JP6305336B2

JP6305336B2 - コレステロールオキシダーゼ

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Publication number: JP6305336B2
Application number: JP2014526420A
Authority: JP
Inventors: 勝博小嶋; 一茂森; 早出　広司; 広司早出
Original assignee: Ultizyme International Ltd
Current assignee: Ultizyme International Ltd
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2032-08-24
Also published as: US9284534B2; WO2013026576A3; EP2562251A1; JP2014528709A; EP2748312A2; WO2013026576A2; EP2562251B1; US20140255959A1; EP2748312B1

Description

本発明は、コレステロールを測定するためのキットおよびセンサーにおいて用いられるコレステロールオキシダーゼに関する。より具体的には、本発明は、オキシダーゼ活性が低減された変異コレステロールオキシダーゼに関する。

血中のリポタンパク質濃度は、臨床検査において極めて重要である。血中のリポタンパク質は、高密度リポタンパク質と低密度リポタンパク質とに分けることができ、いずれもが異なる生物学的機能を有する。血中のリポタンパク質含量の測定値として、リポタンパク質と会合するコレステロールが測定される。血液と同様の生物学的試料では、コレステロールが、コレステロールエステルの形態でリポタンパク質中に存在する。リポタンパク質と会合したコレステロールのレベルを測定するために、コレステロールエステラーゼのような酵素を用いてコレステロールエステルを分解し、次いで、遊離コレステロールを決定する。血中のコレステロール濃度は、コレステロールに対して特異性を有する酵素を用いて測定することができる。

コレステロールオキシダーゼは、多様な種類の菌株から単離されており、このような酵素を用いてコレステロールを解析しうることが示唆されている。

コレステロールオキシダーゼとは、ＦＡＤ依存性酵素であって、ＦＡＤの還元形態（ＦＡＤＨ２）を生成させることにより、コレステロールを酸化させてコレスト−４−エン−３−オンを生成させる反応を触媒する酵素である。ＦＡＤＨ２は、電子を電子受容体へと伝達し、その酸化形態へと転換される。酸素の存在下において、ＦＡＤＨ２は、電子を、人工的な電子受容体（また、伝達体または電子伝達体とも称する）ではなく、酸素分子へと優先的に伝達する。したがって、コレステロールを、伝達体を伴うコレステロールオキシダーゼによりアッセイする場合、アッセイの結果は、反応系内の溶存酸素レベルにより大きく影響されることになる。人工的な電子受容体を使用するポイントオブケア検査デバイスによる血液試料の臨床検査では、このような欠点が特に顕著となろう。人工的な電子伝達体を使用する酵素センサーストリップに用いられる酵素は、酸素に対する活性が低いことが所望される。

したがって、本発明の目的は、その活性が、溶存酸素レベルにより影響される程度が低い酵素、特に、コレステロールオキシダーゼを提供することである。

本出願は、その活性が、溶存酸素レベルにより影響される程度が低い酵素、特に、コレステロールオキシダーゼを提供する。より具体的には、これは、その野生型形態では主にオキシダーゼ活性を示す酵素のオキシダーゼ活性を低減し、好ましくは、同時に、酵素のデヒドロゲナーゼ活性を増大させることにより達成される。以下でより詳細に記載される通り、これは、野生型酵素を突然変異させることにより達成される。

本発明者らは、コレステロールオキシダーゼの多様な突然変異体を調製し、驚くべきことに、特定の種類の突然変異体が、デヒドロゲナーゼ活性、特に、色素媒介のデヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ活性の低減を呈示することを見出した。

本発明は、独立請求項１において定義される変異コレステロールオキシダーゼを提供する。変異コレステロールオキシダーゼの好ましい実施形態は、請求項１に従属する請求項の対象物である。

好ましい実施形態では、本発明の変異コレステロールオキシダーゼは、オキシダーゼ活性が野生型のコレステロールオキシダーゼと比較して低減されており、デヒドロゲナーゼ活性が野生型のコレステロールオキシダーゼと比較して増大していることが好ましい。本発明の変異コレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のコレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性の３０％以下であることが好ましく、また、デヒドロゲナーゼ活性が、野生型のコレステロールオキシダーゼの５０％以上であることも好ましい。また、本発明の変異コレステロールオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性が、野生型のコレステロールオキシダーゼと比較して増大していることも好ましい。

