JP6155197B2 - グルコース脱水素酵素 - Google Patents
グルコース脱水素酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6155197B2 JP6155197B2 JP2013551486A JP2013551486A JP6155197B2 JP 6155197 B2 JP6155197 B2 JP 6155197B2 JP 2013551486 A JP2013551486 A JP 2013551486A JP 2013551486 A JP2013551486 A JP 2013551486A JP 6155197 B2 JP6155197 B2 JP 6155197B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glucose
- amino acid
- protein
- thr
- gdh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
- C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
- C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Description
本出願は,日本特許出願2011−288830(2011年12月28日出願)に基づく優先権を主張しており,この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素(FAD−GDH)、その製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
本発明においては、Sclerotinia sclerotiorum(スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP_001584680))を組み換え発現させる酵素として発明の対象とした。同酵素のアミノ酸配列は配列番号1に示される。スセロチニア・スレロチオラムのゲノム配列は公開されている。
本発明においては、(Aspergillus niger(アスペルギラス・ナイジャー由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP_001394544))を組み換え発現させる酵素として発明の対象とした。同酵素のアミノ酸配列はは配列番号2に示される。アスペルギラス・ナイジャーのゲノム配列は公開されており、また、同酵素の組み換え生産についてはBiotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011において記載されており、同蛋白質がグルコース脱水素酵素(GDH)であると報告されている。
Ssc-n1
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造(Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP_001584680)、配列番号1に記載)のN末端配列から16残基が除去されており、17番目のSer残基がMetに置換されているSsc蛋白質をさす。
Ssc-n2
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造(Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP_001584680)、配列番号1に記載)のN末端配列から23残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加したSsc蛋白質をさす。
Ssc-n3
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造(Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP_001584680、配列番号1に記載)のN末端配列から23残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加したSsc蛋白質をさす。
Ssc-n4
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造(Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP_001584680,、配列番号1に記載)のN末端配列から23残基を除去し、Met-Ala-Pro-Glu-を付加したSsc蛋白質をさす。
Ang-n1
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造(Aspergillus niger; GenBank XP_001394544、配列番号2に記載)のN末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されているAng蛋白質をさす。
Ang-n2
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造(Aspergillus niger; GenBank XP_001394544、配列番号2に記載)のN末端配列から26残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加したAng蛋白質をさす。
Ang-n3
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造(Aspergillus niger; GenBank XP_001394544、配列番号2に記載)のN末端配列から26残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加したAng蛋白質をさす。
本発明者は、配列番号1で表されるアミノ酸配列のN191K、S529Gの変異、またはN191K/S529Gの二重変異を有する改変型FAD−GDHが、野生型FAD−GDHと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にN191K/S529Gの二重変異を有する改変型FAD−GDHは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、スセロチニア・スレロチオラム由来FAD−GDHのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号1のアミノ酸配列の1番目のMetを1として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「S529G」とは、529番目のSerがGlyに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「/」の記号で表す。
本発明者は、配列番号2で表されるアミノ酸配列のE195K、Q196E,N368K,T522Sの変異、またはE195K/Q196E、あるいはN368K/T522Sの二重変異を有する改変型FAD−GDHが、野生型FAD−GDHと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にE195K/Q196Eの二重変異を有する改変型FAD−GDHは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、アスペルギラス・ナイジャー由来FAD−GDHのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号1のアミノ酸配列の2番目のMetを1として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「E195K」とは、195番目のGluがLysに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「/」の記号で表す。
本発明のFAD−GDHは、当該技術分野においてよく知られる手法を用いて組換え発現により製造することができる。スセロチニア・スレロチオラムおよびアスペルギラス・ナイジャー由来の天然のFAD−GDHをコードする遺伝子の配列は、それぞれ配列番号1および2に記載されるアミノ酸配列に基づいて容易に決定することができる。FAD−GDHをコードする遺伝子は、スセロチニア・スレロチオラムおよびアスペルギラス・ナイジャーのゲノムからクローニングしてもよく、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより製造してもよく、または自動化DNA合成機などを用いて全合成してもよい。遺伝子配列は、用いる宿主生物においてより高い発現レベルが達成されるようにコドンを選択して、適宜設計または改変することが望ましい。特定の宿主生物におけるコドン使用の特徴は、当該技術分野においてよく知られている。
