JPWO2014017390A1 - Nad依存型グルコースデヒドロゲナーゼおよびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
D−グルコース + NAD
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + NADH
(1)
NADGDHを発現する微生物から得られたNADGDHであって、以下の(A)および(B)に示す特性を有するNADGDH。
(A)比活性:補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を用いて、グルコースへ反応させた場合、比活性が450U/mg以上である。
(B)1mM EDTAで3時間処理した場合、残存活性が60%以上である。
(2)
さらに、以下の(C)〜(E)のうちいずれか1つ以上の特性を有する、(1)に記載のNADGDH。
(C)温度安定性:80℃で安定
(D)pH安定性:4.8〜9.7
(E)至適pH:7.5〜10.5
(3)
さらに、以下の(F)または(G)の特性を有する、(1)または(2)に記載のNADGDH。
(F)アミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と70%以上の同一性を有する。
(G)アミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列である。
(4)
NADGDHが、微生物を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することにより得られたものである、(1)〜(3)のいずれかに記載のNADGDH。
(5)
NADGDHを発現する微生物を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することを特徴とする、NADGDHの製造方法。
(6)
培地への亜鉛の添加量が0.01mM〜0.1mMである、(5)に記載のNADGDHの製造方法。
(7)
(1)〜(4)のいずれかに記載のNADGDHを用いるグルコース濃度の測定方法。
(8)
(1)〜(4)のいずれかに記載のNADGDHを含むグルコース濃度測定用組成物。
(9)
(1)〜(4)のいずれかに記載のNADGDHを含むグルコースセンサ。
(10)
(1)〜(4)のいずれかに記載のNADGDHを含む燃料電池。
本発明の一の態様は、NADGDHを発現する微生物から得られたNADGDHであって、以下の(A)および(B)に示す特性を有するNADGDHである。
(A)比活性:補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を用いて、グルコースへ反応させた場合、比活性が400U/mg以上である。
(B)1mM EDTAで3時間処理した場合、残存活性が60%以上である。
NADGDH活性は種々の公知の方法で測定することができるが、本書では、GDH活性は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
<試薬>
100mM Tris−HCl緩衝液pH8.0
80mg/mL NAD+水溶液
1.5M D‐グルコース水溶液
酵素希釈溶液 0.1%牛血清アルブミンを含む50mM リン酸カリウム緩衝液pH7.0
<手順1>
NADGDH溶液を、予め氷冷した上記酵素希釈溶液で0.8〜1.2U/mlに希釈し、氷冷保存したものを酵素溶液とする。
<手順2>
上記Tris−HCl緩衝液2.6mL、D‐グルコース水溶液0.3mL、NAD+水溶液0.1mLを混合し、37℃にて5分間予備加温したものを反応混液とする。
反応混液3.0mLに、酵素溶液0.05mLを添加しゆるやかに混和後、水を対照に37℃に制御された分光光度計(光路長1.0cm)で、340nmの吸光度変化を2〜3分間記録し、その後直線部分から(即ち、反応速度が一定になってから)1分間あたりの吸光度変化(ΔODTEST)を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈溶液を0.05mL加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODBLANK)を測定する。これらの値から次の式に従ってNADGDH活性を求める。ここでNADGDH活性における1単位(U)とは、上記の測定条件で1分間にNADHを生成する酵素量である。
GDH活性(U/mL)=[(ΔODTEST−ΔODBLANK)×3.05×希釈倍率]
/(6.22×1.0×0.05)
なお、ここで
3.05:GDH溶液混和後の容量(mL)
6.22 :NADHのミリモル分子吸光係数(cm2/マイクロモル)
1.0 :光路長(cm)
0.05:添加するGDH溶液の液量(mL)
である。
本発明のNADGDHは、高い比活性を有していることが好ましい。
NADGDHを含む標品が固体状(粉末状を含む)の場合は、その固体重量をタンパク質重量とみなし、別途酵素活性を測定して比活性を求める。標品が液体状の場合は、タンパク質重量を、A280nmの吸光度および、バイオラッド社のタンパク質定量試薬(商品名:バイオラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬)を用いて測定、計算して求める。NADGDHを含む標品が固体状であってNADGDH以外の成分を含むと思われる場合は、適当な溶液に溶解した上で液体状の標品として取り扱うことで比活性を求めることが出来る。
本発明のNADGDHの比活性の下限は450(U/mg)以上である。比活性の下限は、好ましくは600(U/mg)以上、さらに好ましくは800(U/mg)以上、さらに好ましくは1000(U/mg)以上、さらに好ましくは1100(U/mg)以上である。比活性の上限は特に限定されないが、好ましくは1500(U/mg)以下、さらに好ましくは1400(U/mg)以下、さらに好ましくは1300(U/mg)以下、さらに好ましくは1200(U/mg)以下である。
また、本発明のFGDHの標品の最終的な形態は液体状であっても固体状(粉体状を含む)であってもよい。
