JP6312593B2

JP6312593B2 - グルコースオキシダーゼ

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Publication number: JP6312593B2
Application number: JP2014526419A
Authority: JP
Inventors: 勝博小嶋; 一茂森; 早出　広司; 広司早出
Original assignee: Ultizyme International Ltd
Current assignee: Ultizyme International Ltd
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2032-08-24
Also published as: JP2014526894A; EP2748311B1; US8999140B2; EP2748311A2; ES2556605T3; WO2013026575A3; PL2748311T3; WO2013026575A2; US20140248645A1

Description

本発明は、グルコースを測定するためのキットおよびセンサーにおいて用いられるグルコースオキシダーゼに関する。より具体的には、本発明は、オキシダーゼ活性が低減された変異グルコースオキシダーゼに関する。

血中のグルコース濃度は、糖尿病を診断するための臨床検査、および糖尿病を患う患者の血糖コントロールにおいて極めて重要である。血中のグルコース濃度は、グルコースに対して特異性を有する酵素を用いて測定することができる。

グルコースオキシダーゼは、多様な種類の菌株から単離されており、このような酵素を用いてグルコースを解析しうることが示唆されている。

グルコースオキシダーゼとは、ＦＡＤ依存性酵素であって、ＦＡＤの還元形態（ＦＡＤＨ２）を生成させることにより、グルコースを酸化させてグルコノラクトンを生成させる反応を触媒する酵素である。ＦＡＤＨ２は、電子を電子受容体へと伝達し、その酸化形態へと転換される。酸素の存在下において、ＦＡＤＨ２は、電子を、人工的な電子受容体（また、伝達体または電子伝達体とも称する）ではなく、酸素分子へと優先的に伝達する。したがって、グルコースを、伝達体を伴うグルコースオキシダーゼによりアッセイする場合、アッセイの結果は、反応系内の溶存酸素レベルにより大きく影響されることになる。人工的な電子受容体を使用するポイントオブケア検査デバイスによる血液試料の臨床検査では、このような欠点が特に顕著となろう。人工的な電子伝達体を使用する酵素センサーストリップに用いられる酵素は、酸素に対する活性が低いことが所望される。

したがって、本発明の目的は、その活性が、溶存酸素レベルにより影響される程度が低い酵素、特に、グルコースオキシダーゼを提供することである。

本出願の発明者らは、その活性が、溶存酸素レベルにより影響される程度が低い酵素、特に、グルコースオキシダーゼを提供することができた。より具体的には、これは、その野生型形態では主にオキシダーゼ活性を示す酵素のオキシダーゼ活性を低減し、好ましくは、同時に、酵素のデヒドロゲナーゼ活性を増大させることにより達成される。以下でより詳細に記載される通り、これは、野生型酵素を突然変異させることにより達成される。

本発明者らは、グルコースオキシダーゼの多様な突然変異体を調製し、驚くべきことに、特定の種類の突然変異体が、デヒドロゲナーゼ活性、特に、色素媒介のデヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ活性の低減を呈示することを見出した。

本発明は、独立請求項１において定義される変異グルコースオキシダーゼを提供する。変異グルコースオキシダーゼの好ましい実施形態は、請求項１に従属する請求項の対象物である。

特に、本発明は、
（ａ）アミノ酸残基Ｔｈｒを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５３位に対応する位置；
（ｂ）アミノ酸残基Ｉｌｅを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１１６位に対応する位置；
（ｃ）アミノ酸残基ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３２位に対応する位置；
（ｄ）アミノ酸残基Ｔｈｒを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３４位に対応する位置；
（ｅ）アミノ酸残基ＩｌｅまたはＰｈｅを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２３７位に対応する位置；
（ｆ）アミノ酸残基ＶａｌまたはＡｌａを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７１位に対応する位置；
（ｇ）アミノ酸残基Ｐｈｅを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７３位に対応する位置；
（ｈ）アミノ酸残基Ｇｌｕを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４３４位に対応する位置；
（ｉ）アミノ酸残基Ｐｈｅを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４３６位に対応する位置；
（ｊ）アミノ酸残基Ｔｒｐを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４８位に対応する位置；および
（ｋ）アミノ酸残基Ｔｒｐを別のアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５３７位に対応する位置
から選択される１または複数の位置において改変された変異グルコースオキシダーゼに関する。