本発明のFAD−GDHは、FADを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。本発明のFAD−GDHのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素によるグルコースの酸化に伴って還元されるFADの量を、酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、PMS(フェナジンメトサルフェート)、DCIP(2,6−ジクロロフェノールインドフェノール)、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。また、本発明のFAD−GDHのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の測定は、例えば、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の吸光度の経時変化を測定することにより行うことができる。
本発明のFAD−GDHのグルコースに対する選択性は、基質として、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
本発明はまた、本発明に従うFAD−GDHを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うFAD−GDHを少なくとも1回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のFAD−GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うFAD−GDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
本発明はまた、本発明に従うFAD−GDHがその表面に固定化されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。これらの電極はカーボン電極であればスクリーンプリント印刷等によって作成される電極、および金、白金電極であればスパッタリングにより作成される電極でもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のFAD−GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素(Ssc)およびアスペルギラス・ナイジャー由来グルコース脱水素酵素(Ang)の組換え遺伝子の調製
スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号1に示される。N末端から16番目まではシグナルペプチドであると推定できる。例えば、シグナル配列切断部位を予測するための方法としてフリーアクセスサーバSignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)を活用できる。このサーバは,The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark において運営されており、以下に記す論文に記載された方法論に基づき、任意のアミノ酸配列に対して、シグナル配列の存在の可能性を検索し、その切断部位を予想する。Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Soren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10:1-6, 1997。SignalP 3.0 Serverを用いる予測にしたがえば、N末端から16番目まではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に17番目のSerをMetに置換した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した(Ssc−n1)。あるいはN末端配列から23残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した(Ssc−n2)。あるいはN末端配列から23残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した(Ssc−n3)。あるいはN末端配列から23残基を除去し、Met-Ala-Pro-Glu-を付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した(Ssc−n4)。
酵素活性の測定
本発明のFAD−GDHのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるDCIP(2,2’−ジクロルジイソプロピルエーテル)の退色を600nmでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10mM リン酸カリウム(pH7.0)+0.6mM PMS+0.06mM DCIP濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、600nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50mMグルコースを用い、1μmolのDCIPを還元させる酵素量を1Unitとし、以下の式より活性値を算出した。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数は16.3mM-1cm-1とした。
ユニット/ml=ΔABS/min×1/16.3×10
ユニット/ml=ΔABS/min×2/38×10
ユニット/mg=Unit/ml/蛋白質mg/ml
A培地を用いるGDHの生産及び粗精製酵素標品の調製
A培地を用いるSsc,Angあるいはこれらの改変型酵素の生産を行った。Ssc,Angあるいはこれらの改変型酵素をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(GDH)を3mL LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、下記A培地(Km 50μg/mL)100mLに前培養液1mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120rpmで振とう培養を行なった。
A培地: LB培地+0.5% グリセロール、0.05% グルコース、0.2% α-ラクトース、25mM (NH4)2SO4、100mM KH2PO4、100mM NaHPO4、1mM MgSO4(ZYP培地;F. William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005)を改変)。
基質特異性の評価
上記実施例3のA培地を用いて得られた酵素について、グルコース、マルトース、キシロースおよびガラクトースを基質として基質特異性を測定した。その結果、基質濃度5mMにおいてグルコースを100%とした時のSsc,Angあるいはこれらの改変型酵素の脱水素酵素活性はマルトース、ガラクトースでは検出できず、キシロースでは10%程度であった。同じ条件でのこれまで報告されているFADGDHではグルコースを100%とした時のキシロースの脱水素酵素活性は21%であった。よってSsc,Angあるいはこれらの改変型酵素は既に報告されているGDHよりキシロースに対する酵素活性が低いことが示された。
Ssc,およびAngへの変異導入
部位特異的変異導入はQuikChange(登録商標)法により行った。QuikChange(登録商標)法では、実施例1で作製した遺伝子をテンプレートとし、変異導入用プライマーによりPCR増幅を行った。続いてPCR後の試料にDpnIを加え37℃、60分間インキュベートすることでテンプレートDNAのみを消化し、この試料を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。LB寒天培地(50μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により目的の変異が導入されていることを確認した。得られたPCR断片をNdeI、HindIII消化(37℃,2時間)し、同制限酵素消化したpET30cとライゲーションし、この試料を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。LB寒天培地(50μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。
