JP2000506012A

JP2000506012A - サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９ｅの第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現並びに酵素の生化学的特徴付け

Info

Publication number: JP2000506012A
Application number: JP9531227A
Authority: JP
Inventors: ダグラスエスバーデット; ジョセフジーザイカス
Original assignee: ミシガンステイトユニヴァーシティー
Priority date: 1996-02-27
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2000-05-23
Also published as: IL125910A0; WO1997032012A1; CA2247038A1; KR19990087330A; EP0883683A1; AU2530797A; US5908924A

Abstract

(57)【要約】サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅの第二級アルコールデヒドロゲナーゼ（２−Ａｄｈ）をコードするａｄｈＢ遺伝子をクローニングし、配列決定し、次いで大腸菌中で発現させた。酵素をコードする核酸配列及びアミノ酸配列の両者が報告される。精製された組換え酵素は３７．７ｋＤａのサブユニットから構成されるホモ四量体であり、９０℃をこえる温度で最適活性であり、９０℃で約１．７時間の半減期を有する。酵素は、第一級アルコールよりも第二級アルコールの酸化を実質的に好む。

Description

【発明の詳細な説明】サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅの第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現並びに酵素の生化学的特徴付け関連出願のクロスリファレンス本出願は、１９９６年２月２７日出願の米国仮出願（U．S．Provisional Appl ication）第６０／０１２，３３１号の利益を主張する。連邦政府援助研究又は開発に関する記載適用せず。本明細書において使用する略語本明細書において、以下に示す略語を使用した。Ａｄｈアルコールデヒドロケナーゼ１°Ａｄｈ第一級アルコールデヒドロケナーゼ２°Ａｄｈ第二級アルコールデヒドロゲナーゼＤＴＮＢジチオニトロベンゾエートＤＥＰＣジエチルピロカーボネートＨＣＡ疎水性クラスター分析ＤＴＴジチオスレイトールＭＡＬＤＩマトリックス付着レーザー脱離イオン化質量分析法（matrix assoc iated laser desorption ionization mass spectrometry）ＥＤＴＡ（エチレンジニトリロ）四酢酸三ナトリウム塩ＯＲＦ読み枠ＲＢＳリボソーム結合部位発明の背景本発明は、酵素をコードする遺伝子のクローニング及び発現に関する。より詳細には、本発明は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現に関する。アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）（ＥＣ１．１．１．１［ＮＡＤＨ］又はＥＣ１．１．１．２［ＮＡＤＰＨ］）は、構造的に保存された酵素のクラスとして十分に研究されている［１］。ウマ肝臓の第一級アルコールデヒドロゲナーゼ（１°Ａｄｈ）のＸ線構造が知られており、この酵素の特性は広範囲に詳述されている［１、２］。Ａｄｈは、触媒作用に関連する亜鉛原子を有する、二量体又は四量体の、典型的なピリジンジヌクレオチド依存性金属酵素である。Ａｄｈタンパク質は、第一級又は第二級アルコールに対する相対活性に基づき１°又は２°Ａｄｈに分類される。１°及び２°Ａｄｈは構造的に類似しており、その活性部位構造における比較的小さな変化により基質が異なると考えられている。四量体２°Ａｄｈは多数の微生物に由来することが報告されている［３〜７］。サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈは二機能性Ａｄｈ／アセチルＣｏＡ還元性チオエステラーゼである［７］。エタノール形成の間、ニコチンアミド補因子を酸化することにより生理的に機能し、グリセロアルデヒドデヒドロゲナーゼ工程における解糖阻害を間接的に防いでいることが提唱されている［８］。２°Ａｄｈは、その広い特異性及びプロキラルなケトンからアルコールへの高度エナンチオ特異的転換のため、キラル化学的生成の触媒としての使用に対して魅力的な対象である［９〜１２］。キラル合成における２°Ａｄｈの商業的規模の適用に対する２つの問題は、高価なニコチンアミド補因子の再生及び維持が困難であること並びに安価かつ安定な酵素が不足していることである。補因子の再生及び維持は、多数の戦略により克服した［１３、１４］。一方、好熱性酵素は、通常その中温性対応物よりもより安定であるが、好熱性２°Ａｄｈを生産する生物は増殖が遅く、細胞密度が低いので、この酵素の代替の発現系は、その商業的な適用及び詳細なタンパク質構造−機能の研究について非常に重要である。好熱性細菌の発見は、熱安定性酵素を直接単離する機会を提供してきた。好熱性嫌気性菌ティー・エタノリカス（T．ethanolicus）及びサーモアンエアロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）［１５］は、７０℃より高い温度で安定なエナンチオ特異的２°Ａｄｈを過剰に発現する。これら２種の２° Ａｄｈは、分子量及び動力学的特性が類似していることに基づいて、構造上非常に類似していると提唱されている［１６］。中温性ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性２°Ａｄｈをコードするクロストリジウム・べイジェリンキイ（Clostridium beijerin ckii）遺伝子がクローニングされ、配列が決定され（ジェンバンク（Genbank）、Acc．No．