より具体的には、本発明の変異グルコースオキシダーゼが、
（ａ）アミノ酸残基ＴｈｒをＳｅｒで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５３位に対応する位置；
（ｂ）アミノ酸残基ＩｌｅをＶａｌで置換することにより配列番号１に示されるアミノ酸配列の１１６位に対応する位置；
（ｃ）アミノ酸残基ＳｅｒをＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＣｙｓもしくはＩｌｅで置換することによる、またはアミノ酸残基ＴｈｒをＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、もしくはＣｙｓで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３２位に対応する位置；
（ｄ）アミノ酸残基ＴｈｒをＡｌａ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３４位に対応する位置；
（ｅ）アミノ酸残基ＩｌｅをＶａｌで置換することによる、またはアミノ酸残基ＰｈｅをＩｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、もしくはＣｙｓで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２３７位に対応する位置；
（ｆ）アミノ酸残基ＶａｌをＴｈｒ、Ａｌａで置換することによる、またはアミノ酸残基ＡｌａをＶａｌで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７１位に対応する位置；
（ｇ）アミノ酸残基ＰｈｅをＬｅｕ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、またはＴｒｐで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７３位に対応する位置；
（ｈ）アミノ酸残基ＧｌｕをＧｌｎで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４３４位に対応する位置；
（ｉ）アミノ酸残基ＰｈｅをＴｒｐ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＧｌｕまたはＩｌｅで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４３６位に対応する位置；
（ｊ）アミノ酸残基ＴｒｐをＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＴｙｒで置換する
ことによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４４８位に対応する位置；および
（ｋ）アミノ酸残基ＴｒｐをＡｌａで置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５３７位に対応する位置から選択される１または複数の位置において改変されている。

好ましい実施形態では、本発明の変異グルコースオキシダーゼは、オキシダーゼ活性が野生型のグルコースオキシダーゼと比較して低減されており、デヒドロゲナーゼ活性が野生型のグルコースオキシダーゼと比較して増大していることが好ましい。本発明の変異グルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のグルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性の３０％以下であることが好ましく、また、デヒドロゲナーゼ活性が、野生型のグルコースオキシダーゼの５０％以上であることも好ましい。また、本発明の変異グルコースオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性が、野生型のグルコースオキシダーゼと比較して増大していることも好ましい。

別の態様では、本発明は、本発明の変異グルコースオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、試料中のグルコースをアッセイするための方法であって、試料を本発明のグルコースオキシダーゼと接触させるステップと、グルコースオキシダーゼにより酸化されたグルコースの量を測定するステップとを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、試料中のグルコースをアッセイするためのデバイスであって、本発明のグルコースオキシダーゼと、好ましくは電子伝達体とを含むデバイスを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、試料中のグルコースをアッセイするためのキットであって、本発明のグルコースオキシダーゼと、好ましくは電子伝達体とを含むキットを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明のグルコースオキシダーゼを電極上に固定化した酵素電極を提供する。

別の態様では、本発明は、グルコースをアッセイするための酵素センサーであって、本発明の酵素電極を作用電極として含む酵素センサーを提供する。

グルコース基質濃度を１００ｍＭとするときの、多様な変異グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）突然変異体のオキシダーゼ（Ｏｘ）活性およびデヒドロゲナーゼ（Ｄｈ）活性の、野生型の活性に対する比を示す図である。図１および表における「ｎ．ｄ．」とは、「検出なし」を意味する。

本明細書で用いられるタンパク質の「突然変異体」という用語は、そのタンパク質における、指示される（１または複数の）位置のアミノ酸残基のうちの１または複数において
置換を含有する変異体タンパク質を指す。突然変異体という用語はまた、このような突然変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドについても用いられる。

