WO2016076364A1 - 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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WO2016076364A1
WO2016076364A1 PCT/JP2015/081757 JP2015081757W WO2016076364A1 WO 2016076364 A1 WO2016076364 A1 WO 2016076364A1 JP 2015081757 W JP2015081757 W JP 2015081757W WO 2016076364 A1 WO2016076364 A1 WO 2016076364A1
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amino acid
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seq
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gdh
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PCT/JP2015/081757
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Inventor
康子 荒木
Original Assignee
キッコーマン株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Definitions

  • the present invention relates to a flavin-binding glucose dehydrogenase with improved substrate specificity, its gene and recombinant DNA, and a method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase with improved substrate specificity.
  • Blood glucose level (blood glucose level) is an important marker of diabetes.
  • SMBG Self Monitoring Blood Glucose
  • enzymes using D-glucose as a substrate such as glucose oxidase (GOD) have been used for biosensors used in SMBG devices.
  • GOD glucose oxidase
  • GOD glucose oxidase
  • GDH glucose dehydrogenases
  • NAD nicotinamide dinucleotide
  • NADP nicotinamide dinucleotide phosphate
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • NAD (P) -GDH has the problem that the stability of the enzyme is poor and the addition of a coenzyme is necessary, and PQQ-GDH has a low substrate specificity, and D-glucose which is a measurement target
  • PQQ-GDH has a low substrate specificity
  • D-glucose which is a measurement target
  • sugar compounds such as maltose, D-galactose and D-xylose
  • sugar compounds other than D-glucose in the measurement sample affect the measurement value, and an accurate measurement value is obtained. There is a problem that it is not possible.
  • Non-Patent Documents 2 to 5 have reports on GDH derived from Aspergillus oryzae.
  • Patent Documents 1 to 3 include a flavin-binding type using flavin adenine dinucleotide (FAD) derived from Aspergillus as a coenzyme. Glucose dehydrogenase (hereinafter FAD-GDH) has been disclosed.
  • FAD-GDH flavin adenine dinucleotide
  • the above enzyme has a characteristic of low reactivity with one or several sugar compounds other than D-glucose, it is reactive with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. Is not sufficiently low.
  • FAD-GDH found from the genus Mucor, which is a kind of mold, has a sufficiently low reactivity with any of maltose, D-galactose, and D-xylose. (See, for example, Patent Document 4).
  • the measurement time is shortened by further improving the measurement sensitivity, the measurement system is further reduced in scale, and the required measurement sample is continuously reduced. It has been pursued.
  • the amount of glucose measurement enzyme mounted on the glucose sensor is increased.
  • the maltose and D-xylose present at a certain concentration or more are used.
  • the reactivity has been confirmed to some extent.
  • the activity on D-xylose is introduced by introducing amino acid substitution into FAD-GDH derived from Aspergillus genus.
  • a method for obtaining a reduced FAD-GDH variant has been disclosed (see, for example, Patent Documents 5 to 6).
  • the Aspergillus genus FAD-GDH is considerably more reactive with D-xylose than the natural Mucor genus FAD-GDH, and has the Aspergillus genus FAD-GDH variants disclosed so far.
  • the substrate specificity is sufficient.
  • Patent Document 7 discloses a method for obtaining an FAD-GDH variant with reduced activity on D-xylose and maltose by introducing an amino acid substitution into Mucor genus-derived FAD-GDH. Attempts to impart high specificity are continually being sought.
  • a glucose measuring enzyme with high specific activity can reduce the amount of glucose measuring enzyme mounted on the glucose sensor, shortening the measurement time by further improving the measurement sensitivity, and further reducing the scale of the measurement system Since it is considered effective for reducing the amount of measurement sample required, an enzyme having high isoisomerism while maintaining specific activity is desired.
  • JP 2007-289148 A Japanese Patent No. 4494978 International Publication No. 07/139013 Japanese Patent No. 4648993 JP 2008-237210 A International Publication No. 09/084616 International Publication No. 13/065770
  • the substrate specificity for D-glucose is excellent, it is difficult to act on sugar compounds other than D-glucose, such as D-xylose and maltose, and these D-glucoses are used when measured for D-glucose. It is an object of the present invention to provide a novel FAD-GDH that is not easily affected even when sugar compounds other than glucose coexist.
  • the modified FAD-GDH obtained by substituting a specific amino acid residue in the Mucor genus-derived FAD-GDH is specific to D-glucose.
  • the present invention has been completed by finding that it is excellent in properties, hardly acts on D-xylose and maltose, and is hardly affected by the presence of these sugar compounds other than D-glucose.
  • the present invention is as follows. (1) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence; A position corresponding to alanine at position 42 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to valine at position 83 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to serine at position 174 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to threonine at position 367 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to alanine at position 385 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to threonine at position 386 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; A position corresponding to leucine at position 391 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, A position corresponding to
  • the ratio of the reactivity to D-xylose (Xyl / Glc (%)) relative to the reactivity to D-glucose is reduced by 10% or more compared to before introducing the substitution.
  • the flavin-binding glucose dehydrogenase described in (1) or (2) which is characterized in that (4) A flavin-binding glucose dehydrogenase gene encoding the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of (1) to (3).
  • a recombinant vector comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase gene according to (4).
  • a host cell comprising the recombinant vector according to (5).
  • a method for producing a flavin-binding glucose dehydrogenase which comprises the following steps: (A) culturing the host cell according to (6), (B) expressing a flavin-binding glucose dehydrogenase gene contained in the host cell; (C) A step of isolating flavin-binding glucose dehydrogenase from the culture. (8) A method for measuring glucose, characterized by using the flavin-binding glucose dehydrogenase described in (1) to (3). (9) A glucose assay kit comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to (1) to (3). (10) A glucose sensor comprising the flavin-binding glucose dehydrogenase according to any one of (1) to (3).
  • FAD-GDH having excellent substrate specificity that maintains specific activity and has reduced reactivity to D-xylose and / or maltose.
  • the FAD-GDH of the present invention catalyzes the reaction of oxidizing the hydroxyl group of D-glucose to produce glucono- ⁇ -lactone in the presence of an electron acceptor, as in the case of known wild type or mutant FAD-GDH.
  • the activity of the FAD-GDH of the present invention utilizes this principle of action, for example, using the following measurement system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. Can be measured.
  • the flavin-binding GDH activity is calculated according to the following formula.
  • the flavin-binding GDH activity is defined as 1 U as the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of 200 mM D-glucose at 37 ° C.
  • 3.0 is the reaction reagent + enzyme reagent solution volume (mL)
  • 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the activity measurement conditions
  • 0.1 is the enzyme solution solution volume.
  • ML 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • ⁇ A600 blank is the absorbance per minute at 600 nm when the reaction is started by adding 10 mM acetate buffer (pH 5.0) instead of the enzyme sample solution.
  • Df represents the dilution factor.
  • the FAD-GDH of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or high identity with the amino acid sequence, for example, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more Preferably consisting of an amino acid sequence that is 85% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, Position corresponding to position 42 in the amino acid sequence described in No.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 42 in the FAD-GDH of the present invention is a substitution in which alanine at the position corresponding to position 42 is substituted with glycine, and corresponds to position 83 described above.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 83 is a substitution in which valine at the position corresponding to position 83 is substituted with either alanine or glycine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 174 described above is at position 174.
  • the serine at the corresponding position is a substitution in which either proline or leucine is substituted, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 367 is the threonine at the position corresponding to position 367 is alanine, serine or asparagine.
  • An amino acid substitution at a position corresponding to position 385 described above is a substitution that is substituted at any of the above positions.
  • a threonine at a position corresponding to position 385 is alanine.
  • An amino acid substitution at the position corresponding to position 386 described above is a substitution that is substituted with either aspartic acid or arginine.
  • the threonine at the position corresponding to position 386 is valine, isoleucine, glycine, leucine, glutamic acid, glutamine. , Asparagine or serine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 391 is a substitution in which leucine at the position corresponding to position 391 is replaced with valine.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 460 is a substitution in which phenylalanine at the position corresponding to position 460 is substituted with either tyrosine or leucine, and the amino acid substitution at the position corresponding to position 461 described above , Threonine corresponding to position 461 is methionine, phenylalanine, glycine, asparagine
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 467 described above is a substitution substituted with any of cysteine, and serine at the position corresponding to position 467 is leucine, methionine, isoleucine, valine, aspartic acid, glutamic acid
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 468 described above is a substitution in which glycine at the position corresponding to position 468 is replaced with threonine.
  • FAD-GDHs of the present invention more preferred examples include multiple mutants having a combination of a plurality of the substitutions as described above.
  • the present invention includes double mutants having two substitutions as described above, triple mutants having three substitutions, and multiple mutants having many mutations in combination. By accumulating such mutations, FAD-GDH having a further reduced effect on D-xylose and / or maltose can be produced.
  • substitutions at positions other than the above-mentioned various substitutions can be combined. Such substitution positions are introduced in combination with the above-described substitution sites, even when those substitutions are introduced alone, even if they do not have a significant effect as in the above-mentioned substitution sites, It can be synergistic.
  • the FAD-GDH of the present invention has a mutation that improves heat stability, a mutation that improves specific activity, pH, and the like in addition to the mutation that hardly acts on D-xylose and maltose as described above. You may combine arbitrarily the well-known variation
  • the FAD-GDH of the present invention first obtains a gene encoding an amino acid sequence close to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by an arbitrary method, and at a position equivalent to the predetermined position of SEQ ID NO: 1. It can also be obtained by introducing an amino acid substitution at any position.
  • the intended amino acid substitution introduction method include a method of introducing mutations at random or a method of introducing site-specific mutations at assumed positions.
  • Examples of the former method include error-prone PCR (Techniques, 1, 11-15, (1989)), XL1-Red competent cells (STRATAGENE) that are prone to errors in plasmid replication and prone to modification during propagation. There is a method of using.
  • a three-dimensional structure is constructed by crystal structure analysis of the target protein, amino acids that are expected to give the desired effect are selected based on the information, and a commercially available Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit is selected.
  • a site-specific mutation is introduced by selecting an amino acid that is expected to give a target effect using a three-dimensional structure of a known protein having high homology with the target protein. .
  • the “position equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1” here is homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (preferably 80% or more, more preferably 85% or more). And more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more), when aligned with other FAD-GDH having an amino acid sequence, it means the same position in the alignment.
