JP6155197B2 - グルコース脱水素酵素 - Google Patents

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Description

関連する出願
本出願は，日本特許出願２０１１−２８８８３０（２０１１年１２月２８日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
本発明はフラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ）、その製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。これまで、グルコース濃度を測定するために、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）などを用いる酵素法が用いられてきた。しかしながら、ＧＯＤは電子受容体として酸素を必要とするため、被検試料中の溶存酸素の値が測定値に影響を及ぼすという欠点があり、Ｇ６ＰＤＨでは反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならず、検出系が複雑になるという問題点があった。また、ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有しており、電子受容体として酸素を必要としないという利点をもつが、グルコースに対する選択性が低く、マルトースに対しても高い活性を示すことが問題であった。したがって、グルコースセンサーの認識素子として用いることができる新たな酵素が求められている。さらに、キシロース吸収試験の実施中であっても血糖値を正確に測定できるよう、キシロースに対する反応性が低いことが望ましい。
真菌がグルコース脱水素酵素を有することは古くから知られている（例えば、Biochim biophys Acta. 139(2), p.265-276, 1967）。また、アスペルギルス属やペニシリウム属由来のグルコース脱水素酵素およびこれを用いるグルコース濃度の測定は、例えば以下の特許文献に開示されている（特開2007-289148、特開2008-178380、特開2008-035748、特開2008-035747、WO2007/11610、WO2004/058958、WO2006/101239、WO2007/139013）。しかし、真菌由来の酵素はその多くは糖蛋白質であり、機能発現には糖鎖修飾が必要である。特にグルコース酸化酵素などの細胞外分泌酵素においては糖鎖修飾が高度に行われていることから、これらの真菌由来の糖蛋白質を大腸菌を用いて組み換え生産することは極めて困難であった。真菌由来グルコース脱水素酵素も細胞外分泌蛋白質であることから、真菌由来グルコース脱水素酵素を大腸菌で組換え発現させることが難しく、発現できたとしてもその生産性が低いために、培養物単位容量あたりの酵素の収率がきわめて低いことが問題であった（例えばBiotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011）。
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。
特開2007-289148 特開2008-178380 特開2008-035748 特開2008-035747 WO2007/11610 WO2004/058958 WO2006/101239 WO2007/139013
Rolke et al.,Mol Plant Pathol. 5(1), p.17-27, 2004 Biotechnol.Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011
本発明は、従来のグルコース脱水素酵素と比較して、さらに高い生産性を有する新たな酵素を提供することを目的とする。
本発明者は、Sclerotinia sclerotiorum由来グルコース脱水素酵素およびAspergillus niger由来グルコース脱水素酵素の遺伝子を単離し、さらにその特定のアミノ酸残基を置換することにより、大腸菌での組換え発現の生産性が顕著に高まることを見いだした。
すなわち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号１で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｘ（ただしＸはＫ、Ｓ、Ｒ、あるいはＥ）、Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲ），またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。好ましくは、本発明の蛋白質はさらに、Ｙ７０ＦあるいはＭ，Ｇ７１Ｓ，Ａ７３Ｘ（ただしＸがＥ、Ｐ、Ｍ、ＴまたはＣ），Ｍ１１２ＣあるいはＬ，Ａ１１３ＦあるいはＳ，Ｙ５２１Ｆ，Ｓ５２３Ｐ，Ｆ５２５ＷあるいＹ、Ｐ５２７Ｘ（ただしＸはＭ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、あるいはＹ）、Ａ１８２Ｒ，Ｓ５０５Ｐ，Ｖ５７１Ｃ，Ｎ４６Ｅ，Ｎ２４０Ｅ，Ｎ２７４Ｅ，Ｎ２７５Ｋ，Ｎ３７０ＫあるいはＥ、からなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する。特に好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ、Ｎ１９１Ｓ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｒ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｅ／Ｓ５２９Ｇからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲである）、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｙ７０Ｆ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｖ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ／Ｇ６９Ａ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。また好ましくは、本発明の蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ４６Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２４０Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７４Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７５Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｋ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｅからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。
さらに本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から１６残基が除去されており、17番目のSer残基がMetに置換されている、上記のいずれかに記載の蛋白質を提供する。また、本発明は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から23残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-、あるいはMet-Ala-Pro-Glu-が付加されている、上記のいずれかに記載の蛋白質を提供する。