本明細書で用いられる「〜に対応する位置」という語句は、クエリーアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置であって、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＡｌｉｇｎＸソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である；Ｌｕ，Ｇ．およびＭｏｒｉｙａｍａ，Ｅ．Ｎ．（２００４年）、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ、ａｂａｌａｎｃｅｄａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｕｉｔｅ、ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ、５、３７８〜８８を参照されたい）をデフォルトのパラメータで用いて、基準アミノ酸配列内のアミノ酸残基とアラインされるアミノ酸残基の位置を意味する。したがって、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列のＹ位に対応する位置におけるアミノ酸（ＡＡ）残基」とは、クエリーアミノ酸配列を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＡｌｉｇｎＸをデフォルトのパラメータで用いて、配列番号Ｘとアラインされる場合に、配列番号ＸのＡＡＹとアラインされるクエリーアミノ酸配列内のＡＡ残基を意味する。配列番号ＸのＡＡＹ自体もまたこの用語に包含されることに注意されたい。

本発明の変異グルコースオキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ活性の減少を呈示する。

本明細書で用いられる「オキシダーゼ活性」とは、グルコースオキシダーゼの酵素活性であって、酸素を電子受容体として使用することにより、グルコースの酸化を触媒して、グルコノラクトンを生成させる酵素活性である。オキシダーゼ活性は、生成したＨ２Ｏ２の量を、当技術分野で知られている任意の方法で、例えば、４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）など、Ｈ２Ｏ２を検出するための試薬を介して、またはＰｔ電極を介して測定することにより、アッセイすることができる。本明細書の相対活性または定量的活性の文脈で用いられるオキシダーゼ活性はとりわけ、単位時間当たりに酸化した基質（グルコース）のモル量であって、１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０、１．５ｍＭのＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭの４−アミノアンチ−ピリン（４ＡＡ）中、２５℃で生成したＨ２Ｏ２の量により測定されるモル量であると定義される。キノンイミン色素の形成は、分光光度法により、５４６ｎｍで測定することができる。

本明細書で用いられる、「デヒドロゲナーゼ活性」とは、グルコースオキシダーゼの酵素活性であって、酸素以外の電子伝達体を電子受容体として使用することにより、グルコースの酸化を触媒して、グルコノラクトンを生成させる酵素活性である。デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート／２，６−ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ−酢酸−１−（３−カルボキシ−プロポキシ）−５−エチル−フェナジニウム、ＮＡＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリンヒドロクロリド、ＮＡＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシ−エチル−４−ニトロソアニリン）、およびＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンを用いて、伝達体へと伝達される電子の量を測定することにより、アッセイすることができる。

本明細書の相対活性または定量的活性の文脈で用いられるデヒドロゲナーゼ活性はとりわけ、単位時間当たりに酸化した基質（グルコース）のモル量であって、１０ｍＭのＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭのＤＣＩＰ、および６ｍＭのメトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）中、２５℃で伝達体へと伝達される電子の量により測定されるモル量であると定義される。

本発明の変異グルコースオキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ活性が野生型のグルコースオキシダーゼと比較して低減されている。

本発明の変異グルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のグルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性の５０％以下であることが好ましい。本発明の変異グルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のグルコースオキシダーゼのオキシダーゼ活性の４０％以下、より好ましくは３０％以下、なおより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１５％以下であることがより好ましい。また、本発明の変異グルコースオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性が、野生型のグルコースオキシダーゼの５０％以上であることも好ましい。本発明の変異グルコースオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性は、野生型のグルコースオキシダーゼの７０％以上、より好ましくは９０％以上、なおより好ましくは１００％以上、最も好ましくは１００％を超えることがより好ましい。

野生型のグルコースオキシダーゼでは、オキシダーゼ活性が、デヒドロゲナーゼ活性の約３〜４倍である。溶存酸素がアッセイ系内に存在する場合、基質の酸化により生成する電子は、酸素へと優先的に伝達されることになる。したがって、電子伝達体の存在下で測定される酵素活性は、溶存酸素濃度により大きく影響されることになる。これに対し、本発明の変異グルコースオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性の比は、約２．０以上、好ましくは、４．０以上、より好ましくは１０以上である。デヒドロゲナーゼ活性がオキシダーゼ活性を超えるので、本発明のグルコースオキシダーゼの酵素活性は、溶存酸素濃度により影響される程度が小さく、これは、血液試料による臨床診断においてグルコースオキシダーゼを使用するのに有利である。