  • Amino acid sequence homology should be calculated using GENETYX-Mac (Software Development, Inc.) maximum matching and search homology programs, or DNASIS Pro (Hitachi Software) maximum matching, multiple alignment programs, etc. Can do.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippman-Person method, and the largest conserved amino acid residue in the amino acid sequence of FAD-GDH is determined. This can be done by giving homology.
  • aligning the amino acid sequence of FAD-GDH in this way it is possible to determine the position of the homologous amino acid residue in each FAD-GDH sequence regardless of the insertion or deletion in the amino acid sequence. It is.
  • the homologous position is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be estimated that the homologous position has a similar effect on the substrate specificity of the target FAD-GDH.
  • FAD-GDH of the present invention Various variations of the FAD-GDH of the present invention are assumed within the above-mentioned range of identity, but the enzymatic scientific properties of various FAD-GDH are the same as the FAD-GDH of the present invention described in the present specification. As long as they are all included in the FAG-GDH of the present invention.
  • FAD-GDH having such an amino acid sequence has high substrate specificity and is hardly affected by the presence of sugar compounds other than D-glucose, such as D-xylose and maltose, and is industrially useful. It is.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 42 described above is a substitution in which alanine at the position corresponding to position 42 is substituted with glycine, which corresponds to position 83 described above.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 83 is alanine or glycine, or the amino acid substitution at the position corresponding to position 174 is the position corresponding to position 174.
  • Serine is either proline or leucine, or amino acid substitution at a position corresponding to position 367 is that threonine at a position corresponding to position 367 is any one of alanine, serine, and asparagine, or Amino acid substitution at the position corresponding to position 385 means that threonine at the position corresponding to position 385 is an alanine, aspartic acid or arginine Or the amino acid substitution at the position corresponding to position 386 is that the threonine at the position corresponding to position 386 is any one of valine, isoleucine, glycine, leucine, glutamic acid, glutamine, asparagine, and serine.
  • the amino acid substitution at the position corresponding to position 391 is that the leucine at the position corresponding to position 391 is valine, or the amino acid substitution at the position corresponding to position 460 is equivalent to position 460.
  • the phenylalanine at the position is either tyrosine or leucine, or the amino acid substitution at the position corresponding to position 461 is any of threonine at the position corresponding to position 461 is methionine, phenylalanine, glycine, aspartic acid or cysteine
  • Amino acid substitution at the position corresponding to position 467 Means that serine at the position corresponding to position 467 is leucine, methionine, isoleucine, valine, aspartic acid or glutamic acid, or an amino acid substitution at the position corresponding to position 468 corresponds to position 468.
  • the glycine at the position is a threonine, not whether it is due to an artificial substitution operation.
  • a desired substitution is introduced using a known technique using a protein in which the amino acid at the above position is originally different from the residue desired in the present invention
  • the desired amino residue is introduced by substitution.
  • a desired protein is obtained by known total peptide synthesis, or when a gene sequence is totally synthesized to encode a protein having a desired amino acid sequence and a desired protein is obtained based on this, or In the case where, for example, one originally found as a natural type has such a sequence, the FAD-GDH of the present invention can be obtained without going through a step of artificial substitution.
  • the FAD-GDH of the present invention is characterized by having a high substrate specificity. Specifically, the FAD-GDH of the present invention reacts with maltose, D-galactose, and D-xylose in the same manner as the fungus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993 previously discovered by the present inventors. It is characterized by extremely low properties. Specifically, when the reactivity to D-glucose is 100%, the reactivity to maltose, D-galactose and D-xylose is all 2% or less.
  • FAD-GDH used in the present invention has such a high substrate specificity, samples of patients who have been administered an infusion solution containing maltose and patients undergoing galactose tolerance test and xylose absorption test are also available. It is possible to accurately measure the amount of D-glucose without being affected by sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose contained in the measurement sample. Furthermore, since the FAD-GDH of the present invention has a higher substrate specificity for D-glucose compared with the fungus-derived FAD-GDH described in Japanese Patent No. 4648993, it is further industrially useful. Sex is expected.
  • the FAD-GDH of the present invention has a very low measurement value when measurement is performed using a sugar compound such as maltose, D-galactose, D-xylose instead of D-glucose as a substrate. It is preferable that D-glucose can be accurately measured even under conditions where sugar compounds such as maltose, D-galactose, and D-xylose are contaminated. Specifically, when the reactivity with respect to D-glucose in the absence of the contaminating sugar compound is 100%, at least one selected from maltose, D-galactose, and D-xylose is selected as the contaminating sugar compound.
  • the measured value when present is 96% to 103%, and even when three kinds of maltose, D-galactose and D-xylose are present simultaneously as the contaminating sugar compound, the measured value is 96% to 104%. preferable.
  • FAD-GDH having such characteristics is used, it is possible to accurately measure the amount of D-glucose even when maltose, D-galactose or D-xylose is present in the measurement sample. is there.
  • the enzymatic chemical properties of various FAD-GDH can be examined using known methods for identifying various properties of the enzyme, for example, the methods described in the following examples.
  • Various properties of the enzyme can be examined to some extent in the culture solution of microorganisms that produce various FAD-GDH and in the middle of the purification process, and more specifically, can be examined using the purified enzyme.
  • the modified FAD-GDH of the present invention is a ratio of reactivity to D-xylose at the same molar concentration with respect to reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)) under the reaction conditions based on the activity measuring method described above. ) And / or the ratio of reactivity to maltose at the same molar concentration relative to reactivity to D-glucose (Mal / Glc (%)) is preferably reduced compared to before introducing amino acid substitutions, Is reduced by 20% or more, more preferably 30% or more, further preferably 40% or more, and most preferably 50% or more.
  • FAD-GDH of the present invention only one of Xyl / Glc (%) or Mal / Glc (%) may be reduced to a preferable degree as compared with FAD-GDH before introducing an amino acid substitution. Alternatively, both of them may be reduced to a preferable degree. It is more preferable if the reactivity to both substrates is reduced.
  • FAD-GDH of the present invention is originally an enzyme with excellent substrate specificity for D-glucose, it is comparable to normal fasting blood glucose level ( ⁇ 126 mg / dL [7 mM]).
  • ⁇ 126 mg / dL [7 mM] normal fasting blood glucose level
  • it is assumed that almost no measurement value suggesting the influence of the coexistence is detected. Therefore, when measuring the reactivity to D-xylose and maltose in the FAD-GDH of the present invention, for example, under the condition where D-xylose and / or maltose coexist in an excessive concentration such as 200 mM.
  • the ratio of reactivity to D-xylose at the same molar concentration relative to the reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%)), and the reaction to maltose at the same molar concentration relative to the reactivity to D-glucose. Since the sex ratio (Mal / Glc (%)) varies depending on the type of transformant, its culture conditions, enzyme activity measurement conditions, etc., it is necessary to compare the respective values before and after introduction of amino acid substitution under the same conditions. There is.
  • the FAD-GDH of the present invention can also be obtained by modifying a known FAD-GDH.
  • known FAD-GDH-derived microorganisms include microorganisms that are classified into the subfamily Pleurotus, preferably Pleurotus, more preferably Pleuromyceae, and more preferably the family Pleurotus.
  • Specific examples include FAD-GDH derived from the genus Mucor, the genus Absidia, the genus Actinomucor, the genus Circinella.
  • microorganisms classified into the genus Mucor examples include Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii, Mucor heimalis f. Silvaticus, Mucor subtilissimus, Mucor dimorphosporus and the like. More specifically, Mucor plainii, Mucor javanicus, Mucor circinolides f. circinelloides, Mucor guilliermondii NBRC 9403, Mucor himalis f.
  • Circinella minor examples include Circinella minor, Circinella mucoloides, Circinella muscae, Circinella rigida, and Circinella simplex. More specifically, mention may be made of Circinella minor NBRC6448, Circinella mucoroides NBRC4453, Circinella muscae NBRC6410, Circinella rigida NBRC6411, Circinella simplex NBRC6412, Circinella umbellata NBRC4452, Circinella umbellata NBRC5842, Circinella RD055423 and Circinella RD055422. In addition, NBRC strain and RD strain are storage strains of NBRC (Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Biotechnology Center).
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene).
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention (hereinafter referred to as FAD-GDH gene)
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method may be used.
  • FAD-GDH gene a gene encoding the FAD-GDH of the present invention
  • FAD-GDH gene a generally used gene cloning method
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted by the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989).
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized and used to select a FAD-GDH gene with high substrate specificity from a chromosomal DNA or cDNA library, or Based on the above amino acid sequence, an appropriate primer DNA is prepared, and FAD-GDH having a high substrate specificity is encoded by an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as 5′RACE method or 3′RACE method. It is also possible to amplify a DNA containing the gene fragment and to link these DNA fragments to obtain a DNA containing the full length of the target FAD-GDH gene.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • FAD-GDH As a method for obtaining FAD-GDH having high substrate specificity according to the present invention using known FAD-GDH as a starting material, mutations are introduced into the gene encoding FAD-GDH, which is the starting material, and expressed from various mutant genes. It is possible to adopt a method of performing selection based on the enzymatic scientific properties of FAD-GDH. Mutation treatment of the starting FAD-GDH gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a method in which a FAD-GDH gene or a recombinant DNA in which the gene is incorporated is brought into contact with and acting on a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method, etc. Can be widely used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for contact and action are not particularly limited as long as conditions according to the type of drug to be used and the like can actually induce a desired mutation in the Mucor genus-derived FAD-GDH gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M. Even in the case of performing ultraviolet irradiation, it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, p24-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)
  • Eckstein method Nucleic Acids Res., 13, 8749 ( (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • a technique known as a general polymerase chain reaction can be used (Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified FAD-GDH gene with high substrate specificity can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter, Inc.
  • the FAD-GDH gene of the present invention obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and is compatible with each vector.
  • the host cell to be transformed can be transformed or transduced by conventional methods.
  • prokaryotic host cells examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli K-12, Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli JM109, Escherichia coli DH5 ⁇ , Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600 and the like ( Both are manufactured by Takara Bio Inc.). They are transformed or transduced to obtain host cells into which DNA has been introduced (transformants).
  • Escherichia coli K-12 Escherichia coli BL21 (DE3)
  • Escherichia coli JM109 Escherichia coli DH5 ⁇
  • Escherichia coli W3110 Escherichia coli C600 and the like
  • a method for transferring the recombinant vector into such a host cell for example, when the host cell is a microorganism belonging to Escherichia coli, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed.