別の観点においては、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース脱水素酵素活性を有する蛋白質において、Ｅ１９５Ｋ、Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、Ｄ、またはＲである）、Ｙ５２４Ｆ、Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｎ３６８Ｋ、Ｔ５２２Ｓ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質を提供する。好ましくは、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、ＤまたはＲである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、ＳまたはＭである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、Ｙ、ＳまたはＭである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ、およびＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ／Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。特に好ましくは、本発明の蛋白質は、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｍ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５ＧおよびＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する。
さらに本発明は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されている、上記いずれに記載の蛋白質を提供する。また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から26残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-が付加されている、上記いずれかに記載の蛋白質を提供する。
また別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、グルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、本発明のグルコース脱水素酵素を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法を提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明のグルコース脱水素酵素が電極表面に固定化されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または挿入されており、かつグルコース酸化酵素活性を示さずかつグルコース脱水素酵素活性を有し、キシロースに対する反応性がグルコースに対する反応性の20％以下であることを特徴とするグルコース脱水素酵素を用いる、溶存酸素の影響を受けないグルコース計測用のバイオセンサーを提供する。
スセロチニア・スレロチオラム由来ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明においては、Sclerotinia sclerotiorum（スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP＿001584680)）を組み換え発現させる酵素として発明の対象とした。同酵素のアミノ酸配列は配列番号１に示される。スセロチニア・スレロチオラムのゲノム配列は公開されている。
アスペルギラス・ナイジャー由来ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明においては、（Aspergillus niger（アスペルギラス・ナイジャー由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP＿001394544)）を組み換え発現させる酵素として発明の対象とした。同酵素のアミノ酸配列はは配列番号２に示される。アスペルギラス・ナイジャーのゲノム配列は公開されており、また、同酵素の組み換え生産についてはBiotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011において記載されており、同蛋白質がグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）であると報告されている。
グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）と異なり、グルコース測定において溶存酸素の影響を受けないため、グルコース計測用のバイオセンサーの認識素子として有用である。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、既知の真菌由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列と約３０〜６０％の配列同一性を有し、例えば、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来グルコース脱水素酵素（GenBank ACW04779.1）とは約５７％のアミノ酸同一性を有する。
本発明においては、SscとはSclerotinia sclerotiorum由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP＿001584680)をさす。本発明ではSscを大腸菌で効率よく組み換え発現させるために、Ssc-n1,Ssc-n2,Ssc-n3,あるいはSsc-n4のアミノ酸配列をコードする遺伝子を作成した。SscのＮ末端配列の違いによる呼称として、本明細書では以下の４種類を用いる。
Ssc-n1
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造（Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP＿001584680)、配列番号１に記載）のＮ末端配列から１６残基が除去されており、17番目のSer残基がMetに置換されているSsc蛋白質をさす。
Ssc-n2
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造（Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP＿001584680)、配列番号１に記載）のＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加したSsc蛋白質をさす。
Ssc-n3
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造（Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP＿001584680、配列番号１に記載）のＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加したSsc蛋白質をさす。
Ssc-n4
ゲノムデータベース記載のSscの一次構造（Sclenotinia sclerotiorum; GenBank XP＿001584680,、配列番号１に記載）のＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Ala-Pro-Glu-を付加したSsc蛋白質をさす。
本発明においては、ＡｎｇとはAspergillus niger由来グルコース脱水素酵素(GenBank XP＿001394544)をさす。本発明ではAngを大腸菌で効率よく組み換え発現させるために、Ang-n1,Ang-n2,あるいはAng-n3のアミノ酸配列をコードする遺伝子を作成した。AngのＮ末端配列の違いによる呼称として、本明細書では以下の3種類を用いる。
Ang-n1
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造（Aspergillus niger; GenBank XP＿001394544、配列番号2に記載）のＮ末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されているAng蛋白質をさす。
Ang-n2
