JP2016002049A - 変異型アルコール脱水素酵素、該変異型アルコール脱水素酵素をコードする単離核酸分子、該変異型アルコール脱水素酵素の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
晶構造解析により、その立体構造が明らかにされた(非特許文献2)。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(g)配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(h)配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(i)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(k)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
〔2〕前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換、又は、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換が、システインへの置換である変異型アルコール脱水素酵素。
〔3〕前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換、又は、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換が、システインへの置換である変異型アルコール脱水素酵素。
〔4〕配列番号7又は9のアミノ酸配列からなる変異型アルコール脱水素酵素。
(m)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(n)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(o)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(p)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(q)配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(r)配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(t)配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(v)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(w)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(x)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
〔6〕前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記277番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である、又は、前記85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、そして、前記283番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である変異型アルコール脱水素酵素。
〔7〕前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記277番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である、又は、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記283番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である変異型アルコール脱水素酵素。
〔8〕配列番号15又は17のアミノ酸配列からなるアルコール脱水素酵素。
〔10〕上記単離核酸分子を含む組換えベクターを導入した形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からアルコールとアルデヒド間の酸化還元反応を触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、配列番号2又は4に示すアミノ酸配列からなる野生型アルコール脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している変異型アルコール脱水素酵素の製造方法。
本発明の変異型ADHは、野生型ADHのアミノ酸配列において、少なくとも1以上の特定のアミノ酸に欠失、置換、又は付加、これらの組み合わせによる変異が生じている変異部位を有する。ここで、「少なくとも1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせによる変異」とは、変異の基礎となるタンパク質をコードする核酸分子に対する公知のDNA組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換又は付加することができる程度の数、例えば、1〜数個のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含むことを意味する。このような変異は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。本発明の変異型ADHには、これら双方により変異が生じた変異型の何れをも含む。
第1級アルコール + NAD+ <=> アルデヒド + NADH + H+
第2級アルコール + NAD+ <=> ケトン + NADH + H+
配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記アミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明の変異型ADHは、試料中のアルコール又はアルデヒドの検出のために利用することができる。アルコール又はアルデヒドの検出は、例えば、基質であるアルコール又はアルデヒドに対する酸化還元反応を触媒する本発明の変異型ADHの活性を測定することにより行うことができる。変異型ADHの活性は、アルコールとアルデヒド間の酸化還元をNAD依存的に触媒する酵素の活性測定法として知られる方法をいずれをも利用して行うことができる。例えば、上述の通り、ホルマザン色素の形成、及びNADH量の増減等を指標に検出することができる。適当な試験条件が選択されていれば、指標値の変化は、測定しようとする酵素の活性に直線的に比例する。このとき、あらかじめ目的濃度範囲内における標準濃度のアルコール又はアルデヒド溶液により標準曲線を作成することにより、得られた指標値に基づいてアルコール又はアルデヒドの濃度を求めることができる。
