JP6322279B2 - 新規グルコースオキシダーゼ変異体 - Google Patents
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Description
a)請求項1から15のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
b)1つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、請求項1から15のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
c)配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号14として示す核酸分子の画分、変異体、誘導体または断片である核酸分子;または
d)a)〜c)のいずれかの核酸分子の相補体
からなる群から選択される核酸分子に関する。
本明細書には、酵素グルコースオキシダーゼ(β−d−グルコース:酸素1−オキシドレダクターゼ;EC1.1.2.3.4)の変異体、特に、配列番号1のアミノ酸配列を含む野生型アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)グルコースオキシダーゼの変異体と、食品加工および医薬品製造、ならびに、医学診断分野におけるイムノアッセイおよびバイオセンサーの成分を含む工業的用途において使用可能な前記グルコースオキシダーゼ変異体をコードする核酸分子が開示されている。また、この酵素変異体は、生医学インプラント、例えば、バイオセンサーおよびインシュリンポンプなどに動力を供給可能な小型バイオ燃料電池の製造に使用することができる。
a)M556V、R537K、T30V、I94V
b)M556V、R537K、T30V、I94V、A162T
c)M556V、R537K、R37K、V293I、E310D、T30V、I94V、A162T
d)M556V、R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
e)R37K、V106I、T30V、I94V、A162T。
e)本開示に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
f)1つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている本開示に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
g)配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号14として示す核酸分子の変異体、相同体、誘導体または断片である核酸分子;
h)ストリンジェントな条件下でa)〜c)のいずれかの核酸分子にハイブリダイズすることが可能な核酸分子;
i)ストリンジェントな条件下でa)〜d)のいずれかの核酸分子の相補体にハイブリダイズすることが可能な核酸分子;
j)a)〜e)のいずれかの核酸分子と少なくとも95%の配列同一性を有し、改良されたグルコースオキシダーゼ活性および/もしくは熱安定性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;
k)a)〜e)のいずれかの核酸分子と少なくとも85%の配列同一性を有し、改良されたグルコースオキシダーゼ活性および/もしくは熱安定性を有するポリペプチドをコードする核酸分子;または
I)a)〜g)のいずれかの核酸分子の相補体
からなる群から選択される核酸分子である。
以下の実施例において、本開示の材料および方法は、本方法によって得られる酵素の触媒特性および安定性特性の判定を含め、提供される。これらの実施例は単なる例示目的であり、いかなる方法においても本開示を限定するものとして解釈されるべきでないことを理解されたい。本明細書中に引用されているすべての刊行物、特許および特許出願は、これによってすべての目的のためにその全体を参照により組み入れるものとする。
グルコースオキシダーゼ変異体は、QuickChangeマルチ部位特異的変異誘発キット(Agilent Technologies、USA)および大腸菌(E. coli)XL1OGoldウルトラコンピテント細胞を使用して作成した。部位特異的プライマー(Eurofins MWG Operon、Germany)を合成し、pCTCON2ベクターに収容され、c−mycタグを含んでいるGOx配列の様々な位置でアニールさせた。
プラスミドDNAは、42℃で2.5時間のヒートショックを使用し、サッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisiae)EBY100に(Gietz RD and Schiestl RH, Nature protocols 2007, 2: 31-4に記載されているようにして)導入した。細胞は27℃で48時間160rpmにてYNB−CAAグルコース培地中で培養し、次いで、16〜18時間、同じ条件下でYNB−CAA Gal/Raf培地に移すことによってGOxの発現を誘導した。
サッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisiae)細胞を3日間27℃で増殖させ、YNB−CAA Gal/Raf培地にレプリカによりプレーティングし、さらに1日培養した。分析培地は、2%寒天培地を、333mMのグルコース、1.75U/mLのHRPおよび7mMのABTSを含有する等量のABTS溶液と混合することにより調製した。これを寒天細胞平板上に注いだ。緑色の輪がGOx活性のあるコロニーの周囲で観察された。
サッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisiae)細胞は、(Bulter T et al. In: Directed Enzyme Evolution Screening and Selection Methods, Arnold FH, Georgiou G (eds) Humana Press: Totowa, New Jersey, 2003に記載されているようにして)培養し、5μLのアリコートを、(Zhu Z et al. Biosensors & Bioelectronics 2006, 21:2046-51; Baron AJ et al. J. Biol. Chem. 1994, 269:25095-25105; Sun L et al. Protein Eng Des Select 2001, 14: 699-704に記載されているようにして)以下の変更を含むABTSアッセイ用の新鮮なMTPに移した。