本出願におけるアミノ酸配列の番号付けは、最初のＭｅｔで始まり、特許請求される変異グルコースオキシダーゼは、シグナルペプチドを有する場合もあり、有さない場合もあることを理解されたい。

別の態様では、本発明は、本発明の変異グルコースオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。グルコースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公開されているデータベースから容易に得ることができる。野生型のグルコースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、各生物のゲノムから、ＰＣＲまたは他の知られた技法を用いてクローニングすることができる。突然変異は、部位指向突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、または当技術分野でよく知られている他の任意の技法により導入することができる。突然変異させるアミノ酸残基は、当技術分野で入手可能な配列アライメント用のソフトウェアのうちのいずれかを用いて同定することができる。代替的に、変異グルコースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより調製することもでき、全体を合成することもできる。

突然変異させたグルコースオキシダーゼは、突然変異体遺伝子を適切な発現ベクターへと挿入し、ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な宿主細胞へと導入することにより調製することができる。形質転換細胞を培養し、形質転換細胞内で発現するグルコースオキシダーゼは、細胞または培養培地から回収することができる。代替的に、組換えグルコースオキシダーゼは、細胞から調製される封入体から回収し、リフォールディングさせることもできる。

このようにして得られた組換えグルコースオキシダーゼは、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析沈殿、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、および透析を含めた、当技術分野で知られている精製法のうちのいずれかにより精製することができる。

したがって、本発明はまた、変異グルコースオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターで形質転換された宿主細胞、および形質転換細胞を培養し、変異グルコースオキシダーゼを培養物から回収および精製することにより、本発明の変異グルコースオキシダーゼを調製するための方法も包含する。

本発明はまた、試料中のグルコースをアッセイする方法も包含する。方法は、試料を本発明のグルコースオキシダーゼと接触させるステップと、グルコースオキシダーゼにより酸化されたグルコースの量を測定するステップとを含む。

別の態様では、本発明は、本発明のグルコースオキシダーゼと電子伝達体とを含む試料中のグルコースをアッセイするためのデバイスを提供する。

アッセイデバイスは、血中グルコースレベルをモニタリングするための、従来の市販の電流測定バイオセンサーによる検査用ストリップのうちのいずれかと同様の構造を有しうる。このようなデバイスの一例は、絶縁基板上に配置された２枚の電極（作用電極および基準電極または対電極）、試薬ポート、および試料レシーバーを有する。試薬ポートは、本発明の突然変異させたグルコースオキシダーゼと伝達体とを含有する。血液試料などの試料を、試料レシーバーへと添加すると、試料中に含有されるグルコースが、グルコースオキシダーゼと反応して、電流を発生させ、これにより、試料中のグルコースの量が示される。酵素基質を決定するのに適する典型的な電気化学的センサーの例は、例えば、ＷＯ２００４／１１３９００およびＵＳ５，９９７，８１７から知られる。電気化学的センサーに対する代替法としては、光学的検出法を用いることもできる。このような光学デバイスは、酵素、電子伝達体、および指示薬を含む試薬系内で生じる色の変化に基づくものが典型的である。色の変化は、蛍光、吸収、または発光の測定値を用いて定量化することができる。酵素基質を決定するのに適する典型的な光学デバイスの例は、例えば、ＵＳ７，００８，７９９、ＵＳ６，０３６，９１９、およびＵＳ５，３３４，５０８から知られる。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のグルコースオキシダーゼと電子伝達体とを含む試料中のグルコースをアッセイするためのキットを提供する。

グルコースを測定するためのキットは、本発明の酵素を用いて構築することができる。本発明のグルコースオキシダーゼに加えて、キットは、測定に必要な緩衝液、適切な伝達体、および、必要な場合は、ペルオキシダーゼなどの酵素、検量線を作成するためのグルコースの標準溶液、および使用のための指示書も含有する。本発明のグルコースオキシダーゼは、多様な形態で、例えば、凍結乾燥試薬として、または適切な保存液中の溶液として提供することができる。