本発明のNADGDHは、1mMのEDTA存在下、3時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して60%以上を維持する。
NADGDHを含む標品をリン酸カリウムバッファー(pH6.5)で酵素濃度1mg/mLに調整し、1mMのEDTA存在下、3時間処理した後の残存酵素活性を測定し、その値を処理前と比較することにより求める。
NADGDHを含む標品の酵素濃度が低く、1mg/mLに調整できない場合は、標品に EDTAを1mMになるように直接添加して溶解し、3時間処理した後の残存酵素活性をEDTA溶解前の酵素活性と比較する。
本明細書において、特定の温度条件の下、リン酸カリウムバッファー(pH8.0)で5U/mLの精製酵素を30分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して80%以上を維持するとき、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。
本発明のNADGDHは、少なくとも80℃以下(即ち、0℃〜80℃の温度範囲)において安定であることが好ましい。
本明細書において、特定のpH条件の下、5U/mLの酵素を25℃で16時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して80%以上である場合に、当該酵素は、当該pH条件において安定であると判断する。
本発明のNADGDHは、少なくともpH5.0〜10.0の範囲で安定であることが好ましい。
本発明のNADGDHは、実施例に示す通り、pH8.8(グリシン塩酸緩衝液)において最も高い活性を示すことが好ましい。
また、pH3.5〜5.6(酢酸緩衝液)、pH5.6〜7.6(リン酸カリウム緩衝液)、pH6.5〜8.8(トリス塩酸緩衝液)、pH8.8〜10.5(グリシン−NaOH緩衝液)において、本発明のNADGDHは、pH8.8(グリシン塩酸緩衝液)における活性を100%として、80%以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のNADGDHの至適pHは7.6〜10.5であり、好ましくはpH8.8である。
上記の特性を有するNADGDHの由来は、特に限定されない。例えば、微生物に由来するものが挙げられる。
例えば、超好熱性始原菌に由来するものであれば、パイロディクティム(Pyrodictim)属、スルフォロバス(Sulfolobus)属、デスルフロコッカス(Desulfurococcus)属、サーモプロテウス(Thermoproteus)属、サーモフィラム(Thermofilum)属、サーモプラズマ(Thermoplasma)属などが挙げられる。好ましくはサーモプロテウス属である。
サーモプロテウス属由来のNADGDHとして、具体的には、WO2009/087929(特許文献1)に開示されているサーモプロテウス・エスピー・GDH1株に由来するNADGDHが挙げられる。
また、該NADGDHのアミノ酸配列を改変したもの(WO2010/137489、特許文献2)がより好ましいものとして挙げられる。そのようなものとして、例えば、配列番号1のポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。配列番号1のポリペプチドは、サーモプロテウス・エスピー・GDH1株に由来するNADGDHの202位のアルギニンをセリンに、および、334位のトリプトファンをアルギニンに、それぞれ置換したNADGDHである。特許文献2には、その他の改変体が多数例示されている。
本発明のNADGDHは、NADGDH活性を保持し、かつ、上記1−2および1−3の特性を保持する限度で(さらに好ましくは上記1−4〜1−6に示したいずれかの特性を保持する限度で)、配列番号1に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が80%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。さらに好ましくは、本発明のNADGDHが有するアミノ酸配列と配列番号1に示されるアミノ酸配列との同一性は、85%以上であり、より好ましくは88%以上、更に好ましくは90%以上、より更に好ましくは93%以上、一層好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、後述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト(初期設定)のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
本発明のNADGDHは、NADGDH活性を保持し、かつ、上記1−2および1−3の特性を保持する限度で(さらに好ましくは上記1−4〜1−6に示したいずれかの特性を保持する限度で)、配列番号1に示すアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明のNADGDHの別の由来として、以下の(A)〜(G)に示す特徴を有する始原菌に由来するものが好ましいものとして例示できる。(A)16SrRNAをコードするゲノムDNA上の塩基配列として、配列番号2に示す塩基配列を含む。(B)80℃以上の温度で生育可能であり、至適生育温度は約90℃である。(C)ゲノムDNAのGC含量が58〜62モル%である。(D)絶対嫌気性菌である。(E)電子受容体としてチオ硫酸塩を加えた場合に良好な増殖を示す。(F)NaCl濃度1%以下で生育可能である。(G)形状は長さ10〜30μm、幅約5μmの長桿菌である。
本発明のNADGDHの別の由来として、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面または内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物に由来するものを単離源としてもよい。