本発明は、本発明の変異型ADHを利用するアルコール又はアルデヒド検出用のバイオセンサーを提供する。当該バイオセンサーは、電極材上に本発明の変異型ADHが固定化した作用電極、及びその対極を設けて構成される。必要に応じて、参照電極を設けて三電極方式として構成してもよい。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。電極材上への酵素の固定化は、既知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合,共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸,カラギーナン等の多糖化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。そして、本発明のADHの酵素活性に際して要求される補酵素NAD、NADの還元体であるNADHを酸化する能力を有する酸化酵素(ジアホラーゼ等)、電子メディエーター(PMS、フェロセン、ジクロロインドフェノール等)も、必要に応じて電極材上に固定化して構成される。
本発明は、本発明の変異型ADHを利用する燃料電池を提供する。本発明の燃料電池は、例えば、酸化反応を行うアノード極と、還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアソードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。アノード電極側では、本発明の変異型ADHが燃料であるアルコールを酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生する。一方、カソード側では、アノード側で発生したプロトンが酸素と反応することによって水を生成するように構成される。電極としては、カーボン、金、白金等を用いることができる。アノード極側には本発明の変異型ADHが供給され、適当な緩衝液中に溶解させた形態で供給してもよいが、電極上に固定化されることが好ましい。このとき、変異型ADHは、好ましくはNADと共に固定化されることが好ましく、特にはNADと結合したホロ酵素の形態で固定化されることが好ましい。また、アポ酵素の形態で固定化し、NADを適当な緩衝液に溶解させた形態で供給してよい。カソード極側には、酸素に電子を伝達することのできる酵素等の触媒を必要に応じて供給してよい。例えば、カソード側触媒として、ラッカーゼやビリルビンオキシダーゼ等のマルチ銅オキシダーゼ等の酵素及び白金等の金属触媒を利用することができる。電極材上への酵素の固定化は、公知の方法によって行うことができる。例えば、物理的吸着、イオン結合,共有結合を介して固定化する担体結合法を利用することができる。また、グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定する架橋法をも利用でき、更には、アルギン酸,カラギーナン等の多糖化合物、ポリアクリルアミド等の網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に閉じて固定化する包括法等をも利用することができる。
本実施例では、野生型ScADH1、及び当該野生型ScADH1にアミノ酸変異を導入した変異型ScADH1を取得するための発現ベクターを作製した。
野生型ScADH1のアミノ酸配列において、1若しくは2個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換した変異型ScADH1を作製した。詳細には、野生型ScADH1をコードする核酸分子を基礎として、部位特異的変異導入により、所望のアミノ酸変異が生じるように特定位置のヌクレオチドに変異を導入した。
N79C(第79番目のアスパラギンのシステインへの置換)用:
N79C-5':TCGTTGTCGGCATGGGTGAATGCGTTAAGGGCTGGAAGATCGG(配列番号20)
N79C-3':CCGATCTTCCAGCCCTTAACGCATTCACCCATGCCGACAACGA(配列番号21)
G107C(第107番目のグリシンのシステインへの置換)用:
G107C-5': CCTGTGAATACTGTGAATTGTGCAACGAATCCAACTGTCCTCA(配列番号22)
G107C-3':TGAGGACAGTTGGATTCGTTGCACAATTCACAGTATTCACAGG(配列番号23)
C277S(第277番目のシステインのセリンへの置換)用:
C277S-5': GTATGCCAGCTGGTGCCAAGAGCTGTTCTGATGTCTTCAACCA(配列番号24)
C277S-3':TGGTTGAAGACATCAGAACAGCTCTTGGCACCAGCTGGCATAC(配列番号25)
上記実施例で作製した野生型および各変異型ScADH1の発現ベクターを大腸菌に導入し発現させた。
実施例1で得た各ScADH1発現ベクターを用いて、BL21(DE3)株を形質転換し、得られたコロニーをLB培地にて37℃で振とう培養した。培養液のO.D.600が約0.6となった時点で、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度1mMで添加してタンパク質発現誘導を行った。発現誘導後、20℃で一晩培養し菌体を回収した。続いて、菌体をリン酸緩衝液(PBS)に懸濁後、超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離して上清を回収した。回収した上清から、TALON樹脂(CLONTECH社製)を用いたメタルイオンアフィニティークロマトグラフィーにて各ScADH1を精製及び回収した。具体的には、PBSで平衡化したTALON樹脂に、回収した上清を加え、10mMイミダゾールを含むPBSで樹脂を洗浄し、最後に100mMイミダゾールを含むPBSで各ScADH1を溶出した。得られた溶出画分を、Hitrap desalting column(GEヘルスケア社製)を用いてイミダゾールを除去し、各ScADH1サンプルとした。
本実施例では、ScADH1の酵素活性測定方法について開示する。ここでは、テトラゾリウム塩の還元によって生じる発色シグナルを検出することにより活性測定を行った。
ScADH1の酵素活性は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の還元を、メトキシフェナジンメソサルフェート(mPMS)をメディエーターとした水溶性テトラゾリウム塩(WST-1)の還元に転化する方法によって評価した。具体的には、1Mエタノール、1mM NAD、10μM mPMS、400μM WST-1、及び酵素1nMを含む50mM リン酸カリウムバッファー(pH8.0)を 37℃にて30分間反応させ、450nmの吸光度変化を測定した。
本実施例では、上記実施例2にて作製した野生型および各変異型ScADH1の耐熱性を評価した。ここでは、70℃で保温した場合の残存活性を算出した。
0.01% BSAを含むPBSを用いて各ScADH1の10nM溶液を調製し、4℃または70℃で10分間保温した後、酵素活性測定を行った。70℃保温サンプルを、4℃保温サンプルと比較して、その残存活性を求めた。酵素活性測定は実施例3に示した方法で行った。
結果を図1のグラフに示す。グラフは、横軸が検討を行った野生型及び各変異型ScADH1を表示し、縦軸がその残存活性を示す。残存活性は、4℃での野生型ScADH1の活性を1.00として算出した。野生型ScADH1は、70℃での処理で完全に失活した。これに対し、変異型ScADH1のうち、A31C、N79C、及びG107C変異体は70℃での処理でも酵素活性を維持していた。さらに、単独では耐熱性向上が認められなかったC277S変異を、N79C及びG107C変異体に導入して作製したN79C-C277S及びG107C-C277S変異体はさらに高い熱安定性を示した。
本実施例では、上記実施例4に続いて、上記実施例2にて作製した野生型および各変異型ScADH1の耐熱性を評価した。ここでは、50℃で保温した場合の残存活性を算出した。
野生型、および実施例4にて高い熱安定性が確認されたN79C、G107C、N79C-C277S、G107C-C277S変異体について、50℃にて1、2,3時間保温後の残存活性を評価した。なお、評価は、実施例4の方法に準じて行った。