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造（Aspergillus niger; GenBank XP＿001394544、配列番号2に記載）のＮ末端配列から26残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加したAng蛋白質をさす。
Ang-n3
ゲノムデータベース記載のAngの一次構造（Aspergillus niger; GenBank XP＿001394544、配列番号2に記載）のＮ末端配列から26残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加したAng蛋白質をさす。
本明細書において用いる場合、大腸菌における生産性が高い酵素とは、大腸菌を宿主として組換え発現させて、その培養物から酵素を単離したときに、培養液単位容量あたりに得られる酵素の活性（Ｕ/Ｌ）が高いことを特徴とする酵素分子を意味する。生産性が高ければ、より小さい培養装置でより低いコストで、酵素を組換え製造することができる。酵素の生産性には、その酵素が有するアミノ酸配列に基づき、蛋白質としての水溶性の違い、フォ-ルディング効率の違い、さらには単位蛋白質量あたりの酵素活性の違い、酵素の安定性の違いなどが総合的に反映される。さらに、培養液単位容量あたりの宿主における組換え発現の速度、インクルージョンボディを形成のしやすさ、菌体内および精製工程における酵素の安定性などにも当該酵素のアミノ酸配列が関与している。
スセロチニア・スレロチオラム由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明者は、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ１９１Ｋ、Ｓ５２９Ｇの変異、またはＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇの二重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨが、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇの二重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、スセロチニア・スレロチオラム由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号１のアミノ酸配列の１番目のMetを１として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「Ｓ５２９Ｇ」とは、５２９番目のＳｅｒがＧｌｙに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「／」の記号で表す。
さらに、スセロチニア・スレロチオラム由来改変型ＦＡＤＧ−ＧＤＨにおいて、Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｘ（ただしＸはＫ、Ｓ、Ｒ、あるいはＥ）、Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲ），またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質が好ましい。さらに、Ｙ７０ＦあるいはＭ，Ｇ７１Ｓ，Ａ７３Ｘ（ただしＸがＥ、Ｐ、Ｍ、ＴまたはＣ），Ｍ１１２ＣあるいはＬ，Ａ１１３ＦあるいはＳ，Ｙ５２１Ｆ，Ｓ５２３Ｐ，Ｆ５２５ＷあるいＹ、Ｐ５２７Ｘ（ただしＸはＭ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、あるいはＹ）、Ａ１８２Ｒ，Ｓ５０５Ｐ，Ｖ５７１Ｃ，Ｎ４６Ｅ，Ｎ２４０Ｅ，Ｎ２７４Ｅ，Ｎ２７５Ｋ，Ｎ３７０ＫあるいはＥからなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有することが好ましい。これらの多重変異のうち、好ましいものは、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ、Ｎ１９１Ｓ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｒ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｅ／Ｓ５２９Ｇからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに好ましい多重変異としては、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲである）、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｙ７０Ｆ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｖ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ／Ｇ６９Ａ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質である。さらに、好ましい多重変異として、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ４６Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２４０Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７４Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７５Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｋ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｅ，からなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質が挙げられる。
さらにこれらの改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から１６残基が除去されており、17番目のSer残基がMetに置換されている蛋白質、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から23残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-、あるいはMet-Ala-Pro-Glu-が付加されている蛋白質においてこれらの変異および多重変異が施されている蛋白質が好ましい。
また、これらのスセロチニア・スレロチオラム由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、キシロースに対するグルコースの選択性がより高かった。
アスペルギラス・ナイジャー由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨ
本発明者は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＥ１９５Ｋ、Ｑ１９６Ｅ，Ｎ３６８Ｋ，Ｔ５２２Ｓの変異、またはＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ、あるいはＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓの二重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨが、野生型ＦＡＤ−ＧＤＨと比較して大腸菌における高い生産性を示し、特にＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅの二重変異を有する改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、高い生産性とともに高い酵素活性を示すことを見いだした。なお、本明細書においては、アスペルギラス・ナイジャー由来ＦＡＤ−ＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸変異の位置は、配列番号１のアミノ酸配列の２番目のMetを１として番号付けする。また、本明細書においては、アミノ酸の変異ないし置換は、元のアミノ酸残基とアミノ酸の位置と置換後のアミノ酸残基とをこの順序で示すことにより表記し、例えば、「Ｅ１９５Ｋ」とは、１９５番目のＧｌｕがＬｙｓに置き換えられていることを示す。二重またはそれ以上の変異の組み合わせは「／」の記号で表す。