  • An electroporation method may be used.
  • commercially available competent cells for example, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • yeast An example of a eukaryotic host cell is yeast.
  • microorganisms classified as yeast include yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces, the genus Saccharomyces, the genus Pichia, the genus Candida, and the like.
  • the inserted gene may include a marker gene to enable selection of transformed cells. Examples of the marker gene include genes that complement the auxotrophy of the host, such as URA3 and TRP1.
  • the inserted gene preferably contains a promoter or other control sequence (for example, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.) capable of expressing the gene of the present invention in the host cell. Specific examples of the promoter include GAL1 promoter and ADH1 promoter.
  • a method for transformation into yeast known methods, for example, a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) and electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481). -484) and the like can be preferably used, but the present invention is not limited to this, and transformation may be performed using various arbitrary methods including a spheroplast method and a glass bead method.
  • eukaryotic host cells include mold cells such as the genus Aspergillus and the genus Trichoderma.
  • the inserted gene contains a promoter capable of expressing the gene of the present invention in the host cell (eg, tef1 promoter) and other regulatory sequences (eg, secretory signal sequence, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.). Is desirable.
  • the inserted gene may contain a marker gene for enabling selection of transformed cells, for example, niaD, pyrG.
  • the inserted gene may contain a homologous recombination region for insertion into an arbitrary chromosomal site.
  • a known method for example, a method using polyethylene glycol and calcium chloride after protoplast formation (Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)) is preferably used. Can do.
  • the FAD-GDH of the present invention is obtained by culturing a host cell that produces the FAD-GDH of the present invention obtained as described above, expressing a flavin-binding glucose dehydrogenase gene contained in the host cell, and then The flavin-binding glucose dehydrogenase may be isolated from the product.
  • a YPD bactopeptone 2%, bactoextract 1%, glucose 2%) liquid medium widely used in the culture of Saccharomyces cerevisiae is preferably used.
  • the carbon source used in the medium may be any assimilable carbon compound, and examples thereof include glucose, starch hydrolysate, glycerin, fructose, and molasses.
  • the nitrogen source may be any available nitrogen compound, and examples thereof include yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor, soy flour, malt extract, amino acid, ammonium sulfate, and ammonium nitrate.
  • various salts such as salt, potassium chloride, magnesium sulfate, manganese chloride, ferrous sulfate, 1st potassium phosphate, 2nd potassium phosphate, sodium carbonate, calcium chloride, are mentioned, for example.
  • vitamins and antifoaming agents may be added as necessary.
  • Examples of the medium for culturing the prokaryotic host cell include one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, phosphate first Add one or more inorganic salts such as potassium, dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat bran leachate, sodium chloride
  • phosphate first Add one or more inorganic salts such as potassium, dibasic potassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • the culture conditions may vary depending on the microorganism to be cultured.
  • the initial pH of the medium is adjusted to pH 5-10
  • the culture temperature is 20-40 ° C.
  • the culture time is 15-25 hours, and 1-2.
  • the period can be set as appropriate, such as a day or 10 to 50 hours, and is carried out by aeration / agitation deep culture, shaking culture, static culture, or the like.
  • a culture medium and culture conditions for culturing yeast belonging to the genus Tigosaccharomyces a medium of bactopeptone 2%, bacto yeast extract 1%, glucose 2% was used at 30 ° C. and 200 rpm for 24 hours. Shake is mentioned.
  • Escherichia coli is cultured at a culture temperature of 10 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of around 25 ° C. for 4 to 8 hours, What is necessary is just to implement by shaking culture, stationary culture, etc.
  • a normal enzyme collecting means can be used.
  • the enzyme is present in the microbial cell, it is preferable to separate the microbial cell from the culture by, for example, filtration, centrifugation, or the like, and collect the enzyme from the microbial cell.
  • a method of destroying bacterial cells using normal disruption means such as an ultrasonic crusher, French press, dynomill, a method of lysing bacterial cell walls using a cell wall lytic enzyme such as lysozyme, Triton X-100, etc.
  • the method of extracting an enzyme from a microbial cell using these surfactants can be used alone or in combination.
  • the cells When the enzyme is present outside the cells, for example, the cells may be separated by an operation such as filtration or centrifugation, and the supernatant may be collected. Next, the insoluble matter is removed by filtration or centrifugation to obtain an enzyme extract.
  • an enzyme extract In order to isolate and purify flavin-binding GDH from the resulting extract as necessary, after removing nucleic acid as necessary, ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added to the fraction, and then precipitated. The product can be collected to obtain the FAD-GDH crude enzyme of the present invention.
  • the crude FAD-GDH enzyme of the present invention can be further purified using any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel or biogel; an adsorption elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel; an adsorption using hydroxyapatite Elution method; Sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane, hollow fiber membrane, etc.
  • the FAD-GDH enzyme preparation of the present invention can be obtained.
  • the present invention also discloses a glucose assay kit containing the FAD-GDH of the present invention.
  • the FAD-GDH of the present invention can be used to detect D-glucose (blood glucose in blood). Value) can be measured.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises the modified FAD-GDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the glucose assay kit of the present invention comprises, in addition to the modified FAD-GDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, D-glucose standard solutions for creating a calibration curve, and use of Includes guidelines.
  • the modified FAD-GDH according to the present invention can be provided in various forms, for example as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the D-glucose concentration can be measured, for example, as follows.
  • the reaction layer of the glucose assay kit includes FAD-GDH, an electron acceptor, and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis) as a reaction accelerator.
  • ADA N- (2-acetamido) imidodiacetic acid
  • -Tris a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole is retained.
  • a pH buffer and a coloring reagent are added as necessary.
  • a sample containing D-glucose is added thereto and allowed to react for a certain time.
  • the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye that is polymerized and formed by receiving electrons from the electron acceptor or the electron acceptor that fades upon reduction is monitored.
  • the standard concentration of D-glucose solution is used in advance from the rate of change of absorbance per time, and in the case of the endpoint method, from the change in absorbance up to the point when all D-glucose in the sample is oxidized.
  • the D-glucose concentration in the sample can be calculated based on the calibration curve prepared in the above.
  • a mediator and coloring reagent for example, 2,6-dichlorophenolindophenol (DCIP) is added as an electron acceptor, and D-glucose can be quantified by monitoring the decrease in absorbance at 600 nm. is there. Further, phenazine methosulfate (PMS) is added as an electron acceptor, and nitrotetrazolium blue (NTB) is further added as a coloring reagent, and the amount of diformazan produced is determined by measuring absorbance at 570 nm, and the D-glucose concentration is calculated. It is possible. Needless to say, the electron acceptor and the coloring reagent used are not limited to these.
  • the present invention also discloses a glucose sensor using the FAD-GDH of the present invention.
  • the electrode a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on this electrode. Immobilization methods include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or ferrocene or a derivative thereof.
  • the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the measurement of D-glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate, or the like can be used. As the working electrode, an electrode on which the modified FAD-GDH of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing D-glucose is added and the increase in current is measured. The D-glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration D-glucose solution.
  • 1.5 U FAD-GDH of the present invention is immobilized on a glassy carbon (GC) electrode, and the response current value with respect to the D-glucose concentration is measured.
  • a glassy carbon (GC) electrode In the electrolytic cell, 1.8 ml of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) and 0.2 ml of 1M potassium hexacyanoferrate (III) aqueous solution (potassium ferricyanide) are added.
  • the GC electrode is connected to a potentiostat BAS100B / W (manufactured by BAS), the solution is stirred at 37 ° C., and +500 mV is applied to the silver-silver chloride reference electrode.
  • a 1M DD-glucose solution is added to these systems to a final concentration of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 mM, and a steady-state current value is measured for each addition. This current value is plotted against a known D-glucose concentration (5, 10, 20, 30, 40, 50 mM) to create a calibration curve.
  • D-glucose can be quantified with an enzyme-immobilized electrode using the FAD-linked glucose dehydrogenase of the present invention.
  • the FAD-GDH of the present invention is excellent in substrate specificity even when compared with the conventional Mucor genus FAD-GDH, and thus has excellent effects particularly when applied to the glucose sensor as described above. It is expected to play.
  • the enzyme reaction is performed under special conditions where a larger amount of enzyme is loaded than when applied to a liquid reagent kit. This is because the necessity for reducing the influence is particularly high.
  • the substrate specificity and thermal stability of the modified FAD-GDH were evaluated according to the following test examples unless otherwise specified.
  • a part of the reaction solution after the treatment was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and it was confirmed that about 8 kbp of DNA was specifically amplified.
  • the amplified DNA was treated with a restriction enzyme DpnI (manufactured by New England Biolabs) and then transformed into a competent cell of Escherichia coli JM109 strain (manufactured by Nippon Gene) according to the attached protocol. Subsequently, each obtained transformant was applied to an LB-amp agar medium and cultured.
  • the grown colonies were inoculated into an LB-amp liquid medium and cultured with shaking, and various plasmid DNAs containing about 8 kbp of amplified DNA (about 8 kbp) according to the attached protocol using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma).
  • GenElute Plasmid Miniprep Kit manufactured by Sigma.
  • pYE2C-Mp-V83A, pYE2C-Mp-V83G, etc. in Example 1 were isolated.
  • Mp-V83G etc. is transformed into Inv-Sc strain (manufactured by Invitrogen) to express yeast transformant Sc-Mp (wild type) strain expressing wild type MpGDH and various modified MpGDH Yeast transformed strains Sc-Mp (modified types such as Sc-Mp-V83A and Sc-Mp-V83G in Example 1) were obtained.
  • the preculture solution is used for 4 mL of a liquid medium for main culture “0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base, 0.192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium”
  • a liquid medium for main culture “0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base, 0.192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium”
  • the cells are cultured at 30 ° C. for 16 hours. This culture solution was separated into cells and culture supernatant by centrifugation (10,000 ⁇ g, 4 ° C., 3 minutes), and the culture supernatant was used for evaluation of substrate specificity.
  • the activity for each substrate was measured by changing the substrate for the above activity measurement method from D-glucose to D-xylose at the same molar concentration. From these values, the “ratio of reactivity to D-xylose with respect to reactivity to D-glucose (Xyl / Glc (%))” was calculated. The (Xyl / Glc (%)) of wild type MpGDH expressed in the Sc-Mp (wild type) strain was 1.47%. Such substrate specificity is very excellent as compared with other conventionally known FAD-GDH, and it is expected that D-glucose which is a measurement target substance can be measured with high accuracy.