M84723）、ティー・ブロッキイ（T．brockii）の２°Ａｄｈのアミノ酸配列がエドマン分解により決定されている［１７］が、詳細な生化学的研究のためにクローニングされた好熱性２°Ａｄｈは入手することができない。ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈのアミノ酸配列は、本出願の優先日前には公衆に利用可能ではなかった。発明の概要本発明は、好熱性ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈをコードする遺伝子のクローニング、配列決定及び発現に関する。組換え酵素の動力学的及び熱的特性が開示される。酵素の非連続的アレニウスプロットが記載される。最終的には、タンパク質配列情報を使用して、好熱性及び中温性の１°Ａｄｈおよび２°Ａｄｈの間の構造上の関係を調べた。これらの比較を使用して、２°Ａｄｈの触媒作用的Ｚｎ配位残基及び２°Ａｄｈの熱安定性における特異的プロリンの潜在的な関係を予想した。図面の幾つかの観点の簡単な説明図１は、ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈクローン（Ｒ３５Ａ２５）の制限酵素地図を示す。側方の制限部位はプラスミドのポリリンカーに由来する。ａｄｈＢ遺伝子コーディング領域は、ＸｂａＩ部位の下流から開始し、ＳｓｐＩ部位を越えたところで終了する。図２は、組換えティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈについてのアレニウスプロットを示す。（Ａ）は、５５℃でプレインキュベートした組換え酵素を用いての、２５〜９０℃におけるプロパン−２−オールの酸化についての温度−活性データである。データに最も適合した直線回帰は、ｙ＝１３．６７４−３．３６９４ｘ（Ｒ²＝０．９９３）であると決定した。（Ｂ）は、５５℃でプレインキュベートした組換え２°Ａｄｈを用いての、２５〜９０℃におけるエタノールの酸化についての温度−活性データであり、速度の不連続点（rate discontinui ty）より高い点（■）及びそれより低い点（●）を示している。データに最も適合した直線回帰は、不連続点より高い点ではｙ＝９．７９２９−２．５０３６ｘ（Ｒ²＝０．９４６）であり、不連続点より低い点ではｙ＝１５．７３０−４．３８９９ｘ（Ｒ²＝０．９６９）あると決定した。発明の詳細な説明材料及び方法化学薬品及び試薬全ての化学薬品は、少なくとも試薬／分子生物学用であった。気体はＡＧＡスペシャルティーガス（AGA specialty gases）（クリーブランド、オハイオ）より提供を受け、加熱した銅のファイリング（heated copper filing）を通して通気することにより嫌気状態にした。オリゴヌクレオチド合成及びアミノ酸配列決定分析は、高分子構造施設（Macromolecular Structure Facility）（ミシガン州立大学生物化学部）により行った。発現べクター構築に使用したカナマイシン耐性ジェンブロック（GenBlock）（ＥｃｏＲＩ）ＤＮＡカートリッジはファルマシア（Pharmacia）（ウプサラ、スウェーデン）より購入した［１８］。培地及び株ティー・エタノリカス３９Ｅ（ＡＴＣＣ＃３３２２３）は、既知の方法［１９］にしたがいＴＹＥ培地中で増殖させた。全てのバッチ培養物を、ヘッドスペースＮ₂の下で嫌気的に増殖させた。組換えａｄｈＢ遺伝子を含む大腸菌ＤＨ５ α株を、栄養複合培地（２０ｇｌ^-1トリプトン、１０ｇｌ^-1酵母エキス、５ｇｌ^-1 ＮａＣｌ）中、２５ｍｇｍｌ^-1カナマイシン及び１００ｍｇｍｌ^-1アンピシリンの存在下、３７℃で増殖させた。ＤＮＡ操作及びライブラリーの構築プラスミドＤＮＡ精製、制限分析、ＰＣＲ並びにコロニー及びＤＮＡハイブリダイゼーションは、従来の技術を使用して行った［２０、２１］。ティー・エタノリカスの染色体ＤＮＡは、既知の方法にしたがい精製した［２２］。部分的に分解した２〜５ＫｂのＳSａｕ３ＡＩ断片を、１０〜４０％スクロース勾配のサイズ分画により単離し［２０］、次いでｐＵＣ１８ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）に連結した。連結混合物用いて、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５αを形質転換した［２１］。変性プライマー（１）（5'-ATGAA(R)GG(N)TT(H)GC(N)ATG(Y)T）及び（２）（5'-G(W)(N)GTCATCA T(R)TC(N)G(K)(D)ATCAT）を使用して、コロニーハイブリダイゼーション用の相同プローブを合成した。ａｄｈＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、Sangerらの方法を使用して配列決定した［２４］。酵素精製天然２°Ａｄｈを、確立された技術により精製した［７］。組換え酵素は、大腸菌ＤＨ５αから好気的に精製した。バッチ培養物に由来するペレット化細胞を、５ｍＭＤＴＴ及び１０ｍＭＺｎＣｌ₂を含む５０ｍＭトリス：ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）中に再懸濁（０．５ｇ湿重量ｍｌ^-1）し、フレンチプレスセルを通して溶菌した。清澄な溶菌液を６５℃で２５分間インキュベートし、次いで１５０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、緩衝液Ａを用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファクリル（sephacryl）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）に適用し、２５０ｍｌＮａＣｌ勾配（０〜３００ｍＭ）を使用して溶離した。活性な画分を、緩衝液Ａ中で４倍に希釈し、次いで緩衝液Ａを用いて平衡化したＱセファロースカラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）に適用した。純度＞９０％の２°ＡＤＨを得た、より好ましい精製方法は以下に示す通りである。