試料中のグルコースの濃度は、酵素反応により発生した電子の量を測定することにより、決定することができる。当技術分野では、炭素電極、金属電極、および白金電極を含めた多様なセンサー系が知られている。本発明の突然変異させたグルコースオキシダーゼは、電極上に固定化される。固定化するための手段の例には、架橋形成、高分子マトリックスへの封入、透析膜によるコーティング、光学的架橋形成ポリマー、導電性ポリマー、酸
化還元ポリマー、およびこれらの任意の組合せが含まれる。

炭素電極を用いる電流測定系内で測定を実行する場合は、酵素の固定化を施された金電極または白金電極を作用電極として、対電極（白金電極など）および基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に用いる。電極は、伝達体を含有する緩衝液へと挿入し、所定の温度に保つ。所定の電圧を作用電極へと印加し、次いで、試料を添加し、電流値の増大を測定する。アッセイにおいて用いられる伝達体の例には、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、ルテニウム誘導体、フェナジンメトスルフェートなどが含まれる。一般にまた、１枚の作用電極と１枚の対電極または擬似基準電極とを伴う、いわゆる二電極系を用いることも可能である。

さらに、グルコースは、炭素電極、金電極、または白金電極を用いる電流測定系内に固定化された電子伝達体を用いてもアッセイすることができる。酵素を、高分子マトリックス中のフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトスルフェートなどの電子伝達体と共に、吸着または共有結合により電極上に固定化して作用電極を調製する。作用電極を、対電極（白金電極など）および基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、緩衝液へと挿入し、所定の温度に保つ。所定の電圧を作用電極へと印加し、次いで、試料を添加し、電流値の増大を測定する。

本明細書で引用される全ての特許および参考文献の内容は、全体において、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を、以下の実施例により詳細に例示するが、本発明は、それらの実施例に限定されないものとする。

ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓのＧＯｘを発現させるプラスミド
ｐＥＴ２２ｇｏｘＷＴを、ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓのＧＯｘ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤＯ１４９３）を発現させるプラスミドとして用いた。このプラスミドは、ベクターｐＥＴ２２のＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩクローニング部位内に挿入されている、シグナル配列を除いた、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓに由来するＧＯｘの構造遺伝子の領域を含有するＤＮＡ断片を有する。このプラスミド内のＧＯｘ遺伝子は、Ｔ７プロモーターにより制御される。ｐＥＴ２２ｇｏｘＷＴは、アンピシリン耐性遺伝子を含有する。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓに由来するＧＯｘの構造遺伝子の突然変異誘発
（１）残基１３２および３７３の突然変異誘発
実施例１で得られたｐＥＴ２２ｇｏｘＷＴ内に含有されている、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓに由来するＧＯｘの構造遺伝子に、この遺伝子によりコードされるＧＯｘの残基１３２におけるセリンおよび残基３７３におけるフェニルアラニンを他のアミノ酸残基で置換するように突然変異誘発した。

具体的には、実施例１で記載したプラスミドｐＥＴ２２ｇｏｘＷＴ内に含有されているＧＯｘの構造遺伝子の残基１３２におけるセリンのコドン（ＴＣＣ）および残基３７３におけるフェニルアラニンのコドン（ＴＴＣ）を、市販されている部位指向突然変異誘発キット（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒｐ．、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ）を用いて、他のアミノ酸のコド
ンで置換した。

アミノ酸残基の置換において用いられるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列を、以下の表に示す。

突然変異を表す表記法では、番号が、ＧＯｘのシグナル配列を含有するアミノ酸配列における位置を表し、番号の前に記載されるアルファベットが、アミノ酸置換の前のアミノ酸残基を表し、番号の後に記載されるアルファベットが、アミノ酸置換の後のアミノ酸残基を表す。例えば、Ｓ１３２Ａは、残基１３２におけるセリンのアラニンへの置換を表す。

ＰＣＲ反応では、以下に示される組成の反応溶液を、９５℃で３０秒間にわたる反応、次いで、各々が９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、および６８℃で８分間を伴う１５回の反復サイクルの後、６８℃で３０分間にわたる反応下に置き、次いで、４℃に保った。

反応溶液の組成
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）２μＬ
１０倍濃度の反応緩衝液５μＬ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μＬ）１．２５μＬ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μＬ）１．２５μＬ
ｄＮＴＰ１μＬ
蒸留水３８．５μＬ
ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ
合計５０μＬ