本発明のNADGDHは、NADGDHを発現する微生物を、後述のように、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することにより得られたものであってもよい。
後の実施例でも述べるように、本発明の、亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHと、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHとは、物質として異なるものである。
あるNADGDHが、以下の(A)および(B)に示す特性を有することを確認すれば、該NADGDHが、NADGDHを発現する微生物を亜鉛を添加した培地で培養して得られた培養液を精製することにより得られたものであることが、強く示唆される。
(A)比活性:補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を用いて、グルコースへ反応させた場合、比活性が450U/mg以上である。
(B)1mM EDTAで3時間処理した場合、残存活性が60%以上である。
本発明の別の態様は、NADGDHを発現する微生物を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することを特徴とする、NADGDHの製造方法である。
本発明のNADGDHの製造方法において、NADGDHの発現系を構築する方法は特に限定されない。例えば、NADGDHの生産能を有する微生物をそのまま発現系として用いればよい。あるいは、NADGDHをコードするDNAを適当な宿主ベクター系に導入して作製した遺伝子組み換え体(形質転換体とも言う)を発現系としてもよい。産業上は、制御がしやすい、安全性がより高い、等の理由で遺伝子組み換え体を用いることが好ましい。
本発明は、NADGDHを発現する遺伝子組換え体を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することを特徴とする、NADGDHの製造方法である。
亜鉛の給源は特に限定されないが、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛二水和物、炭酸亜鉛、硝酸亜鉛六水和物、酸化亜鉛、硫酸亜鉛七水和物、などが挙げられる。
市販のLB培地(Luria−Bertai Medium)、M9培地(M9 Minimal Medium)、NZCYM培地(NZCYM Medium)、NZYM培地(NZYM Medium)、NZM培地(NZM Medium)、SOB培地(SOB Medium)、TB培地(Terrific
Broth)、2XYT培地(2XYT Medium)を用いてもよい。
本発明の別の態様は、NADGDHを含むプロダクトである。
本明細書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる1セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明のNADGDHを含むものを意味する。
(a)NADGDHによりNADHなどの基質を測定すること。
(b)NADGDHによる酵素反応により電流を発生させること。
本発明のNADGDHを用いて生体成分の濃度又は量を測定する限り、その態様は特に制限されないが、例えば、グルコース、ラクテートデヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、中性脂肪(TG)、胆汁酸および総分岐鎖アミノ酸(BCAA)などの生体成分等を測定するための試薬、キット、センサなど種々の形態が例示できる。
以下、グルコースを測定する場合を例にとり、説明する。
本発明のNADGDHを用いて燃料電池を作製し稼動させる限り、その態様は特に制限されないが、例えば、以下のような手段により電池として稼動させることができる。まず、本発明のNADGDHをバイオ燃料電池の負極において、GDH、オスミウム錯体などの電子メディエータなどとともに固定化し、一方、正極において、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどから選択される酸化還元酵素と、ヘキサシアノ鉄酸イオンなどのメディエータを固定化する。さらに、負極と正極とを電子伝導性を持たずプロトンのみ伝導する電解質層を介して対向した構造を構築し、負極では、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン(H+)を発生させ、正極では、負極から電解質層を通って輸送されたプロトンと負極から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成させる。
グルコースを含有する燃料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。
配列番号1のポリペプチドは、サーモプロテウス・エスピー・GDIII株に由来するNADGDHの202位のアルギニンをセリンに、および、334位のトリプトファンをアルギニンに、それぞれ置換したNADGDHである。該NADGDHならびにこれをコードする遺伝子クローンは、WO2010/137489に記載されている。配列番号1のポリペプチドをコードする構造遺伝子を保持する発現プラスミドをエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)DH5α株コンピテントセル(東洋紡製)に形質転換し、SOC培地中で1hr、37℃で前培養後、LB−amp寒天培地に展開し、コロニーである該形質転換体を取得した。得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリーDH5α(TspGDH)と命名した。
5mLのTB液体培地(トリプトン1.2%、イーストイクストラクト2.4%、グリセロール0.4%、KH2PO4 0.23%、K2HPO4 1.25%、pH7.0)を試験管に入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地の培地とした。さらに、二価金属を人為的に添加した培養液として、上記のTB培地に表1記載の二価金属のうち各1種類ずつをそれぞれ0.01mM含む8種類の液体培地を作成した。