細胞を、ＤＴＴ及びＺｎＣｌ₂を有する前記緩衝液Ａ中で再懸濁し、その後８５℃で１５分間加熱した。細胞を、氷中で３０分間冷却し、次いで１５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。硫酸アンモニウムを、上清に、５０％（ｗ：ｖ）になるまで、撹拌しながら４℃で３０分間かけて添加した。上清を、再び１５，０００×ｇで３０分間遠心分離に付した。上清中の硫酸アンモニウムを、７０％（ｗ：ｖ）になるまで、撹拌しながら４℃で３０分間かけて増加させた。上清を、再び１５，０００×ｇで３０分間遠心分離に付した。ペレットを同一の緩衝液中に再懸濁した。分子量測定組換えホロ酵素の分子量を、２００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝液を用いて平衡化したファルマシアＳ３００カラム（１１０ｃｍ×１．２ｃｍ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィー（０．５ｍｌ／分）を使用して、標準タンパク質（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ）との比較により測定した。サブユニットの分子量は、ミシガン州立大学マススペクトル施設（Mass Spectrometry Faci lity）におけるマトリックス付着レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）により測定した。動力学及び熱安定性標準的な２°Ａｄｈ活性の分析を、既知の方法にしたがい、６０℃における、プロパン−２−オールの酸化へと結びつく、ＮＡＤＰ⁺の還元として定義した［７］。特に示す場合を除き、活性測定前に５５℃で１５分間、酵素をインキュベートした。Ｋｍ_app及びＶｍａｘ_appを決定する測定を、２０×Ｋｍ_app〜０．２ ×Ｋｍ_appの濃度の基質を用いて６０℃で行った。動力学パラメーターを、カインザイム（Kinzyme）ソフトウェアを使用して、データをミカエリスーメンテンの式に非線形最良適合することにより計算した［２６］。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸手順（ピアース（Pierce）、ロックフォード、イリノイ）を使用して測定した［２７］。２°Ａｄｈの熱安定性は、所望の温度で一定時間インキュベートした後の残留活性として測定した。熱による不活性化は、２５℃で３０分間のインキュベーションにより停止させた。サンプルを、５５℃で１５分間のプレインキュベーションすることにより、活性測定の準備をした。インキュベーションを、１００ｍｌＰＣＲチューブ（カタログ番号＃７２．７３３．０５０）サルステッド（Sa rstedt）、ニュートン、ノースカロライナ）中、緩衝液Ａ１００ｍｌ中のタンパク質２００ｍｇ／ｍｌとともに行った。非分画サンプルを使用して活性を決定した。酵素活性に及ぼす温度の影響を、基質濃度１０×Ｋｍ_appのプロパン−２− オール又はエタノールを用いて研究した。酵素反応速度に及ぼす酵素プレインキュベーション温度の影響を研究するために、２°Ａｄｈを、温度範囲３０〜９０°での活性測定前に、０、２５、又は５５℃で１５分間インキュベートした。トリス−ＨＣｌ緩衝液のｐＨを、使用する温度下でｐＨ８．０になるように、２５℃下で調節した（熱補正率＝−９．０３１ΔｐＨ℃^-1）。不連続点温度より高い及びそれより低いアレニウスプロットの勾配の間の差異の統計学的有意性を、共分散分析により決定した［２５］。化学修飾システイン残基を、ジチオニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ）を２５℃及び６０ ℃で使用して、可逆的に修飾した［２８］。ＤＴＮＢ−不活化２°Ａｄｈを、０．０１〜１．０ｍＭ金属塩又は０．５〜３．０ｍＭＥＤＴＡの存在下でＤＴＴを使用して再活性化した。ヒスチジン残基を、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を用いて、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中の２０ｍＭ又は４０ｍＭＤＥＰＣと共に２５℃で１時間インキュベートすることにより化学的に修飾した。反応は、０．５Ｍイミダゾール（ｐＨ６．５）の０．５×容積を添加することによりクエンチした［２９］。タンパク質配列の比較バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（acc.# D90421）、スルホロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）（acc ．#S51211）及びザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）（acc．#M3210O )の１°Ａｄｈ並びにアルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）（acc．#J03362）及びクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beij erinckii）（acc．#M84723）の２°Ａｄｈのペプチド配列を、ジェンバンク（GenBank）より入手した。ウマ肝臓の１°Ａｄｈ［１］及びティー・ブロッキイの２°Ａｄｈ［１７］のペプチド配列を文献より入手した。ジェンバンクへのアクセス、標準的な配列の配列化（alignment）及びアミノ酸の類似性／同一性の百分率は、ウィスコンシンパッケージ（Wisconsin Package）用プログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年９月、（ジェネティックス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）、マディソン、ウィスコンシン）を使用して行った。タンパク質配列の配列化は、疎水性クラスター分析（ＨＣＡ）使用して行った［３０］。個々のタンパク質配列のＨＣＡプロットは、ＨＣＡ−プロットＶ２コンピューターソフトウェア（ドリアン（Doriane）、ルシェスネイ、フランス）を使用して作成した。