ＰＣＲ反応の後、０．５μＬのＤｐｎＩを、反応溶液へと添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートして、鋳型プラスミドを分解した。

ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）コンピテント細胞を、得られた反応溶液で形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地（１％のＢａｃｔｏトリプトン、０．５％の酵母抽出物、１％の塩化ナトリウム、１．５％の寒天）上で増殖させたコロニーから、プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定して、対象の突然変異がＧＯｘの構造遺伝子内に導入されていることを確認した。

突然変異が導入されていることが確認されたプラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化させて、突然変異誘発されたＧＯｘの構造遺伝子を切り出し、これを、ｐＥＴ２２ベクターへと挿入した。ＤＨ５αをこのプラスミドで形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出して、ＧＯｘの突然変異体の発現プラスミドを得た。

突然変異体ＧＯｘの酵素活性の解析
実施例２で得た突然変異体ＧＯｘの発現プラスミドを用いて、突然変異体ＧＯｘを生成させ、その酵素活性について研究した。

（１）培養
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株を、実施例１で調製した野生型ＧＯｘ発現プラスミド、または実施例２で調製した突然変異体ＧＯｘの発現プラスミドで形質転換した。これらの形質転換細胞を、Ｌ字型管を用いて、３ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する）中、３７℃で１２時間にわたり、個別に振とう培養した。これらの培養液の各々１ｍＬずつを、１００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する）を含有する、バッフル付きの５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコへと接種し、３７℃で旋回培養した。ＯＤ６００が約０．６に達した時点において、これに０．５ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した後、２０℃で２４時間にわたり培養した。

（２）封入体画分の調製
このようにして培養された培養液から、細菌細胞を回収し、洗浄した。次いで、得られた湿潤細菌細胞を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に懸濁させ、超音波処理した。次いで、ホモジネートを、１７４００×ｇ、４℃で２０分間にわたり遠心分離し、沈殿物を不溶性画分として用いた。

得られた不溶性画分を、洗浄液（１）（リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８＋１００ｍＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＥＤＴＡ＋１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で洗浄し、１００００×ｇ、４℃で１０分間にわたり遠心分離した。沈殿物を、洗浄液（２）（リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８＋１００ｍＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、１００００×ｇ、４℃で１０分間にわたり遠心分離した。沈殿物を、洗浄液（３）（２Ｍの尿素＋２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８）でさらに洗浄し、１００００×ｇ、４℃で１０分間にわたり遠心分離した。封入体を沈殿物として回収した。この封入体の大部分は、ＧＯｘである。

（３）封入体のリフォールディング
このようにして調製された封入体を、可溶化緩衝液（８Ｍの尿素＋３０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）＋２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８）中に懸濁させ、この懸濁液を、可溶化封入体画分として用いた。可溶化封入体を、可溶化緩衝液で、０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで希釈し、１００倍容量以上のリフォールディング緩衝液（１ｍＭのグルタチオン（還元形態）＋１ｍＭのグルタチオン（酸化形態）＋０．０５ｍＭのフラビンアデニンジヌクレオチド＋１０％の（ｗ／ｖ）グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）＋２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８）に対して、２４時間にわたり透析した。次いで、結果として得られた透析溶液を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して、１２時間にわたりさらに透析し、１７４００×ｇ、４℃で３分間にわたり遠心分離し、タンパク質凝集物を除去した。上清を、ＧＯｘ試料として用いて、野生型ＧＯｘおよび突然変異体ＧＯｘの各々について、２５℃におけるグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）活性およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性を決定した。

（４）ＧＯｘ活性の決定
基質との反応を介して生成させた過酸化水素から、ペルオキシダーゼ、トリンダー試薬（ＴＯＤＢ）、および４−アミノアンチピリンを用いて生成させた色素に由来する、５４６ｎｍにおける吸光度の変化を、ある時間経過にわたり決定することにより、ＧＯｘ活性を決定した。反応は、以下に示される条件下で実施した。