  • the modified FAD-GDH after site-directed mutagenesis shows the value of Xyl / Glc (%) in Mucor genus-derived FAD-GDH before site-directed mutagenesis in various mutants as 100%.
  • the “Xyl / Glc ratio” representing the specific substrate specificity was calculated. “In the modified FAD-GDH having an Xyl / Glc ratio of less than 100, the reactivity to D-xylose is lower and the substrate specificity is higher than FAD-GDH before site-directed mutagenesis. The degree is larger as the numerical value is smaller.
  • a main culture liquid medium “0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base, 0.192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium.
  • a main culture liquid medium “0.67% (w / v) amino acid-free yeast nitrogen base, 0.192% (w / v) uracil-free yeast synthesis dropout medium.
  • 2.5% (w / v) D-galactose, 0.75% (w / v) raffinose ” the cells were cultured at 30 ° C. for 14 hours.
  • the culture broth was separated into cells and culture supernatant by centrifugation (10,000 ⁇ g, 4 ° C., 3 minutes), and it was confirmed that the culture supernatant had GDH activity and used for the following operations. .
  • the collected culture supernatant containing FAD-GDH to be evaluated was concentrated by a centrifugal filter unit (Amicon Ultra-15 30K, manufactured by MERCK MILLIPORE), and then replaced with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). .
  • the collected concentrated solution is applied to a column of Superdex 200 10 / 300GL (manufactured by GE Healthcare Bioscience) pre-equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 150 mM sodium chloride.
  • the purified enzyme was obtained by collecting the fractions.
  • the specific activity of the purified enzyme was measured as the activity (U / A280) per absorbance (A280) at 280 nm using the above-mentioned GDH activity measurement method. And "relative specific activity" in modified MpGDH when the specific activity of wild type MpGDH was set to 100 was calculated. When the relative specific activity is not much less than 100, it can be seen that the modified MpGDH is not significantly reduced in specific activity.
  • Example 1 (Preparation of various modified MpGDH and evaluation of substrate specificity)
  • PCR reaction was performed using the synthetic nucleotide combinations of SEQ ID NOs shown in Table 1 using pYE2C-Mp (wild type) as a template plasmid.
  • E. coli strain JM109 was transformed with the vector containing the amplified DNA, and the base sequence of the DNA encoding MpGDH in the plasmid DNA retained by the grown colonies was determined, so that the sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • valine at position 83 is alanine
  • alanine at position 42 is glycine
  • valine at position 83 is glycine
  • serine at position 174 is proline
  • serine at position 174 is leucine
  • threonine at position 367 is alanine.
  • Threonine at position 386 is isoleucine and threonine at position 386 is Sin, threonine at position 386, threonine at position 386, glutamine, threonine at position 386, asparagine at position 386, threonine at position 386, serine, leucine at position 391, valine 460 position phenylalanine, 460 position phenylalanine to leucine, 461 position threonine to methionine, 461 position threonine to phenylalanine, 461 position threonine to glycine, 461 position threonine to aspartic acid
  • Threonine at position 461 is cysteine, se
  • V83A means that V (Val) at position 83 is replaced with A (Ala).
  • positions 42, 83, 174, 367, 385, 386, 391, 460, 461, 467, or 468 relative to wild-type MpGDH of SEQ ID NO: 1 Specific mutagenesis, specifically, A42G, V83A, V83G, S174P, S174L, T367A, T367S, T367N, A385T, A385D, A385R, T386V, T386I, T386G, T386L, T386E, T386Q, T386L, T38639, FAD-GDH xylose by introducing site-specific mutations of F460Y, F460L, T461M, T461F, T461G, T461D, T461C, S467L, S467M, S467I, S467V, S467D, S467E, and G468T It was confirmed that the reactivity of the drops.
  • Example 2 Evaluation of specific activity in various modified MpGDH
  • the specific activities of mutants A42G, T367A, A385T, T386S, F460Y, S467V, S467D, and S467E obtained in Example 1 were measured.
  • a PCR reaction was performed with combinations of synthetic nucleotides having the sequence numbers shown in Table 2, using pYE2C-Mp (wild type) as a template plasmid. Subsequently, E.
  • coli strain JM109 was transformed with the vector containing the amplified DNA, and the base sequence of the DNA encoding MpGDH in the plasmid DNA retained by the grown colonies was determined, so that the sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • threonine at position 367 is alanine
  • alanine at position 385 is threonine
  • threonine at position 386 is serine
  • phenylalanine at position 460 is tyrosine
  • serine at position 467 is valine
  • serine at position 467 is aspartic acid.
  • Mp-S467V, p E2C-Mp-S467D, the pYE2C-Mp-S467E obtained respectively.
  • pYE2C-Mp-L121M, pYE2C-Mp-W123V, pYE2C-Mp-S612C, and pYE2C-Mp-W569Y described in Patent Document 7 were transformed and obtained according to the items of Test Example (1).
  • the transformed strains (Sc-Mp-L121, Sc-Mp-W123V, Sc-Mp-S612C, Sc-Mp-W569Y) were cultured, and the GDH activity of the culture supernatant was measured.
  • the ratio of reactivity to D-xylose with respect to reactivity to D-glucose based on the procedure of the item of Test Example (2) using the culture supernatant of the above-mentioned various mutants whose GDH activity was confirmed. “Xyl / Glc (%)” and “Xyl / Glc ratio” were measured. Subsequently, using the culture supernatants of the above-mentioned various mutants whose GDH activity was confirmed, purification was performed based on the procedure of the item of Test Example (3) above, and the “relative specific activity of the purified enzyme” (%) "Was measured. In all of the comparative examples, the substrate specificity was as low as 34 to 64%, but the relative specific activity was about 60%. On the other hand, the enzyme of the present invention improves the substrate specificity by 10% or more while maintaining a specific activity of 65% or more.
  • JP 2013-176363 A discloses sequence information of GDH derived from Mucor RD056860 (hereinafter referred to as MrdGDH) of SEQ ID NO: 56 having 73% identity with MpGDH. Therefore, it was decided to verify whether or not the reactivity to xylose was reduced by introducing the amino acid substitution found in Example 1 into MrdGDH as follows. First, the base sequence of SEQ ID NO: 57 encoding the amino acid of SEQ ID NO: 56 and modified in codon for recombinant expression was obtained by total synthesis.
  • PCR reaction was performed using synthetic nucleotides of SEQ ID NOs: 58 and 59 and Prime STAR Max DNA polymerase (TaKaRa) according to the attached protocol.
  • the PCR reaction solution was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, and about 2 kb “DNA fragment for insert” was purified using RECOCHIP (manufactured by TakaRa).
  • Saccharomyces cerevisiae expression plasmid pYES2 / CT (manufactured by Invitrogen) was treated with restriction enzyme KpnI (manufactured by New England Biolabs), the reaction solution after restriction enzyme treatment was electrophoresed on 1.0% agarose gel, and RECOCHIP About 6 kb “DNA fragment for vector” was purified using (manufactured by TakaRa). Subsequently, in order to express MpGDH under the GAL1 promoter, the purified “DNA fragment for insert” and “DNA fragment for vector” were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) according to the attached protocol.
  • the recombinant plasmid pYE2C-Mrd was prepared.
  • PCR reaction was carried out using combinations of synthetic nucleotides having the sequence numbers shown in Table 3 using pYE2C-Mrd (wild type) as a template plasmid.
  • the position corresponding to MpGDH in MrdGDH was determined using the multiple alignment program ClustalW (http://www.genome.jp/tools/clusterw/) on WEB.
  • PYE2C-Mrd-T383S a recombinant plasmid in which the threonine at position 383 of the amino acid sequence is substituted with serine, the threonine at position 383 is replaced with asparagine, the threonine at position 464 is replaced with aspartic acid, and the threonine at position 464 is replaced with glutamic acid.
  • pYE2C-Mrd-T383N, pYE2C-Mrd-T464D, and pYE2C-Mrd-T464E were obtained, respectively.
  • the FAD-GDH of the present invention has a sufficiently high substrate specificity to D-glucose while maintaining a specific activity, and therefore contains a large amount of a sugar compound other than D-glucose, such as D-xylose.
  • the D-glucose concentration can be accurately measured even when the D-glucose in the sample is measured under conditions where the enzyme is concentrated, or even under conditions where the enzyme concentration is high.
  • the conventional FAD- Compared to the case of using GDH, it is expected that measurement with higher accuracy and higher sensitivity will be possible.