ヌクレオチド配列受託番号本明細書に開示した配列のジェンバンク受託番号は＃Ｕ４９９７５である。結果ティー・エタノリカスのａｄｈＢ遺伝子のクローニング及び配列決定ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈを、ティー・エタノリカス染色体ＤＮＡライブラリーから、相同性ハイブリダイゼーションにクローニングした。天然のティー・エタノリカスの２°ＡｄｈのＮ末端配列を決定（MKGFAML）し、これはシー・ベイジェリンキイ及びティー・ブロッキイの２°ＡｄｈのＮ末端配列と同一であった。この配列を、プライマー（１）の生成に使用した。シー・ベイジェリンキー及びティー・ブロッキイの２°Ａｄｈのペプチド配列の配列化は、低縮合性オリゴヌクレオチド（プライマー［２］）に逆翻訳する別の保存領域（残基１４７〜１５３）を示した。４７０ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマー（１）及び（２）並びにシー・ベイジェリンキイ及びティー・ブロッキイの２°Ａｄｈにおけるプライマー（１）及び（２）の位置から予想される、鋳型としてのティー・エタノリカス染色体ＤＮＡを使用して得た。このＰＣＲ産物を相同プローブとして使用して、ティー・エタノリカスの遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。６０℃において最も高い２°Ａｄｈ活性を示す陽性クローンを、更なる研究のために選択した。更なる配列決定及びペプチド分析により、１．６ｋｂＳａｕ３ＡＩ挿入物を含むプラスミドｐＡＤＨＢ２５−Ｃは、完全なａｄｈＢ遺伝子を有することが示された。１．６ｋｂの挿入物を、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）のＸｂａＩ部位にサブクローニングし、発現プラスミドｐＡＤＨＢ２５を構築した。天然のティー・エタノリカス３９Ｅの転写及び翻訳シグナル配列を含むｐＡＤＨＢ２５挿入物の物理的地図を図１に示す。プラスミドｐＡＤＨＢ２５は、カナマイシン耐性カートリッジをベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより安定化され、これによりカナマイシン及びアンピシリン存在下での二重の選択が可能になる。ＰＣＲ増幅後、ｐＡＤＨＢ２５−ｋａｎ構築物から、２° ＡＤＨコード領域をクローニングした。使用したＰＣＲプライマーは、であった。５’末端プライマーをＫｐｎＩ部位に導入した。３’末端プライマーをＡｐａＩ部位に導入した。同一のコード領域を含むが、天然の転写及び翻訳シグナル並びに下流ＯＲＦを欠いているＫｐｎＩ／ＡｐａＩ断片を、増殖産物から得、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋ベクターへクローニングし、２°ＡＤＨ遺伝子の開始コドンがＬａｃプロモーターから８１塩基に存在するようにした。コード領域は、連続したATG（Met）コドンから始まる。このクローンをｐＡＤＨＢＫＡ４−ｋａｎと呼ぶ。Ｎ末端に２つのＭｅｔ残基を有するタンパク質は、Ｍｅｔ残基を１つのみ有するその他の同等のタンパク質と動力学的に区別することができないことに注意すべきである。ｐＡＤＨＢ２５挿入物のヌクレオチド配列を配列番号１として示す。唯一の読み枠（ＯＲＦ）は、シー・ベイジェリンキイの２°Ａｄｈとの相同性が高く、天然のティー・エタノリカスの２°ＡｄｈのＮ末端配列で開始するポリペプチドをコードすることを同定した。２つの連続ATGコドン（「ストロングスタート（str ong start）」）を、潜在的な翻訳開始コドンとして同定した。天然の２°Ａｄｈタンパク質のＮ末端は、１つのＭｅｔで開始する。このことは、最初のＡＴＧコドンは翻訳されないか又は翻訳後に除去されることを示唆している。潜在的なリボソーム結合部位(RBS)(部位２２３〜２２８)は、開始コドンの１０ｂｐ上流に位置している。潜在的な転写プロモーターは、ＲＢＳの約７０〜１００ｂｐ上流で同定された。「−３５」及び「−１０」領域は、大腸菌のコンセンサスプロモーター配列と非常に類似しており［３１］、１６ｂｐ離れている。「 −１０」領域は、第一のコピーと重複する第二のコピーを有しながら、複写されている。「−３５」領域から不適当な距離にあるため、第二のコピーは、Ａ＋Ｔに富む配列のみを供給し、鎖分離を援助するだろう。ティー・エタノリカス３９Ｅ遺伝子は、コード配列中に少なくとも６０％、好ましくは６０〜７０％のＡ− Ｔ塩基対を含んでいることにより特徴付けることができる。転写停止部位は、ａｄｈＢの下流で同定されなかった。代わりに、この領域において、ＲＢＳにより先行される切断されたＯＲＦが同定された。この領域は、シー・ベイジェリンキイのａｄｈＢ遺伝子の下流に位置する類似の切断ＯＲＦの産物と、４６％同一でありかつ６８％類似しているアミノ酸ペプチド断片（配列番号３）に翻訳される。ジェンバンクにおいて、他の配列に対する不十分な類似性が見出され、そのためこのＯＲＦをコードする配列は、ａｄｈＢ領域又は隣接するＤＮＡ領域用のプローブとして使用することができるけれども、その機能は不明のままである。１°及び２°Ａｄｈの配列の比較１°及び２°Ａｄｈのアミノ酸配列の標準的な配列化は、偏性嫌気性菌由来の３種の２°Ａｄｈとの間に高レベルの類似性を示した（表１）。ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈ（配列番号２）は、ティー・ブロッキイの酵素（ジェンバンクＸ１７７１７９９０）と、わずか３つの残基（配列番号１のアミノ酸残基９１、３１３、３２５）で異なり、中温性のシー・ベイジェリンキイ（ジェンバンクＸ６４８４１）由来の酵素に対して７５％同一であった。偏性好気性エイ・ユートロフス由来の２°Ａｄｈとの比較では、類似性は低かった。１°Ａｄｈは、２°Ａｄｈよりも低い配列保存性（２５〜５４％の同一性及び４９〜７１％の類似性）を示し、２°Ａｄｈに対してわずか２０〜２７％の同一性（及び４８〜５１％の類似性）を示した。これらの標準的配列化を基づくと、重要なコアドメイン残基、活性部位ポケットに並ぶアミノ酸及びウマ肝臓の酵素［１］について同定された構造的に保存されたグリシンの保存性は、全てのペプチド間において高かった。