S529G,N191X(ただしXはK、S、R、あるいはE)、G69X(ただしXがA、H、N、C、D、F、K、L、M、N、あるいはR)。さらに、Y70FあるいはM,G71S,A73X(ただしXがE、P、M、TまたはC),M112CあるいはL,A113FあるいはS,Y521F,S523P,F525WあるいY、P527X(ただしXはM、I、Q、V、あるいはY)、A182R,S505P,V571C,N46E,N240E,N274E,N275K,N370KあるいはEからなる群より選択される1またはそれ以上の変異を有する多重変異酵素。また、N191K/S529G、N191S/S529G,N191R/S529G,N191E/S529G多重変異酵素。さらにN191K/S529G/G69X(ただしXがA、H、N、C、D、F、K、L、M、N、あるいはRである)、N191K/S529G/Y70F、N191K/S529G/F525Y、N191K/S529G/P527Y、N191K/S529G/P527V、N191K/S529G/P527Y、N191K/S529G/F525Y/P527Y,N191K/S529G/F525Y/P527Y/G69A、N191K/S529G/S505P多重変異酵素。さらに、N191K/S529G/S505P/N46E,N191K/S529G/S505P/N240E,N191K/S529G/S505P/N274E,N191K/S529G/S505P/N275E,N191K/S529G/S505P/N370K,N191K/S529G/S505P/N370E多重変異酵素を構築した。
N368K,T522S,E195K,Q196X(XはE、DまたはRである)、N368K/T522S,E195K/Q196X(XはE、DまたはRである)、N368K/T522S/E195K/Q196E、E195K/Q196E/G73A、E195K/Q196E/S75G、E195K/Q196E/G73A/S75G、E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A、E195K/Q196E/Y524F、E195K/Q196E/P526X(XはG、V、I、F、Y、S、T、C、M、HまたはQである)、E195K/Q196E/G73A/Y524F、E195K/Q196E/G73A/P526X(XはI、F、SまたはMである)、E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F、E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X(XはI、F、Y、SまたはMである)、N368K/T522S、およびN368K/T522S/E195K/Q196E。
変異酵素の生産および活性測定
各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養した。300mlバッフル付きフラスコを用いA培地60mlに対し1%量殖菌し、20℃、28時間、125rpmの条件で振とう培養を行った。培地50mlを集菌後、湿菌体1gに5mlの割合でBugBuster(登録商標)蛋白質抽出試薬(Novagen)を加え懸濁し、ゆるやかに振とうしながら室温で15分間インキュベートを行った。遠心(15Krpm/4℃/20分間)により不溶性分画を除去後、得られた上清を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で4℃で一晩透析した。透析終了後に遠心を行い、その上清を粗精製酵素標品とした。不溶性分画は、懸濁液2ml分の不溶性分画に対し20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を1mの割合で懸濁した。
酵素センサーの作製および評価
Ssc変異酵素Ssc−n2N191K/S529GおよびAng変異酵素Ang−n2E195K/Q196Eを用いて酵素電極を作製した。5ユニットの本発明の改変型FAD−GDHにカーボンペースト20mgを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約40mg充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を1%のグルタルアルデヒドを含む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で30分間処理した後、20mMリジンを含む10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で20分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を10mM MOPS緩衝液(pH7.0)中で室温で1時間以上平衡化させた。電極は4℃で保存した。
Claims (12)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、E195K/Q196X(XはE、DまたはRである)、E195K/Q196E/G73A、E195K/Q196E/S75G、E195K/Q196E/G73A/S75G、E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A、E195K/Q196E/Y524F、E195K/Q196E/P526X(XはG、V、I、F、Y、S、T、C、M、HまたはQである)、E195K/Q196E/G73A/Y524F、E195K/Q196E/G73A/P526X(XはI、F、SまたはMである)、E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F、E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X(XはI、F、Y、SまたはMである)、N368K/T522S、およびN368K/T522S/E195K/Q196Eからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
- E195K/Q196E/G73A/S75G/P526M、
E195K/Q196E/Y524F、
E195K/Q196E/P526G、
E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A、
E195K/Q196E/G73A/S75G、
E195K/Q196E/S75Gおよび
E195K/Q196E/G73Aからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する請求項1に記載の蛋白質。 - 請求項1または2記載の蛋白質において、そのN末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されている蛋白質。
- 請求項1または2記載の蛋白質において、そのN末端配列から26残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-が付加されている蛋白質。
- 請求項1−4のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子。
- 請求項5に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
- 請求項6に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
- 請求項7に記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
- 請求項1−4のいずれかに記載の蛋白質を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法。
- 請求項1−4のいずれかに記載の蛋白質を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
- 請求項1−4のいずれかに記載の蛋白質が電極表面に固定化されている酵素電極。
- 作用極として請求項11に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011288830 | 2011-12-28 | ||
JP2011288830 | 2011-12-28 | ||
PCT/JP2012/008460 WO2013099294A1 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-28 | グルコース脱水素酵素 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013099294A1 JPWO2013099294A1 (ja) | 2015-04-30 |
JP6155197B2 true JP6155197B2 (ja) | 2017-06-28 |
Family
ID=48696822
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013551486A Expired - Fee Related JP6155197B2 (ja) | 2011-12-28 | 2012-12-28 | グルコース脱水素酵素 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9512459B2 (ja) |
EP (1) | EP2799545A4 (ja) |