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Abstract

　Ｄ－グルコースに対する基質特異性が高く、Ｄ－キシロースへの反応性が低減したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを提供する。　Ｍｕｃｏｒ属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの４２位、８３位、１７４位、３６７位、３８５位、３８６位、３９１位、４６０位、４６１位、４６７位および４６８位に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。　グルコースセンサー等の、多量の酵素を搭載した条件下で使用する場合においても、Ｄ－キシロースが共存したときの影響を受けにくく、Ｄ－グルコース量を正確に測定することができる。

Description

基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡ、並びに基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造法に関する。
　血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病患者が自己の血糖値を管理するための装置としては、電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定（Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）機器が広く利用されている。ＳＭＢＧ機器に用いられるバイオセンサには、従来、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等のＤ－グルコースを基質とする酵素が利用されている。しかしながら、ＧＯＤは酸素を電子受容体とするという特性を備えているため、ＧＯＤを用いたＳＭＢＧ機器では、測定サンプル中の溶存酸素が測定値に影響を与え、正確な測定値が得られない場合が起こりうる。
　一方、Ｄ－グルコースを基質とするが、酸素を電子受容体としない別の酵素として、各種のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）が知られている。具体的には、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするタイプのＧＤＨ（ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨ）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするＧＤＨ（ＰＱＱ－ＧＤＨ）が見出されており、ＳＭＢＧ機器のバイオセンサに使用されている。しかしながら、ＮＡＤ（Ｐ）－ＧＤＨは、酵素の安定性が乏しく、かつ、補酵素の添加が必要という問題を有し、また、ＰＱＱ－ＧＤＨは基質特異性が低く、測定対象であるＤ－グルコース以外にも、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースなどの糖化合物に対して作用してしまうため、測定サンプル中のＤ－グルコース以外の糖化合物が測定値に影響し、正確な測定値が得られないという問題点が存在する。
　近年、ＰＱＱ－ＧＤＨをバイオセンサとして用いたＳＭＢＧ機器を用いて、輸液投与を受けていた糖尿病患者の血糖値を測定する際に、ＰＱＱ－ＧＤＨが輸液中に含まれるマルトースにも作用して、実際の血糖値よりも高い測定値が得られ、この値に基づく処置が原因となって患者が低血糖等を発症した例が報告されている。また、同様の事象はガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者にも起こり得ることも判明している（例えば、非特許文献１参照）。これを受け、厚生労働省医薬食品局は、Ｄ－グルコース溶液に各糖類を添加した場合における血糖測定値への影響を調査する目的で交差反応性試験を行ったところ、６００ｍｇ／ｄＬのマルトース、３００ｍｇ／ｄＬのＤ－ガラクトース、あるいは、２００ｍｇ／ｄＬのＤ－キシロース添加を行った場合には、ＰＱＱ－ＧＤＨ法を用いた血糖測定キットの測定値は、実際のＤ－グルコース濃度より２．５～３倍ほど高い値を示すことがわかった。すなわち、測定試料中に存在し得るマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースにより測定値が不正確になることが判明し、このような測定誤差の原因となる糖化合物の影響を受けず、Ｄ－グルコースを特異的に測定可能な基質特異性の高いＧＤＨの開発が切に望まれている。
　上記のような背景の下、上記以外の補酵素を利用するタイプのＧＤＨが着目されるようになってきている。例えば、非特許文献２～５にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来のＧＤＨについての報告があり、例えば、特許文献１～３にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開示されている。
　しかし、上記の酵素は、Ｄ－グルコースではない１種または数種の糖化合物に対して反応性が低いという特性を示すものの、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという特性を有してはいない。これらに対して、出願人は、ケカビの一種であるムコール（Ｍｕｃｏｒ）属から見出されたＦＡＤ－ＧＤＨが、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースのいずれに対しても反応性が十分に低いという優れた特性を有することを見出している（例えば、特許文献４参照）。また、このＧＤＨを用いれば、一定濃度範囲のマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在する条件下においても、それらの糖化合物による影響を受けることなくＤ－グルコース濃度を正確に測定することが可能であることを確認している（例えば、特許文献４参照）。このような優れた基質特異性は、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨの実用上の優位性を示す大きな特徴である。
　一方で、自己血糖測定における利便性をより向上させるために、測定感度のさらなる向上による測定時間短縮化や、測定系のさらなる小スケール化、必要とされる測定サンプルの少量化等が継続的に追求されている。例えば、測定感度を向上させるための一手段としては、グルコースセンサー上に搭載するグルコース測定酵素の量を増加させることも想定される。しかしながら、このような使用法において予測される、多量の酵素が存在する条件下では、前述のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合においても、一定濃度以上で存在するマルトースやＤ－キシロースへの反応性が若干ながら確認され、Ｄ－グルコース以外の糖化合物に対する反応性を低下させる取り組みにおいては、依然として改善の余地が存在する。
　ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性を向上させることを目的として、既存のＦＡＤ－ＧＤＨを改変する試みとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨに対してアミノ酸置換を導入することによりＤ－キシロースに対する作用性が低減したＦＡＤ－ＧＤＨ改変体を得る方法が開示されている（例えば、特許文献５～６参照）。しかしながら、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨは、天然型のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと比べてＤ－キシロースへの反応性がかなり高く、これまでに開示されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ改変体をもってしても、その基質特異性は十分であるとは言い難い。また、特許文献７では、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨに対してアミノ酸置換を導入することによりＤ－キシロース及びマルトースに対する作用性が低減したＦＡＤ－ＧＤＨ改変体を得る方法が開示されているが、さらなる高い特異性を付与する試みは継続的に求められている。
　一方で、高い比活性を持ったグルコース測定酵素はグルコースセンサー上に搭載するグルコース測定酵素の量を減らすことができるため、測定感度のさらなる向上による測定時間短縮化や、測定系のさらなる小スケール化、必要とされる測定サンプルの少量化等に有効であると考えられることから、比活性を維持したまま高い等異性を持つ酵素が求められている。
特開２００７－２８９１４８号公報 特許第４４９４９７８号公報 国際公開第０７／１３９０１３号 特許第４６４８９９３号公報 特開２００８－２３７２１０号公報 国際公開第０９／０８４６１６号 国際公開第１３／０６５７７０号
医薬品・医療用具等安全性情報２０６号（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｓａｆｅｔｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｎｏ．２０６）、２００４年１０月、厚生労働省医薬食品局 Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　Ｉ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｂｙ　ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，　Ｔ．　Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２６５－２７６　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩ．　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１３９，　２７７－２９３　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＩＩ．　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３１７－３２７　（１９６７）． Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ．　ＩＶ．　Ｈｉｓｔｉｄｙｌ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｓ　ａｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ，　Ｔ．Ｃ．　Ｂａｋ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｓａｔｏ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　１４６，　３２８－３３５　（１９６７）．
　本発明では、Ｄ－グルコースに対する基質特異性に優れ、Ｄ－グルコース以外の糖化合物、例えば、Ｄ－キシロースやマルトース等に作用しにくく、Ｄ－グルコースの測定に用いたときに、これらのＤ－グルコース以外の糖化合物が共存したときにも影響を受けにくい新規なＦＡＤ－ＧＤＨを提供することを課題とする。
　本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、Ｍｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおける特定のアミノ酸残基を置換することによって得られる改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが、Ｄ－グルコースに対する特異性に優れ、Ｄ－キシロースやマルトースに作用しにくく、これらのＤ－グルコース以外の糖化合物が共存したときの影響を受けにくいことを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　（１）　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４２位のアラニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における８３位のバリンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における１７４位のセリンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３６７位のスレオニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアラニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８６位のスレオニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のロイシンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６０位のフェニルアラニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６１位のスレオニンに対応する位置、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６７位のセリンに対応する位置、および配列番号１記載のアミノ酸配列における４６８位のグリシンに対応する位置よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が低減していることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
　（２）　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４２位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がグリシンであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における８３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、グリシンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における１７４位のセリンに対応する位置のアミノ酸がプロリン、ロイシンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３６７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン、アスパラギンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸が、スレオニン、アスパラギン酸、アルギニンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８６位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がバリン、イソロイシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、セリンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６０位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン、ロイシンのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６１位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸、システインのいずれかであるか、
　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６７位のセリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸のいずれかであるか、
　または配列番号１記載のアミノ酸配列における４６８位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
　（３）　Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が、前記の置換を導入する前と比較して１０％以上低減していることを特徴とする（１）又は（２）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
　（４）　（１）～（３）のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
　（５）　（４）記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
　（６）　（５）記載の組換え体ベクターを含む宿主細胞。
　（７）　フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
　（ａ）（６）に記載の宿主細胞を培養する工程、
　（ｂ）前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
遺伝子を発現させる工程、
　（ｃ）前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。
　（８）　（１）～（３）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とするグルコース測定方法。
　（９）　（１）～（３）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
　（１０）　（１）～（３）に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
　本発明によれば、比活性を維持し、かつＤ－キシロースおよび／またはマルトースへの反応性が低減した、基質特異性に優れたＦＡＤ－ＧＤＨを提供することができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの作用原理および活性測定法）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知の野生型または変異型ＦＡＤ－ＧＤＨ同様、電子受容体存在下でＤ－グルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）および２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）　Ｄ－グルコ－ス　＋　ＰＭＳ（酸化型）
　　　　　　　　→　Ｄ－グルコノ－δ－ラクトン　＋　ＰＭＳ（還元型）
（反応２）　ＰＭＳ（還元型）　＋　ＤＣＩＰ（酸化型）
　　　　　　　　→　ＰＭＳ（酸化型）　＋　ＤＣＩＰ（還元型）
　具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ－グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。そして、続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　具体的には、フラビン結合型ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．５） ２．０５ｍＬ、１Ｍ Ｄ－グルコース溶液 ０．６ｍＬおよび２ｍＭ ＤＣＩＰ溶液 ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．１ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一なアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１記載のアミノ酸配列における４２位に相当する位置、８３位に相当する位置、１７４位に相当する位置、３６７位に相当する位置、３８５位に相当する位置、３８６位に相当する位置、３９１位に相当する位置、４６０位に相当する位置、４６１位に相当する位置、４６７位に相当する位置、および４６８位に相当する位置に相当する位置から選択される位置のアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする。