ＨＣＡ比較は、異なるアミノ酸配列を有する酵素間における潜在的に類似した２°又は３°の構造領域の配列化を可能にする。各Ａｄｈペプチドにおいて同定されたロスマンフォールドのコンセンサス配列｛Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-(Xaa )_18-20［ＮＡＤ（Ｈ）依存に対しては負に帯電したアミノ酸又はＮＡＤ(Ｐ)(Ｈ) に対しては中性アミノ酸］｝［３２］を、１°及び２°ＡｄｈのＨＣＡ配列化に直接使用した。ティ・エタノリカス及びシー・ベイジェリンキイのＮＡＤＰ（Ｈ）結合２°Ａｄｈのコンセンサスモチーフ（consensus motif）を、Gly¹⁷⁴-Xaa- Gly¹⁷⁶-Xaa-Xaa-Gly¹⁷⁹、Gly¹⁹⁸として同定し、ＮＡＤ（Ｈ）依存性ビー・ステアロサーモフィラス及びウマ肝臓の１°Ａｄｈのコンセンサスモチーフをそれぞれ、Gly¹⁷²-Xaa-Gly¹⁷⁴-Xaa-Xaa-Gly¹⁷⁷、Asp¹⁹⁵及びGly¹⁹⁹-Xaa-Gly²⁰¹-Xaa-Xa a-Gly²⁰⁴、Asp²²³として同定した。この配列化は、重大な疎水性コア残基（７１〜９４％）、活性部位ポケット残基（７１〜１００％）及びウマ肝臓酵素において同定された構造的に類似した重要なグリシン（全ての場合において１００％）について、１°及び２°のＡｄｈの間で全体で７１〜９４％の類似性を予想した。ＨＣＡ比較は、ウマ肝臓酵素について同定された対応の残基に基づく４種のデヒドロゲナーゼの全てにおける対応のクラスター領域及び触媒作用的に重要な残基の同定を可能にした［１、２］。ウマ肝臓１°Ａｄｈは、サブユニットあたり２つの亜鉛原子、１つは構造用及び１つは触媒用を含んでいる［１］。好熱性ビー・ステアロサーモフィラスの１°Ａｄｈは、ウマ肝臓Ａｄｈの構造的Ｚｎ結合ループ（Cys⁹²、Cys⁹⁵、Cys⁹⁸及びCys¹⁰⁶を含む）と類似している、システイン残基９７、１００、１０３及び１１１を含む領域を含んでいた。しかしながら、ティー・エタノリカス及びシー・ベイジェリンキイの２°Ａｄｈにおいては、類似の構造的Ｚｎ結合ループ領域は同定されなかった。ウマ肝臓酵素における触媒的Ｚｎ配位子が明らかになった（Cys⁴⁶、His⁶⁸及びCys¹⁷⁴）。触媒的Ｚｎ原子に対するＮ末端のシステイン及びヒスチジン配位子は、１°及び２°Ａｄｈ配列の両者において保存されているらしい。しかしながら、ウマ肝臓の１°Ａｄｈにおける第二のシステインリガンド（Cys¹⁷⁴）は、ビー・ステアロサーモフィラスの１°Ａｄｈにおいては保存（Cys¹⁴⁸）されていたが、ティー・エタノリカス及びシー・ベイジェリンキイのタンパク質においてはアスパラギン酸残基（ Asp¹⁵⁰）で置換されていた。エイ・ユートロフス及びティー・ブロッキイの２° Ａｄｈも、対応のアスパラギン酸残基を保存しており、１°Ａｄｈ様構造的Ｚｎ結合ループを欠いているようであった。中温性菌及び好熱性菌由来の２°Ａｄｈ酵素の配列の比較プロリン残基により導入された構造状の圧迫（structural constraint）は、タンパク質の熱安定性に関連する機構として提唱されてきている［３３］。中温性シー・ベイジェリンキイの２°Ａｄｈと好熱性ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈとの間の、１２の非保存的配列置換のなかで、９つがティー・エタノリカスのタンパク質におけるプロリン導入（２２、２４、１４９、１７７、２２２、２７５、３１３、３１６及び３４７）に対応する。Pro³¹³を除く全てが、好熱性ティー・ブロッキイの２°Ａｄｈ中に存在している。中温性２°Ａｄｈサブユニットは、全部で１３のプロリン（３．７％）を含んでおり、ティー・エタノリカス及びティー・ブロッキイのサブユニットは、それぞれ２２のプロリン（６．２％）及び２１のプロリン（６．０％）を含んでいた。プロリン２０、２２及び２４は、推定上の触媒作用的Ｚｎ配位子であるCys³⁷近くの親水性アミノ酸の９残基のストレッチ（stretch）に存在する。Pro¹⁴⁹は、疎水性クラスターを妨害し、別の椎定上の触媒作用的Ｚｎ配位子であるAsp¹⁵⁰の次に存在する。ニコチンアミド補因子結合モチーフは、疎水性クラスター領域をも妨害するPro¹⁷⁷を含んでいる。プロリン２２２、２７５、３１３、３１６及び３４７は、推定上のターン領域（turn region）を形成する短い（２〜４残基）疎水性ストレッチに位置する。本明細書において、中温性細菌は、２５〜４５℃での最適増殖を有するが、一方好熱性細菌は、４５〜８０℃での最適増殖を有する。Vieille，C．ら、Biotec hnology Annual Review、2:1-83(1996)を参照のこと。ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈは、ティー・ベイジェリンキイの２°Ａｄｈ又はティー・ブロッキイの２°Ａｄｈよりも、熱安定性かつ好熱性である。熱安定性は、酵素が完全な酵素活性の回復を有することができる温度（例えば８５℃）で加熱している時間の評価である。好熱性は、選択した高温における酵素活性の単位の評価である。ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈは、９０℃での１時間をこえるインキュベーション後において１００％の活性を保持していた。一方、ティー・ブロッキイの２°Ａｄｈは、９１℃での３０分間のインキュベーション後においてわずか４０％の活性を保持していた。シー・ベイジェリンキイは、７０℃で１０分以内のインキュベーションで完全に不活化された［６］。改善された熱安定性及び好熱性は、ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈ酵素を、長い触媒寿命それゆえ低コストを提供するプロセスのデザインに対する優れた選択対象にする。その安定性のため、タンパク質を、コンビナトリアルケミストリー法における使用のために容易に固定化することができる。タンパク質は、酸化還元色素に結合するか又は免疫学的担体として使用することもできる。