さらに、アスペルギラス・ナイジャー由来改変型ＦＡＤＧ−ＧＤＨにおいて、Ｅ１９５Ｋ、Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、Ｄ、またはＲである）、Ｙ５２４Ｆ、Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｎ３６８Ｋ、Ｔ５２２Ｓ、またはこれらの組み合わせのアミノ酸変異を有する蛋白質が好ましい。好ましい多重変異としては、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、ＤまたはＲである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、ＳまたはＭである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、Ｙ、ＳまたはＭである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ、およびＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ／Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅが挙げられる。特に好ましい多重変異は、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｍ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５ＧおよびＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａである。
さらにこれらの改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されている、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、そのＮ末端配列から26残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-が付加されている蛋白質においてこれらの変異および多重変異が施されている蛋白質が好ましい。
また、これらのアスペルギラス・ナイジャー由来改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼＴＩ株由来のＦＡＤ−ＧＤＨと比較して、キシロースに対するグルコースの選択性がより高かった。
ＦＡＤ−ＧＤＨの製造方法
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、当該技術分野においてよく知られる手法を用いて組換え発現により製造することができる。スセロチニア・スレロチオラムおよびアスペルギラス・ナイジャー由来の天然のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子の配列は、それぞれ配列番号１および２に記載されるアミノ酸配列に基づいて容易に決定することができる。ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、スセロチニア・スレロチオラムおよびアスペルギラス・ナイジャーのゲノムからクローニングしてもよく、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよく、または自動化DNA合成機などを用いて全合成してもよい。遺伝子配列は、用いる宿主生物においてより高い発現レベルが達成されるようにコドンを選択して、適宜設計または改変することが望ましい。特定の宿主生物におけるコドン使用の特徴は、当該技術分野においてよく知られている。
本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子は、天然のＦＡＤ−ＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨにおいては、所望のグルコース脱水素酵素活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部またはそれ以上が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。さらに、そのような改変型ＦＡＤ−ＧＤＨは好ましくは天然のＦＡＤ−ＧＤＨと少なくとも８０％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性は少なくとも８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％であり、さらに好ましくは少なくとも９５％である。
このようにして得た遺伝子を適当な発現のベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。糖鎖が結合したグルコース脱水素酵素の製造が望ましい場合には、真核生物細胞を宿主として用いる。得られた形質転換体を定法にしたがって培養し、細胞または培養液からＦＡＤ−ＧＤＨを回収することができる。
本発明の１つの好ましい態様においては、大腸菌の形質転換体をF. William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005)にZYP brothとして記載されている培地（以下Ａ培地）にて培養する。すなわち、一般的に大腸菌の培地に用いられるLB培地にさらに0.5% グリセロール、0.05% グルコース、0.2% アルファ−ラクトース、２５ｍＭ (NH4)2SO4、１００ｍＭ KH2PO4、１００ｍＭ NaHPO4、1mM MgSO4を加えた培地である。
Ａ培地で、１５℃から２５℃、好ましくは約２０℃で培養して、組換え蛋白質を発現させる。このことにより、慣用のIPTG誘導法を用いた場合よりも、高い生産性を得ることができる。さらに、本発明の変異酵素を、蛋白質のフォールディングを促進することが知られているシャペロンGroELおよびGroESと共発現させることにより、さらに高い生産性を得ることができる。シャペロンとの共発現は、例えば、本発明の変異酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、GroELおよびGroES遺伝子をアラビノース誘導下に発現するベクター（例えば市販のシャペロンベクターpGro7、TaKaRa）とともに大腸菌に導入して培養し、形質転換体がある程度増殖した後にアラビノースを加えてシャペロンの発現を誘導することにより行うことができる。
このようにして得られた組換えＦＡＤ−ＧＤＨは、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、免疫沈殿、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析などの当該技術分野において知られる精製手法の任意のものを用いて精製することができる。
酵素活性の測定方法
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、ＦＡＤを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素によるグルコースの酸化に伴って還元されるＦＡＤの量を、酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）、ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。また、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の測定は、例えば、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の吸光度の経時変化を測定することにより行うことができる。
グルコースに対する選択性