反応は、基質を、酵素溶液を含有する反応溶液（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０＋１．５ｍＭの４−アミノアンチピリン＋１．５ｍＭのＴＯＤＢ＋２Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ；全ての濃度は最終濃度である）へと添加することにより開始し、５４６ｎｍにおける吸光度の変化を決定した。多様な濃度のグルコースを、基質として用いた。１マイクロモルの過酸化水素を１分間にわたり形成する酵素の量を、１Ｕと定義する。３８ｍＭ−１ｃｍ^-1を、ｐＨ７．０におけるＴＯＤＢのモル吸収係数として用いた。活性値を吸光度の変化から計算するための式を以下に示す。
Ｕ／ｍｌ＝ΔＡＢＳ₅₄₆／分×２／３８×１０
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍｌ／タンパク質ｍｇ／ｍｌ

（５）ＧＤＨ活性の決定
基質との反応を介して還元されたＤＣＩＰの退色に由来する、６００ｎｍにおける吸光度の変化を、ある時間経過にわたり定量化することにより、ＧＤＨ活性を決定した。反応は、以下に示される条件下で実施した。

反応は、基質を、酵素溶液を含有する反応溶液（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０＋０．６ｍＭのＰＭＳ＋０．０６ｍＭのＤＣＩＰ；全ての濃度は最終濃度である）へと添加することにより開始し、６００ｎｍにおける吸光度の変化を決定した。ＧＯｘ活性の決定において用いた基質を、基質として用いた。１マイクロモルのＤＣＩＰを還元する酵素の量を、１Ｕと定義する。活性値は、以下に示される式に従い計算した。１６．３ｍＭ−１ｃｍ^-1を、ｐＨ７．０におけるＤＣＩＰのモル吸収係数として用いた。
Ｕ／ｍｌ＝ΔＡＢＳ₆₀₀／分×１／１６．３×１０
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍｌ／タンパク質ｍｇ／ｍｌ

野生型ＧＯｘおよび突然変異体ＧＯｘの活性の決定の結果を、表３および４（異なる試行）に示す。さらに、グルコース基質濃度を１０ｍＭとするときの、多様な突然変異体のオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性の、野生型の活性に対する比を示すグラフを、図１に示す。Ｓ１３２突然変異体およびＦ３７３突然変異体は、野生型と比較してオキシダーゼ活性を低減し、デヒドロゲナーゼ活性を改善した。Ｓ１３２突然変異体およびＦ３７３突然変異体のうちで、Ｓ１３２Ａ突然変異体は、デヒドロゲナーゼ活性を野生型
の４倍以上まで改善し、オキシダーゼ活性を、野生型の約４０％まで低減した。

Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒに由来する野生型ＧＯｘおよび突然変異体ＧＯｘの酵素活性の調製および解析
Ａ．ｎｉｇｅｒ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１３００６）に由来する野生型ＧＯｘおよび突然変異体ＧＯｘを、実施例１および２で記載したのと同じ形で調製した。Ａ．ｎｉｇｅｒ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１３００６）の１３２位におけるトレオニン残基および３７３位におけるフェニルアラニン残基は、それぞれ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤＯ１４９３）の１３２位におけるセリン残基および３７３位におけるフェニルアラニン残基に対応する。

Ａ．ｎｉｇｅｒに由来する突然変異体ＧＯｘは、実施例３で記載したのと同じ形で調製し、その酵素活性を解析した。野生型ＧＯｘおよび突然変異体ＧＯｘによる結果を、以下の表５にまとめる。

表６および７は、グルコースオキシダーゼであることが注記されているアミノ酸配列のアライメントを示す。これらの突然変異させたグルコースオキシダーゼの配列の全体を、配列番号１〜２１に示す。アライメントは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩシリーズ６．０のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて創出した。当業者は、Ｂｌａｓｔなど、別のアライメントソフトウェアプログラムも、同じアライメントまたは実質的に同じアライメントを提供することを理解しよう。