別の態様では、本発明は、本発明の変異コレステロールオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

別の態様では、本発明は、試料中のコレステロールをアッセイするための方法であって、試料を本発明のコレステロールオキシダーゼと接触させるステップと、コレステロールオキシダーゼにより酸化されたコレステロールの量を測定するステップとを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、試料中のコレステロールをアッセイするためのデバイスであって、本発明のコレステロールオキシダーゼと、好ましくは電子伝達体とを含むデバイスを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、試料中のコレステロールをアッセイするためのキットであって、本発明のコレステロールオキシダーゼと、好ましくは電子伝達体とを含むキットを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明のコレステロールオキシダーゼを電極上に固定化した酵素電極を提供する。

別の態様では、本発明は、コレステロールをアッセイするための酵素センサーであって、本発明の酵素電極を作用電極として含む酵素センサーを提供する。

本明細書で用いられるタンパク質の「突然変異体」という用語は、そのタンパク質における、指示される（１または複数の）位置のアミノ酸残基のうちの１または複数において置換を含有する変異体タンパク質を指す。突然変異体という用語はまた、このような突然変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドについても用いられる。

本明細書で用いられる「〜に対応する位置」という語句は、クエリーアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置であって、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＡｌｉｇｎＸソフトウェア（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である；Ｌｕ，Ｇ．およびＭｏｒｉｙａｍａ，Ｅ．Ｎ．（２００４年）、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ、ａｂａｌａｎｃｅｄａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｕｉｔｅ、ＢｒｉｅｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍ、５、３７８〜８８を参照されたい）をデフォルトのパラメータで用いて、基準アミノ酸配列内のアミノ酸残基とアラインされるアミノ酸残基の位置を意味する。したがって、「配列番号Ｘに示されるアミノ酸配列のＹ位に対応する位置におけるアミノ酸（ＡＡ）残基」とは、クエリーアミノ酸配列を、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＡｌｉｇｎＸをデフォルトのパラメータで用いて、配列番号Ｘとアラインされる場合に、配列番号ＸのＡＡＹとアラインされるクエリーアミノ酸配列内のＡＡ残基を意味する。配列番号ＸのＡＡＹ自体もまたこの用語に包含されることに注意されたい。

本発明の変異コレステロールオキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ（すなわちＤｈ）活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ（すなわちＯｘ）活性の減少を呈示する。

本明細書で用いられる「オキシダーゼ活性」とは、コレステロールオキシダーゼの酵素活性であって、酸素を電子受容体として使用することにより、コレステロールの酸化を触媒して、コレスト−４−エン−３−オンを生成させる酵素活性である。オキシダーゼ活性は、生成したＨ２Ｏ２の量を、当技術分野で知られている任意の方法で、例えば、４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）など、Ｈ２Ｏ２を検出するための試薬を介して、またはＰｔ電極を介して測定することにより、アッセイすることができる。本明細書の相対活性または定量的活性の文脈で用いられるオキシダーゼ活性はとりわけ、単位時間当たりに酸化した基質（コレステロール）のモル量であって、１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０、１．５ｍＭのＴＯＤＢ、２Ｕ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および１．５ｍＭの４−アミノアンチ−ピリン（４ＡＡ）中、２５℃で生成したＨ２Ｏ２の量により測定されるモル量であると定義される。キノンイミン色素の形成は、分光光度法により、５４６ｎｍで測定することができる。

本明細書で用いられる、「デヒドロゲナーゼ活性」とは、コレステロールオキシダーゼの酵素活性であって、酸素以外の電子伝達体を電子受容体として使用することにより、コレステロールの酸化を触媒して、コレスト−４−エン−３−オンを生成させる酵素活性である。デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート／２，６−ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ−酢酸−１−（３−カルボキシ−プロポキシ）−５−エチル−フェナジニウム、ＮＡＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリンヒドロクロリド、ＮＡＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシ−エチル−４−ニトロソアニリン）、およびＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンを用いて、伝達体へと伝達される電子の量を測定することにより、アッセイすることができる。

本明細書の相対活性または定量的活性の文脈で用いられるデヒドロゲナーゼ活性はとりわけ、単位時間当たりに酸化した基質（コレステロール）のモル量であって、１０ｍＭのＰＰＢ（ｐＨ７．０）、０．６ｍＭのＤＣＩＰ、および６ｍＭのメトキシＰＭＳ（ｍＰＭＳ）中、２５℃で伝達体へと伝達される電子の量により測定されるモル量であると定義される。