　好ましくは、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける、上述の４２位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４２位に相当する位置のアラニンがグリシンに置換される置換であり、上述の８３位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、８３位に相当する位置のバリンがアラニン、グリシンのいずれかに置換される置換であり、上述の１７４位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、１７４位に相当する位置のセリンがプロリン、ロイシンのいずれかに置換される置換であり、上述の３６７位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３６７位に相当する位置のスレオニンがアラニン、セリン、アスパラギンのいずれかに置換される置換であり、上述の３８５位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３８５位に相当する位置のスレオニンがアラニン、アスパラギン酸、アルギニンのいずれかに置換される置換であり、上述の３８６位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３８６位に相当する位置のスレオニンがバリン、イソロイシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、セリンのいずれかに置換される置換であり、上述の３９１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３９１位に相当する位置のロイシンがバリンに置換される置換であり、上述の４６０位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６０位に相当する位置のフェニルアラニンがチロシン、ロイシンのいずれかに置換される置換であり、上述の４６１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６１位に相当する位置のスレオニンがメチオニン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸、システインのいずれかに置換される置換であるか、上述の４６７位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６７位に相当する位置のセリンがロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸のいずれかに置換される置換であり、上述の４６８位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６８位に相当する位置のグリシンがスレオニンに置換される置換である。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの中で、さらに好ましいものの例として、上記のような置換を複数組み合わせて有する多重変異体が挙げられる。例えば、上記のような置換を２箇所組み合わせて有する２重変異体、３箇組み合わせて有する３重変異体、さらに多数の変異を組み合わせて有する多重変異体が本発明に包含される。このような変異の蓄積により、Ｄ－キシロースおよび／またはマルトースへの作用性がさらに低減したＦＡＤ－ＧＤＨを作出することができる。
　また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであっても、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するものであり得る。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上述のような、Ｄ－キシロースやマルトースに作用しにくいという変異のほかに、熱安定性を向上させる変異や、比活性を向上させる変異や、ｐＨや特定の物質などへの耐性を向上させる効果などのような、別種の効果を奏することを目的とした公知の変異を任意に組み合わせてもよい。このような別種の変異を組み合わせた場合であっても、本発明の効果を発揮し得るものである限り、それらのＦＡＤ－ＧＤＨは本発明に包含される。
　後述のとおり、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、例えば、まず任意の方法で、配列番号１のアミノ酸配列に近いアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番号１の所定の位置と同等の位置におけるいずれかの位置においてアミノ酸置換を導入することにより得ることもできる。
　目的とするアミノ酸置換導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者の方法としては、エラープローンＰＣＲ法（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１，１１－１５，（１９８９））や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしやすく、改変を生じやすいＸＬ１－Ｒｅｄコンピテントセル（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等がある。また、後者の方法として、目的とするタンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のＱｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等により部位特異的変異を導入する方法がある。あるいは、後者の方法として、目的とするタンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用いて、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異的変異を導入する方法もある。
　また、ここでいう、例えば、「配列番号１のアミノ酸配列と同等の位置」とは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号１と相同性（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を持つアミノ酸配列を有する他のＦＡＤ－ＧＤＨとをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおける同一の位置を意味する。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ－Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、又はＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
　「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。ＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各ＦＡＤ－ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性に関して類似した効果を有することが推定できる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種ＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質が本明細書に記載する本発明のＦＡＤ―ＧＤＨと同様である限り、それらは全て本発明のＦＡＧ－ＧＤＨに含まれ得る。このようなアミノ酸配列を有するＦＡＤ－ＧＤＨは、基質特異性が高く、かつ、Ｄ－グルコース以外の糖化合物、例えば、Ｄ－キシロースやマルトース等が共存したときにも影響を受けにくく、産業上有用である。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、上述の４２位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４２位に相当する位置のアラニンがグリシンに置換される置換であり、上述の８３位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、８３位に相当する位置のバリンがアラニン、グリシンのいずれかであること、または、１７４位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、１７４位に相当する位置のセリンがプロリン、ロイシンのいずれかであること、または、３６７位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３６７位に相当する位置のスレオニンがアラニン、セリン、アスパラギンのいずれかであること、または、３８５位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３８５位に相当する位置のスレオニンがアラニン、アスパラギン酸、アルギニンのいずれかであること、または、３８６位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３８６位に相当する位置のスレオニンがバリン、イソロイシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、セリンのいずれかであること、または、３９１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、３９１位に相当する位置のロイシンがバリンであること、または、４６０位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６０位に相当する位置のフェニルアラニンがチロシン、ロイシンのいずれかであること、または、４６１位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６１位に相当する位置のスレオニンがメチオニン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸、システインのいずれかであること、４６７位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６７位に相当する位置のセリンがロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸のいずれかであること、または、４６８位に相当する位置でのアミノ酸置換とは、４６８位に相当する位置のグリシンがスレオニンであることが重要なのであって、それが人為的な置換操作によるものか否かは重要でない。例えば、上記の位置のアミノ酸が本発明で所望される残基とは元々異なっているタンパク質を出発物質として、そこに公知の技術を用いて所望の置換を導入していく場合であれば、これらの所望されるアミノ残基は置換により導入される。一方、公知のペプチド全合成により所望のタンパク質を入手する場合、または、所望のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするように遺伝子配列を全合成し、これに基づき所望のタンパク質を入手する場合、あるいは、天然型として見出されたものの中に元々そのような配列を有するものがあった場合等には、人為的な置換という工程を経ることなく、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおける基質特異性の向上）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、高い基質特異性を有することを特徴とする。具体的には、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、本発明者らが先に見出した特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨと同様に、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースに対する反応性が極めて低いことを特徴とする。具体的には、Ｄ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースに対する反応性がいずれも２％以下であることを特徴とする。本発明に用いるＦＡＤ－ＧＤＨは、このような高い基質特異性を有するため、マルトースを含む輸液の投与を受けている患者や、ガラクトース負荷試験およびキシロース吸収試験を実施中の患者の試料についても、測定試料に含まれるマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物の影響を受けることなく、正確にＤ－グルコース量を測定することが可能となる。さらに、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、特許第４６４８９９３号公報に記載のケカビ由来ＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、さらに高いＤ－グルコースに対する基質特異性を有するものであるため、一層の産業上の有用性が期待される。
　また、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のようにＤ－グルコースの代わりにマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物を基質として測定を行った際の測定値が非常に低く、さらに、マルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロース等の糖化合物が夾雑する条件下でも正確にＤ－グルコースを測定できることが好ましい。具体的には、それらの夾雑糖化合物が存在しない条件でのＤ－グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－キシロースから選択される１以上が存在する場合の測定値が９６％～１０３％であり、夾雑糖化合物としてマルトース、Ｄ－ガラクトースおよびＤ－キシロースの３種が同時に存在する場合でも、測定値が９６％～１０４％であることが好ましい。
　このような特性を有するＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合には、測定試料中にマルトースやＤ－ガラクトース、Ｄ－キシロースが存在している状況でも、Ｄ－グルコース量を正確に測定することが可能である。
　各種のＦＡＤ－ＧＤＨが有する酵素化学的性質は、酵素の諸性質を特定するための公知の手法、例えば、以下の実施例に記載の方法を用いて調べることができる。酵素の諸性質は、各種のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する微生物の培養液や、精製工程の途中段階において、ある程度調べることもでき、より詳細には、精製酵素を用いて調べることができる。
　本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは、前述の活性測定方法に基づく反応条件下で、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））および／または、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））が、アミノ酸置換を導入する前と比較して低減している、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上低減していることを特徴とする。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）またはＭａｌ／Ｇｌｃ（％）のいずれか片方のみがアミノ酸置換を導入する前のＦＡＤ－ＧＤＨと比べて好ましい程度に低減していてもよく、あるいは、その両方が、好ましい程度に低減していてもよい。両方の基質に対する反応性がいずれも低減しているものであれば、より好ましい。
　また、上述のように、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、元々Ｄ－グルコースに対する基質特異性が優れた酵素であるため、通常の空腹時血糖値（≦１２６ｍｇ／ｄＬ[７ｍＭ]）と同程度のモル濃度のＤ－キシロース及びマルトースを用いて行う反応性の測定においては、その共存の影響を示唆する測定値がほとんど検出されないことが想定される。そこで、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨにおけるＤ－キシロースおよびマルトースへの反応性を測定する際には、例えば、２００ｍＭ等の過剰量の濃度でＤ－キシロースおよび／またはマルトースを共存させた条件下で、同モル濃度のＤ－グルコースへの反応性が２Ｕ/ｍｌ以上、好ましくは５Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１０Ｕ／ｍｌ以上である多量の酵素液を用いて測定を行うことが好ましい。このような条件で測定を行うことにより、グルコースセンサー上に多量の酵素を搭載した際と同等な条件を想定した、共存物質の影響を検討することができる。
　なお、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））、および、Ｄ－グルコースへの反応性に対する同モル濃度のマルトースへの反応性の割合（Ｍａｌ／Ｇｌｃ（％））は、形質転換体の種類やその培養条件、あるいは酵素活性測定条件等によって異なるため、同一の条件下において、アミノ酸置換導入前後のそれぞれの値を比べる必要がある。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの由来となる天然型ＦＡＤ－ＧＤＨの例）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを改変することにより取得することもできる。公知のＦＡＤ－ＧＤＨの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属由来のＦＡＤ－ＧＤＨ等が挙げられる。
　Ｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｍｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ等が挙げられる。より具体的には、特許文献５に記載のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ、Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ　ｆ．　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＮＢＲＣ９４０３、Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ　ｆ．　ｓｉｌｖａｔｉｃｕｓ　ＮＢＲＣ６７５４、Ｍｕｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ　ＮＢＲＣ６３３８、Ｍｕｃｏｒ　ＲＤ０５６８６０、Ｍｕｃｏｒ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ　ＮＢＲＣ５３９５等が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｂｓｉｄｉａ　ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ、Ａｂｓｉｄｉａ　ｈｙａｌｏｓｐｏｒａを挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のＡｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ　ｅｌｅｇａｎｓを挙げることができる。Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａを挙げることができる。より具体的には、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｉｎｏｒ　ＮＢＲＣ６４４８、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ　ＮＢＲＣ４４５３、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｍｕｓｃａｅ　ＮＢＲＣ６４１０、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｒｉｇｉｄａ　ＮＢＲＣ６４１１、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ＮＢＲＣ６４１２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ４４５２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ｕｍｂｅｌｌａｔａ　ＮＢＲＣ５８４２、Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２３及びＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ　ＲＤ０５５４２２を挙げることができる。なお、ＮＢＲＣ菌株およびＲＤ菌株はＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構　バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子の取得）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを効率よく取得するためには、遺伝子工学的手法を利用するのが好ましい。本発明のＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えば、公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質とし、それを改変することにより本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを取得するには、ＦＡＤ－ＧＤＨ生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、公知のＦＡＤ－ＧＤＨのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーから基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、基質特異性の高いＦＡＤ－ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることもできる。
　公知のＦＡＤ－ＧＤＨを出発物質として、本発明の基質特異性が高いＦＡＤ－ＧＤＨを取得する方法として、出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＦＡＤ－ＧＤＨの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
　出発物質であるＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，　ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
　また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。
　なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望の基質特異性の高い改変ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