実施例1にて取得した形質転換体エシェリヒア・コリーDH5α(TspGDH)のコロニーを一白金耳試験管5mlのLB−amp液体培地に植菌し、30℃で16時間培養した。
LB培地から、実施例2にて用意した培地に植え継ぎを行い、本培養とした。LB培地からTB培地およびTB培地に各種金属を添加した培地への植え継ぎ量は1%(v/v)である。37℃、24時間培養を行い、培養終了とした。培養終了より菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、ビーズ破砕にて菌体を破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。
実施例3で得た粗酵素液中のNADGDH活性を、上記1−1.に示したNADGDH活性測定方法を用いて測定した。その結果、比較対象であるTB培地に比べ、亜鉛を添加した培地で高い酵素活性を得ることができた(図1A)。その他の二価金属を添加した場合は、TB培地の場合とほぼ同じ酵素活性か、または、TB培地での結果を下回った。
実施例2で用意したTB培地5mLを試験管に入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地の培地とした。亜鉛を人為的に添加した培養液として、上記のTB培地に塩化亜鉛を0.00001mM〜0.1mM含む液体培地を作成した。実施例3および実施例4と同様の方法にて粗酵素液中のNADGDH活性を測定した。その結果、比較対象であるTB培地に比べ、0.01mM以上の亜鉛を添加した培地で特に高い酵素活性を得ることができた(図1B)。0.001mM以下の亜鉛を添加した場合は、TB培地の場合とほぼ同じ酵素活性であった。
金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHを作成した。金属添加なしの培養液として、実施例2で用意したTB培地500mLを2L坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。5mLの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度30℃、180rpmで24時間振とう培養した。その後、菌体を遠心分離により集菌し、菌体を回収した。得られた菌体を20mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に懸濁した。亜鉛を添加した培養液として、実施例2で用意したTB培地500mLに0.01mMの塩化亜鉛を含む培地を作成し、同様の操作を行った。
実施例6で得られた金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDH酵素液を用いて、NADGDHの精製度と比活性を調べた。NADGDH活性を、上記1−1.に示したNADGDH活性測定方法を用いて測定した。タンパク質量はA280吸光度の値でもとめ、比活性を算出した。その結果、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHの比活性は382U/mg、亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHの比活性は1137U/mgであった。
以上の事実は、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと、亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHとは、物質として異なるものであることを示している。
実施例6で得られた、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDH(比活性は382U/mg)、に塩化亜鉛を添加し、比活性の変化を調べた。終濃度0〜0.1mM 塩化亜鉛を含むNADGDH酵素液を調整し、塩化亜鉛濃度がNADGDH活性に与える影響を調べた。塩化亜鉛処理は、0〜0.1mM 塩化亜鉛(0は塩化亜鉛なしのネガティブコントロール)、の酵素液を調整し、25℃で保存した。その後、各塩化亜鉛濃度で0時間(酵素液調整直後)、3時間、24時間処理した後、活性を測定し、比活性を算出した(図3)。その結果、塩化亜鉛を添加しても、顕著な比活性向上は起こらなかった。亜鉛濃度が0.1mMの場合、ネガティブコントロールと比べ、5%ほど比活性の向上が観察されたが、比活性は450U/mg未満であった。
実施例6で得られた金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDH酵素液(1mg/mL)を用いて、EDTAの影響を調べた。終濃度1mM EDTAを含むNADGDH酵素液と終濃度5mM EDTAを含むNADGDH酵素液を調整し、EDTA濃度がNADGDH活性に与える影響を調べた。EDTA処理は、0mM EDTA (EDTAなしのネガティブコントロール)、1mM EDTA,5mM EDTAの酵素液を調整し、25℃で保存した。その後、各EDTA濃度で0時間(酵素液調整直後)、3時間、24時間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した(図4A、図4B)。図4Aと図4Bは0時間(酵素液調整直後)の活性を100%とした時の相対活性を示している。
実施例6で得られた金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDH酵素液(2U/mL)を用いて、至適pHを調べた。100mM 酢酸緩衝液(pH3.5〜6.0、図中◆印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0−8.0、図中■印でプロット)、100mMTris−HCl緩衝液(pH7.0−8.0、図中▲印でプロット)、100mM
グリシン−NaOH緩衝液(pH9.0−11.0、図中×でプロット)、を用い、それぞれのpHにおいて、温度25℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図5Aと図5Bに示す。