本発明の変異コレステロールオキシダーゼは、デヒドロゲナーゼ活性を実質的に保持しながら、オキシダーゼ活性が野生型のコレステロールオキシダーゼと比較して低減されている。

本発明の変異コレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のコレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性の５０％以下であることが好ましい。本発明の変異コレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性は、野生型のコレステロールオキシダーゼのオキシダーゼ活性の４０％以下、より好ましくは３０％以下、なおより好ましくは２０％以下、最も好ましくは１５％以下であることがより好ましい。また、本発明の変異コレステロールオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性が、野生型のコレステロールオキシダーゼの５０％以上であることも好ましい。本発明の変異コレステロールオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性は、野生型のコレステロールオキシダーゼの７０％以上、より好ましくは９０％以上、なおより好ましくは１００％以上、最も好ましくは１００％を超えることがより好ましい。

野生型のコレステロールオキシダーゼでは、オキシダーゼ活性が、デヒドロゲナーゼ活性の約３００倍である。溶存酸素がアッセイ系内に存在する場合、基質の酸化により生成する電子は、酸素へと優先的に伝達されることになる。したがって、電子伝達体の存在下で測定される酵素活性は、溶存酸素濃度により大きく影響されることになる。これに対し、本発明の変異コレステロールオキシダーゼのデヒドロゲナーゼ活性／オキシダーゼ活性の比は、約２．０以上、好ましくは、４．０以上、より好ましくは１０以上である。デヒドロゲナーゼ活性がオキシダーゼ活性を超えるので、本発明のコレステロールオキシダーゼの酵素活性は、溶存酸素濃度により影響される程度が小さく、これは、血液試料による臨床診断においてコレステロールオキシダーゼを使用するのに有利である。

本出願におけるアミノ酸配列の番号付けは、最初のＭｅｔで始まり、特許請求される変異コレステロールオキシダーゼは、シグナルペプチドを有する場合もあり、有さない場合もあることを理解されたい。

別の態様では、本発明は、本発明の変異コレステロールオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。コレステロールオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公開されているデータベースから容易に得ることができる。野生型のコレステロールオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、各生物のゲノムから、ＰＣＲまたは他の知られた技法を用いてクローニングすることができる。突然変異は、部位指向突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、または当技術分野でよく知られている他の任意の技法により導入することができる。突然変異させるアミノ酸残基は、当技術分野で入手可能な配列アライメント用のソフトウェアのうちのいずれかを用いて同定することができる。代替的に、変異コレステロールオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、一連の化学合成されたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより調製することもでき、全体を合成することもできる。

突然変異させたコレステロールオキシダーゼは、突然変異体遺伝子を適切な発現ベクターへと挿入し、ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な宿主細胞へと導入することにより調製することができる。形質転換細胞を培養し、形質転換細胞内で発現するコレステロールオキシダーゼは、細胞または培養培地から回収することができる。

このようにして得られた組換えコレステロールオキシダーゼは、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析沈殿、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、および透析を含めた、当技術分野で知られている精製法のうちのいずれかにより精製することができる。

したがって、本発明はまた、変異コレステロールオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、このようなベクターで形質転換された宿主細胞、および形質転換
細胞を培養し、変異コレステロールオキシダーゼを培養物から回収および精製することにより、本発明の変異コレステロールオキシダーゼを調製するための方法も包含する。

本発明はまた、試料中のコレステロール、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールをアッセイする方法も包含する。方法は、試料を本発明のコレステロールオキシダーゼと接触させるステップと、コレステロールオキシダーゼにより酸化されたコレステロールの量を測定するステップとを含む。

別の態様では、本発明は、本発明のコレステロールオキシダーゼと電子伝達体とを含む試料中のコレステロール、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールをアッセイするためのデバイスを提供する。

アッセイデバイスは、血中コレステロールレベルをモニタリングするための、従来の市販の電流測定バイオセンサーによる検査用ストリップのうちのいずれかと同様の構造を有しうる。このようなデバイスの一例は、絶縁基板上に配置された２枚の電極（作用電極および基準電極または対電極）、試薬ポート、および試料レシーバーを有する。試薬ポートは、本発明の突然変異させたコレステロールオキシダーゼと伝達体とを含有する。血液試料などの試料を、試料レシーバーへと添加すると、試料中に含有されるコレステロールが、コレステロールオキシダーゼと反応して、電流を発生させ、これにより、試料中のコレステロールの量が示される。酵素基質を決定するのに適する典型的な電気化学的センサーの例は、例えば、ＷＯ２００４／１１３９００およびＵＳ５，９９７，８１７から知られる。電気化学的センサーに対する代替法としては、光学的検出法を用いることもできる。このような光学デバイスは、酵素、電子伝達体、および指示薬を含む試薬系内で生じる色の変化に基づくものが典型的である。色の変化は、蛍光、吸収、または発光の測定値を用いて定量化することができる。酵素基質を決定するのに適する典型的な光学デバイスの例は、例えば、ＵＳ７，００８，７９９、ＵＳ６，０３６，９１９、およびＵＳ５，３３４，５０８から知られる。

さらに別の態様では、本発明は、本発明のコレステロールオキシダーゼと電子伝達体とを含む試料中のコレステロール、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールをアッセイするためのキットを提供する。

コレステロール、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールを測定するためのキットは、本発明の酵素を用いて構築することができる。本発明のコレステロールオキシダーゼに加えて、キットは、測定に必要な緩衝液、適切な伝達体、および、必要な場合は、コレステロールエステラーゼなどのさらなる酵素、検量線を作成するためのコレステロールの標準溶液、および使用のための指示書も含有する。本発明のコレステロールオキシダーゼは、多様な形態で、例えば、凍結乾燥試薬として、または適切な保存液中の溶液として提供することができる。

試料中のコレステロールの濃度は、酵素反応により発生した電子の量を測定することにより、決定することができる。当技術分野では、炭素電極、金属電極、および白金電極を含めた多様なセンサー系が知られている。本発明の突然変異させたコレステロールオキシダーゼは、電極上に固定化される。固定化するための手段の例には、架橋形成、高分子マ
トリックスへの封入、透析膜によるコーティング、光学的架橋形成ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマー、およびこれらの任意の組合せが含まれる。

炭素電極を用いる電流測定系内で測定を実行する場合は、酵素の固定化を施された金電極または白金電極を作用電極として、対電極（白金電極など）および基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に用いる。電極は、伝達体を含有する緩衝液へと挿入し、所定の温度に保つ。所定の電圧を作用電極へと印加し、次いで、試料を添加し、電流値の増大を測定する。アッセイにおいて用いられる伝達体の例には、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、ルテニウム誘導体、フェナジンメトスルフェートなどが含まれる。一般にまた、１枚の作用電極と１枚の対電極または擬似基準電極とを伴う、いわゆる二電極系を用いることも可能である。

さらに、コレステロールは、炭素電極、金電極、または白金電極を用いる電流測定系内に固定化された電子伝達体を用いてもアッセイすることができる。酵素を、高分子マトリックス中のフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトスルフェートなどの電子伝達体と共に、吸着または共有結合により電極上に固定化して作用電極を調製する。作用電極を、対電極（白金電極など）および基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、緩衝液へと挿入し、所定の温度に保つ。所定の電圧を作用電極へと印加し、次いで、試料を添加し、電流値の増大を測定する。

本出願が解析物としてのコレステロールに言及する場合はいつでも、例えば、ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬコレステロールなどのコレステロールへと転換されうる他の解析物もまた包含するものとすることを理解されたい。コレステロールをコレステロールエステルから遊離させるには、血液または血液画分と同様の試料物質中に天然に存在するコレステロールエステラーゼ酵素が必要とされうることを、当業者は承知している。