　上記のような任意の方法により選択された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定または確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
　上述のように得られた本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
　原核宿主細胞の一例としては、エシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ－１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
　真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５，　２５５－２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５５　（２００３）４８１－４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
　真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のようなカビ細胞が挙げられる。挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター（例えばｔｅｆ１プロモーター）及びその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。また、挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子、例えばｎｉａＤ、ｐｙｒＧが含まれていても良い。さらに、挿入遺伝子には、任意の染色体部位へ挿入するための相同組換え領域が含まれていても良い。糸状菌への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１８，　９９－１０４（１９８９））を好適に用いることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの製造）
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離することにより、製造すればよい。
　上記真核宿主細胞を培養するためには、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養において広く用いられているＹＰＤ（バクトペプトン　２％，バクトイースト・エクストラクト　１％，グルコース　２％）液体培地を好適に用いることができると考えられるが、その他にも、添加することにより本発明に用いるフラビン結合型ＧＤＨの製造量を向上させることができる栄養源や成分があれば、単独で、あるいは組み合わせてそれらを添加してもよい。
　培地に使用する炭素源としては、同化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜などが挙げられる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、マルツエキス、アミノ酸、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどが挙げられる。無機物としては、例えば、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第１鉄、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、炭酸ナトリウム、塩化カルシウムなどの種々の塩が挙げられる。その他、必要に応じてビタミン類、消泡剤などを添加してもよい。
　上記原核宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培養条件は、培養する微生物により異なっても良いが、例えば、培地の初発ｐＨは、ｐＨ５～１０に調整し、培養温度は、２０～４０℃、培養時間は、１５～２５時間、１～２日間、あるいは１０～５０時間等、適宜設定することができ、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などにより実施する。
　例えば、チゴサッカロマイセス属の酵母を培養する場合の培地および培養条件の一例として、バクトペプトン　２％，バクトイースト・エクストラクト　１％，グルコース　２％の培地を用いた、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間の振盪が挙げられる。例えば、エシェリヒア・コリーの培養は、１０～４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で４～８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
　培養終了後、該培養物あるいは培養菌体内部からフラビン結合型ＧＤＨを採取するには、通常の酵素の採取手段を用いることができる。
　上記酵素が菌体内に存在する場合には、培養物から、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この菌体から酵素を採取するのが好ましい。例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミルなどの、通常の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを単独または組み合わせて採用することができる。
　上記酵素が菌体外に存在する場合には、例えば、濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、上清を回収すればよい。次いで、濾過または遠心分離などにより不溶物を取りのぞき、酵素抽出液を得る。得られた抽出液から、フラビン結合型ＧＤＨを、必要に応じて単離、精製するには、必要により核酸を除去したのち、これに硫酸アンモニウム、アルコール、アセトンなどを添加して分画し、沈殿物を採取し、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を得ることができる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＦＡＤ－ＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いたＤ－グルコース測定方法）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを開示し、例えば、このようなグルコースアッセイキットを用いることにより、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いて血中のＤ－グルコース（血糖値）を測定することができる。
　本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを、少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのＤ－グルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＦＡＤ－ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
　Ｄ－グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のように行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＦＡＤ－ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてＮ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにＤ－グルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のＤ－グルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のＤ－グルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のＤ－グルコース濃度を算出することができる。
　この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでＤ－グルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、Ｄ－グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
（本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを含むグルコースセンサー）
　本発明はまた、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨを用いるグルコースセンサーを開示する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
　Ｄ－グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、Ｄ－グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のＤ－グルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のＤ－グルコース濃度を計算することができる。
　具体的な一例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の１．５ＵのＦＡＤ－ＧＤＨを固定化し、Ｄ－グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．８ｍｌ、及び、１Ｍ　ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀－塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ　Ｄ－Ｄ－グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のＤ－グルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のＦＡＤ結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でＤ－グルコースの定量が可能となる。
　本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、従来のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨと比較した場合でも、基質特異性が優れているために、特に、上記のようなグルコースセンサーに対し応用する場合に、優れた効果を奏することが期待される。グルコースセンサーにおいては、液状試薬キット等に応用する場合と比較して、より多量の酵素を搭載する特殊な条件下で酵素反応が行われることが想定され、このような条件下では、共存物質の影響を低減する必要性が特に高いことが求められるためである。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
　本発明において、改変型ＦＡＤ－ＧＤＨの基質特異性および熱安定性の評価は、特に記載がない限り、以下の試験例の方法に従い行った。
［試験例］
（１）各種の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨを発現する酵母形質転換体の作製
　特許文献７に記載の方法に準じ、配列番号２のＭｕｃｏｒ　ｐｒａｉｎｉｉ由来ＦＡＤ－ＧＤＨ遺伝子（野生型ＭｐＧＤＨ遺伝子）をコードする組換え体プラスミド（ｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（野生型））を取得した。
　得られた組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを鋳型として、各アミノ酸置換導入用の合成ヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとして「反応液」を調製した。サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、調製した反応液を９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５５℃、３０秒」－「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。
　上記処理後の反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８ｋｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、添付のプロトコールに従って、大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン社製）のコンピテントセルに混合することにより形質転換を行った。次いで、取得した形質転換体をそれぞれＬＢ－ａｍｐ寒天培地に塗布し、培養を行った。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ液体培地に接種して振とう培養し、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、約８ｋｂｐの増幅されたＤＮＡを含む各種のプラスミドＤＮＡ（例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ等）を単離した。次いで、これらの各種プラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、それぞれの配列において、配列番号１記載のアミノ酸配列における所定の位置のアミノ酸が置換されていることを確認した。このようにして、所定のアミノ酸が置換された改変型ＭｐＧＤＨをコードする酵母発現用ベクターｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ等）を取得した。
　その後、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）、および各種変異が導入されたｐＹＥＳ２Ｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ等）をＩｎｖ－Ｓｃ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換することにより、野生型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）株、および各種の改変型ＭｐＧＤＨを発現する酵母形質転換株Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ等）株をそれぞれ取得した。
（２）基質特異性評価
　酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例１におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ等）を、各々、５ｍＬの前培養用液体培地「０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース」中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１ｍＬを４ｍＬの本培養用液体培地「０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース」に加えて、３０℃で１６時間培養する。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液を基質特異性の評価に用いた。
　具体的には、上述の活性測定法の基質をＤ－グルコースから同モル濃度のＤ－キシロースとした系に変えてそれぞれの基質に対する活性を測定した。そして、これらの値から、「Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））」を算出した。
　Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）株にて発現させた野生型ＭｐＧＤＨの（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））は１．４７％であった。このような基質特異性は、従来知られたその他のＦＡＤ-ＧＤＨと比較しても非常に優れており、測定目的物質であるＤ－グルコースを精度よく測定できることが期待される。
　また、各種変異体における部位特異的変異導入前のＭｕｃｏｒ属由来ＦＡＤ－ＧＤＨにおけるＸｙｌ／Ｇｌｃ（％）の値を１００％とした時に部位特異的変異導入後の改変型ＦＡＤ－ＧＤＨが示す相対的な基質特異性を表す「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率」を算出した。「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率が１００を下回る改変型ＦＡＤ－ＧＤＨにおいては、部位特異的変異導入前のＦＡＤ－ＧＤＨと比較して、Ｄ－キシロースへの反応性が低下し、基質特異性が高まっていることを示し、その度合は、数値が小さくなるほど大きい。
（３）比活性評価
　酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（野生型）、および、各種の酵母形質転換体Ｓｃ－Ｍｐ（改変型、例えば、実施例２におけるＳｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ等）を、各々、１０ｍＬの前培養用液体培地「０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース（ＢＤ）、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物（ｓｉｇｍａ社製）、２．０％（ｗ／ｖ）ラフィノース」中で、３０℃にて２４時間培養した。その後、前培養液１０ｍＬを４０ｍＬの本培養用液体培地「０．６７％（ｗ／ｖ）アミノ酸不含有イーストニトロゲンベース、０．１９２％（ｗ／ｖ）ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、２．５％（ｗ／ｖ）Ｄ－ガラクトース、０．７５％（ｗ／ｖ）ラフィノース」に加えて、３０℃で１４時間培養した。この培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、３分間）により菌体と培養上清に分離し、培養上清液にＧＤＨ活性があることを確認し、以下の操作に用いた。
　回収した評価対象のＦＡＤ－ＧＤＨを含む培養上清液を遠心式フィルターユニット(Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５　３０Ｋ、ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製)により濃縮後、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換した。
　次に、回収した濃縮液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　１０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のカラムにかけ、活性画分を回収することで精製酵素を取得した。
　精製した酵素の比活性は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）あたりの活性（Ｕ／Ａ２８０）として、上述のＧＤＨ活性測定法を用いて測定した。そして、野生型ＭｐＧＤＨの比活性を１００とした際の改変型ＭｐＧＤＨにおける「相対比活性」を算出した。相対比活性が１００よりあまり小さくないとき、その改変型ＭｐＧＤＨは比活性が大幅に低くなっていないことがわかる。
［実施例１］
（各種改変型ＭｐＧＤＨの調製と基質特異性評価）