結果を図2のグラフに示す。グラフは、横軸が検討を行った野生型及び各変異型ScADH1を表示し、縦軸がその残存活性を示す。残存活性は、4℃での野生型ScADH1の活性を1.00として算出した。野生型ScADH1に対して、何れの変異体も高い残存活性を示した。特に、N79C-C277S変異体は、50℃にて3時間の保温に対しても残存活性が90%以上であり、高い熱安定性を示した。また、G107C-C277S変異体も50℃にて2時間の保温に対して80%以上、3時間の保温に対しても75%以上の残存活性を有していた。
Claims (10)
- 配列番号2又は4に示すアミノ酸配列からなる野生型アルコール脱水素酵素に比べて熱安定性が向上した、以下のタンパク質から選択される変異型アルコール脱水素酵素。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(g)配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(h)配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(i)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(j)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(k)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(l)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換、又は、前記第85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換が、システインへの置換である請求項1に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換、又は、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換が、システインへの置換である請求項1に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 配列番号7又は9のアミノ酸配列からなる請求項1〜3の何れか一項に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 以下のタンパク質から選択される請求項1に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
(m)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(n)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(o)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(p)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(q)配列番号2に示すアミノ酸配列における第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(r)配列番号4に示すアミノ酸配列における第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列における第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(t)配列番号4に示すアミノ酸配列における第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列において、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含み、かつ、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列において第79番目のアスパラギン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第79番目のアスパラギン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(v)配列番号4に示すアミノ酸配列において第85番目のアスパラギン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第85番目のアスパラギン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(w)配列番号2に示すアミノ酸配列において第107番目のグリシン、及び、第277番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第107番目のグリシン、及び、前記第277番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(x)配列番号4に示すアミノ酸配列において第113番目のグリシン、及び、第283番目のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と少なくとも80%の相同性を有し、かつ、前記第113番目のグリシン、及び、前記第283番目のシステインの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記第79番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記277番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である、又は、前記85番目のアスパラギンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、そして、前記283番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である請求項5に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 前記第107番目のグリシンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記277番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である、又は、前記第113番目のグリシンの他のアミノ酸への置換がシステインへの置換であり、かつ、前記283番目のシステインの他のアミノ酸への置換がセリンへの置換である請求項5に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 配列番号15又は17のアミノ酸配列からなる請求項5〜7の何れか一項に記載の変異型アルコール脱水素酵素。
- 請求項1〜8の何れか一項に記載の変異型アルコール脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
- 請求項9に記載の単離核酸分子を含む組換えベクターを導入した形質転換体を培養する工程、及び得られた培養物からアルコールとアルデヒド間の酸化還元反応触媒する能力を有するタンパク質を採取する工程を含む、配列番号2又は4に示すアミノ酸配列からなる野生型アルコール脱水素酵素に比べて熱安定性が向上している変異型アルコール脱水素酵素の製造方法。
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