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、マンノース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨはグルコースに対する選択性が高く、特にマルトースおよびガラクトースに対する反応性は測定限界以下であった。したがって、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、被検試料にマルトース等の他の糖が含まれているかその可能性がある場合にも、高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
さらに、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨはキシロースに対して反応性が低いという特徴を有する。このことは、キシロース吸収試験を実施している場合においても血糖値が正確に測定できるという利点を提供する。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従うＦＡＤ−ＧＤＨがその表面に固定化されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。これらの電極はカーボン電極であればスクリーンプリント印刷等によって作成される電極、および金、白金電極であればスパッタリングにより作成される電極でもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＡＤ−ＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、メディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェート、ルテニウム錯体、などを用いることができる。作用電極として本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および必要に応じて参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨは、血糖値のアッセイ装置において用いるのに特に有用である。アッセイ装置は、一般に市販されている血糖値測定用のアンペロメトリーバイオセンサーテストストリップと同様の構造とすることができる。一例として、アッセイ装置は、絶縁体上に装着された２つの電極（作用極および参照極）、試薬ポートおよびサンプル受容部を有する。試薬ポートには、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨおよびメディエーターを入れる。血液サンプルなどのサンプルをサンプル受容部に加えると、サンプル中に含まれるグルコースがＦＡＤ−ＧＤＨと反応して電流が生じ、この電流の値から血中グルコース濃度（血糖値）を求めることができる。電気化学的検出の他、光学センサーを用いてグルコースを測定することもできる。
本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially consisting of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting of）」との表現により表される態様を包含する。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素(Ｓｓｃ)およびアスペルギラス・ナイジャー由来グルコース脱水素酵素(Ａｎｇ)の組換え遺伝子の調製
スセロチニア・スレロチオラム由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列は配列番号１に示される。Ｎ末端から１６番目まではシグナルペプチドであると推定できる。例えば、シグナル配列切断部位を予測するための方法としてフリーアクセスサーバSignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）を活用できる。このサーバは,The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark において運営されており、以下に記す論文に記載された方法論に基づき、任意のアミノ酸配列に対して、シグナル配列の存在の可能性を検索し、その切断部位を予想する。Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Soren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10:1-6, 1997。SignalP 3.0 Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から１６番目まではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に１７番目のＳｅｒをＭｅｔに置換した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ｓｓｃ−ｎ１）。あるいはＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ｓｓｃ−ｎ２）。あるいはＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ｓｓｃ−ｎ３）。あるいはＮ末端配列から23残基を除去し、Met-Ala-Pro-Glu-を付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ｓｓｃ−ｎ４）。
アスペルギラス・ナイジャー由来グルコース脱水素酵素(Ａｎｇ)のアミノ酸配列は配列番号２に示される。Ｎ末端から２０番目までは上記と同様に予測してシグナルペプチドであると推定できる。SignalP 3.0 Serverを用いる予測にしたがえば、Ｎ末端から２０番目まではシグナルペプチドであると推定されるので、開始メチオニンの下流に２１番目のＡｌａをＭｅｔに置換した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ａｎｇ−ｎ１）。あるいはＮ末端配列から26残基を除去し、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asnを付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ａｎｇ−ｎ２）。あるいはＮ末端配列から26残基を除去し、Met-Asn-Thr-Thr-Thr-を付加した配列を有するアミノ酸配列をコードし、大腸菌による組み換え生産に適したコドンをもつ遺伝子配列を設計して、全合成した（Ａｎｇ−ｎ３）。
組換え生産の宿主としては大腸菌BL21(DE3)［F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal(λcI 857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3);Novagen］を用いた。遺伝子発現ベクターとしてはpET30c［kan, lacI;Novagen］を、シャペロン共発現用ベクターとしてはpGro7［GroEL, GroES；TaKaRa］をそれぞれ用いた。
実施例２
酵素活性の測定
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース脱水素酵素活性は、脱水素酵素と基質の反応により還元されるDCIP（２，２’−ジクロルジイソプロピルエーテル）の退色を600nmでの吸光度の経時変化を定量することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10mM リン酸カリウム(pH7.0)＋0.6mM PMS＋0.06mM DCIP濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、600nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50mMグルコースを用い、1μmolのDCIPを還元させる酵素量を1Unitとし、以下の式より活性値を算出した。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数は16.3mM-1cm-1とした。
