ES2556605T3

ES2556605T3 - Glucosa oxidasa

Info

Publication number: ES2556605T3
Application number: ES12753399.0T
Authority: ES
Inventors: Katsuhiro Kojima; Kazushige Mori; Koji Sode
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Ultizyme International Ltd
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Ultizyme International Ltd
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2032-08-24
Also published as: JP2014526894A; US20140248645A1; PL2748311T3; EP2748311A2; WO2013026575A3; JP6312593B2; US8999140B2; WO2013026575A2; EP2748311B1

Abstract

Una glucosa oxidasa mutante modificada en una o más posiciones seleccionadas entre: (a) una posición correspondiente a la posición 53 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Thr con Ser; (b) una posición correspondiente a la posición 116 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Ile con Val; (c) una posición correspondiente a la posición 132 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Ser con Ala, Thr, Val, Cys o Ile, o mediante la sustitución del resto de aminoácido Thr con Ala, Ser, Val, Trp o Cys; (d) una posición correspondiente a la posición 134 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Thr con Ala, Ile o Met; (e) una posición correspondiente a la posición 237 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Ile con Val, o mediante la sustitución del resto de aminoácido Phe con Ile, Ala, Val, Met, Ser, Asp, Leu, Thr, Asn, Arg o Cys; (f) una posición correspondiente a la posición 371 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Val con Thr, Ala, o mediante la sustitución del resto de aminoácido Ala con Val; (g) una posición correspondiente a la posición 373 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Phe con Leu, Tyr, Ala, Met, Asn o Trp; (h) una posición correspondiente a la posición 434 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Glu con Gln; (i) una posición correspondiente a la posición 436 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Phe con Trp, Ala, Leu, Tyr, Met, Glu o Ile; (j) una posición correspondiente a la posición 448 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Trp con Ala, Ile, Ser, Val, Met, Thr, Cys, Gly, Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Gln o Tyr; y (k) una posición correspondiente a la posición 537 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 1 mediante la sustitución del resto de aminoácido Trp con Ala.

Description

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DESCRIPCION

Glucosa oxidasa Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una glucosa oxidasa para su uso en un kit y un sensor para medir la glucosa. Mas concretamente, la presente invencion se refiere a una glucosa oxidasa mutante que tiene actividad de oxidasa reducida.

Antecedentes de la tecnica

La concentracion de glucosa en sangre es muy importante en los ensayos clmicos para el diagnostico de la diabetes mellitus y en el control del azucar en sangre de los pacientes que padecen diabetes mellitus. La concentracion de glucosa en sangre se puede medir usando una enzima que tenga especificidad por la glucosa.

Se han aislado glucosa oxidasas de diversos tipos de cepas, y se ha sugerido que es posible analizar la glucosa usando dichas enzimas.

La glucosa oxidasa es una enzima dependiente de FAD que cataliza una reaccion en la que la glucosa se oxida para generar gluconolactona, con la generacion de la forma reducida de FAD (FADH2). A su vez, FADH2 transmite electrones a un aceptor de electrones y se convierte en su forma oxidada. En presencia de oxfgeno, FADH2 transmite preferentemente electrones a la molecula de oxfgeno, en lugar de a aceptores de electrones artificiales (tambien conocidos como mediadores o mediadores de electrones). Por lo tanto, cuando se analiza la glucosa mediante glucosa oxidasa con mediadores, los resultados del ensayo se veran enormemente afectados por el nivel de oxfgeno disuelto en el sistema de reaccion. Dicha desventaja se advertira particularmente en los ensayos clmicos de muestras de sangre mediante un dispositivo de ensayo de punto de cuidado, utilizando un aceptor de electrones artificial. Lo deseable es que las enzimas usadas para las tiras de los sensores enzimaticos que emplean mediadores de electrones artificiales tengan baja actividad hacia el oxfgeno.

Por consiguiente, el objeto de la presente invencion es proporcionar una enzima, en particular, una glucosa oxidasa, cuya actividad se vea menos afectada por el nivel de oxfgeno disuelto.

