Zygosaccharomyces bailii (Z. rouxii).
  • the coryneform bacterium is not particularly limited as long as it is classified as such, but it belongs to the genus Corynebacterium, the bacterium belonging to the genus Brevibacterium, the genus Arthrobacter, the genus Mycobacterium Bacteria belonging to the genus Microbacterium, Micrococcus, etc. Among these, preferred are those belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, and more preferred are corynebacteria.
  • Um glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Brevibacterium flavum, Brevibacterium ammoniagene (Brevibacterium ammoniagenes) or bacteria like classified into Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum).
  • Particularly preferred specific examples of the parent strain of coryneform bacterium used in the non-amino organic acid production process include Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233 AB-41 (FERM BP-1498), Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872, Corynebacterium glutamicum ATCC31831, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, etc. are mentioned. Brevibacterium flavum is currently sometimes classified as Corynebacterium glutamicum (Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal). of Systematic Bacteriology, 1991, vol.
  • Brevibacterium flavum MJ-233 strain and its mutant MJ-233 AB-41 strain are respectively Corynebacterium glutamicum MJ. -233 strain and MJ-233 AB-41 strain.
  • Brevibacterium flavum MJ-233 was established on April 28, 1975, by the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science, Microbial Industrial Technology Research Institute (currently the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, Ibaraki, Japan 305-8586 Deposited as FERM P-3068 at Tsukuba City Higashi 1-chome 1-1 1-1, and transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on May 1, 1981, and deposited under the deposit number of FERM BP-1497 Yes.
  • any microorganism that can produce a non-amino organic acid is not only a wild strain of the above microorganism, but also a mutant strain, cell fusion or gene obtained by normal mutation treatment such as UV irradiation or NTG treatment.
  • Recombinants derived by genetic techniques such as recombinant methods are also used.
  • recombinant what was obtained by well-known methods, such as the expression enhancement of a biosynthetic enzyme gene, the expression fall of a degradation enzyme gene, is used about each non-amino organic acid.
  • the pyruvate carboxylase activity is genetically modified so as to be enhanced as compared with the unmodified type, or the lactodehydrogenase activity is decreased as compared with the unmodified type.
  • examples include those that have been genetically modified.
  • PC pyruvate carboxylase
  • pc pyruvate carboxylase activity
  • the pc gene can be constructed by high expression in a host bacterium using a plasmid.
  • it may be integrated on the chromosome by homologous recombination, or the expression of the pc gene can be enhanced by promoter replacement. Transformation can be performed by, for example, the electric pulse method (Res. Microbiol., Vol. 144, p. 181-185, 1993).
  • a pc gene derived from Corynebacterium glutamicum can be used as a specific pc gene.
  • the pc gene is a DNA that hybridizes with the pc gene derived from Corynebacterium glutamicum under stringent conditions, or the base sequence of the gene is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • a DNA having a homology of 99% or more and encoding a protein having PC activity can also be used suitably.
  • pc genes derived from coryneform bacteria other than Corynebacterium glutamicum, or from other microorganisms or animals and plants can also be used.
  • the microorganism or animal or plant-derived pc gene shown below has a known sequence (shown below), and by amplifying the ORF portion by hybridization or PCR as described above, Can be acquired.
  • Human [Biochem. Biophys. Res. Comm. , 202, 1009-1014 (1994)] Mouse [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 90, 1766-1779, (1993)] Rat [GENE, 165, 331-332, (1995)] Yeast; Saccharomyces cerevisiae [Mol. Gen.
  • the PC activity is enhanced means that the PC activity is preferably increased by 1.5 times or more, more preferably by 3.0 times or more per unit cell weight relative to the unmodified strain such as the wild strain or the parent strain. It means that The enhanced PC activity is confirmed by a known method such as J. Org. Bacteriol. , 158, 55-62, (1984), and can be confirmed by measuring PC activity. As the pc gene and a specific introduction method, those described in JP-A-2008-259451 are used.
  • LDH activity is reduced means that LDH activity is reduced as compared with an unmodified strain. LDH activity may be completely lost. The decrease in LDH activity can be confirmed by measuring LDH activity by a known method (L. Kanarek, et al., J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964), etc.).
  • the microorganisms used in the production method of the present invention include acetate kinase (hereinafter also referred to as “ACK”), phosphotransacetyl, in addition to the enhancement of PC activity, or enhancement of PC activity and reduction of LDH activity.
  • ACK acetate kinase
  • phosphotransacetyl in addition to the enhancement of PC activity, or enhancement of PC activity and reduction of LDH activity.
  • the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of lysase (hereinafter also referred to as “PTA”), pyruvate oxidase (hereinafter also referred to as “POXB”) and acetyl CoA hydrolase (hereinafter also referred to as “ACH”) May be a bacterium modified to reduce
  • PTA activity refers to the activity of catalyzing the reaction of transferring phosphoric acid to acetyl CoA to produce acetyl phosphate.
  • Modified to reduce PTA activity means that the PTA activity is lower than that of an unmodified strain such as a wild strain. The PTA activity is preferably reduced to 30% or less per unit cell weight, more preferably 10% or less, compared to the unmodified strain. Further, the PTA activity may be completely lost. The decrease in PTA activity is described in, for example, Klotzsch, H. et al. R. , Meth Enzymol. 12, 381-386 (1969) and the like, and can be confirmed by measuring PTA activity.
  • ACK activity refers to the activity of catalyzing the reaction of producing acetic acid from acetyl phosphate and ADP. “Modified to reduce ACK activity” means that ACK activity is lower than that of an unmodified strain such as a wild strain. The ACK activity is preferably reduced to 30% or less per unit cell weight, more preferably 10% or less, compared to the unmodified strain. Further, the ACK activity may be completely lost. The decrease in ACK activity can be confirmed by measuring the ACK activity by the method of Ramponi et al. (Ramponi G., Meth. Enzymol. 42, 409-426 (1975)).
  • both enzymes are encoded by the pta-ack operon (GenBank Accession No. X89084). Therefore, when the pta gene is disrupted, PTA And the activity of both ACK enzymes can be reduced.
  • the activity of PTA and ACK is reduced by disrupting these genes according to a known method, for example, a method using homologous recombination or a method using a sacB gene (Schaffer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73). Can be done. Specifically, it can be performed according to the method disclosed in JP-A-2006-000019.
  • the pta gene and the ack gene the above GenBank Accession No.
  • a gene having a degree of homology that causes homologous recombination with the pta gene and the ack gene on the host chromosome can also be used.
  • homology that causes homologous recombination is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • homologous recombination can occur if the DNAs can hybridize with each other under stringent conditions.
  • POXB activity refers to the activity of catalyzing the reaction of generating acetic acid from pyruvic acid and water. “Modified to reduce POXB activity” means that POXB activity is lower than that of an unmodified strain, for example, a wild strain. The POXB activity is preferably reduced to 30% or less per unit cell weight, more preferably 10% or less, compared to the unmodified strain. “Decrease” includes the case where the activity is completely lost. POXB activity is determined by Chang Y. et al. , Et al. ,. J. et al. Bacteriol. 151, 1279-1289 (1982) and the like, and can be confirmed by measuring the activity.