ユニット/ml＝ΔABS/min×1/16.3×10
本発明のＦＡＤ−ＧＤＨのグルコース酸化活性測定は、脱水素酵素と基質の反応により生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬(TODB)、4-アミノアンチピリンを用いて、生成する色素の546nmにおける吸光度の経時変化を測定することにより行った。反応条件は断りの無い限り以下の条件で行った。酵素溶液を含む反応溶液(10mM リン酸カリウム(pH7.0)＋1.5mM 4-アミノアンチピリン＋1.5mM TODB＋2U/ml ペルオキシダーゼ、濃度は全て終濃度)に基質を加えることで反応を開始し、546nmの吸光度変化を測定した。基質には終濃度50mMグルコースを用い、1分間に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Unitとした。TODBのpH7.0におけるモル吸光定数には38mM-1cm-1を用いた。以下に吸光度変化から活性値を算出する式を示す。
ユニット/ml＝ΔABS／min×2/38×10
ユニット/mg＝Unit／ml／蛋白質mg/ml
実施例３
Ａ培地を用いるＧＤＨの生産及び粗精製酵素標品の調製
Ａ培地を用いるＳｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素の生産を行った。Ｓｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターpET30cを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。得られた形質転換体BL21(DE3)/pET30c(ＧＤＨ)を3mL LB培地に植菌し、一晩37℃で振とう培養した。その後、下記Ａ培地（Km 50μg/mL）100mLに前培養液1mlを植菌し、20℃で坂口フラスコを用いて、120rpmで振とう培養を行なった。
Ａ培地: LB培地＋0.5% グリセロール、0.05% グルコース、0.2% α-ラクトース、２５ｍＭ (NH4)2SO4、１００ｍＭ KH2PO4、１００ｍＭ NaHPO4、1mM MgSO4（ZYP培地；F. William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005）を改変）。
培養中、任意の時間ごとに培養液300μlを回収し、集菌した菌体に60μlのBugBuster Reagentを加え、20分間、4℃で振盪し、菌体を溶菌させた。10mM リン酸カリウムを60μl加え、遠心(16,000×g、4℃、20分間)して上清を回収し、その上清を粗精製酵素標品としてその活性を測定した。
Ｓｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素はGDH活性を有する水溶性酵素として発現された。Ａ培地で培養することにより得られたＳｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素の粗精製酵素標品の酵素活性を測定した結果、グルコース脱水素酵素活性のみが確認され、グルコース酸化酵素活性は検出されなかった。
実施例４
基質特異性の評価
上記実施例３のＡ培地を用いて得られた酵素について、グルコース、マルトース、キシロースおよびガラクトースを基質として基質特異性を測定した。その結果、基質濃度5mMにおいてグルコースを100％とした時のＳｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素の脱水素酵素活性はマルトース、ガラクトースでは検出できず、キシロースでは１０％程度であった。同じ条件でのこれまで報告されているＦＡＤＧＤＨではグルコースを100％とした時のキシロースの脱水素酵素活性は21％であった。よってＳｓｃ，Ａｎｇあるいはこれらの改変型酵素は既に報告されているGDHよりキシロースに対する酵素活性が低いことが示された。
実施例５
Ｓｓｃ，およびＡｎｇへの変異導入
部位特異的変異導入はQuikChange（登録商標）法により行った。QuikChange（登録商標）法では、実施例１で作製した遺伝子をテンプレートとし、変異導入用プライマーによりPCR増幅を行った。続いてPCR後の試料にDpnIを加え37℃、60分間インキュベートすることでテンプレートDNAのみを消化し、この試料を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。LB寒天培地(50μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により目的の変異が導入されていることを確認した。得られたPCR断片をNdeI、HindIII消化(37℃,2時間)し、同制限酵素消化したpET30cとライゲーションし、この試料を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。LB寒天培地(50μg/mlカナマイシン)により一晩培養後、任意に選んだクローンからプラスミドを抽出し、シークエンス解析により変異導入を確認した。
このようにして、以下のＳｓｃ変異酵素を発現する形質転換体を得た：
Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｘ（ただしＸはＫ、Ｓ、Ｒ、あるいはＥ）、Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲ）。さらに、Ｙ７０ＦあるいはＭ，Ｇ７１Ｓ，Ａ７３Ｘ（ただしＸがＥ、Ｐ、Ｍ、ＴまたはＣ），Ｍ１１２ＣあるいはＬ，Ａ１１３ＦあるいはＳ，Ｙ５２１Ｆ，Ｓ５２３Ｐ，Ｆ５２５ＷあるいＹ、Ｐ５２７Ｘ（ただしＸはＭ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、あるいはＹ）、Ａ１８２Ｒ，Ｓ５０５Ｐ，Ｖ５７１Ｃ，Ｎ４６Ｅ，Ｎ２４０Ｅ，Ｎ２７４Ｅ，Ｎ２７５Ｋ，Ｎ３７０ＫあるいはＥからなる群より選択される１またはそれ以上の変異を有する多重変異酵素。また、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ、Ｎ１９１Ｓ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｒ／Ｓ５２９Ｇ，Ｎ１９１Ｅ／Ｓ５２９Ｇ多重変異酵素。さらにＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｇ６９Ｘ（ただしＸがＡ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、あるいはＲである）、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｙ７０Ｆ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｖ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ／Ｐ５２７Ｙ／Ｇ６９Ａ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ多重変異酵素。さらに、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ４６Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２４０Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７４Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ２７５Ｅ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｋ，Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐ／Ｎ３７０Ｅ多重変異酵素を構築した。
また、以下のＡｎｇ変異酵素を発現する形質転換体を得た：