Divulgacion de la invencion

Los inventores de la presente solicitud han podido proporcionar una enzima, en particular, una glucosa oxidasa, cuya actividad se ve menos afectada por el nivel de oxfgeno disuelto. Mas concretamente, esto se ha logrado mediante la reduccion de la actividad de oxidasa de una enzima que, en su forma de tipo silvestre, muestra predominantemente una actividad de oxidasa y que, preferentemente, al mismo tiempo el aumento de la actividad de deshidrogenasa de la enzima. Como se describira mas detalladamente a continuacion, esto se ha logrado mediante la mutacion de la enzima de tipo silvestre.

Los presentes inventores han preparado diversos mutantes de una glucosa oxidasa y, sorprendentemente, han encontrado que un cierto tipo de mutantes presenta actividad de oxidasa reducida a la vez que conserva sustancialmente la actividad de deshidrogenasa, en particular, la actividad de deshidrogenasa mediada por colorante.

La presente invencion proporciona una glucosa oxidasa mutante segun lo definido en la reivindicacion independiente 1. Las realizaciones preferidas de la glucosa oxidasa mutante son la materia objeto de las reivindicaciones dependientes de la reivindicacion 1.

En particular, la presente invencion se refiere a una glucosa oxidasa mutante modificada en una o mas posiciones seleccionadas entre:

(a) una posicion correspondiente a la posicion 53 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con otro resto de aminoacido;

(b) una posicion correspondiente a la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido lie con otro resto de aminoacido;

(c) una posicion correspondiente a la posicion 132 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Ser o Thr con otro resto de aminoacido;

(d) una posicion correspondiente a la posicion 134 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con otro resto de aminoacido;

(e) una posicion correspondiente a la posicion 237 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido IIe o Phe con otro resto de aminoacido;

(f) una posicion correspondiente a la posicion 371 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Val o Ala con otro resto de aminoacido;

(g) una posicion correspondiente a la posicion 373 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con otro resto de aminoacido;

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(h) una posicion correspondiente a la posicion 434 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Glu con otro resto de aminoacido;

(i) una posicion correspondiente a la posicion 436 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con otro resto de aminoacido;

(j) una posicion correspondiente a la posicion 448 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con otro resto de aminoacido; y

(k) una posicion correspondiente a la posicion 537 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con otro resto de aminoacido.

Mas concretamente, la glucosa oxidasa mutante de la presente invencion esta modificada en una o mas posiciones seleccionadas entre:

(a) una posicion correspondiente a la posicion 53 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con Ser;

(b) una posicion correspondiente a la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido IIe con Val;

(c) una posicion correspondiente a la posicion 132 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1

mediante la sustitucion del resto de aminoacido Ser con Ala, Thr, Val, Cys o IIe, o mediante la sustitucion del resto

de aminoacido Thr con Ala, Ser, Val, Trp o Cys;

(d) una posicion correspondiente a la posicion 134 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con Ala, IIe o Met;

(e) una posicion correspondiente a la posicion 237 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido IIe con Val, o mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con IIe, Ala, Val, Met, Ser, Asp, Leu, Thr, Asn, Arg o Cys;

(f) una posicion correspondiente a la posicion 371 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1

mediante la sustitucion del resto de aminoacido Val con Thr, Ala, o mediante la sustitucion del resto de aminoacido

Ala con Val;

(g) una posicion correspondiente a la posicion 373 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con Leu, Tyr, Ala, Met, Asn o Trp;

(h) una posicion correspondiente a la posicion 434 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Glu con Gln;

(i) una posicion correspondiente a la posicion 436 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con Trp, Ala, Leu, Tyr, Met, Glu o IIe;

(j) una posicion correspondiente a la posicion 448 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con Ala, IIe, Ser, Val, Met, Thr, Cys, Gly, Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Gln o Tyr; y

(k) una posicion correspondiente a la posicion 537 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con Ala.

En una realizacion preferida, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de oxidasa reducida en comparacion con la glucosa oxidasa de tipo silvestre y, preferentemente, tiene una mayor actividad de deshidrogenasa en comparacion con la glucosa oxidasa de tipo silvestre. Preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de oxidasa del 30 % o menos de la de la glucosa oxidasa de tipo silvestre, y preferentemente tambien tiene una actividad de deshidrogenasa del 50 % o mas de la glucosa oxidasa de tipo silvestre. Tambien, preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una mayor actividad de deshidrogenasa en comparacion con la glucosa oxidasa de tipo silvestre.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado que codifica la glucosa oxidasa mutante de la presente invencion.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un vector que comprende el polinucleotido de la invencion.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona una celula hospedadora transformada con un vector de la invencion.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de determinacion de la glucosa en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con la glucosa oxidasa de la invencion y medir la cantidad de la glucosa oxidada mediante la glucosa oxidasa.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un dispositivo de determinacion de la glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de la invencion y, preferentemente, un mediador de electrones.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un kit de determinacion de glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de la invencion y, preferentemente, un mediador de electrones.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un electrodo enzimatico que tiene la glucosa oxidasa de la invencion que esta inmovilizada en el electrodo.

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En otro aspecto, la presente invencion proporciona un sensor enzimatico de determinacion de la glucosa que comprende el electrodo enzimatico de la invencion como un electrodo de trabajo.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra las proporciones de las actividades de oxidasa (Ox) y de deshidrogenasa (Dh) de diversos mutantes de glucosa oxidasa (GOx) a una concentracion de sustrato de glucosa de 100 mM con respecto a las actividades de tipo silvestre. "nd" de la Fig. 1 y de las tablas significa "no detectado".

Descripcion detallada de la invencion

El termino "mutante" de una protema, como se usa en el presente documento, se refiere a una variante de protema que contiene la sustitucion en uno o mas de los restos de aminoacido de la protema en la/s posicion/es indicada/s. El termino mutante tambien se usa para un polinucleotido que codifica dicha protema mutante.

La expresion "una posicion correspondiente a", como se usa en el presente documento, significa la posicion de un resto de aminoacido de una secuencia de aminoacidos de consulta que se alinea con el resto de aminoacido de una secuencia de aminoacidos de referencia usando un programa informatico AlignX de Vector NTI con los parametros por defecto (disponible en Invitrogen; vease, Lu, G., y Moriyama, E. N. (2004), “Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite”. Brief Bioinform 5, 378-88). Por lo tanto, "el resto de aminoacido (AA) de una posicion correspondiente a la posicion Y de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: X" significa el resto de AA de una secuencia de aminoacidos de consulta que esta alineado con el AA Y de SEC ID N° X cuando la secuencia de aminoacidos de consulta se alinea con SEC ID N°: X usando AlignX de Vector NTI con los parametros por defecto. Cabe senalar que dicha expresion tambien engloba el AA Y de la propia SEC ID N°: X.

La glucosa oxidasa mutante de la invencion presenta una menor actividad de oxidasa a la vez que conserva sustancialmente la actividad de deshidrogenasa.

Como se usa en el presente documento, "actividad de oxidasa" es una actividad enzimatica de la glucosa oxidasa para catalizar la oxidacion de la glucosa con el fin de generar gluconolactona con la utilizacion de oxfgeno como aceptor de electrones. La actividad de oxidasa se puede ensayar midiendo la cantidad de H2O2 generado mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante reactivos para la deteccion de H2O2 tales como 4AA/TODB/POD (4-aminoantipirina/sal disodica de W,W-Bis(4-sulfobutil)-3-metilanilina/peroxidasa de rabano picante) o mediante el electrodo Pt. Como se usa en el presente documento, en el contexto de la actividad relativa o cuantitativa, la actividad de oxidasa se define espedficamente como la cantidad en moles del sustrato (glucosa) oxidado por unidad de tiempo medida por la cantidad de H2O2 generado a 25 °C en PPB 10 mM, pH 7,0, TODB 1,5 mM, 2 U/ml de peroxidasa de rabano (POD) y 4-aminoanti-pirina (4AA) 1,5 mM. La formacion de colorante de quinoneimina se puede medir espectrofotometricamente a 546 nm.

Como se usa en el presente documento, "actividad de deshidrogenasa" es una actividad enzimatica de la glucosa oxidasa para catalizar la oxidacion de la glucosa con el fin de generar gluconolactona con la utilizacion de un mediador de electrones distinto del oxfgeno como aceptor de electrones. La actividad de deshidrogenasa se puede ensayar midiendo la cantidad de electrones transferida al mediador usando, por ejemplo, mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio/2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoro-acetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31_1144 (clorhidrato de W,W-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, Na BM31_1008 (A/,W-bis-hidroxietil-4- nitrosoanilina) y A/,W-4-dimetil-nitrosoanilina.