表６からは、配列番号１のＳｅｒ１３２が、表６に列挙されるアミノ酸配列の間で保存されていることが明らかである。したがって、当業者は、保存領域内の配列番号１のＳｅｒ１３２に対応するＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基を、市販されている配列アライメント用のソフトウェアプログラムのうちのいずれかを用いて容易に同定することができ、変異グルコースオキシダーゼが、このＳｅｒまたはＴｈｒ残基に対して改変を導入することにより容易に調製されることを理解することができる（注記：^*データベース：ｇｂ：Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ；ｓｐ：Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ；ｒｅｆ：基準配列；ｅｍｂ：ＥＭＢＬ；ｐｄｂ：ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ；^**配列番号は全長配列を表す）。

表７からは、配列番号１のＰｈｅ３７３は、表７に列挙されるアミノ酸配列の間で保存されていることが明らかである。したがって、当業者は、保存領域内の配列番号１のＰｈｅ３７３に対応するＰｈｅ残基を、市販されている配列アライメント用のソフトウェアプログラムのうちのいずれかを用いて容易に同定することができ、変異グルコースオキシダーゼが、このＰｈｅ残基に対して改変を導入することにより容易に調製されることを理解することができる（注記：^*データベース：ｇｂ：ＧｅｎＢａｎｋ；ｓｐ：Ｓｗｉｓｓｐ
ｒｏｔ；ｒｅｆ：基準配列；ｅｍｂ：ＥＭＢＬ；ｐｄｂ：ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ；^**配列番号は全長配列を表す）。

さらなるＧＯｘ突然変異体
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤＯ１４９３）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＰ１３００６）に由来するＧＯｘのさらなるＧＯｘ突然変異体を、実施例１〜４で記載したのと同じ形で調製し、それらの酵素活性を解析した。各突然変異体のグルコースデヒドロゲナーゼ活性：グルコースオキシダーゼ活性の比を、野生型のグルコースオキシダーゼの比を１００％として、以下の表８ａ、８ｂ、９ａ、および９ｂにまとめる。各野生型ＧＯｘのアミノ酸配列の配列番号を、表６および７に示す。また、突然変異させた位置の近傍のアミノ酸配列のアライメントも、表１０ａ〜ｈに示す。

本発明の突然変異させたグルコースオキシダーゼは、グルコースを測定するために用いることができるが、これは、糖尿病性状態を診断およびコントロールするのに臨床的に有用である。

Claims

（ａ）アミノ酸残基ＴｈｒをＳｅｒで置換することによる、５３位に対応する位置；
（ｂ）アミノ酸残基ＳｅｒをＡｌａ、Ｖａｌ、ＣｙｓもしくはＩｌｅで置換することによる、１３２位に対応する位置；
（ｃ）アミノ酸残基ＰｈｅをＴｒｐ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、またはＧｌｕで置換することによる、４３６位に対応する位置；
および
（ｄ）アミノ酸残基ＴｒｐをＡｌａで置換することによる、５３７位に対応する位置
から選択される１または複数の位置
において改変された、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異グルコースオキシダーゼ。
オキシダーゼ活性が、野生型のグルコースオキシダーゼと比較して低減されている、請求項１に記載の変異グルコースオキシダーゼ。
オキシダーゼ活性が、そのデヒドロゲナーゼ活性未満である、請求項１に記載の変異グルコースオキシダーゼ。
デヒドロゲナーゼ活性が、野生型のグルコースオキシダーゼの５０％以上である、請求項１に記載の変異グルコースオキシダーゼ。
グルコースデヒドロゲナーゼ活性：グルコースオキシダーゼ活性の比が、野生型のグルコースオキシダーゼのオキシダーゼより高い、請求項１に記載の変異グルコースオキシダーゼ。
請求項１から５のいずれか一項に記載の変異グルコースオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
試料中のグルコースをアッセイするための方法であって、試料を請求項１から５のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼと接触させるステップと、グルコースオキシダーゼにより酸化されたグルコースの量を測定するステップとを含む方法。
試料中のグルコースをアッセイするためのデバイスであって、請求項１から５のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼおよび電子伝達体を含むデバイス。
試料中のグルコースをアッセイするためのキットであって、請求項１から５のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼおよび電子伝達体を含むキット。
請求項１から５のいずれか一項に記載のグルコースオキシダーゼが電極上に固定化された酵素電極。
グルコースをアッセイするための酵素センサーであって、請求項１２に記載の酵素電極を作用電極として含む酵素センサー。