本明細書で引用される全ての特許および参考文献の内容は、全体において、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を、以下の実施例により詳細に例示するが、本発明は、それらの実施例に限定されないものとする。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種株ＳＡ−ＣＯＯのＣｈＯｘを発現させるプラスミド
ｐＥＴ２８ＣｈＯｘ＿Ｎｈｉｓを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種株ＳＡ−ＣＯＯのＣｈＯｘ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤＯ１４９３）を発現させるプラスミドとして用いた。このプラスミドは、ベクターｐＥＴ２８ａのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位内に挿入されている、シグナル配列を除いた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種株ＳＡ−ＣＯＯに由来するＣｈＯｘの構造遺伝子のＤＮＡ断片を有する。このプラスミド内のＣｈＯｘ遺伝子は、Ｔ７プロモーターにより制御される。ｐＥＴ２８ＣｈＯｘ＿Ｎｈｉｓは、カナマイシン耐性遺伝子を含有する。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種株ＳＡ−ＣＯＯに由来するＣｈＯｘの構造遺伝子の突然変異誘発
（１）残基１５９、２２８および３９６の突然変異誘発
実施例１で得られたｐＥＴ２８ＣｈＯｘ＿Ｎｈｉｓ内に含有されている、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属種株ＳＡ−ＣＯＯに由来するＣｈＯｘの構造遺伝子に、この遺伝子によりコードされるＣｈＯｘの残基１５９におけるメチオニン、残基２２８におけるバリンお
よび残基３９６におけるフェニルアラニンを他のアミノ酸残基で置換するように突然変異誘発した。

具体的には、実施例１で記載したプラスミドｐＥＴ２８ＣｈＯｘ＿Ｎｈｉｓ内に含有されているＣｈＯｘの構造遺伝子の残基１５９におけるメチオニンのコドン（ＡＴＧ）、残基２２８におけるバリンのコドン（ＧＴＴ）および残基３９６におけるフェニルアラニンのコドン（ＴＴＴ）を、市販されている部位指向突然変異誘発キット（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒｐ．、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ）を用いて、他のアミノ酸のコドンで置換した。

アミノ酸残基の置換において用いられるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列を、以下の表に示す。

突然変異を表す表記法では、番号が、ＣｈＯｘのシグナル配列を含有するアミノ酸配列における位置を表し、番号の前に記載されるアルファベットが、アミノ酸置換の前のアミノ酸残基を表し、番号の後に記載されるアルファベットが、アミノ酸置換の後のアミノ酸残基を表す。例えば、Ｍ１５９Ａは、残基１５９におけるメチオニンのアラニンへの置換を表す。

ＰＣＲ反応では、以下に示される組成の反応溶液を、９５℃で３０秒間にわたる反応、次いで、各々が９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、および６８℃で８分間を伴う１５回の反復サイクルの後、６８℃で３０分間にわたる反応下に置き、次いで、４℃に保った。

反応溶液の組成
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）２μＬ
１０倍濃度の反応緩衝液５μＬ
フォワードプライマー（１００ｎｇ／μＬ）１．２５μＬ
リバースプライマー（１００ｎｇ／μＬ）１．２５μＬ
ｄＮＴＰ１μＬ
蒸留水３８．５μＬ
ＤＮＡポリメラーゼ１μＬ
合計５０μＬ

ＰＣＲ反応の後、０．５μＬのＤｐｎＩを、反応溶液へと添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートして、鋳型プラスミドを分解した。

ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１）コンピテント細胞を、得られた反応溶液で形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地（１％のＢａｃｔｏトリプトン、０．５％の酵母抽出物、１％の塩化ナトリウム、１．５％の寒天）上で増殖させたコロニーから、プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定して、対象の突然変異がＣｈＯｘの構造遺伝子内に導入されていることを確認した。

突然変異が導入されていることが確認されたプラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させて、突然変異誘発されたＣｈＯｘの構造遺伝子を切り出し、これを、ｐＥＴ２８ａベクターへと挿入した。ＤＨ５αをこのプラスミドで形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを抽出して、ＣｈＯｘの突然変異体の発現プラスミドを得た。

突然変異体ＣｈＯｘの酵素活性の解析
実施例２で得た突然変異体ＣｈＯｘの発現プラスミドを用いて、突然変異体ＣｈＯｘを生成させ、その酵素活性について研究した。

（１）培養
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）株を、実施例１で調製した野生型ＣｈＯｘ発現プラスミド、または実施例２で調製した突然変異体ＣｈＯｘの発現プラスミドで形質転換した。これらの形質転換細胞を、Ｌ字型管を用いて、３ｍＬのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有する）中、３７℃で１２時間にわたり、個別に振とう培養した。これらの培養液の各々１ｍＬずつを、１００ｍＬのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する）を含有する、バッフル付きの５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコへと接種し、３７℃で旋回培養した。ＯＤ６００が約０．６に達した時点において、これに１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した後、２０℃で２４時間にわたり培養した。

（２）水溶性画分の調製
このようにして培養された培養液から、細菌細胞を回収し、洗浄した。次いで、得られた湿潤細菌細胞を、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁させ、超音波処理した。次いで、ホモジネートを、１７４００×ｇ、４℃で２０分間にわたり遠心分離し、上清を回収した。この上清を、１００４００×ｇ、４℃で６０分間にわたりさらに超遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、これを水溶性画分として用いた。この水溶性画分をＣｈＯｘ試料として用いて、野生型のＣｈＯｘおよび突然変異体のＣｈＯｘの各々について、コレステロールオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）活性およびコレステロールデヒドロゲナーゼ（ＣｈＤＨ）活性を決定した。

（４）基質溶液の調製
コレステロール粉末を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に１００ｍＭの濃度で溶解させ、８０℃でインキュベートして、コレステロールを完全に溶解させた。１００ｍＭのコレステロール溶液を純水で１０倍に希釈し、流水中で冷却し、室温とした。次いで、コール酸ナトリウムを３ｍＭの最終濃度でこれに添加して、１０ｍＭのコレステロール溶液を調製した。活性を決定するために、コレステロール溶液を純水で適切に希釈して、多様な濃度の基質溶液を調製した。

（５）ＣｈＯｘ活性の決定
基質との反応を介して生成させた過酸化水素から、ペルオキシダーゼ、トリンダー試薬（ＴＯＤＢ）、および４−アミノアンチピリンを用いて生成させた色素に由来する、５４６ｎｍにおける吸光度の変化を、ある時間経過にわたり決定することにより、ＣｈＯｘ活性を決定した。反応は、以下に示される条件下で実施した。

反応は、基質を、酵素溶液を含有する反応溶液（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０＋１．５ｍＭの４−アミノアンチピリン＋１．５ｍＭのＴＯＤＢ＋２Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ；全ての濃度は最終濃度である）へと添加することにより開始し、５４６ｎｍにおける吸光度の変化を決定した。多様な濃度のコレステロールを、基質として用いた。１マイクロモルの過酸化水素を１分間にわたり形成する酵素の量を、１Ｕと定義する。３８ｍＭ−１ｃｍ^-1を、ｐＨ７．０におけるＴＯＤＢのモル吸収係数として用いた。活性値を吸光度の変化から計算するための式を以下に示す。
Ｕ／ｍｌ＝ΔＡＢＳ₅₄₆／分×２／３８×１０
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍｌ／タンパク質ｍｇ／ｍｌ

（６）ＣｈＤＨ活性の決定
基質との反応を介して還元されたＤＣＩＰの退色に由来する、６００ｎｍにおける吸光度の変化を、ある時間経過にわたり定量化することにより、ＣｈＤＨ活性を決定した。反応は、以下に示される条件下で実施した。

反応は、基質を、酵素溶液を含有する反応溶液（１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０＋０．６ｍＭのＰＭＳ＋０．０６ｍＭのＤＣＩＰ；全ての濃度は最終濃度である）へと添加することにより開始し、６００ｎｍにおける吸光度の変化を決定した。ＣｈＯｘ活性の決定において用いた基質を、基質として用いた。１マイクロモルのＤＣＩＰを還元する酵素の量を、１Ｕと定義する。活性値は、以下に示される式に従い計算した。１６．３ｍＭ−１ｃｍ^-1を、ｐＨ７．０におけるＤＣＩＰのモル吸収係数として用いた。
Ｕ／ｍｌ＝ΔＡＢＳ₆₀₀／分×１／１６．３×５
Ｕ／ｍｇ＝Ｕ／ｍｌ／タンパク質ｍｇ／ｍｌ

野生型ＣｈＯｘおよび突然変異体ＣｈＯｘの活性の決定の結果を、表７〜９（異なる試行）に示す。

Ｍ１５９突然変異体酵素全てのオキシダーゼ活性は、大幅に低減された。それらのうち、Ｍ１５９Ｆ、Ｍ１５９Ｌ、およびＭ１５９Ｖのデヒドロゲナーゼ活性は、野生型の１．７〜２．９倍まで改善された。特に、Ｍ１５９Ｆのオキシダーゼ活性値は、２．０×１０^-2Ｕ／ｍｇであり、デヒドロゲナーゼ活性値は、２．２×１０^-2Ｕ／ｍｇであり、これは、野生型の２．９倍であった。野生型では、デヒドロゲナーゼ活性のオキシダーゼ活性に対する比が０．２８％であったのに対し、Ｍ１５９Ｆでは、この比が１１０％であり、これは、野生型の約３９０倍までの改善であった。

Ｖ２２８突然変異体酵素全てのオキシダーゼ活性は、野生型より低値であった（２．７Ｕ／ｍｇ）。最も低い活性を呈示した突然変異体は、Ｖ２２８Ｄであった（２．０×１０^-4Ｕ／ｍｇ）。この値は、野生型の約１／１００００であり、酸素に対する反応性の著明な低減を示した。Ｖ２２８Ｄに加えて、Ｖ２２８Ｎ、Ｖ２２８Ｑ、Ｖ２２８Ｓ、およびＶ２２８Ｋも、野生型の１％以下という非常な低値のオキシダーゼ活性値を呈示した（Ｖ２２８Ｎ：７．０×１０^-3Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｅ：５．０×１０^-3Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｓ：９．０×１０^-3Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｋ：８．８×１０^-3Ｕ／ｍｇ）。他方、Ｖ２２８Ａを含め、イソロイシン、ロイシン、またはフェニルアラニンへの置換を有するＶａｌ２２８突然変異体は、オキシダーゼ活性値が比較的高く（野生型に対する比：１０％〜）、したがって、酸素に対する反応性を保持した（Ｖ２２８Ｉ：２．２Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｌ：９．４×１０^-1Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｆ：２．２×１０^-1Ｕ／ｍｇ）。野生型と比較してデヒドロゲナーゼ活性が改善された８つの突然変異体が得られた。それらのうち、Ｖ２２８Ｔは、野生型の約５倍の活性（５．６×１０^-2Ｕ／ｍｇ）を呈示した。加えて、リシン、セリン、またはシステインへの置換を有する突然変異体も、高いデヒドロゲナーゼ活性（Ｖ２２８Ｋ：３．４×１０^-2Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｃ：３．１×１０^-2Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｓ：２．０×１０^-2Ｕ／ｍｇ）を呈示した。他方、ロイシンまたはイソロイシンへの置換を有する突然変異体の活性は、野生型の１／１０まで低減された（Ｖ２２８Ｌ：１．０×１０^-3Ｕ／ｍｇ、Ｖ２２８Ｉ：１．０×１０^-3Ｕ／ｍｇ）。Ｖ２２８ＤおよびＶ２２８Ｒのデヒドロゲナーゼ活性は、検出可能でなかった。

Ｆ３９６突然変異体酵素のオキシダーゼ活性は低減された。Ｆ３９６Ｗ突然変異体酵素のオキシダーゼ活性値は、１．２×１０^-1Ｕ／ｍｇであり、デヒドロゲナーゼ活性値は、２．０×１０^-2Ｕ／ｍｇであった。オキシダーゼ活性は、野生型のＣｈＯｘのオキシダーゼ活性と比較して低減され、デヒドロゲナーゼ活性は、野生型の２倍以上まで改善された。デヒドロゲナーゼ活性のオキシダーゼ活性に対する比は１６％であり、これは、野生型（０．２８％）の５７倍であった。Ｆ３９６ＮおよびＦ３９６Ｄは、オキシダーゼ活性が、野生型の、それぞれ、１．９％および０．０３２％まで低減されるだけでなく、デヒドロゲナーゼ活性もまた、野生型の、それぞれ、２３％および１４％まで低減された。突然変異体酵素であるＦ３９６Ｍ、Ｆ３９６Ｌ、Ｆ３９６Ｖ、Ｆ３９６Ｉ、およびＦ３９６Ｙの各々は、他の突然変異体酵素と比較して、オキシダーゼ活性（野生型の３０〜８０％）
を維持した。

表１０〜１２は、コレステロールオキシダーゼであることが注記されているアミノ酸配列のアライメントを示す。これらの突然変異させたコレステロールオキシダーゼの配列の全体を、配列番号１〜４８に示す。アライメントは、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩシリーズ６．０のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを用いて創出した。当業者は、Ｂｌａｓｔなど、別のアライメントソフトウェアプログラムも、同じアライメントまたは実質的に同じアライメ
ントを提供することを理解しよう。