Ｎ３６８Ｋ，Ｔ５２２Ｓ，Ｅ１９５Ｋ，Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、ＤまたはＲである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ，Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、ＤまたはＲである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ／Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、ＳまたはＭである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、Ｙ、ＳまたはＭである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ、およびＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ／Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ。
実施例６
変異酵素の生産および活性測定
各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養した。300mlバッフル付きフラスコを用いＡ培地60mlに対し1％量殖菌し、20℃、28時間、125rpmの条件で振とう培養を行った。培地50mlを集菌後、湿菌体1ｇに5mlの割合でBugBuster（登録商標）蛋白質抽出試薬（Novagen）を加え懸濁し、ゆるやかに振とうしながら室温で15分間インキュベートを行った。遠心（15Krpm/4℃/20分間）により不溶性分画を除去後、得られた上清を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で4℃で一晩透析した。透析終了後に遠心を行い、その上清を粗精製酵素標品とした。不溶性分画は、懸濁液2ml分の不溶性分画に対し20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を1mの割合で懸濁した。
いくつかの多重変異酵素については、小スケールの発現系を用いた。各変異酵素を発現する形質転換体BL21(DE3)を前培養し、Ａ培地3mlに1vol%量を殖菌した。37℃で4時間振とう培養後、20℃で20時間振とう培養を行った。培養後2mlの培地を集菌し400μlのBugBuster（登録商標）を加え懸濁後に室温で15分間振とうした。その後、遠心（15000rmp/4℃/20分間）を行い、得られた上清を粗精製酵素標品とした。
GDH活性測定はDCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を使用し、基質としてグルコース（Glc；1,2,4,10,20,40mM)、キシロース（Xyl；4,40mM)を使用した。
また、熱安定性試験は次のようにして行った。45℃にした20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5) 800μlに上記粗精製酵素標品を200μl 加え混和し、すぐに、予め45℃に加熱しておいた20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5) 100μlに対して100μlを加えた（終濃度10倍希釈）。添加後、45℃で2、5、10、15、20、25、または30分間のインキュベーションを行った。所定時間経過後、速やかに氷中で冷却した。GDH活性測定は、DCIP(0.3ｍM)/PMS(0.6mM)系で緩衝液は20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)を使用し、基質はGlc（40mＭ）を使用した。
Ｓｓｃ変異酵素の評価の結果を表１から表６に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍg）および生産性（Ｕ／Ｌ）は40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；1,2,4,10,20,40mM）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍax）を求めた。
Figure 0006155197
表１は６０ｍｌ培養においてＳｓｃ−ｎ１に対して変異を導入した酵素の評価結果である。Ｎ１９１ＫあるいはＳ，Ｒ，Ｅに置換した変異酵素は天然型であるＮ１９１（３５８Ｕ／Ｌ）に比べ、生産性がＮ１９１Ｋ（７３５Ｕ／Ｌ）で２倍、Ｎ１９１Ｓ（１５１６Ｕ／Ｌ）で４．２倍、Ｎ１９１Ｒ（２２４５Ｕ／Ｌ）で６．３倍、Ｎ１９１Ｅ（１９６７Ｕ／Ｌ）で５．５倍といずれも生産性が向上した。また、Ｓ５２９Ｇ（１６７３Ｕ／Ｌ）で４．７倍と向上した。さらにこの中で、これらの変異を組み合わせることで、Ｓｓｃ−ｎ１ Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ（３４０９Ｕ／Ｌ）と９．５倍の生産性の大幅な向上に成功した。
Figure 0006155197
表２は６０ｍｌ培養におけるＳｓｃ−ｎ２および−ｎ３，−ｎ４を用いた二重変異の評価結果である。Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇの二重変異はＳｓｃ−ｎ２，−ｎ３，−ｎ４のいずれの組み合わせにおいても天然型であるＳｓｃ−ｎ１に比べて生産性が向上しているばかりでなく、Ｓｓｃ−ｎ２，−ｎ３，−ｎ４よりもそれぞれのＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇの二重変異の方が高い生産性を示した。さらにＳｓｃ−ｎ２ Ｓ５２９ＧとＮ１９１Ｓ、Ｒ，あるいはＥと組み合わせた二重変異においてもＳｓｃ−ｎ２および天然型であるＳｓｃ−ｎ１に比べて生産性が向上していた。以上の結果から、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇの二重変異はＳｓｃの生産性向上にきわめて有効な変異であることが示された。
Figure 0006155197
表３は６０ｍｌ培養におけるＳｓｃ−ｎ２を用いたＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９ＧとＧ６９Ａ（あるいはＨあるいはＮ）、あるいはＹ７０Ｆ、あるいはＡ７３ＥあるいはＰ変異との組み合わせを評価した結果である。いずれの変異も天然型であるＳｓｃ−ｎ１に比べて生産性が向上していた。Ａ７３ＥとＧ６９Ｈ以外の組み合わせはいずれもＳｓｃ−ｎ２よりも生産性が向上していた。また、すべての変異酵素においてキシロースとの反応性は同じ濃度のグルコースに対する活性の５〜７％程度であり、野生型よりも大幅にグルコースに対する特異性が高まり、キシロースに対する活性が低下した。
Figure 0006155197
表４は３ｍｌ培養におけるＳｓｃ−ｎ２を用いたＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇと各種変異を組み合わせた多重変異酵素の評価結果である。ここでの基準となる活性は天然型であるＳｓｃ−ｎ１である。いずれの多重変異酵素もこの値を上回り、いずれの変異も生産性の向上に有効であることが示された。また、Ｓｓｃ−ｎ２の６０ｍｌでの評価結果と比較しても、Ａ７３Ｍ，Ｍ１１２ＣおよびＡ１１３Ｆ以外の変異との組み合わせでは、Ｓｓｃ−ｎ２よりも高い生産性が達成され、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇと各種変異の組み合わせが生産性の向上に有効であることが示された。この中でも特に、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｆ５２５Ｙ、Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙ，およびＮ１９１Ｋ／Ｆ５２５Ｙ／Ｓ５２９Ｇ／Ｐ５２７Ｙにおいてきわめて高い生産性が達成された。
Figure 0006155197
表５は６０ｍｌ培養におけるＳｓｃ−ｎ２を用いたＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９ＧとＦ５２５ＷあるいはＹ、Ｐ５２７ＶあるいはＹ変異との多重変異酵素の評価結果である。いずれの多重変異酵素においてもＳｓｃ−ｎ１およびＳｓｃ−ｎ２の生産性を上回り、さらにＮ１９１Ｋ／Ｓ５２５Ｇ／Ｐ５２７ＹはＮ１９１Ｋ／Ｓ５２５Ｇの生産性を上回り優れた変異酵素であることが示された。