  • the decrease in POXB activity is caused by disrupting the poxB gene according to a known method, for example, a method using homologous recombination or a method using the sacB gene (Schaffer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73). Can be performed. Specifically, it can be carried out according to the method disclosed in WO2005 / 113745.
  • Examples of the poxB gene include GenBank Accession No. A gene having the base sequence of Cgl2610 (the 2777766-2778505th complementary strand of GenBank Accession No. BA000036) can be mentioned, but it has homology to the extent that homologous recombination occurs with the podB gene on the chromosomal DNA of the host bacteria.
  • homologous gene of the sequence can also be used.
  • the homology that causes homologous recombination is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • homologous recombination can occur if the DNAs can hybridize with each other under stringent conditions.
  • ACH activity refers to the activity of catalyzing the reaction of generating acetic acid from acetyl CoA. “Modified to reduce ACH activity” means that the ACH activity is lower than that of an unmodified strain such as a wild strain. The ACH activity is preferably reduced to 30% or less per unit cell weight, more preferably 10% or less, compared to the unmodified strain. The “decrease” includes the case where the activity is completely lost. ACH activity is described, for example, by Gergely, J. et al. , Et al. , (1952) J.H. Biol. Chem. 198 p323-334, Veit, A .; , Et al. , (2009) J. Biotechnol. 140 (1-2): It can be measured by the method described in 75-83 and the like.
  • the decrease in ACH activity is caused by disrupting the ach gene according to a known method, for example, a method using homologous recombination or a method using the sacB gene (Schaffer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73). It can be carried out. Specifically, it can be carried out according to the method disclosed in WO2005 / 113744.
  • Examples of the ach gene include GenBank Accession No. A gene having the base sequence of Cgl2569 (the complementary sequence of 2729376-2730917 of GenBank Accession No. BA00000036) is mentioned, but it has homology to the extent that homologous recombination occurs with the ach gene on the chromosomal DNA of the host bacteria.
  • homologous gene of the sequence can also be used.
  • the homology that causes homologous recombination is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • homologous recombination can occur if the DNAs can hybridize with each other under stringent conditions.
  • the microorganism used in the non-amino organic acid production process is a bacterium obtained by combining two or more of the above modifications in addition to the above PC activity enhancement or PC activity enhancement and LDH activity reduction. It may be.
  • Preferred microorganisms include, for example, the Brevibacterium flavum MJ233 / PC-4 / ⁇ LDH strain described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-259451, the alcohol dehydrogenase described in International Publication No. 2010/003728, etc.
  • ADH1 and ADH2 genes are disrupted, GPD1 gene encoding glycerol 3-phosphate dehydrogenase is disrupted, and phosphoenolpyruvate carboxykinase gene, malate dehydrogenase gene, fumarase gene, NADH type fumarate reductase gene and malate transport SUC-200 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1 :: lox adh2 :: lox gpd1 which is a recombinant yeast strain introduced with a protein gene : Kanlox, overexpressing PCKa, MDH3, FUMR, include FRDg and SpMAE1) or the like.
  • non-amino organic acid is succinic acid
  • many microorganisms that produce non-amino organic acids other than succinic acid are known, and such known microorganisms are used.
  • Non-amino organic acids other than succinic acid can also be produced.
  • the microorganism cultured on a solid medium such as an agar medium may be directly used for the non-amino organic acid production reaction, but the microorganism is previously cultured in a liquid medium ( It is preferable to use a seed culture.
  • a medium used for seed culture a normal medium used for culturing the above-mentioned microorganism can be used.
  • a general medium in which a natural nutrient source such as meat extract, yeast extract or peptone is added to a composition composed of inorganic salts such as ammonium sulfate, potassium phosphate and magnesium sulfate can be used.
  • the culture for obtaining the cells used for the non-amino organic acid production reaction by growing the microorganism is usually in the range of 25 ° C. to 35 ° C., more preferably 25 ° C., which is the optimum growth temperature for coryneform bacteria. C. to 30.degree. C., particularly preferably about 30.degree. C., while aeration and agitation are performed and oxygen is supplied.
  • the culture time may be a time for obtaining a certain amount of cells, but is usually 6 to 96 hours.
  • the optimum growth temperature refers to the temperature at which the growth rate is fastest under the conditions used for producing the non-amino organic acid.
  • a method for preparing a microbial cell more suitable for the production of a non-amino organic acid a method of culturing so as to alternately and repeatedly repeat depletion and fullness of a carbon source described in JP-A-2008-259451 is also used. be able to.
  • the bacterial cells after the seed culture may be collected by centrifugation, membrane separation or the like and then used for a non-amino organic acid production reaction.
  • the processed material of the microbial cell can also be used as a microorganism used for manufacture of a non-amino organic acid.
  • treated cells include, for example, immobilized cells obtained by culturing and collecting cells collected by the above method using acrylamide, carrageenan, etc., disrupted cells, centrifuge supernatants thereof, or the like Examples thereof include a fraction obtained by partially purifying the supernatant by an ammonium sulfate treatment.
  • a non-amino organic acid is produced by reacting the microorganism thus obtained with a mixed solution of a heated sucrose aqueous solution obtained in the sucrose heating step and a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt.
  • the use concentration of the heated sucrose used in the non-amino organic acid production reaction is not particularly limited, but under batch conditions, it is advantageous to make it as high as possible as long as the production of the non-amino organic acid is not inhibited.
  • the reaction is carried out within the range of 5.0 to 30% (W / V), preferably 10 to 20% (W / V). Further, although there is no particular limitation according to the reduction of sucrose accompanying the progress of the reaction, for example, additional heating sucrose may be added so as to be 0.1 to 10% (W / V).
  • the reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt to which the heated aqueous sucrose solution is added is not particularly limited, and may be, for example, a medium for culturing the microorganism or a buffer solution such as a phosphate buffer solution.
  • the nitrogen source is not particularly limited as long as it is a nitrogen source that can be assimilated by the bacterium to produce succinic acid and the like. Specifically, ammonium salt, nitrate, urea, soybean hydrolysate, casein degradation Various organic and inorganic nitrogen compounds such as food, peptone, yeast extract, meat extract and corn steep liquor.
  • the inorganic salt various phosphates, sulfates, magnesium, potassium, manganese, iron, zinc, and other metal salts are used.
  • factors that promote growth such as vitamins such as biotin, pantothenic acid, inositol, and nicotinic acid, nucleotides, and amino acids are added as necessary.
  • the method for mixing the obtained sucrose-containing aqueous solution with a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt is not particularly limited, and may be mixed by a known method such as stirring.
  • the prepared microorganisms may be allowed to act simultaneously, or may be allowed to act after mixing a sucrose-containing aqueous solution with a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt.
  • reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt or a mixture of a sucrose-containing aqueous solution and a reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt examples include, for example, carbonate ions, It is preferable to contain ions or carbon dioxide gas (carbon dioxide gas). Carbonate ions or bicarbonate ions are supplied from magnesium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, etc., which can also be used as a neutralizing agent. It can also be supplied from these salts or carbon dioxide gas.
  • the carbonate or bicarbonate salt include magnesium carbonate, ammonium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, ammonium bicarbonate, sodium bicarbonate, and potassium bicarbonate.
  • Carbonate ions and bicarbonate ions are added at a concentration of 1 to 500 mM, preferably 2 to 300 mM, more preferably 3 to 200 mM.
  • carbon dioxide gas is contained, 50 mg to 25 g, preferably 100 mg to 15 g, more preferably 150 mg to 10 g of carbon dioxide gas is contained per liter of the solution.
  • the mixed solution of the sucrose-containing aqueous solution, the reaction solution containing the nitrogen source and the inorganic salt may contain the above microorganisms.
  • the pH of the mixed solution of the sucrose-containing aqueous solution and the reaction solution containing a nitrogen source and an inorganic salt is sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, etc. It can adjust by adding.
  • the pH in this reaction is not particularly limited, but for microorganisms with weak acid resistance, the pH is usually 5 or more, preferably 6 or more, on the other hand, usually 12 or less, preferably 10 or less, more preferably 9.5. Since the following is more preferable, the pH of the reaction solution is adjusted within the above range with an alkaline substance, carbonate, urea or the like as necessary during the reaction.
  • the pH in this reaction is usually pH 1 or more, more preferably 1.5 or more, particularly preferably 2 or more, on the other hand, usually 5 or less. It is preferably 4 or less, particularly preferably 3.5 or less.
  • the non-amino organic acid production reaction is performed at a temperature 2 to 20 ° C., preferably 7 to 15 ° C. higher than the optimum growth temperature of the microorganism used, specifically 37 to 45 ° C., preferably 39 to 45 ° C. More preferably, it is carried out in the range of 39 to 43 ° C., particularly preferably 39 to 41 ° C.
  • the reaction time is preferably 1 to 168 hours, more preferably 3 to 72 hours.
  • the amount of cells used for the reaction is not particularly limited, but 1 to 700 g / L, preferably 10 to 500 g / L, more preferably 20 to 400 g / L is used.
  • the reaction may be carried out with aeration and stirring, but may also be carried out in an anaerobic atmosphere without aeration and without supplying oxygen. Under the anaerobic atmosphere here, for example, the container is sealed and reacted without aeration, supplied with an inert gas such as nitrogen gas and reacted, or the inert gas containing carbon dioxide gas is vented. Obtainable.
  • non-amino organic acids such as succinic acid, fumaric acid and malic acid are generated and accumulated in the reaction solution.
  • the non-amino organic acid accumulated in the reaction solution can be collected from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, for example, after removing solids such as cells by centrifugation, filtration, etc., desalting with an ion exchange resin or the like, and purifying by crystallization or column chromatography from the solution, etc.
  • Non-amino organic acids can be collected.
  • succinic acid derivative can be produced using the obtained succinic acid after producing succinic acid by the method of the present invention.
  • succinic acid derivatives include succinic acid salt, succinic anhydride, maleic anhydride, succinic acid ester, succinimide, 1,4-diaminobutane, succinic acid nitrile, 2-pyrrolidone, N-methylpyrrolidone (NMP).
  • 1,4-butanediol can be produced by hydrogenating succinic acid.
  • 1,4-butanediol is used as a raw material for polybutylene succinate resin, polybutylene terephthalate resin, tetrahydrofuran (solvent), N-methylpyrrolidone and ⁇ -butyrolactan which is a precursor of N-vinylpyrrolidone.
  • a succinic acid-containing polymer can be produced by conducting a polymerization reaction using succinic acid produced by the production method of the present invention as a raw material.
  • succinic acid produced in the present invention is processed into polymers such as polyester and polyamide.
  • Specific examples of succinic acid-containing polymers include succinic acid polyesters obtained by polymerizing diols such as butanediol and ethylene glycol and succinic acid, succinic acid polyamides obtained by polymerizing diamines such as hexamethylenediamine and succinic acid, and the like. Is mentioned.
  • succinic acid obtained by the production method of the present invention or a composition containing the succinic acid can be used for food additives, pharmaceuticals, cosmetics and the like.
  • fumaric acid or a composition containing fumaric acid can be used as a food additive, unsaturated polyester resin, paper sizing agent, etc.
  • malic acid or a composition containing malic acid is used as a food additive. It can be used for cosmetics, deodorants, detergents, dyes and the like.
  • sucrose aqueous solution whose sucrose decomposition rate after heat processing is 14% or less>
  • Sucrose 500 g was dissolved in distilled water, and the sucrose aqueous solution made up to 1000 mL was adjusted to a predetermined pH with sulfuric acid or potassium hydroxide aqueous solution and sterilized by heating at 121 ° C. for 20 minutes to obtain sucrose aqueous solutions having different decomposition rates.
  • Table 1 shows the residual ratio of sucrose after heat sterilization (100 ⁇ sucrose concentration after heating / heated sucrose concentration).
  • glucose aqueous solution and fructose aqueous solution dissolved glucose and fructose 500g in distilled water, respectively, made up to 1000 mL, and heat-sterilized at 120 degreeC for 20 minutes.
  • seed culture medium (urea: 4 g, ammonium sulfate: 14 g, monopotassium phosphate: 0.5 g, dipotassium phosphate 0.5 g, magnesium sulfate heptahydrate: 0.5 g, ferrous sulfate-7 water (Japanese product: 20 mg, manganese sulfate / hydrate: 20 mg, D-biotin: 200 ⁇ g, thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, yeast extract: 1 g, casamino acid: 1 g, and distilled water: 100 mL of 1000 mL medium) in a 500 mL Erlenmeyer flask The mixture was sterilized by heating at 120 ° C.
  • the obtained whole culture solution was collected by centrifugation at 5000 rpm for 7 minutes, and a cell suspension medium (magnesium sulfate.7 hydrate: 1 g, ferrous sulfate.7 hydrate: 40 mg, manganese sulfate. Hydrate: 40 mg, D-biotin: 400 ⁇ g, thiamine hydrochloride: 400 ⁇ g, monoammonium phosphate: 0.8444 g, diammonium phosphate: 0.758 g, potassium chloride: 0.1491 g, ammonium sulfate 66 g, and distilled water: 1000 mL ) So that the absorbance of OD 660 is 80.
  • a 4 ml reactor Into a 4 ml reactor, 0.5 ml of the substrate suspension (glucose aqueous solution or fructose aqueous solution or sucrose aqueous solution having different decomposition rates: 400 mL, magnesium carbonate: 194.2 g, and distilled water: 470 mL) 0.5 mL was added and allowed to react for 25.5 hours or 43 hours at 39 ° C. in a 20% carbon dioxide 80% nitrogen atmosphere.
  • the substrate suspension glucose aqueous solution or fructose aqueous solution or sucrose aqueous solution having different decomposition rates: 400 mL, magnesium carbonate: 194.2 g, and distilled water: 470 mL
  • a non-amino organic acid such as succinic acid can be efficiently produced by the method of the present invention.
  • Succinic acid is useful as a raw material for polymers such as polyester and polyamide, particularly biodegradable polyester, and as a raw material for synthesizing foods, pharmaceuticals and other chemicals.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)

Abstract

スクロース含有水溶液を、加熱後のスクロース分解率が１４％以下になるように加熱し、得られたスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合し、得られた混合液を微生物またはその処理物に作用させて非アミノ有機酸を生成・蓄積させ、該非アミノ有機酸を採取する。

Description

非アミノ有機酸の製造方法
　本発明は、微生物を使用してコハク酸などの非アミノ有機酸を製造する方法に関するものである。
　コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
　また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、非アミノ有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。
　特許文献５ではスクロース（ショ糖）を酸でグルコースとフルクトースに分解し、これを炭素源として用いてコハク酸発酵を行う方法が開示されている。
　特許文献６ではスクロース（ショ糖）を加熱滅菌した後に、これを炭素源としてコハク酸発酵を行う方法が開示されている。
　非特許文献２ではスクロース（ショ糖）、窒素源及び無機塩を同時に混合した溶液を加熱処理した後に、これを炭素源としてコハク酸発酵を行う方法が開示されている。
　しかし、加熱後のスクロースの分解率を１４％以下になるように加熱すること、及び該スクロース含有溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合した後に、該スクロース溶液を炭素源として用いた非アミノ酸の製造方法については開示がない。
米国特許第５，１４３，８３４号公報 米国特許第５，５０４，００４号公報 特開平１１－１１３５８８号公報 特開平１１－１９６８８８号公報 米国特許公開２００７－１２２８９２号 国際公開第２００５／０２６３４９号
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（１９９９），　４９，２０７－２１６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（２００６），１００，１３４８－１３５４
　本発明の課題は、微生物を使用したコハク酸などの非アミノ有機酸の製造方法において、その生産効率を向上させることにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、スクロース含有水溶液を、加熱後のスクロース分解率が１４％以下になるように加熱して得られたスクロース含有水溶液を炭素源として用いることにより、コハク酸などの非アミノ有機酸の対糖収率が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）スクロース含有水溶液を、加熱工程後のスクロース分解率が１４％以下になるように加熱し、得られたスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合し、得られた混合液を微生物またはその処理物に作用させて非アミノ有機酸を生成・蓄積させ、該非アミノ有機酸を採取することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
（２）加熱されるスクロース含有水溶液がｐＨ６．０以上１４以下の水溶液である、（１）に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
（３）前記微生物が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物である、（１）又は（２）に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
（４）前記微生物が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された微生物である、（１）～（３）のいずれかに記載の非アミノ有機酸の製造方法。
（５）非アミノ有機酸がコハク酸である、（１）～（４）のいずれかに記載の非アミノ有機酸の製造方法。
（６）（５）に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を重合する工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
（７）（５）に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料としてコハク酸誘導体を合成する工程を含む、コハク酸誘導体の製造方法。
　本発明の方法によれば、コハク酸などの非アミノ有機酸を効率よく生産することができる。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明の非アミノ有機酸の製造方法は、スクロース含有水溶液を、加熱工程後のスクロース分解率が１４％以下になるように加熱し、得られたスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合し、得られた混合液を微生物またはその処理物に作用させて非アミノ有機酸を生成・蓄積させ、該非アミノ有機酸を採取することを特徴とする。
　本発明において、非アミノ有機酸はアミノ酸以外の有機酸を意味する以外特に限定はないが、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、２－オキソグルタル酸、シス－アコニット酸およびピルビン酸が好ましく、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸などのジカルボン酸がより好ましく、コハク酸が特に好ましい。
　まず、本発明の方法のスクロース含有水溶液加熱工程について説明する。
　この工程では、加熱工程後のスクロース分解率が１４％以下になるようにスクロース含有水溶液を加熱する。ここで「スクロース分解率」とはスクロースがグルコースとフルクトースに分解される割合をいう。スクロース分解率は好ましくは１０％以下である。
　加熱工程の条件については、加熱工程後のスクロース分解率が１４％以下になる限り特段の制限は無いが、加熱工程の温度、圧力及び時間並びに加熱工程前のスクロース含有水溶液のｐＨ及び窒素含有量等の条件を制御することにより上記分解率が達成される。その中でも、加熱工程が殺菌処理を兼ねることが好ましい。液化炭酸ガスを混合したり、超音波処理を行ってもよく、膜処理を行ってもよい。加熱工程は、回分操作でもよいし、連続操作でもよい。
　加熱工程の温度は、特段の制限はないが、通常６０℃以上、好ましくは１００℃以上であり、一方、通常１６０℃以下、好ましくは１４０℃以下である。加熱工程温度をこの範囲にすることにより、殺菌の点で好ましい。
　加熱工程の圧力は、特段の制限はないが、通常０．１ＭＰａ以上、好ましくは０．２ＭＰａ以上であり、一方、通常０．６ＭＰａ以下、好ましくは０．５ＭＰａ以下である。加熱工程の圧力をこの範囲にすることにより、殺菌の点で好ましい。
　加熱工程の時間は、特段の制限はないが、通常１分以上、好ましくは３分以上であり、一方、通常１２０分以下、好ましくは２０分以下である。加熱工程の時間をこの範囲にすることにより、殺菌の点で好ましい。
　加熱工程前のスクロース含有水溶液の濃度は、特段の制限はないが、通常５重量％以上、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量％以上であり、一方、通常８５重量％以下、好ましくは８０重量％以下、より好ましくは７５重量％以下である。加熱工程前のスクロース含有水溶液の濃度をこの範囲にすることにより、スクロース含有水溶液の加熱殺菌効率、スクロース含有水溶液の液量適正化のため、好ましい。
　加熱工程前のスクロース含有水溶液のｐＨは、通常６．０以上、好ましくは６．３以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは６．８以上、特に好ましくは７．０以上であり、一方、通常１４.０以下、好ましくは１３.０以下、より好ましくは１２.０以下、さらに好ましくは１１.０以下、特に好ましくは１０.０以下、殊更に好ましくは９．０以下である。加熱工程前のスクロース含有水溶液のｐＨをこの範囲にすることにより、加熱工程後のスクロース分解率が抑制されるため、好ましい。
　加熱工程前のスクロース含有水溶液の窒素含有量は、炭素含有量１００重量あたり、通常５％以下、好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下である。加熱工程前のスクロース含有水溶液の窒素含有量を５％以下とすることにより、スクロース並びにスクロースの分解物であるグルコース又はフルクトースと、窒素含有化合物との反応が抑制されるために好ましい。
　次に、非アミノ有機酸製造工程について説明する。この工程では、スクロース加熱工程で得られた加熱スクロース水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合し、得られた混合液をスクロースを非アミノ有機酸に変換することのできる微生物を作用させて非アミノ有機酸を製造する。
　ここで使用される微生物は、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ　Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌又はサクシノバチルス（Ｓｕｃｃｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、糸状菌、酵母が好ましく、この中ではコリネ型細菌及び酵母がより好ましい。
　エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリなどが挙げられ、ラクトバチルス属細菌としてはラクトバチルス・ヘルヴェチカスなどが挙げられ（Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　２００１，　９１，　ｐ８４６－８５２、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス等が挙げられ、リゾビウム属細菌としては、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｅｔｌｉ）などが挙げられ、酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびチゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などに属する酵母が挙げられる。
　サッカロミセス属（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ウバラム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・バイアヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）等が用いられる。
　シゾサッカロミセス属（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母としては、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。
　カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する酵母としては、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ソノレンシス（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）およびカンジダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）等が挙げられる。
　ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）に属する酵母としては、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピディス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ）等が挙げられる。
　クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびクルイウェロマイセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）等が挙げられる。
　チゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｂａｉｌｌｉ）およびチゴサッカロミセス・ロウキシ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）等が挙げられる。
　コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌が挙げられる。
　非アミノ有機酸製造工程で用いるコリネ型細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９７）、同ＭＪ－２３３　ＡＢ－４１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Ｌｉｅｌｂｌ，　Ｗ．，　Ｅｈｒｍａｎｎ，　Ｍ．，　Ｌｕｄｗｉｇ，　Ｗ．　ａｎｄ　Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，　Ｋ．　Ｈ．，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１９９１，　ｖｏｌ．　４１，　ｐ２５５－２６０）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３株、及びその変異株ＭＪ－２３３　ＡＢ－４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ－２３３株及びＭＪ－２３３　ＡＢ－４１株と同一の株であるものとする。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ－２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター　〒３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９７の受託番号で寄託されている。
　非アミノ有機酸製造工程では、非アミノ有機酸を生産できる微生物であれば、上記微生物の野生株だけではなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組み換え法等の遺伝学的手法により誘導される組み換え体等も用いられる。
上記の組み換え体としては、各非アミノ有機酸について生合成酵素遺伝子の発現強化や分解酵素遺伝子の発現低下等、公知の方法によって得られたものが用いられる。具体的には、例えば、コハク酸製造方法においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変型と比べて増強するように遺伝子改変されたものや、ラクトデヒドロゲナーゼ活性が非改変型と比べて低減するように遺伝子改変されたもの等が挙げられる。
　ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＣ」、あるいは「ｐｃ」とも呼ぶ）活性が非改変型と比べて増強するように遺伝子改変された細菌は、例えば、特開平１１－１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、ｐｃ遺伝子をプラスミドにより宿主細菌中で高発現させることにより構築することができる。また、相同組換えによって染色体上に組み込んでもよいし、プロモーター置換によってｐｃ遺伝子の発現を増強することもできる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Ｒｅｓ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　Ｖｏｌ．１４４，　ｐ．１８１－１８５，　１９９３）等によって行うことができる。具体的なｐｃ遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｃ遺伝子（Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，　Ｐ．Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　ｖｏｌ．１４４　（１９９８）　ｐ９１５－９２７）などを用いることができる。また、ｐｃ遺伝子は、該コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｐｃ遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、または該遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡであって、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好適に用いることができる。
　さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム以外のコリネ型細菌、または他の微生物又は動植物由来のｐｃ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト　［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，　２０２，　１００９－１０１４，　（１９９４）］
マウス［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，　９０，　１７６６－１７７９，　（１９９３）］
ラット［ＧＥＮＥ，　１６５，　３３１－３３２，　（１９９５）］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，　２２９，　３０７－３１５，　（１９９１）］
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）
［ＤＤＢＪ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．；　Ｄ７８１７０］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
［ＧＥＮＥ，　１９１，　４７－５０，　（１９９７）］
リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｅｔｌｉ）
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７８，　５９６０－５９７０，　（１９９６）］
　「ＰＣ活性が増強される」とは、ＰＣ活性が野生株又は親株等の非改変株に対して、単位菌体重量あたり好ましくは１．５倍以上、より好ましくは３．０倍以上増加していることをいう。
ＰＣ活性が増強されたことは、公知の方法、例えば、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８，５５－６２，（１９８４）に記載の方法によりＰＣ活性を測定することによって確認することができる。ｐｃ遺伝子や具体的な導入方法としては、特開２００８－２５９４５１号に記載のものが用いられる。
　また、ラクトデヒドロゲナーゼ（以下、「ＬＤＨ」と称することがある）活性が非改変型と比べて低減するように遺伝子改変されたもとしては、例えば、特開平１１－２０６３８５号公報に記載されている相同組換えによる方法、あるいは、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ　１４５　（１９９４）　６９－７３）等で染色体上のＬＤＨ遺伝子を破壊することによって構築することができる。なお、「ＬＤＨ活性が低減された」とは、非改変株と比較してＬＤＨ活性が低下していることをいう。ＬＤＨ活性は完全に消失していてもよい。ＬＤＨ活性が低下したことは、公知の方法（Ｌ．．Ｋａｎａｒｅｋ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９，４２０２（１９６４）等）によりＬＤＨ活性を測定することによって確認することができる。
　さらに、本発明の製造方法で用いられる微生物は、上記ＰＣ活性の増強、または、ＰＣ活性の増強およびＬＤＨ活性の低下に加えて、アセテートキナーゼ（以下、「ＡＣＫ」とも呼ぶ）、ホスフォトランスアセチラーゼ（以下、「ＰＴＡ」とも呼ぶ）、ピルベートオキシダーゼ（以下、「ＰＯＸＢ」とも呼ぶ）およびアセチルＣｏＡハイドロラーゼ（以下、「ＡＣＨ」とも呼ぶ）からなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