DNAを(Singh MV and Weil PA, Analytical Biochemistry 2002, 307:13-17に記載されているようにして)サッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisiae)変異体から抽出し、GOx配列を、適切な制限酵素(New England Biolabs GmbH、Germany)を使用してpICZalpha A(Invitrogen、Germany)のXhoI/XbaI部位へ移した。コンピテントピキア・パストリス(P. pastoris)KM71H細胞(Invitrogen、Germany)を調製し、形質転換し(Becker DM and Guarente L, Methods Enzymol 1991, 194: 182-187を参照)、それぞれの変異体を示す優良クローンを選択した。
Invitrogen社の推奨に従って4日間発酵させた後、細胞は、Beckman Coulter Avanti J26 XP遠心機(Krefeld Germany)を使用して10分間11,000×gの遠心分離によりペレット化した。上清を収集し、0.22μmのPTFEフィルター(Carl Roth GmbH、Germany)を通して濾過し、10kDa膜を用いるViva Flow50システム(Sartorius AG、Germany)を使用して濾液を5〜10mLに濃縮した。濃縮物を4℃で一晩10mMリン酸緩衝液(pH6.0)に対し透析し、AKTApurifier(GE Healthcare Europe GmbH、Germany)を使用する20mL Fast Flow DEAEセファロースカラム(GE Healthcare Europe GmbH、Germany)に装填した。タンパク質は、30カラム容量に対し10〜250mMのリン酸緩衝液pH6の直線濃度勾配を使用して精製した。本発明者らは、ABTSアッセイを使用して50mLフラクションを試験し、GOx活性の個別のピークを有するものを収集し、10kDa限外濾過カラム(Sartorius AG、Germany)を使用して5mLに濃縮した。
それぞれのGOx変異体の動態特性は、pH5.5および7.4でグルコース濃度が2.5〜260mMの範囲である三連のMTP ABTSアッセイを使用して判定した。それぞれの測定の傾きは線形領域に対して計算し、ミカエリス−メンテン曲線にフィットさせ、KM値およびkcat値が決定できるようにした。Lineweaver−Burk、Eadie−HofsteeおよびHanes−Woolfプロットも構築し、外れ値を同定し除いた。kcat値は、280nmで吸収度を測定することにより決定した(1.5mg/mLのGOxの吸収は、ProtParamを使用して計算した場合、配列に基づき1AUと等しいと考えられる)。
フェロセンメタノール(酸化型)はZhuらによって記載されているようにして調製し、1MのKOHまたは1MのHClを使用して活性測定に使用される対応pHに調整した。精製グルコースオキシダーゼ変異体を使用して、酸素の存在下で、フェロセンメタノールに関するKMおよびkcatを決定した。各測定は、400mMのグルコースを使用し、フェロセンメタノールの濃度を0.22〜10mMの範囲で変えて、MTPにおいて3回繰り返して実施した。測定はpH5.5、7.4および8で実施した。動態は625nmでモニターした。これらの測定を使用し、KMおよびkcatは、最小二乗法による非線形回帰を用いてデータにミカエリス−メンテンモデルをフィットさせることにより決定した。kcatを計算するため、酵素濃度は280nmでの吸光度により測定した(1.5mg/mLのGOxの吸光は、ProtParamを使用して計算した場合、配列に基づく1AUと同等であると考えられる)。外れ値は同定し除いた。フェロセンメタノールに関する動態パラメーターを表5にまとめる。
N,N−ジメチル−p−ニトロソアニリン(NDMA)溶液は、適切な緩衝液(リン酸緩衝液pH7.4または酢酸緩衝液pH5.5)中に化学物質を添加することによって調製した。事前に精製したGOx変異体を用いる動態測定に、この酸化型N,N−ジメチル−p−ニトロソアニリンを使用した。これに関し、GOxの伝達物質との反応速度は、様々な伝達物質濃度に対して決定した。NDMA低下は、飽和グルコース濃度で528nmにてモニターした。KMおよびkcatの決定は、400mMグルコースを使用し、pH5.5および7.4で、NDMA濃度を0.46〜15.33mMの間で変えて行った。測定はすべて、MTPにおいて3回繰り返して実施した。pH5.5および7.4でのNDMAに対して得られた動態データは、ミカエリス−メンテン曲線にフィットさせた。品質管理として、また外れ値を同定し除くために、同様にLineweaver−Burk、Hanes−WoolfおよびEadie−Hofstee曲線をプロットした。NDMAに関する動態データを表6に示す。
GOx変異体の熱安定性は、基質の非存在下、60℃にて50mM酢酸緩衝液(pH5.5)中で酵素をインキュベートし(Bhatti HN, Saleem N, Food Technol. Biotechnol. 47 (3) 331-335, 2009, 47: 331-335を参照)、ABTSアッセイを使用して定期的にアリコートの残存活性を測定することによって決定した。残存活性のパーセンテージを示すA(t)値は、下記に示すように不活性化速度定数(kd)を決定するため、指数方程式において、時間0の100%活性に対し異なる時点でプロットした:
A(t)=e−kd*t
[1]
グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の野生型グルコースオキシダーゼ(配列番号1)のアミノ酸残基T30、I94およびA162に対応する位置での変異と、アミノ酸残基M556、R537、R37、V106、V293またはE310に対応する位置での少なくとも1つまたは複数のさらなる変異とを含み、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の少なくとも最小のパーセンテージ配列同一性および/またはパーセンテージ相同性を有する、ポリペプチド。
[2]
少なくともアミノ酸残基T30、I94、A162に対応する位置での変異と、アミノ酸残基M556、R537、R37、V106、V293またはE310に対応する位置での少なくとも1つまたは複数の変異を含む、[1]に記載のポリペプチド。
[3]
少なくともアミノ酸残基T30、I94、A162に対応する位置での変異と、少なくともアミノ酸残基M556での変異とを含む、[1]から[2]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[4]
少なくともアミノ酸残基M556およびR537に対応する位置での変異を含む、[1]から[3]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[5]
少なくともアミノ酸残基R37に対応する位置での変異を含む、[1]から[4]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[6]
少なくともアミノ酸残基R37およびV106に対応する位置での変異を含む、[1]から[5]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[7]
少なくともアミノ酸残基V106に対応する位置での変異を含む、[1]から[6]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[8]
少なくともアミノ酸残基V293に対応する位置での変異を含む、[1]から[7]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[9]
少なくともアミノ酸残基E310に対応する位置での変異を含む、[1]から[8]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[10]
前記変異がT30V、I94V、R37K、V106I、A162T、V293I、E310、R537KおよびM556Vの群から選択される置換、またはその組み合わせである、[1]から[9]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[11]
a)M556V、R537K、T30V、I94V、A162T
b)M556V、R537K、R37K、V293I、E310D、T30V、I94V、A162T
c)M556V、R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
d)R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
からなる群から選択される置換を含む、[10]に記載のポリペプチド。
[12]
配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[1]から[11]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[13]
配列番号7のアミノ酸配列を含む、[1]から[12]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[14]
配列番号11のアミノ酸配列を含む、[1]から[12]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[15]
前記アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の少なくとも最小のパーセンテージ配列同一性および/またはパーセンテージ相同性を有する、[1]から[14]のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[16]
a)[1]から[15]のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
b)1つもしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、[1]から[15]のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子;
c)配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号14として示す核酸分子の画分、変異体、誘導体または断片である核酸分子;または
d)a)〜c)の核酸分子のいずれかの相補体
からなる群から選択される核酸分子。
[17]
[16]に記載の核酸分子を含むベクター。
[18]
[17]に記載のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトした宿主細胞。
[19]
(a)適切な条件下において適切な培養培地中で[18]に記載の宿主細胞を培養して、グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するステップと;(b)前記生成したポリペプチドを取得するステップと、任意選択で、(c)前記ポリペプチドを処理するステップとを含む、グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法。
[20]
[1]から[15]のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
[21]
食品組成物、医薬組成物、診断用組成物または化粧用組成物である、[20]に記載の組成物。
[22]
[1]から[15]のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドとサンプルを接触させることと、グルコースオキシダーゼによって酸化されたグルコースの量を測定することとを含む、サンプル中のグルコースをアッセイする方法。
[23]