　上記試験例で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表１に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の８３位のバリンがアラニンに、４２位のアラニンがグリシンに、８３位のバリンがグリシンに、１７４位のセリンがプロリンに、１７４位のセリンがロイシンに、３６７位のスレオニンがアラニンに、３６７位のスレオニンがセリンに、３６７位のスレオニンがアスパラギンに、３８５位のアラニンがスレオニンに、３８５位のアラニンがアスパラギン酸に、３８５位のアラニンがアルギニンに、３８６位のスレオニンがバリンに、３８６位のスレオニンがイソロイシンに、３８６位のスレオニンがグリシンに、３８６位のスレオニンがロイシンに、３８６位のスレオニンがグルタミン酸に、３８６位のスレオニンがグルタミンに、３８６位のスレオニンがアスパラギンに、３８６位のスレオニンがセリンに、３９１位のロイシンがバリンに、４６０位のフェニルアラニンがチロシンに、４６０位のフェニルアラニンがロイシンに、４６１位のスレオニンがメチオニンに、４６１位のスレオニンがフェニルアラニンに、４６１位のスレオニンがグリシンに、４６１位のスレオニンがアスパラギン酸に、４６１位のスレオニンがシステインに、４６７位のセリンがロイシンに、４６７位のセリンがメチオニンに、４６７位のセリンがイソロイシンに、４６７位のセリンがバリンに、４６７位のセリンがアスパラギン酸に、４６７位のセリンがグルタミン酸に、４６８位のグリシンがスレオニンに置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｐ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ４６８Ｔをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｐ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｒ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｑ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｆ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｌ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｉ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｇ４６８Ｔを用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｖ８３Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｐ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ１７４Ｌ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｓ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ｎ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｄ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｒ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｖ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｉ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｌ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｅ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｑ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｎ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｌ３９１Ｖ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｌ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｍ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｆ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｄ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ４６１Ｃ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｌ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｍ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｉ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｖ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｇ４６８Ｔ、）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）」及び「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率」を測定した。
　なお、例えば、表１において、「Ｖ８３Ａ」は８３位のＶ（Ｖａｌ）をＡ（Ａｌａ）に置換することを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１に示すとおり、配列番号１の野生型ＭｐＧＤＨに対する４２位、８３位、１７４位、３６７位、３８５位、３８６位、３９１位、４６０位、４６１位、４６７位、または４６８位への部位特異的変異導入、具体的には、Ａ４２Ｇ、Ｖ８３Ａ、Ｖ８３Ｇ、Ｓ１７４Ｐ、Ｓ１７４Ｌ、Ｔ３６７Ａ、Ｔ３６７Ｓ、Ｔ３６７Ｎ、Ａ３８５Ｔ、Ａ３８５Ｄ、Ａ３８５Ｒ、Ｔ３８６Ｖ、Ｔ３８６Ｉ、Ｔ３８６Ｇ、Ｔ３８６Ｌ、Ｔ３８６Ｅ、Ｔ３８６Ｑ、Ｔ３８６Ｎ、Ｔ３８６Ｓ、Ｌ３９１Ｖ、Ｆ４６０Ｙ、Ｆ４６０Ｌ、Ｔ４６１Ｍ、Ｔ４６１Ｆ、Ｔ４６１Ｇ、Ｔ４６１Ｄ、Ｔ４６１Ｃ、Ｓ４６７Ｌ、Ｓ４６７Ｍ、Ｓ４６７Ｉ、Ｓ４６７Ｖ、Ｓ４６７Ｄ、Ｓ４６７Ｅ、Ｇ４６８Ｔの部位特異的変異を導入することにより、ＦＡＤ－ＧＤＨのキシロースへの反応性が低下することが確認された。
［実施例２］
（各種改変型ＭｐＧＤＨにおける比活性の評価）
　実施例１で取得した変異体Ａ４２Ｇ、Ｔ３６７Ａ、Ａ３８５Ｔ、Ｔ３８６Ｓ、Ｆ４６０Ｙ、Ｓ４６７Ｖ、Ｓ４６７Ｄ、Ｓ４６７Ｅの比活性を測定した。試験例（３）で記述した方法に従って、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表２に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｐＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３６７位のスレオニンがアラニンに、３８５位のアラニンがスレオニンに、３８６位のスレオニンがセリンに、４６０位のフェニルアラニンがチロシンに、４６７位のセリンがバリンに、４６７位のセリンがアスパラギン酸に、４６７位のセリンがグルタミン酸に置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｐＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅを用いて、試験例（３）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ４２Ｇ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３６７Ａ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ａ３８５Ｔ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｔ３８６Ｓ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｆ４６０Ｙ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｄ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ４６７Ｅ）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）」及び「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率」を測定した。
続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（３）の項目の手順に基づき、精製を行った上、精製した酵素の比活性を測定し「相対比活性」を計算した。
　比較例として特許文献７記載のｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１Ｍ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｖ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｃ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙを試験例（１）の項目に従ってＩｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｐ－Ｌ１２１、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｗ１２３Ｖ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｓ６１２Ｃ、Ｓｃ－Ｍｐ－Ｗ５６９Ｙ）の培養を行い、培養上清のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて試験例（２）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）」及び「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率」を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（３）の項目の手順に基づき、精製を行った上、精製した酵素の「相対比活性（％）」を測定した。
　比較例はいずれも基質特異性は３４～６４％と低くなっているものの、相対比活性が６０％程度であった。一方、本発明酵素は比活性６５％以上を維持したまま、基質特異性が１割以上向上している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例３］
（各種改変型ＭｒｄＧＤＨの調製と基質特異性評価）
　特開２０１３－１７６３６３号公報において、ＭｐＧＤＨと７３％の同一性を有する、配列番号５６のＭｕｃｏｒ  ＲＤ０５６８６０由来のＧＤＨ（以下、ＭｒｄＧＤＨ）の配列情報が公開されている。そこで、実施例１で見出したアミノ酸置換をＭｒｄＧＤＨに導入することで、同様にキシロースへの反応性が低減するかどうかを以下のように検証することにした。まず、配列番号５６のアミノ酸をコードし、組み換え発現用にコドンを改変した配列番号５７の塩基配列を全合成により取得した。これを鋳型として、配列番号５８、５９の合成ヌクレオチド、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約２ｋｂの「インサート用ＤＮＡ断片」を精製した。また、Saccharomyces cerevisiaeの発現用プラスミドｐＹＥＳ２／ＣＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、制限酵素処理後の反応液を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、ＲＥＣＯＣＨＩＰ（ＴａｋａＲａ社製）を用いて、約６ｋｂの「ベクター用ＤＮＡ断片」を精製した。続いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて添付のプロトコールに従って、精製した「インサート用ＤＮＡ断片」および「ベクター用ＤＮＡ断片」を連結し、ＧＡＬ１プロモーター下でＭｐＧＤＨを発現するための組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄを作製した。次に、上記試験例で記述した方法と同様にして、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ（野生型）を鋳型プラスミドとして、表３に示した配列番号の合成ヌクレオチドの組み合わせでＰＣＲ反応を行った。なお、ＭｒｄＧＤＨにおけるＭｐＧＤＨに対応する位置はＷＥＢ上のマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を利用して決定した。これにより、ＭｐＧＤＨにおける３８６位のスレオニン、４６７位のセリンに対応する位置は、ＭｒｄＧＤＨではそれぞれ３８３位のスレオニン、４６４位のスレオニンであった。次いで、増幅されたＤＮＡを含むベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育したコロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＭｒｄＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行うことにより、配列番号５６に記載のアミノ酸配列の３８３位のスレオニンがセリンに、３８３位のスレオニンがアスパラギンに、４６４位のスレオニンがアスパラギン酸に、４６４位のスレオニンがグルタミン酸に置換された組換え体プラスミドであるｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｅをそれぞれ取得した。
　次いで、部位特異的変異を導入した上述の各種改変型ＭｒｄＧＤＨをコードする組換え体プラスミドｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｓ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｎ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｄ、ｐＹＥ２Ｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｅを用いて、試験例（２）の項目に従って、Ｉｎｖ－Ｓｃ株の形質転換及び取得された形質転換株（Ｓｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｓ、Ｓｃ－Ｍｒｄ－Ｔ３８３Ｎ、Ｓｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｄ、Ｓｃ－Ｍｒｄ－Ｔ４６４Ｅ）の培養を行い、培養上清中のＧＤＨ活性を測定した。
　続いて、ＧＤＨ活性が確認された上述の各種変異体の培養上清を用いて、上記の試験例（２）の項目の手順に基づき、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％）」及び「Ｘｙｌ／Ｇｌｃ比率」を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３に示すとおり、配列番号５６の野生型ＭｒｄＧＤＨに対する３８３位、４６４位への部位特異的変異導入、具体的には、Ｔ３８３Ｓ、Ｔ３８３Ｎ、Ｔ４６４Ｄ、Ｔ４６４Ｅの部位特異的変異を導入することにより、ＭｐＧＤＨと同様にキシロースへの反応性が低下することが確認された。
　また、上述のＭｒｄＧＤＨの変異体（Ｔ３８３Ｓ、Ｔ４６４Ｄ）の培養上清を用いて、上記の試験例（３）の項目の手順に基づき、精製した酵素の比活性を測定し「相対比活性」を計算した。その結果、Ｔ３８３Ｓ、Ｔ４６４Ｄの相対比活性はそれぞれ１００％、１２３％であり、これらの変異はＭｒｄＧＤＨにおいても比活性を低下させることなく、キシロースへの反応性を低下させるために非常に有効であることがわかった。
　以上のように、本発明のＦＡＤ－ＧＤＨは、比活性を維持しつつ、Ｄ－グルコースへの基質特異性が十分に高いため、Ｄ－キシロース等のＤ－グルコース以外の糖化合物を多量に含有する条件下で試料中のＤ－グルコースを測定する場合や、酵素濃度の濃い条件下においても、Ｄ－グルコース濃度を正確に測定ができ、例えば、グルコースセンサーへの応用等において、従来のＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合に比べて、より高精度かつ高感度な測定が可能になることが期待される。

Claims (10)

  1. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と７０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４２位のアラニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における８３位のバリンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における１７４位のセリンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３６７位のスレオニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアラニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８６位のスレオニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のロイシンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６０位のフェニルアラニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６１位のスレオニンに対応する位置、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６７位のセリンに対応する位置、および配列番号１記載のアミノ酸配列における４６８位のグリシンに対応する位置よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換を行う前と比較して、Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が低減していることを特徴とする、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  2. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列に対応する位置のアミノ酸が、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４２位のアラニンに対応する位置のアミノ酸がグリシンであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における８３位のバリンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、グリシンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における１７４位のセリンに対応する位置のアミノ酸がプロリン、ロイシンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３６７位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン、アスパラギンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸が、スレオニン、アスパラギン酸、アルギニンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３８６位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がバリン、イソロイシン、グリシン、ロイシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、セリンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における３９１位のロイシンに対応する位置のアミノ酸がバリンであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６０位のフェニルアラニンに対応する位置のアミノ酸がチロシン、ロイシンのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６１位のスレオニンに対応する位置のアミノ酸がメチオニン、フェニルアラニン、グリシン、アスパラギン酸、システインのいずれかであるか、
    　配列番号１記載のアミノ酸配列における４６７位のセリンに対応する位置のアミノ酸がロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸のいずれかであるか、
    　または配列番号１記載のアミノ酸配列における４６８位のグリシンに対応する位置のアミノ酸がスレオニンであるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  3. 　Ｄ－グルコースへの反応性に対するＤ－キシロースへの反応性の割合（Ｘｙｌ／Ｇｌｃ（％））が、前記の置換を導入する前と比較して１０％以上低減していることを特徴とする請求項１又は２記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ。
  4. 　請求項１～３のいずれかに記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼをコードするフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
  5. 　請求項４記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
  6. 　請求項５記載の組換え体ベクターを含む宿主細胞。
  7. 　フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
    　（ａ）請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程、
    　（ｂ）前記宿主細胞中に含まれるフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ
    遺伝子を発現させる工程、
    　（ｃ）前記培養物からフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを単離する工程。
  8. 　請求項１～３に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とするグルコース測定方法。
  9. 　請求項１～３に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースアッセイキット。
  10. 　請求項１～３に記載のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含むグルコースセンサー。
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