Figure 0006155197
表６は３ｍｌ培養におけるＳｓｃ−ｎ２を用いたＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇと各種変異を組み合わせた多重変異酵素の評価結果である。いずれの多重変異酵素もＳｓｃ−ｎ１およびＳｓｃ−ｎ２の生産性を上回り、これらの変異の組み合わせにより生産性が向上することがわかった。この中でも特にＮ１９１Ｋ／Ｓ５２９Ｇ／Ｓ５０５Ｐは優れた生産性を示した。また、熱安定性が向上した変異も含まれていることが明らかとなった。
Ａｎｇ変異酵素の評価の結果を表７および表８に示す。表中の数値は、比活性（Ｕ／ｍg）および生産性（Ｕ／Ｌ）は40mMのグルコースを基質として、同一条件で行った数回分のデータの平均値である。また得られた粗精製酵素を用いて、基質（グルコース；1,2,4,10,20,40mM）濃度と活性との相関を観察し、そこから求められる飽和曲線から得られるミカエルリス・メンテン定数（Ｋｍ値）およびみかけの最大活性（Ｖｍax）を求めた。
Figure 0006155197
表７は６０ｍｌ培養においてＡｎｇ−ｎ１、−ｎ２、および−ｎ３に対して変異を導入した酵素の評価結果である。いずれの変異酵素も天然型であるＡｎｇ−ｎ１に比べて生産性が向上した。Ａｎｇ−ｎ２を用いた変異酵素の評価では、Ｔ５２２ＳおよびＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓの二重変異においてＡｎｇ−ｎ１およびＡｎｇ−ｎ２よりも大幅に生産性が高くなった。さらにＡｎｇ−ｎ１，Ａｎｇ−ｎ２，およびＡｎｇ−ｎ３とＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅとを組み合わせせることにより、大幅に生産性が向上した。また、Ａｎｇ−ｎ２とＥ１９５ＤあるいはＲとをＱ１９６Ｅと組み合わせることでも大幅な生産性の向上が達成できた。このようにこれらの変異およびその組み合わせによって作成された変異酵素は生産性が向上した変異型酵素であることが明らかとなった。
Figure 0006155197
表８は３ｍｌ培養におけるＡｎｇ−ｎ２を用いたＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅと他のアミノ酸変異との組み合わせの評価結果である。これらの変異酵素はＡｎｇ−ｎ２よりも高い生産性を示し、有効な変異であることが明らかとなった。さらにキシロースに対する活性も低下していることが明らかとなった。特に、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３ＡおよびＥ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇでは生産性が向上し、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇは生産性と基質特異性が向上し、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａは基質特異性が向上した。また、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆは生産性とＫｍが向上し、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘは基質特異性が向上した。
これらのうち、特に興味深い変異体について、60mlスケールで培養し、酢酸を用いて酵素を精製して評価した。結果を表９に示す。Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｍでは、生産性、Ｖｍａｘ、および基質特異性が向上していた。
Figure 0006155197
実施例７
酵素センサーの作製および評価
Ｓｓｃ変異酵素Ｓｓｃ−ｎ２Ｎ１９１Ｋ／Ｓ５２９ＧおよびＡｎｇ変異酵素Ａｎｇ−ｎ２Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅを用いて酵素電極を作製した。５ユニットの本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨにカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＦＡＤ−ＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
本発明は、グルコース濃度の測定、特に血糖値の測定に有用である。

Claims (12)

  1. 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｘ（ＸはＥ、ＤまたはＲである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＧ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｍ、ＨまたはＱである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、ＳまたはＭである）、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｙ５２４Ｆ、Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｘ（ＸはＩ、Ｆ、Ｙ、ＳまたはＭである）、Ｎ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ、およびＮ３６８Ｋ／Ｔ５２２Ｓ／Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する蛋白質。
  2. Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ／Ｐ５２６Ｍ、
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｙ５２４Ｆ、
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｐ５２６Ｇ、
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ６９Ｅ／Ｎ７０Ｄ／Ｇ７３Ａ、
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａ／Ｓ７５Ｇ、
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｓ７５Ｇおよび
    Ｅ１９５Ｋ／Ｑ１９６Ｅ／Ｇ７３Ａからなる群より選択されるアミノ酸変異を有する請求項１に記載の蛋白質。
  3. 請求項１または２記載の蛋白質において、そのＮ末端配列から20残基が除去されており、21番目のAla残基がMetに置換されている蛋白質。
  4. 請求項１または２記載の蛋白質において、そのＮ末端配列から26残基が除去されており、Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn、あるいはMet-Asn-Thr-Thr-Thr-が付加されている蛋白質。
  5. 請求項１−４のいずれかに記載の蛋白質をコードする遺伝子。
  6. 請求項５に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
  7. 請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
  8. 請求項７に記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
  9. 請求項１−４のいずれかに記載の蛋白質を用いて試料中のグルコース濃度を測定することを特徴とするグルコース分析方法。
  10. 請求項１−４のいずれかに記載の蛋白質を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
  11. 請求項１−４のいずれかに記載の蛋白質が電極表面に固定化されている酵素電極。
  12. 作用極として請求項１１に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
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