[1]から[15]のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドと電子伝達物質とを含む、サンプル中のグルコースをアッセイするためのデバイス。
[24]
[1]から[15]のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドと電子伝達物質とを含む、サンプル中のグルコースをアッセイするためのキット。
[25]
電極上に固定化されている、[1]から[15]のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを有する酵素電極。
[26]
作用電極として[25]に記載の酵素電極を含む、グルコースをアッセイするための酵素センサー。
[27]
使い捨てのセンサーである、[26]に記載の酵素センサー。
[28]
食品を保護するための、[1]から[15]のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの使用。
[29]
アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の野生型グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列(配列番号1)の番号付けに対して556および537または37に対応する位置でのアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の天然に存在する野生型グルコースオキシダーゼのアミノ酸配列における少なくとも3個のアミノ酸残基の置換と、少なくともアミノ酸残基556および537または37および106に対応する位置での置換とを含み、野生型酵素よりも改善された固有活性を有する、修飾型グルコースオキシダーゼ。
[30]
前記ポリペプチドがアミノ酸残基37、293または310に対応する位置での少なくとも1つまたは複数のさらなる変異を含む、[29]に記載の修飾型グルコースオキシダーゼ。
[31]
前記変異がT30V、I94V、R37K、V106I、A162T、V293I、E310、R537KおよびM556Vの群から選択される置換、またはそれらの組み合わせである、[29]から[30]のいずれか一項に記載の修飾型グルコースオキシダーゼ。
Claims (15)
- アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の野生型グルコースオキシダーゼ(配列番号1)に比べて2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)アッセイ(ABTSアッセイ)における改善された熱安定性および改善された固有活性を同時に有するポリペプチドであって、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の野生型グルコースオキシダーゼ(配列番号1)のアミノ酸残基T30およびI94に対応する位置での変異と、アミノ酸残基A162、M556、R537、R37またはV106に対応する位置での少なくとも1つまたは複数のさらなる変異とを含み、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の少なくとも最小のパーセンテージ配列同一性を有する、ポリペプチド。
- アミノ酸残基V293またはE310に対応する位置での少なくとも1つまたは複数の変異を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記変異がT30V、I94V、R37K、V106I、A162T、V293I、E310D、R537KおよびM556Vの群から選択される置換、またはその組み合わせである、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- a)M556V、R537K、T30V、I94V
b)M556V、R537K、T30V、I94V、A162T
c)M556V、R537K、R37K、V293I、E310D、T30V、I94V、A162T
d)M556V、R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
e)R37K、V106I、T30V、I94V、A162T
からなる群から選択される置換を含む、請求項1に記載のポリペプチド。 - 配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11および配列番号13からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の少なくとも最小のパーセンテージ配列同一性を有する、請求項1から7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項9に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトした宿主細胞。
- (a)適切な条件下において適切な培養培地中で請求項11に記載の宿主細胞を培養して、グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するステップと;(b)前記生成したポリペプチドを取得するステップと、任意選択で、(c)前記ポリペプチドを処理するステップとを含む、グルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成する方法。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物であって、特に、食品組成物、医薬組成物、診断用組成物または化粧用組成物である、組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドとサンプルを接触させることと、グルコースオキシダーゼによって酸化されたグルコースの量を測定することとを含む、サンプル中のグルコースをアッセイする方法。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼ活性を有するポリペプチドと電子伝達物質とを含む、サンプル中のグルコースをアッセイするためのデバイス。
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