組換え２°Ａｄｈの精製及び特徴付け組換えティー・エタノリカスの２°Ａｄｈは、誘導していない大腸菌中で高度に発現し、又５ｍＭイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを用いた誘導において有意な増加は見られなかった。クローニングした２°Ａｄｈ遺伝子をコードする好ましい発現構築物（ｐＡＤＨＢＫＡ４−ｋａｎ）は、天然の転写及び翻訳を命じる（directing）配列を含んでいなかった。代わりに、コード配列は、Lac プロモーターの８１塩基下流に位置していた。全タンパク質の１５％程の発現がこの構築物で見られた。好ましくない構築物であるｐＡＤＨＢ２５の酵素発現レベルは、大腸菌及び天然の生物中において類似していた（全タンパク質の１〜５％）。組換え酵素を、３６倍に精製し、均一にした（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１本のバンドの存在により決定）。サブユニットの分子量を、ＭＡＬＤＩを使用した３回（天然の酵素）及び５回（組換え酵素）の測定により計算し、天然の酵素及び組換え酵素のサブユニットについてそれぞれ３７７０７Ｄａ及び３７８５４Ｄａの分子量を得た。これらの値は、一般的に許容される技術上の誤差（〜１％）の範囲内にあり、遺伝子配列に基づく天然の酵素の理論上の分子量（３７６４４Ｄａ）と一致する。組換え酵素のＮ末端アミノ酸分析は、組換えタンパク質の７２±５％では、２つのＮ末端ＡＴＧコドンが翻訳され、一方２８±２％のタンパク質では、天然の酵素のように単一のMet残基を含んでいることを示した。組換え酵素について測定された１４７Ｄａの分子量増加については、ＭＡＬＤＩに関連する測定誤差と比較して小さいけれども、１つのMet残基の分子量（１４９．２Ｄａ）と一致する。ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した１６０ｋＤａの組換えホロタンパク質分子量は、組換えティー・エタノリカスの２°Ａｄｈは、天然の酵素と同様にホモ四量体であることを示している。２°Ａｄｈは、２５℃及６０℃において、システイン特異的ＤＴＮＢ修飾により完全に不活化された。不活化は、６０℃において、ＤＴＴの添加により逆転し、初期の活性（初期の活性＝５４±３．０Ｕｍｇ^-1）の３４％を回復した。ＣｄＳＯ₄、ＦｅＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＮａＣｌ（０．０１〜１．０ｍＭ）又はＥＤＴＡ（０．５〜３．０ｍＭ）の添加は、ＤＴＴによる酵素再活性化に影響せず、ＣｏＣｌ₂又はＮｉＣｌ₂の添加は、回復した活性をそれぞれ初期活性の１０％又は１５％に減少させた。亜鉛は、再活性化を増強する（ＺｎＣｌ₂の存在下で４８％まで活性を回復）唯一の金属である。ヒスチジン残基のＤＥＰＣ修飾も酵素を完全に不活化した。組換えティー・エタノリカスの２°Ａｄｈの熱的及び動力学的特性の特徴付けＡｄｈ基質に対する組換え２°Ａｄｈ活性を特徴付けた。プロパン−２−オールに対するＶｍａｘ_app（４７Ｕｍｇ^-1）は、エタノールに対する値（１０Ｕ／ｍｇ）よりも５倍高く、１°アルコールに対するＫｍ_app（４７ｍＭ）は、２° アルコールに対する値（１．１ｍＭ）よりもほぼ４３倍高かった。組換え酵素の触媒能力は、１°アルコールに対する値（０．０００２１ｍ１分^-1ｍｇ^-1）よりも２°アルコールに対する値（０．２９ｍｌ分^-1ｍｇ^-1）が約２００倍高かった。ＮＡＤＰ⁺についてのＫｍ_appは、０．０１１ｍＭであり、ＮＡＤ（Ｈ）依存活性は検出されなかった。天然及び組換え酵素活性の温度依存性は、類似であることが明らかになった。したがって、組換え酵素について得られたデータのみを本明細書において報告する。ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈ活性を、２５℃未満及び９０℃をこえる温度下で検出した（図２Ａ）。９０℃における２°Ａｄｈの半減期は１．７時間であった。酵素を測定前に５５℃でインキュベートしたとき、プロパン−２−オールの酸化についてのアレニウスプロットは、２５〜９０℃で直線状であった。しかしながら、同一の条件下、エタノール酸化に対しては、アレニウスプロットにおいて明確な不連続点が見られた（図２Ｂ）。不連続点は、プロパン−２−オール及びエタノール酸化についてそれぞれ、酵素を０℃又は２５℃でプレインキュベートしたとき、〜５５℃及び〜４６℃で見られた（表２）。不連続点より高い又はそれより低い最良適合回帰曲線の傾きは、５５℃でプレインキュベートした酵素によるプロパン−２−オール酸化を除いて（この場合、回帰曲線の傾きは、９５％の信頼水準で類似していた）、９５％の信頼水準をこえて著しく異なっていた。プロパン−２−オール及びエタノール酸化に対する活性化エネルギーは、不連続点よりも高い測定温度下では類似していたが、不連続点温度未満では、エタノール酸化についての値がプロパン−２−オール酸化についての値よりも１５〜２０ｋＪｍｏｌ^-1大きかった（表２）。更に、不連続点温度をこえる又はそれより低い温度における活性化エネルギー間の差異（Δ）は、プレインキュベーション温度の上昇につれて減少した。エタノール酸化についての差異は、プロパン−２−オール酸化についての差異よりも少なくとも３倍大きかった。以下に示すのは、酵素活性、好熱性及び不連続的アレニウスプロットの基本となる分子の証拠の記載である。タンパク質配列の比較は、１°及び２°Ａｄｈは、触媒作用的Ｚｎ及びニコチンアミド補因子の結合に関連した構造−機能類似性を有することを予測している。しかしながら、全体の１°及び２°Ａｄｈ配列に存在する疎水性クラスターにおける差異は、これらの酵素の全部の構造における有意な差異を予測している。天然の酵素の動力学的特性［６］と類似の動力学的特性を有する、組換えティー・エタノリカスタンパク質は、好熱性かつ熱安定性ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性酵素であり、その低いＫｍ_app及び高いＶｍａｘ_app値のために、１°アルコールよりも２°アルコールに対して非常に高い触媒能力を示す。化学修飾実験は、酵素活性が少なくともCys及びHis残基並びに密接に結合したＺｎ原子を要求することを示唆している。