JP (1) | JP6155197B2 (ja) |
KR (1) | KR101766522B1 (ja) |
WO (1) | WO2013099294A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6702192B2 (ja) * | 2014-09-04 | 2020-05-27 | 東洋紡株式会社 | グルコース脱水素酵素製剤 |
JP6569203B2 (ja) * | 2014-10-06 | 2019-09-04 | 東洋紡株式会社 | グルコースセンサによるグルコース測定方法 |
JP6856344B2 (ja) | 2015-10-29 | 2021-04-07 | アークレイ株式会社 | 変異グルコース脱水素酵素およびその利用 |
CN112851821B (zh) * | 2021-01-12 | 2022-07-05 | 山东省科学院生物研究所 | 一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用 |
CN114958789B (zh) * | 2022-05-23 | 2023-08-29 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种葡萄糖脱氢酶突变体、其制备方法及其应用 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60331477D1 (de) | 2002-12-24 | 2010-04-08 | Ikeda Food Res Co Ltd | Coenzymbindende glukosedehydrogenase |
JP2005270082A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-10-06 | Koji Hayade | グルコース脱水素酵素 |
EP2365073A1 (en) | 2005-03-25 | 2011-09-14 | Ikeda Food Research Co. Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
US7622438B1 (en) | 2005-07-18 | 2009-11-24 | Acologix, Inc. | Protein formulation for promoting hard tissue formation |
JP4179384B2 (ja) | 2006-03-31 | 2008-11-12 | 東洋紡績株式会社 | アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
JP2007289148A (ja) | 2006-03-31 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法 |
JPWO2007139013A1 (ja) | 2006-05-29 | 2009-10-08 | 天野エンザイム株式会社 | フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素 |
JP2008035747A (ja) | 2006-08-03 | 2008-02-21 | Toyobo Co Ltd | ペニシリウム属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ |
JP2008035748A (ja) | 2006-08-03 | 2008-02-21 | Toyobo Co Ltd | アスペルギルス属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ |
WO2009084616A1 (ja) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子 |
JP2010054503A (ja) | 2008-08-01 | 2010-03-11 | Toyobo Co Ltd | グルコース脱水素酵素を用いたグルコースの電気化学測定法 |
JP2010057427A (ja) * | 2008-09-04 | 2010-03-18 | Toyobo Co Ltd | グルコース脱水素酵素およびグルコースの電気化学測定法 |
US8999691B2 (en) | 2010-06-29 | 2015-04-07 | Ultizyme International Ltd. | Glucose dehydrogenase |
-
2012
- 2012-12-28 EP EP12863747.7A patent/EP2799545A4/en not_active Withdrawn
- 2012-12-28 WO PCT/JP2012/008460 patent/WO2013099294A1/ja active Application Filing
- 2012-12-28 JP JP2013551486A patent/JP6155197B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-12-28 KR KR1020147020334A patent/KR101766522B1/ko active IP Right Grant
- 2012-12-28 US US14/369,646 patent/US9512459B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20140356887A1 (en) | 2014-12-04 |
KR20140122713A (ko) | 2014-10-20 |
EP2799545A4 (en) | 2016-01-20 |
WO2013099294A1 (ja) | 2013-07-04 |
JPWO2013099294A1 (ja) | 2015-04-30 |
US9512459B2 (en) | 2016-12-06 |
EP2799545A1 (en) | 2014-11-05 |
KR101766522B1 (ko) | 2017-08-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5873796B2 (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
JP6911066B2 (ja) | フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼの製造方法、およびそれを用いたグルコース測定方法 | |
JP4348563B2 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6184326B2 (ja) | 基質特異性が向上したフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ | |
US7662600B2 (en) | Modified flavin adenine dinucleotide dependent glucose dehydrogenase | |
WO2010053161A1 (ja) | 改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JP6155197B2 (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
WO2017094776A1 (ja) | シトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法 | |
JP5408125B2 (ja) | 糸状菌由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(fadgdh) | |
JPWO2003106668A1 (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
JP2000312588A (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
JPWO2004005499A1 (ja) | グルコース脱水素酵素 | |
JP2005270082A (ja) | グルコース脱水素酵素 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151221 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170516 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170605 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6155197 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |