CN112851821B - 一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种融合酶及所述融合酶在纸基生物传感器中的应用。以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)具有良好的稳定性，开发成为便携式葡萄糖传感器具有良好的应用前景。本发明提供了一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型葡萄糖脱氢酶(GDH)基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因构建的GDH‑linker‑CBM融合酶，通过碳水化合物结合模块及连接肽的修饰作用，将其制备成为一种纸基传感器，有效的提高了纸基传感器的酶活力、检测灵敏度及抗干扰能力，具有良好的市场开发前景。
Description
技术领域
本发明属于生物酶基因工程和生物传感技术领域，具体涉及一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型葡萄糖脱氢酶(GDH)基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因构建的GDH-linker-CBM融合酶以及所述融合酶在纸基生物传感器中应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
严格控制生理血糖浓度是糖尿病患者避免危及生命的并发症的唯一途径，因此血糖监测是糖尿病管理的重要组成部分。目前在医疗保健基础设施完善的发达国家，通过血糖自我监测进行血糖控制已成为对公众经济、有效的途径，但在许多资源匮乏的国家，由于缺乏实验室基础设施和训练有素的专业人员，许多致命疾病都无法应付，糖尿病护理通常得不到优先考虑。因此，开发简单、低成本、易于操作、便携式的葡萄糖传感器成为迫切需要。近年来，基于纸张的微流体体系在开发简单、低成本、便携式的葡萄糖检测设备中受到了相当多的关注。其优势包括：(1)氧化还原酶可以通过物理吸附直接固定到纸基质中；(2)许多微流体元件可以集成在具有复杂的3D微流体通道的纸上；(3)多种多样的电极材料可以很容易地通过丝网印刷到纸上，且不需要昂贵的洁净室设施。
用于血糖监测的葡萄糖传感器通常采用葡萄糖氧化酶作为生物识别元件，而葡萄糖氧化酶易受氧分压的影响，在检测静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量差异明显的样本局限性较大。以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)不以氧气为电子受体，且酶活性高、底物专一性强、稳定性好，成为用于开发便携式葡萄糖传感器的研究热点酶分子。但是目前GDH通常是利用物理吸附或共价结合等方式随机固定在电极表面，酶分子活性中心常被隐藏掉或不能正确取向，导致酶活大量损失，便携式葡萄糖传感器检测灵敏度较差。
近年来，利用生物亲和吸附进行酶的固定化引起越来越多的关注，其最大优势是酶分子可与载体材料特异性结合、固定化方向可控以及酶分子构象改变最小。碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules，CBM)是天然碳水化合物活性酶分子，自身没有催化活性，但能对纤维素等多糖具有结合特异性的结构域。随着分子生物学、合成生物学、计算机辅助模拟等技术发展，目前研究者利用融合DNA技术试图获得多种多样CBM与酶分子融合蛋白，以此提高酶分子与底物亲和力、酶分子稳定性或酶活。但利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶，并以纸基作为融合酶分子固定化载体，提高酶电极传感器检测灵敏性的改造策略目前国内外几乎未见报道。
发明内容
针对以上研究现状，发明人认为，提供一种基于葡萄糖脱氢酶的纸基传感器有助于获得一种性能优良的血糖监测设备，是一种前景良好的改造方向。基于该研究思路，本发明利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶，并以纸基作为融合酶分子固定化载体。经测定，该优化后的融合酶不仅能够与纸基载体表现出良好的亲和力，还能够从多个方面提高酶电极传感器的检测灵敏性。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种融合酶，所述融合酶包括葡萄糖脱氢酶(GDH)肽段和碳水化合物结合模块(CBM)肽段，两部分通过柔性肽链连接。
基于上述设计思路，本发明得到了一种融合酶，通过碳水化合物结合模块(CBM)的连接作用，能够有效的增加葡萄糖脱氢酶与纤维素纸基的结合力，有望获得一种检测灵敏性更高的纸基传感器。进一步的，经本发明的验证，上述设计思路获得的融合酶不仅能够获得良好的酶活力稳定性，其制备得到的纸基生物传感器的检测灵敏性也得到了明显的提升，并且生物样品中包括抗坏血酸、尿酸、尿素在内的常见干扰物均不会影响上述传感器的检测效果。基于该研究结果，将上述融合酶应用于纸基生产传感器的开发，有望获得检测性能更加优良的血糖、尿糖等检测产品。
本发明第二方面，提供第一方面所述融合酶在制备葡萄糖检测元件中的应用。
所述葡萄糖检测元件进一步的为纸基生物传感元件。
纸基葡萄糖检测设备具有组装简单，使用便携的优点。传统的葡萄糖氧化酶检测元件受氧分压的影响，对氧气含量差异明显的样本检测具有很大局限性，并且葡萄糖氧化酶通常采用物理吸附或共价结合的方式进行固定，这种固定方式并不稳定，会导致酶分子活性中心受到影响，酶活也随之降低。而本发明提供的上述融合酶，采用黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)作为酶元件，可以排除氧分压对测定结果的影响。另外，上述葡萄糖脱氢酶(GDH)与碳水化合物结合模块结合后与纸基能够获得更好的结合能力，有效的降低了传统葡萄糖氧化酶与载体脱离、酶活降低的概率。
本发明第三方面，提供一种纸基生物传感元件，所述传感元件为固定第一方面所述融合酶的纤维素纸。
本发明第四方面，提供一种血糖检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述融合酶的固定化载体和/或第三方面所述纸基生物传感元件。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
目前利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合酶，并以纸基作为融合酶分子固定化载体，提高酶电极传感器检测灵敏性的改造策略目前国内外几乎未见报道。本发明首次提供了该融合酶的优异性能，基于该融合酶对纤维素结合特异性的发掘，本领域技术人员可以方便获得多种性能更加优良的葡萄糖水平监测产品，这对临床样品中葡萄糖水平监测及糖尿病的防治等均具有重要意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为SDS-PAGE检测异源表达的葡萄糖脱氢酶；
其中(a)为预测的野生型葡萄糖脱氢酶(GDH)结构；
(b),(c),(d)为预测的融合葡萄糖脱氢酶(GDH-NL-CBM2,GDH-(GGGGS)2-CBM2,GDH-(EAAAK)3-CBM2)结构；
(c)条带M:蛋白标准物，20mM咪唑洗脱GDH的SDS-PAGE检测图谱；
(d)10mM咪唑洗脱GDH-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱；
(e)超滤浓缩GDH和GDH-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱。
图2为GDH和GDH-NL-CBM2最适温度、最适pH测定；
(a)为最适pH测定结果图；(b)为最适温度测定结果图。
图3为固定GDH-NL-CBM2的纤维素纸基生物传感器模式图。
图4为GDH和GDH-NL-CBM2/纤维素纸基生物传感器在PBS和不同浓度葡萄糖溶液中的电化学性能检测结果；
(a),(b)分别为GDH和GDH-NL-CBM2循环伏安检测曲线；(c),(d)分别为GDH和GDH-NL-CBM2计时电流检测曲线；(e)为GDH和GDH-NL-CBM2对葡萄糖的线性响应分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，纸基葡萄糖传感器具有便携、开发简便的优势，为了提供一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的葡萄糖脱氢酶的纸基葡萄糖传感器，本发明提出了一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖型葡萄糖脱氢酶(GDH)与碳水化合物结合模块(CBM)结合的融合酶。
本发明第一方面，提供一种融合酶，所述融合酶包括葡萄糖脱氢酶(GDH)肽段和碳水化合物结合模块(CBM)肽段，两部分通过柔性肽链连接。
优选的，所述葡萄糖脱氢酶肽段来源于Aspergillus niger An76。
进一步的，所述GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％及以上相似度、具有同样功能的氨基酸序列也在本发明请求保护的范围之内。
更进一步的，本发明同时还提供SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的编码基因，其序列如SEQ ID NO:2所示；除该基因序列外，由于密码子简并性同样能够翻译得到SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的基因序列，由于能够实现同样的技术效果，也在本发明请求保护范围之内。
优选的，所述碳水化合物结合模块(CBM)肽段选自CBM1、CBM2、CBM3、CBM5、CBM10中的一种。
进一步的，所述碳水化合物结合模块为第2家族CBM(CBM2)，所述CBM2的序列如SEQID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有80％及以上相似度、具有同样功能的氨基酸序列也在本发明请求保护的范围之内。
更进一步的，本发明同时还提供SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的编码基因，其序列如SEQ ID NO:4所示；除该基因序列外，由于密码子简并性同样能够翻译得到SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的基因序列，由于能够实现同样的技术效果，也在本发明请求保护范围之内。
优选的，所述柔性肽链为一种连接肽，所述连接肽选自(EAAAK)3、(GGGGS)2Thermobifida fusca基因组中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域、CBM2结构域的天然linker序列(NL)中的一种或任意几种。
经本发明验证，效果较好的方案中，所述连接肽选自Thermobifida fusca基因组中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的天然linker序列(NL)。经验证，通过增加连接肽使GDH和碳水化合物结合模块(Carbohydrate-BindingModules，CBM)融合表达可以使GDH直接结合到纤维素纸质材料上，并且可以使GDH活性中心不被隐藏，保持高活性，从而保证了葡萄糖传感器的检测灵敏性。
另外的一些实施方式中，本发明同时还提供SEQ ID NO:7所示连接肽(EAAAK)3及对应的编码基因(SEQ ID NO:8)、SEQ ID NO:9所示连接肽(GGGGS)2及其对应的编码基因(SEQ ID NO:10)。
进一步的，所述CBM2结构域的天然连接肽序列如SEQ ID NO:5所示，或与SEQ IDNO:5所示氨基酸序列具有80％及以上相似度、具有同样功能的氨基酸序列也在本发明请求保护的范围之内。
更进一步的，本发明同时还提供SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的编码基因，其序列如SEQ ID NO:6所示；除该基因序列外，由于密码子简并性同样能够翻译得到SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的基因序列，由于能够实现同样的技术效果，也在本发明请求保护范围之内。
在上述优选技术方案的一种具体实施方式中，所述融合酶从N端到C端，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。同时，本发明还提供了上述融合蛋白的编码基因，所述融合蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO:12所示。
另外的一些实施方式中，融合酶GDH-(EAAAK)3-CBM2(氨基酸序列如SEQ ID NO:13)及其对应的编码基因(SEQ ID NO:14)、融合酶GDH-(GGGGS)2-CBM2(氨基酸序列如SEQID NO:15)及其对应的编码基因(SEQ ID NO:16)。
另外，上述融合酶的表达方法可以通过将多核苷酸连接至载体或通过将其整合入宿主细胞基因组而实现。如本文所使用的，术语“载体”指的是包含编码期望蛋白质的核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中表达期望的蛋白质。该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的操纵基因(operator)序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化入适当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因组本身。
进一步的，本发明提供了一种具体的制备方法，即将编码基因转化到毕赤酵母中，然后进行表达纯化的步骤。
在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、卡隆4A和卡隆21A可以用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。本发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。优选地，可以使用pDZ、pPIC9k、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC57、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。
本发明第二方面，提供第一方面所述融合酶在制备葡萄糖检测元件中的应用。
优选的，所述葡萄糖检测元件为纸基生物传感元件。
本发明第三方面，提供一种纸基生物传感元件，所述传感元件为固定第一方面所述融合酶的纤维素纸。
优选的，所述纸基生物传感元件的制备方法如下：将所述融合酶固定到纤维素纸基上、然后在固定有融合酶的纸基上打印电极。
一种具体的实施方式中，所述制备方法如下：将聚二甲基硅氧烷和羊毛脂按混合超声混匀后打印在纳米纤维素纸上形成疏水区，在纳米纤维纸亲水区的工作电极打印区滴加第一方面所述融合酶，室温干燥，再在亲水区分别打印工作电极、对电极和参比电极。
本发明第四方面，提供一种血糖检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述融合酶的固定化载体和/或第三方面所述纸基生物传感元件。
优选的，所述血糖检测试剂盒中，还包括血样采集装置等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1、CBM与GDH的融合表达
选取CBM1、CBM2、CBM3、CBM5、CBM10家族里对纤维素具有结合特异性的CBMs序列，利用结构生物信息学分析工具(SWISS-MODEL、ClustalX、VMD及PyMOl软件)对不同CBMs的氨基酸频率、功能架构序列谱等信息进行统计分析，筛选出Thermobifida fusca中的CBM2用于融合酶构建。
基于CBM2和GDH结构特点分析，从LinkerDB数据库中选择融合酶分子linker序列((GGGGS)2、(EAAAK)3)，同时选择Thermobifida fusca基因组中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的天然linker序列；分别作为连接肽用于GDH融合酶的构建，所述天然linker序列为“LGGDSSGGGPGEPGGPGGPGEPGGPGGPGEPGGPGDGT”，预测的GDH和GDH融合酶结构如图1a-1d所示。
实施例2
以前期研究中获得的连接有密码子优化的Aspergillus niger An76 GDH编码基因的pPIC9k-GDH质粒为模板设计引物获得编码GDH的基因，以质粒pUC57-linker-CBM2 DNA为模板设计引物获得编码linker以及CBM2的基因。按照南京诺唯赞同源重组试剂盒方法获得3种带有不同连接肽的GDH融合酶基因，3种GDH融合酶基因分别以pPIC9K质粒为表达载体，以Pichia pastoris GS115为表达宿主，实现GDH融合酶表达。
(1)GDH融合酶基因克隆：
利用同源重组的原理和Pichia pastoris GS115克隆位点附近序列，分别根据密码子优化的GDH基因序列和pUC57-linker-CBM2基因序列设计六对引物：
以连接有密码子优化的Aspergillus niger An76 GDH编码基因的pPIC9K-GDH质粒为模板，分别以P1、P2，P1’、P2’，P1”、P2”为引物，PCR扩增获得带有不同同源重组臂的GDH基因，以pUC57-linker-CBM2基因为模板，以P3、P4，P3’、P4’，P3”、P4”为引物，PCR扩增获得不同连接肽和CBM2的编码基因。PCR反应在50μL体系(参照
Max Super-FidelityDNA Polymerase)中进行，反应条件为在95℃预变性3min开始循环，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环后，再于72℃延伸5min。分别扩增得到GDH基因和linker-CBM2基因PCR片段，割胶回收(产物纯化试剂盒纯化)。然后利用南京诺唯赞
Ultra One Step Cloning Kit产品将GDH基因和linker-CBM2基因PCR割胶回收片段连接到pPIC9k质粒载体上，反应体系为10μL(1μL线性化载体，2μL GDH基因PCR片段，1.5μLlinker-CBM1基因PCR片段，5μL 2×ClonExpress Mix，0.5μL ddH2O)，吸打混匀后，50℃反应15min，立即置于冰上冷却，即得pPIC9k-GDH-linker-CBM2融合酶基因重组产物。
(3)pPIC9k-GDH-linker-CBM2融合酶基因转化大肠杆菌富集质粒
将pPIC9k-GDH-linker-CBM2融合酶基因重组产物与大肠杆菌DH5α混合，热激90s后涂布于100ug/mL氨苄抗性的LB琼脂培养平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落，然后提取质粒电泳检测，并在-20℃保存质粒。再利用EcoRI与NotI酶切检测目的片段，之后送菌悬液由公司进行测序，将测序正确的质粒以同样方法转化大肠杆菌实现质粒富集。
(4)pPIC9k-GDH-linker-CBM2转化毕赤酵母宿主菌
接种毕赤酵母GS115单菌落到含有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃过夜培养。按1％接种量转接到含有50mL YPD液体培养基的三角瓶，30℃培养过夜，直到OD600＝1.3～1.5；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清液，利用50mL冰浴双蒸水重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清液，利用25mL冰浴双蒸水重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清液，用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清液，用100μL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为150μL；将80μL处理好的感受态细胞和5～20μg经过bglI线性化了的pPIC9k-GDH-linker-CBM2质粒加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀。然后把混合液转移入预先冰浴的转化杯中(0.2cm型)；冰浴装有转化混合液的转化杯5min；按照biorad毕赤酵母电转参数设置电转化仪，并启动电脉冲，脉冲后立即往转化杯中加入1mL冰浴的1M的山梨醇溶液，然后把转化液转入一个新的1.5mL离心管中；30℃静置培养2h。吸取GS115转化液100μL涂布MD平板，30℃培养，直到转化子出现。对转化的MD平板上的单克隆进行菌落PCR验证，确保外源基因的整合。
(5)GDH-linker-CBM2融合酶基因诱导表达
接种筛选出来的毕赤酵母重组子于5mL BMGY液体培养基中，30℃，250rpm，振荡培养过夜；取500μL过夜培养物转接于50mL BMGY液体培养基中，30℃，250rpm，振荡培养至OD600＝2～6(对数生长期，大约16-18h)；3000g，离心5min，弃上清，用BMMY液体培养基重悬细胞至OD600＝1.0，甲醇终浓度为1％)置于500mL三角瓶中，用8层灭菌纱布封口，30℃，250rpm，振荡培养5d；8000rpm离心发酵液获得粗酶液，SDS-PAGE检测粗酶液中有无目的蛋白的表达，并进行酶活检测。结果显示在粗酶液中分别以(GGGGS)2、(EAAAK)3、天然linker序列(NL)为连接肽的融合酶都有表达，但酶活存在差异，其中以NL为连接肽的GDH融合酶发酵液中酶活性最高(2480U/L)，而以(GGGGS)2、(EAAAK)3为连接肽的GDH融合酶发酵液中酶活性分别为1860U/L和1520U/L。
(6)GDH-linker-CBM2融合酶分离纯化
分别将三种连接肽连接的GDH融合酶粗酶液与含有镍的填料混合，于4℃冰箱中转动结合6h。然后用梯度浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白，用3K超滤管、pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤20mM咪唑洗脱下来的蛋白溶液，4900rpm，4℃，直至流下来的缓冲液的pH为5.0，停止超滤，收集超滤获得的GDH融合酶溶液，进行酶活测定和SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示以(GGGGS)2为连接肽的融合酶可能由于6×His纯化标签无法正常暴露，导致未能获得纯化后的融合酶，而以(EAAAK)3为连接肽的融合酶纯化后酶活性(2360U/L)约为以天然linker序列为连接肽的融合酶活性(92000U/L)的1/4，因此以天然linker序列为连接肽构建的GDH融合酶具有明显酶活性优势，并对其性质进行进一步检测分析。SDS-PAGE检测图谱显示，GDH-NL-CBM2的分子量明显大于野生型GDH的分子量(图1e-1g)，说明CBM2已成功融合到GDH酶分子上，并且由于酶分子的糖基化作用，实际表达酶分子的分子量都要高于预测的分子量。测定融合酶的最适pH为6.0、最适反应温度为50℃，与野生型GDH(pH 6.0,37℃)相比，最适pH未发生明显变化，而最适反应温度显著提高，这可能由于CBM2来自于嗜热裂孢菌，具有较高的温度耐受性，融合到酶分子中提高整个酶分子的温度适应性(图2)。
实施例3、GDH和GDH-NL-CBM2融合酶纸基传感元件检测性能对比
将聚二甲基硅氧烷和羊毛脂按10:1的比例混合，60Hz超声混匀30min，打印在制备的孔径为0.1μm的纳米纤维素纸上形成疏水区。在纳米纤维纸亲水区的工作电极打印区滴加实验室前期研究中分离纯化的GDH野生型酶分子(10U，30μL)和25％戊二醛(2μL)、0.5％壳聚糖(8μL)混合溶液以及40μL GDH-NL-CBM2融合酶(10U)，室温干燥4h。再在亲水区分别打印工作电极、对电极和参比电极(图3)。利用电化学工作站三电极体系分别对GDH野生型酶和GDH-NL-CBM2融合酶传感元件性能进行检测。
在电位范围为-0.2V-0.6V时，依次对纸基酶传感元件在pH 7.0的PBS缓冲液和不同浓度的葡萄糖溶液(5mM,10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM，50mM)中进行循环伏安法扫描检测。结果显示两种纸基酶传感元件在PBS缓冲液中都可以检测到一对明显的二茂铁的氧化还原峰，并且氧化峰电位(+0.26V)对应的电流值随着葡萄糖浓度的升高逐渐增加，而还原峰电位(+0.17V)对应的电流值逐渐降低(图4a,4b)，表明两种固定化方式的纸基酶传感元件都具有葡萄糖电催化特性。进一步采用计时电流法对葡萄糖线性检测范围进行了探究，结果显示在葡萄糖浓度为5mM-50mM范围内，两种纸基酶传感元件电流变化都呈线性相关(R2≥0.99)(图4c,4d)，但是与GDH酶传感元件检测性能相比(灵敏度10.75μA.mM- 1.cm-2，检测限2.62mM)，GDH-NL-CBM2融合酶传感元件具有更高的灵敏度(20.23μA.mM-1.cm-2)和更低检测限2.53mM(S/N＝3)(4e)。同时，与以葡萄糖氧化酶为传感元件的传感器相比，以GDH为传感元件的传感器大大提高对抗坏血酸、尿酸、尿素等物质的抗干扰能力。
GDH-NL-CBM2融合酶纸基传感元件与GDH传感元件相比，具有制作简单，检测性能更加优良等特点，因此，在生物传感器领域应用前景广阔。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种融合酶，其特征在于，所述融合酶从N端到C端，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述融合酶的编码基因如SEQ ID NO:12所示。
2.如权利要求1所述融合酶在制备葡萄糖检测元件中的应用；所述葡萄糖检测元件为纸基生物传感元件。
3.一种纸基生物传感元件，其特征在于，所述传感元件为固定权利要求1所述融合酶的纤维素纸。
4.如权利要求3所述的纸基生物传感元件，其特征在于，所述纸基生物传感元件的制备方法如下：将所述融合酶固定到纤维素纸基上、然后在固定有融合酶的纸基上打印电极。
5.如权利要求3所述的纸基生物传感元件，其特征在于，所述制备方法如下：将聚二甲基硅氧烷和羊毛脂按混合超声混匀后打印在纳米纤维素纸上形成疏水区，在纳米纤维纸亲水区的工作电极打印区滴加权利要求1所述融合酶，室温干燥，再在亲水区分别打印工作电极、对电极和参比电极。
6.一种血糖检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述融合酶的固定化载体和/或权利要求4或5所述纸基生物传感元件。
7.如权利要求6所述的血糖检测试剂盒，其特征在于，所述血糖检测试剂盒中，还包括血样采集装置。
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