最終的に、アレニウスプロットにおける屈曲（bend）の規模は、酵素プレインキュベーション温度に逆比例して変化し、このことは、触媒作用的に有意な、酵素における温度依存性構造変化の存在を示している。好熱性ティー・エタノリカスの２°ＡｄｈをコードするａｄｈＢ遺伝子を、ハイブリダイゼーションによりクローニングし、大腸菌において発現させた。天然及び組換え酵素のＮ末端配列及び分子量の比較は、組換え酵素は、Ｎ末端メチオニンが付加している点でのみ天然タンパク質と異なることを示した。最初のATG は大腸菌における主要翻訳開始コドンであるが、唯一の開始コドンであり（かつ第一のメチオニンが後に加工される）かどうか、又は第二のATGが開始コドンとして使用されるのかどうかについては不明である。ａｄｈＢの１８０ヌクレオチド下流の切断ＯＲＦ（ＲＢＳにより先行される）の存在及び潜在的な転写終止シグナルがまったく存在しないことは、ａｄｈＢはオペロンの第一遺伝子であることを示唆した。本明細書において報告した切断ＯＲＦ及びシー・ベイジェリンキイａｄｈＢの下流の切断ＯＲＦ間の類似性は、この仮説の更なる支持を導く。ピリジンジヌクレオチド結合モチーフにより方向付けされた１°及び２°ＡｄｈのＨＣＡ配列化は、これらのクラスの酵素間の幾つかの構造状の類似性を示した。負に荷電したAsp^{(223,195,215)}残基は、それぞれウマ肝臓、ビー・ステアロサーモフィラス及びエイ・ユートロフス酵素のＮＡＤ（Ｈ）依存性と一致する。一方、ティー・エタノリカス、ティー・ブロッキイ及びシー・べイジェリンキイの類似の部位における荷電していない残基（Gly¹⁹⁸）の存在は、これらの酵素のＮＡＤＰ（Ｈ）依存性と一致する［３、６、７］。更に、酵素の疎水性コアにおいて同定された残基、活性部位洞（cavity）に並ぶ残基及びウマ肝臓の１°Ａｄｈにおいて同定された構造的に重要なグリシン［１］は、全部のペプチド配列よりもこの配列化におけるタンパク質間においてより良好に保存されていた。推定上の構造的に重要な領域の類似性が、その他のＡｄｈ比較について報告されている［３４］。酵素構造−機能特性間の相関及びこの配列化の予測は、更なるＡｄｈ構造−機能の研究におけるその使用を支持している。しかしながら、２°Ａｄｈにおける構造的Ｚｎ結合ループの明らかな欠如、四量体２°Ａｄｈだけではなく四量体及び二量体１°Ａｄｈにおける報告、並びにＨＣＡ比較により予測される１°及び２°Ａｄｈ間よりも２°Ａｄｈ間で大きい有意な類似性は、機能的に類似しているが、１°及び２°Ａｄｈは以前考えられていた程構造的に類似していないことを示唆している。９０℃でインキュベートした好熱性ティー・エタノリカス３９Ｅの２°Ａｄｈは、１時間をこえる期間、検出しうる活性を保持した。一方、中温性シー・ベイジェリンキイの２°Ａｄｈは、７０℃で１０分問以内に完全に不活化した［６］。それにもかかわらず、これら２種の酵素は、８５％をこえる配列類似性を共有した。これらのタンパク質のサブユニット間の９つの非保存的置換は、ティー・エタノリカス酵素におけるプロリンに対応する。類似の好熱性ティー・ブロッキイの２°Ａｄｈは、追加の８つのプロリンを含んでいる。好熱性対中温性の２° Ａｄｈのプロリン含量における差異は、タンパク質の安定化におけるプロリンの役割に関するMatthewsらの仮説［３３］並びにプロリン挿入［３５、３６］、圧迫されたループ領域［３７］及びループ中へのプロリン置換［３８〜４０］によるタンパク質安定化に関する多数の研究による見解と一致する。ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈにおける置換プロリンは、推定上の短いループ領域又は複数のプロリンを含む推定上の長いループ領域のいずれかに存在する。このことは、プロリンの数だけではなく特定の位置がその安定化効果にとって重要であることを示唆している。ティー・エタノリカス及びシー・ベイジェリンキイ酵素間のプロリン含量の差異並びに全体的な高い配列類似性は、これら２°Ａｄｈを、タンパク質構造の安定化に及ぼすプロリン挿入の効果についての試験用の優れた系にする。比較用配列分析は、２°Ａｄｈの触媒作用における特定のCys、His及びAsp残基の関連を予測している。組換え及び天然のティー・エタノリカスの２°ＡｄｈのＤＴＮＢを用いての化学修飾は、触媒作用におけるシステイン残基の重要性を明らかにした。Ｚｎが、ＤＴＮＢ修飾後の酵素再活性化を増強する唯一の金属であるという見解は、酵素はＺｎ依存性であることを示唆している。この知見は、ＳＨ修飾試薬であるｐ−クロロメルクリ安息香酸塩により不活化した場合、ティー・ブロッキイの２°ＡｄｈはＺｎＣｌ₂の存在下でのみ活性を回復するという既知の報告［３］と一致する。６０℃における、添加した金属及び再活性化の速度を減少させることができないＥＤＴＡが存在しない中、ＤＴＮＢ修飾の逆転における初期活性の３４％の回復は、触媒作用的金属はタンパク質に密接に結合したままであることを示唆している。ＤＥＰＣによるティー・エタノリカス酵素のヒスチジン特異的修飾は、完全な酵素の不活化を伴い、このことはヒスチジン残基を触媒作用に関連付けている。２°Ａｄｈサブユニットにおける構造的Ｚｎ結合領域の明らかな欠如は、ＤＴＮＢと関連する不活化及びＺｎ依存性再活性化は、システインが配位した構造的Ｚｎの欠如及び回復のせいではないことを主張している。それゆえ、触媒作用的に重要なシステイン及びヒスチジン残基は、その他のＡｄｈについて記載されているように［１］、触媒的Ｚｎ配位子として作用するだろう。２°Ａｄｈ活性に対するAsp¹⁵⁰の重要性の測定は、突然変異誘発性分析、結晶解析又は生化学的分析を待っている。天然及び組換え酵素についての触媒活性の温度依存性は類似していた。５５℃ でプレインキュベートしたティー・エタノリカスの２°Ａｄｈにより酸化されたプロパン−２−オールのアレニウスプロットは直線状であり、これはティー・ブロッキイについて既に報告されているもの［３］とは似ていなかった。しかしながら、ティー・エタノリカス酵素によるエタノール及びプロパン−２−オール酸化の両者についてのアレニウスプロットにおける統計学的に有意な不連続点は、酵素を低温でプレインキュベートしたときに見られた。全体の反応の工程を決定する速度における変化及び触媒構造における改変を求めないその他の説明は、アレニウスプロットの不連続点を予測している［４４、４５］。