実施例6で得られた金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDH酵素液(5U/mL)を用いて、pH安定性を調べた。100mM 酢酸緩衝液(pH3.5〜6.0、図中◆印でプロット)、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0−pH8.0:図中■印でプロット)、100mM Tris−HCl緩衝液(pH7.0−pH9.0:図中▲印でプロット)、100mM
グリシン−NaOH緩衝液(pH9.0−11.0、図中×でプロット)を用い、25℃、16時間処理した後の活性の残存率を測定した。結果を図6Aと図6Bに示す。
実施例6で得られた金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHと亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDH酵素液(5U/mL)を用いて、温度安定性を調べた。100mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)を用いて、NAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素液を各温度(50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)で30分間処理した後、見かけの活性の残存率を測定した。結果を図7Aと図7Bに示す。
上述したNADGDHの活性測定法において、基質であるD−グルコースの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ(図8A、図8B)からLineweaver−burk plotを作成し、Km値を算出した。その結果、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHのD−グルコースに対するKm値は、7.49mMであることが判明した。亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHのD−グルコースに対するに対するKm値は、7.55mMであることが判明した。
上述したNADGDHの活性測定法において、基質であるNADの濃度を変化させて活性測定を行い、基質濃度と反応速度のグラフ(図9A、図9B)からLineweaver−burk plotを作成し、Km値を算出した。その結果、金属添加なしの培養液にて生産したNADGDHのNADに対するKm値は、0.24mMであることが判明した。亜鉛を添加した培養液にて生産したNADGDHのNADに対するKm値は、0.26mMであることが判明した。
Claims (10)
- NAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを発現する微生物から得られたNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼであって、以下の(A)および(B)に示す特性を有するNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(A)比活性:補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を用いて、グルコースへ反応させた場合、比活性が450U/mg以上である。
(B)1mM EDTAで3時間処理した場合、残存活性が60%以上である。 - さらに、以下の(C)〜(E)のうちいずれか1つ以上の特性を有する、請求項1に記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(C)温度安定性:80℃で安定
(D)pH安定性:4.8〜9.7
(E)至適pH:7.5〜10.5 - さらに、以下の(F)または(G)の特性を有する、請求項1または2に記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
(F)アミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と70%以上の同一性を有する。
(G)アミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列である。 - NAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼが、微生物を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することにより得られたものである、請求項1〜3のいずれかに記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼ。
- NAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを発現する微生物を、亜鉛を添加した培地で培養し、得られた培養液を精製することを特徴とする、NAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
- 培地への亜鉛の添加量が0.01mM〜0.1mMである、請求項5に記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いるグルコース濃度の測定方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコース濃度測定用組成物。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサ。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のNAD依存型グルコースデヒドロゲナーゼを含む燃料電池。
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