　ＰＴＡとＡＣＫはいずれか一方を活性低下させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
「ＰＴＡ活性」とは、アセチルＣｏＡにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＰＴＡ活性が低減するように改変された」とは、ＰＴＡ活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ＰＴＡ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＰＴＡ活性は完全に消失していてもよい。ＰＴＡ活性が低下したことは、例えば、Ｋｌｏｔｚｓｃｈ，　Ｈ．　Ｒ．，　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１２，　３８１－３８６（１９６９）等に記載の方法により、ＰＴＡ活性を測定することによって確認することができる。
　「ＡＣＫ活性」は、アセチルリン酸とＡＤＰから酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＡＣＫ活性が低減するように改変された」とは、ＡＣＫ活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ＡＣＫ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。また、ＡＣＫ活性は完全に消失していてもよい。ＡＣＫ活性が低下したことは、Ｒａｍｐｏｎｉらの方法（Ｒａｍｐｏｎｉ　Ｇ．，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　４２，４０９－４２６（１９７５））により、ＡＣＫ活性を測定することによって確認することができる。
　なお、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムに分類されるものも含む）においては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．　１９９９　Ｆｅｂ；１４５　（Ｐｔ　２）：５０３－１３に記載されているように、両酵素はｐｔａ－ａｃｋオペロン（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ８９０８４）にコードされているため、ｐｔａ遺伝子を破壊した場合は、ＰＴＡ及びＡＣＫの両酵素の活性を低下させることができる。
　ＰＴＡおよびＡＣＫの活性低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１４５　（１９９４）　６９－７３）に従ってこれらの遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、特開２００６－００００９１号公報に開示された方法に従って行うことができる。ｐｔａ遺伝子およびａｃｋ遺伝子としては、上記ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｘ８９０８４の塩基配列を有する遺伝子のほか、宿主染色体上のｐｔａ遺伝子およびａｃｋ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
　「ＰＯＸＢ活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＰＯＸＢ活性が低減するように改変された」とは、ＰＯＸＢ活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ＰＯＸＢ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ＰＯＸＢ活性は、Ｃｈａｎｇ　Ｙ．　，ｅｔ　ａｌ．，．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５１，１２７９－１２８９（１９８２）等に記載の方法により、活性を測定することによって確認することができる。
　ＰＯＸＢ活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１４５　（１９９４）　６９－７３）等に従ってｐｏｘＢ遺伝子を破壊することにより行うことができる。具体的には、ＷＯ２００５／１１３７４５号公報等に開示された方法に従って行うことができる。ｐｏｘＢ遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｃｇｌ２６１０（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６の２７７６７６６－２７７８５０５番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のｐｏｘＢ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
　「ＡＣＨ活性」は、アセチルＣｏＡから酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ＡＣＨ活性が低減するように改変された」とは、ＡＣＨ活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ＡＣＨ活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり３０％以下に低下していることが好ましく、１０％以下に低下していることがより好ましい。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ＡＣＨ活性は、例えば、Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９５２）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　１９８　ｐ３２３－３３４、Ｖｅｉｔ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４０（１－２）：７５－８３等に記載の方法により測定することが出来る。
　ＡＣＨ活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｓｃｈａｆｅｒ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　１４５　（１９９４）　６９－７３）に従ってａｃｈ遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、ＷＯ２００５／１１３７４４号公報等に開示された方法に従って行うことができる。ａｃｈ遺伝子としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｃｇｌ２５６９（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＢＡ００００３６の２７２９３７６－２７３０９１７番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のａｃｈ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
　なお、非アミノ有機酸製造工程に用いられる微生物は、上記ＰＣ活性の増強、または、ＰＣ活性の増強およびＬＤＨ活性の低下に加え、上記改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。
　好ましい微生物としては、例えば、日本国特開２００８－２５９４５１号公報に記載されているブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ－４／ΔＬＤＨ株、国際公開第２０１０／００３７２８号等に記載のアルコールデヒドロゲナーゼをコードするＡＤＨ１及びＡＤＨ２遺伝子が破壊され、グリセロール３リン酸デヒドロゼナーゼをコードするＧＰＤ１遺伝子が破壊され、並びにホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、フマラーゼ遺伝子、ＮＡＤＨ型フマル酸リダクターゼ遺伝子及びリンゴ酸輸送タンパク質遺伝子が導入された組換え酵母菌株であるＳＵＣ－２００（ＭＡＴＡ　ｕｒａ３－５２　ｌｅｕ２－１１２　ｔｒｐ１－２８９　ａｄｈ１：：ｌｏｘ　ａｄｈ２：：ｌｏｘ　ｇｐｄ１：：Ｋａｎｌｏｘ，　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＰＣＫａ，ＭＤＨ３，ＦＵＭＲ，ＦＲＤｇ　ａｎｄ　ＳｐＭＡＥ１）等が挙げられる。
　以上、非アミノ有機酸がコハク酸の場合に使用できる組換え微生物について説明したが、コハク酸以外の非アミノ有機酸を生産する微生物も数多く知られており、そのような公知の微生物を用いてコハク酸以外の非アミノ有機酸を製造することもできる。
　上記のような微生物を非アミノ有機酸の製造に用いる場合、寒天培地等の固体培地で斜面培養した微生物を直接非アミノ有機酸生産反応に用いても良いが、微生物を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。種培養に用いる培地は、上記微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。
　上記微生物を増殖させて非アミノ有機酸生成反応に用いる菌体を得るための培養は、通常、コリネ型細菌であれば、生育至適温度である２５℃～３５℃の範囲、より好ましくは２５℃～３０℃、特に好ましくは約３０℃で、通気、攪拌し酸素を供給しながら行う。培養時間は一定量の菌体が得られる時間であればよいが、通常、６～９６時間である。生育至適温度は、非アミノ有機酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。
　また、より非アミノ有機酸の製造に適した菌体の調製方法として、特開２００８－２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