表１０からは、配列番号１のＭｅｔ１５９が、表１０に列挙されるアミノ酸配列の間で保存されていることが明らかである。したがって、当業者は、保存領域内の配列番号１のＭｅｔ１５９に対応するＭｅｔ残基またはＩｌｅ残基を、市販されている配列アライメント用のソフトウェアプログラムのうちのいずれかを用いて容易に同定することができ、変異コレステロールオキシダーゼが、このＭｅｔまたはＩｌｅ残基に対して改変を導入することにより容易に調製されることを理解することができる。

^*データベース:gb:GenBank;sp:Swissprot;ref:基準配列;emb:EMBL;pdb:Protein Data Bank
^**配列番号は全長配列を表す

表１１からは、配列番号１のＶａｌ２２８、表１１に列挙されるアミノ酸配列の間で保存されていることが明らかである。したがって、当業者は、保存領域内の配列番号１のＶａｌ２２８に対応するＶａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅ残基を、市販されている配列アライメント用のソフトウェアプログラムのうちのいずれかを用いて容易に同定することができ、変異コレステロールオキシダーゼが、このＶａｌ、ＭｅｔまたはＩｌｅ残基に対して改変を導入することにより容易に調製されることを理解することができる。

表１２からは、配列番号１のＰｈｅ３９６は、表１２に列挙されるアミノ酸配列の間で保存されていることが明らかである。したがって、当業者は、保存領域内の配列番号１のＰｈｅ３９６に対応するＰｈｅ残基を、市販されている配列アライメント用のソフトウェアプログラムのうちのいずれかを用いて容易に同定することができ、変異コレステロールオキシダーゼが、このＰｈｅ残基に対して改変を導入することにより容易に調製されることを理解することができる。

本発明の突然変異させたコレステロールオキシダーゼは、コレステロールまたは高密度リポタンパク質または低密度リポタンパク質など、コレステロールと会合するリポタンパク質を測定するために用いることができるが、これは、特定の健康状態を診断およびコントロールするのに臨床的に有用である。

Claims

配列番号１〜１３、１５〜２０、２２、２３および２５〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列において、
（ａ）アミノ酸残基ＭｅｔをＰｈｅ、およびＬｙｓから選択されるアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１５９位に対応する位置；
（ｂ）アミノ酸残基ＶａｌをＡｌａ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２２８位に対応する位置；および／または
（ｃ）アミノ酸残基ＰｈｅをＡｓｐから選択されるアミノ酸残基で置換することによる、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３９６位に対応する位置
において改変されたアミノ酸配列を有し、
オキシダーゼ活性が、そのデヒドロゲナーゼ活性未満である、
変異コレステロールオキシダーゼ。
オキシダーゼ活性が、野生型のコレステロールオキシダーゼと比較して低減されている、請求項１に記載の変異コレステロールオキシダーゼ。
請求項１または２に記載の変異コレステロールオキシダーゼをコードする単離ポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
試料中のコレステロールをアッセイするための方法であって、試料を請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼと接触させるステップと、コレステロールオキシダーゼにより酸化されたコレステロールの量を測定するステップとを含む方法。
ＨＤＬコレステロールをアッセイするための方法であって、試料中のＨＤＬを反応させてコレステロールを生成させるステップと、コレステロールを請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼと接触させるステップと、酸化されたコレステロールの量を測定するステップとを含む方法。
ＬＤＬコレステロールをアッセイするための方法であって、試料中のＬＤＬを反応させてコレステロールを生成させるステップと、コレステロールを請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼと接触させるステップと、酸化されたコレステロールの量を測定するステップとを含む方法。
試料中のコレステロール、ＨＤＬコレステロール、および／またはＬＤＬコレステロールをアッセイするためのデバイスであって、請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼおよび電子伝達体を含むデバイス。
試料中のコレステロール、ＨＤＬコレステロール、および／またはＬＤＬコレステロールをアッセイするためのキットであって、請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼおよび電子伝達体を含むキット。
請求項１または２に記載のコレステロールオキシダーゼが電極上に固定化された酵素電極。
コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールをアッセイするための酵素センサーであって、請求項１１に記載の酵素電極を作用電極として含む酵素センサー。