酵素の構造における改変と関連しない反応の遅い工程におけるシフトは、酵素の初期温度からは独立しており、酵素プレインキュベーション温度と不連続点より高い又はより低い温度における活性化エネルギーの差異（Ｄ）との間に見られる逆相関と一致しない。不連続点より高い分析温度において、反応活性化エネルキーは、０２５及び５５℃においてプレインキュベートした酵素については類似していた。低い分析温度下では類似していなかった。この見解は、測定した速度に影響しない十分に高い分析温度において、その最適な活性構造を急速に獲得する酵素と一致する。ティー・エタノリカスの増殖について報告されている最も低い温度よりも低い不連続点温度は、生理学的に無関係であるが、動力学的分析を行うとき、中温性酵素とは異なる好熱性酵素の取り扱いの重要性を強調している。更に、エタノール及びプロパン−２−オールについての低温における活性化エネルギ一間の差異は、基質／生成物−タンパク質相互作用は、触媒作用における速度決定工程に対して重要であることを強調している。アレニウスプロットは、５５℃でプレインキュベートした２°Ａｄｈによるプロパン−２−オールについては直線状であり、このことは、これらの条件下における、反応速度の温度依存性は、機能的に重要な構造変化よりも、平均基質分子エネルギーにおける変化によるものであることを主張している。これらのデータは結諭的なものではないけれども、アレニウスプロットの不連続点として見ることができる酵素構造における触媒作用的に有意な変化は、好熱性タンパク質の過度の剛性（構造変化に対する耐性）が、中温性酵素の活性と比較しての中温における低いティー・エタノリカスの２°Ａｄｈ活性を説明することを不必要にした［６］。それゆえ、ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈは温度依存性の、触媒作用的に有意な構造変化を受けている間、アレニウスプロットの不連続点は、好熱性タンパク質の高い剛性の証拠として求めることができない。５５℃でプレインキュベートしたティー・エタノリカスの２°Ａｄｈによるプロパン−２−酸化の直線状アレニウスプロットは、この酵素の中温における低活性は、基質エネルギーのみで説明することができることを示している。アレニウスの理諭は、温度の上昇するにつれてＫｍ_app及びＶｍａｘ_appが増加することを予測し、この効果はサーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）のＤ −キシロースイソメラーゼについて確認されている［４６］。好熱性２°Ａｄｈは、２５℃における中温性酵素活性の延長から予測されるものより低いＶｍａｘ_app を有している。実際、６０℃において、好熱性２°Ａｄｈは、２５℃における中温性酵素について報告されている値と類似した、基質に対するＫｍ_app及びＶｍａｘ_appの値を維持している。これらの類似の動力学的値は、好熱性酵素は、より過剰の基質結合エネルギーを基質結合に導き（channel）、代謝回転には少ないことを示唆している［４７］。それゆえ、ティー・エタノリカスの２°Ａｄｈは、高い代謝回転数を犠牲にして、高温における高い基質親和性を維持しているらしい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１の２３８〜１２９６の部位に示される配列を含む、第二級アルコールデヒドロケナーゼ酵素をコードする、単離かつ精製された核酸分子。２．配列番号１に示される配列を含む、請求の範囲第１項記載の核酸分子。３．酵素が３１３番目の部位にプロリン残基を含む、好熱性細菌に由来する第二級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の精製した調製物。４．酵素が３２５番目の部位にグルタミン残基を含む、請求の範囲第３項記載の酵素調製物。５．酵素が９１番目の部位にトリプトファン残基を含む、請求の範囲第３項記載のデヒドロゲナーゼ酵素。６．好熱性細菌が、サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅである請求の範囲第１０項記載の酵素調製物。７．酵素が９１番目の部位にトリプトファン残基を、３１３番目の部位にプロリン残基を、かつ３２５番目の部位にグルタミン残基を含む、サーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅ由来の第二級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素の精製された調製物。８．第一及び第二の変性オリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれが以下に示す配列：を有するプライマーを、好熱性細菌由来の染色体ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせる工程、及びハイブリダイズしたプライマー間の染色体ＤＮＡのセグメントを増幅して、増幅したＤＮＡ断片を形成する工程、を含むことを特徴とするＤＮＡ増幅方法。９．好熱性細菌がサーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅである、請求の範囲第８項記載の方法。 10．好熱性細菌由来の第二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む細菌クローンを得る方法であって、好熱性細菌由来のＤＮＡ断片を細菌クローニングベクターに結合し、結合生成物を形成する工程、結合生成物で細菌宿主を形質転換し、好熱性細菌由来のゲノムＤＮＡライブラリーを形成する工程、第一及び第二の変性オリゴヌクレオチドプライマーであって、それそれが以下に示す配列：を有するプライマーを、好熱性細菌由来の染色体ＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせる工程、ハイブリダイズしたプライマー間の染色体ＤＮＡのセグメントを増幅して、増幅したＤＮＡ断片を形成する工程、及びプローブを用いてライブラリーをスクリーニングする工程、を含むことを特徴とする方法。 11．好熱性細菌がサーモアンエアロバクター・エタノリカス３９Ｅである、請求の範囲第10項記載の方法。