　種培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収した後に、非アミノ有機酸生成反応に用いてもよい。本発明では、非アミノ有機酸の製造に用いられる微生物として、その菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、上記方法で培養、集菌した菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
　かくして得られる微生物をスクロース加熱工程で得られた加熱スクロース水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液との混合液と反応させることによって非アミノ有機酸を製造する。
　非アミノ有機酸生成反応に用いられる上記加熱スクロースの使用濃度は特に限定されないが、バッチ条件下では、非アミノ有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５．０～３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０～２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴うスクロースの減少にあわせ、特段の制限はないが、例えば０．１～１０％（Ｗ／Ｖ）となるように加熱スクロースの追加添加を行っても良い。
　上記加熱スクロース水溶液を添加する窒素源及び無機塩を含む反応液としては、特に限定されず、例えば、上記微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化してコハク酸等を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
　得られたスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合する方法としては、特段の制限はなく、攪拌等の公知の方法で混合すればよい。又、上記調整した微生物を同時に作用させても、スクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合した後に作用させてもよい。
　窒素源及び無機塩を含む反応液又はスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液の混合液には、例えば上記した加熱スクロース、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガス（炭酸ガス）を含有させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。
　炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１～５００ｍＭ、好ましくは２～３００ｍＭ、さらに好ましくは３～２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ～２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ～１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ～１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
　スクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液の混合液には、上記の微生物を含んでいてもよい。
　スクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液の混合液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、特段の制限はないが、耐酸性が弱い微生物においては、通常、ｐＨは５以上、好ましくはｐＨ６以上、一方、通常１２以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９．５以下がより好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
　一方、糸状菌や酵母菌のように耐酸性が強い微生物を用いる場合は、本反応におけるｐＨは、通常ｐＨ１以上、より好ましくは１．５以上、特に好ましくは２以上、一方、通常５以下、好ましくは４以下、特に好ましくは３．５以下とすることが好ましい。
　上記非アミノ有機酸生成反応は、用いる微生物の生育至適温度より２～２０℃高い温度、好ましくは７～１５℃高い温度で、具体的には、３７～４５℃、好ましくは３９～４５℃、より好ましくは３９～４３℃、特に好ましくは３９～４１℃の範囲で行うとよい。反応の時間は１～１６８時間が好ましく、３～７２時間がより好ましい。非アミノ有機酸の生産反応の間、常に３７～４５℃である必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間、上記温度範囲にすることが望ましい。
　反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１～７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０～４００ｇ／Ｌが用いられる。反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
　以上のような反応により、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等の非アミノ有機酸が反応液中に生成、蓄積する。反応液中に蓄積した非アミノ有機酸は、常法に従って、反応液より採取することができる。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、各非アミノ有機酸を採取することができる。
　非アミノ有機酸がコハク酸である場合、上記本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を用いてコハク酸誘導体を製造することができる。ここで、コハク酸誘導体としては、コハク酸塩、無水コハク酸、無水マレイン酸、コハク酸エステル、コハク酸イミド、１，４－ジアミノブタン、コハク酸ニトリル、２－ピロリドン、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＧ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、γ－ブチロラクトン（ＧＢＬ）、ポリテトラメチンエーテルグリコール（ＰＴＭＧ）などが挙げられる。例えば、コハク酸を水素化することによって、１，４－ブタンジオールを製造することができる。１，４－ブタンジオールは、ポリブチレンサクシネート樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、テトラヒドロフラン（溶媒）、Ｎ－メチルピロリドンやＮ－ビニルピロリドンの前駆体であるγ－ブチロラクタンの原料等に用いられる。
　さらに、本発明の製造方法により製造されたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、特に、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
　また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。またフマル酸または該フマル酸を含有する組成物は、食品添加物、不飽和ポリエステル樹脂、紙用サイズ剤等に用いることができ、リンゴ酸または該リンゴ酸を含有する組成物は、食品添加物、化粧品、消臭剤、洗剤、染色剤等に用いることができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
＜加熱処理後のスクロース分解率が１４％以下のスクロース水溶液の発酵評価＞
　スクロース５００ｇを蒸留水に溶かし、１０００ｍＬにメスアップしたスクロース水溶液を硫酸あるいは水酸化カリウム水溶液で所定のｐＨに調整し、１２１℃、２０分加熱滅菌し、分解率の異なるスクロース水溶液を得た。加熱滅菌後のスクロース残存率（１００×加熱後スクロース濃度／加熱スクロース濃度）を表１に示す。また、グルコース水溶液およびフルクトース水溶液はグルコースおよびフルクトース５００ｇをそれぞれ蒸留水に溶かし、１０００ｍＬにメスアップし、１２０℃、２０分加熱滅菌した。
　１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ－ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、グルコース水溶液またはフルクトース水溶液または分解率の異なるスクロース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株（特開２００５－９５１６９）を接種して１６時間３０℃にて種培養した。
　得られた全培養液を５０００ｒｐｍ、７分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ－ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８４４４ｇ、リン酸二アンモニウム：０．７５８ｇ、塩化カリウム：０．１４９１ｇ、硫酸アンモニウム６６ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ660の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース水溶液またはフルクトース水溶液または分解率の異なるスクロース水溶液：４００ｍＬ、炭酸マグネシウム：１９４．２ｇ、及び蒸留水：４７０ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、２０％炭酸ガス８０％窒素雰囲気下、３９℃で２５．５時間または４３時間反応させた。
　反応後、１２０００ｒｐｍ、５分で遠心分離し、上清のコハク酸濃度を分析した結果、表１に示されるように、加熱処理後のスクロース分解率が１４％以下のスクロース水溶液を用いると、消費糖当たりのグルタミン酸の収率には変化は見られなかったが、消費糖当たりのコハク酸の収率は増加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の方法によりコハク酸などの非アミノ有機酸を効率よく製造することができる。コハク酸は、ポリエステル、ポリアミド等のポリマー、特に生分解性ポリエステルの原料として、また、食品、医薬品、その他化学品の合成原料として有用である。

Claims (7)

  1. スクロース含有水溶液を、加熱工程後のスクロース分解率が１４％以下になるように加熱し、得られたスクロース含有水溶液と窒素源及び無機塩を含む反応液を混合し、得られた混合液を微生物またはその処理物に作用させて非アミノ有機酸を生成・蓄積させ、該非アミノ有機酸を採取することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
  2. 加熱されるスクロース含有水溶液がｐＨ６．０以上１４以下の水溶液である、請求項１に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
  3. 前記微生物が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比較して低減するように改変された微生物である、請求項１又は２に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
  4. 前記微生物が、さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された微生物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
  5. 非アミノ有機酸がコハク酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載の非アミノ有機酸の製造方法。
  6. 請求項５に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を重合する工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
  7. 請求項５に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料としてコハク酸誘導体を合成する工程を含む、コハク酸誘導体の製造方法。
PCT/JP2010/070121 2009-11-13 2010-11-11 非アミノ有機酸の製造方法 WO2011059031A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112012011416-6A BR112012011416B1 (pt) 2009-11-13 2010-11-11 Método de produzir ácido succínico
JP2011540537A JP5810412B2 (ja) 2009-11-13 2010-11-11 非アミノ有機酸の製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009259806 2009-11-13
JP2009-259806 2009-11-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011059031A1 true WO2011059031A1 (ja) 2011-05-19

Family

ID=43991689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/070121 WO2011059031A1 (ja) 2009-11-13 2010-11-11 非アミノ有機酸の製造方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP5810412B2 (ja)
BR (1) BR112012011416B1 (ja)
WO (1) WO2011059031A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9388433B2 (en) 2011-03-18 2016-07-12 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026349A1 (ja) * 2003-09-17 2005-03-24 Mitsubishi Chemical Corporation 非アミノ有機酸の製造方法
US20070122892A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Christian Andersson Process for producing succinic acid from sucrose

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005026349A1 (ja) * 2003-09-17 2005-03-24 Mitsubishi Chemical Corporation 非アミノ有機酸の製造方法
US20070122892A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Christian Andersson Process for producing succinic acid from sucrose

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGARWAL L. ET AL.: "A cost effective fermentative production of succinic acid from cane molasses and corn steep liquor by Escherichia coli.", J. APPL. MICROBIOL., vol. 100, no. 6, 2006, pages 1348 - 1354 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9388433B2 (en) 2011-03-18 2016-07-12 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism
US10077456B2 (en) 2011-03-18 2018-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing polymer, method for producing organic acid, and organic acid-producing microorganism

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012011416A2 (pt) 2020-12-01
BR112012011416B1 (pt) 2021-09-21
JPWO2011059031A1 (ja) 2013-04-04
JP5810412B2 (ja) 2015-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1672067B1 (en) Process for producing non-amino organic acid
JP5180060B2 (ja) 有機酸生産菌及び有機酸の製造法
JP4582228B2 (ja) ポリエステル
JPWO2008133131A1 (ja) 有機酸の製造方法
JP2012516135A (ja) ヤロウィア属に属する酵母を用いてコハク酸を製造する方法
JP5034630B2 (ja) 有機酸生産微生物の菌体の調製法及び有機酸の製造法
EP2192189B1 (en) Method for production of succinic acid at high temperatures
CA2938372A1 (en) Modified microorganism for improved production of fine chemicals on sucrose
JP5857954B2 (ja) コハク酸の製造方法
JP2008067623A (ja) 非アミノ有機酸の製造方法
JP5810412B2 (ja) 非アミノ有機酸の製造方法
WO2013069786A1 (ja) コハク酸の製造方法
JP5663859B2 (ja) 非アミノ有機酸生産菌および非アミノ有機酸の製造方法
JP7158107B2 (ja) 有機化合物の生産方法
WO2010119927A1 (ja) コハク酸の製造方法
JP2008067629A (ja) 有機酸生産菌及び有機酸の製造方法
JP2008067624A (ja) 非アミノ有機酸の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10829990

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011540537

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1201002192

Country of ref document: TH

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10829990

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112012011416

Country of ref document: BR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112012011416

Country of ref document: BR

Free format text: 1) IDENTIFICAR E ENVIAR DOCUMENTACAO COMPROBATORIA, EM ATE 60 (SESSENTA) DIAS, DE QUE OS SIGNATARIOS DAS PETICOES NO 020120042836 DE 14/05/2012 E NO 020120065146 DE 13/07/2012 TEM PODERES PARA ATUAR EM NOME DO DEPOSITANTE, UMA VEZ A PROCURACAO FOI FEITA EM NOME DO ESCRITORIO, NAO HOUVE ENVIO DE SUBSTABELECIMENTO DETERMINANDO A QUALIFICACAO INDIVIDUAL DOS AGENTES AUTORIZADOS PARA AGIR EM NOME DO DEPOSITANTE, NAO FOI POSSIVEL IDENTIFICAR A PESSOA RESPONSAVEL PELA ASSINATURA DA PETICAO 260 E, CONFORME DETERMINADO PELO ARTIGO 216 DA LEI 9.279/1996 DE 14/05/1996 (LPI), OS ATOS PREVISTOS NESTA LEI DEVERAO SER PRATICADOS PELAS PARTES OU POR SEUS PROCURADORES, DEVIDAMENTE QUALIFICADOS.2) APRESENTAR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112012011416

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20120514