Como se usa en el presente documento, en el contexto de la actividad relativa o cuantitativa, la actividad de deshidrogenasa se define espedficamente como la cantidad en moles del sustrato (glucosa) oxidado por unidad de tiempo medida por la cantidad de electrones transferidos al mediador a 25 °C en PPB 10 mM (pH 7,0), DCIP 0,6 mM y metoxi PMS 6 mM (mPMS).

La glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de oxidasa reducida en comparacion con la glucosa oxidasa de tipo silvestre, mientras que conserva sustancialmente la actividad de deshidrogenasa.

Preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de oxidasa del 50 % o menos de la de la glucosa oxidasa de tipo silvestre. Mas preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de oxidasa del 40 % o menos, mas preferentemente del 30 % o menos, incluso mas preferentemente del 20 % o menos, y lo mas preferentemente del 15 % o menos de la de la glucosa oxidasa de tipo silvestre. Tambien preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de deshidrogenasa del 50 % o mas de la glucosa oxidasa de tipo silvestre. Mas preferentemente, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una actividad de deshidrogenasa del 70 % o mas, mas preferentemente del 90 % o mas, incluso mas preferentemente del 100 % o mas, y lo mas preferentemente de mas del 100 % de la glucosa oxidasa de tipo silvestre.

En la glucosa oxidasa de tipo silvestre, la actividad de oxidasa es aproximadamente de 3 a 4 veces superior a la actividad de deshidrogenasa. Cuando hay oxfgeno disuelto en el sistema de ensayo, el electron generado mediante la oxidacion del sustrato se transferira preferentemente al oxfgeno. Asf pues, la actividad enzimatica medida en presencia de mediador de electrones se ve enormemente afectada por la concentracion de oxfgeno disuelto. Por el contrario, la glucosa oxidasa mutante de la invencion tiene una proporcion de la actividad de

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deshidrogenasa/oxidasa de aproximadamente 2,0 o mas, preferentemente de 4,0 o mas, mas preferentemente de 10 o mas. Dado que la actividad de deshidrogenasa supera a la actividad de oxidasa, la actividad enzimatica de la glucosa oxidasa de la presente invencion se vera menos afectada por la concentracion de oxfgeno disuelto, lo que es ventajoso en la utilizacion de la glucosa oxidasa en el diagnostico cffnico con una muestra de sangre.

Se ha de entender que la numeracion de la secuencia de aminoacidos de la presente solicitud comienza en la Met inicial, y que la glucosa oxidasa mutante reivindicada puede tener o no el peptido senal.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un polinucleotido aislado que codifica la glucosa oxidasa mutante de la presente invencion. La secuencia de nucleotidos de los polinucleotidos que codifican la glucosa oxidasa se puede obtener facilmente de bases de datos publicas. El polinucleotido que codifica la glucosa oxidasa de tipo silvestre se puede clonar a partir del genoma de los respectivos organismos usando PCR u otras tecnicas conocidas. Se pueden introducir mutaciones mediante mutagenesis dirigida, mutagenesis por PCR o cualquier otra tecnica bien conocida en la materia. El resto de aminoacido que se va a mutar se puede identificar usando cualquier programa informatico de alineacion de secuencias disponible en la tecnica. Como alternativa, el polinucleotido que codifica la glucosa oxidasa mutante se puede preparar mediante PCR usando una serie de oligonucleotidos sintetizados qmmicamente o totalmente sintetizados.

La glucosa oxidasa mutada se puede preparar mediante la insercion del gen mutante en un vector de expresion apropiado e introduciendo el vector en una celula hospedadora apropiada, tal como celulas de E. coli. El transformante se cultiva, y la glucosa oxidasa expresada en el transformante se puede recoger de las celulas o del medio de cultivo. Como alternativa, la glucosa oxidasa recombinante se puede recoger y volver a plegar a partir de los cuerpos de inclusion preparados de las celulas.

La glucosa oxidasa recombinante asf obtenida se puede purificar mediante cualquiera de las tecnicas de purificacion conocidas en la materia, incluyendo la cromatograffa en columna de intercambio ionico, la cromatograffa de afinidad, la cromatograffa de ffquidos, la filtracion, la ultrafiltracion, la precipitacion de sales, la precipitacion con disolvente, la inmunoprecipitacion, la electroforesis en gel, la electroforesis isoelectrica y la dialisis.

Asf pues, la presente invencion tambien engloba un vector que comprende el polinucleotido que codifica la glucosa oxidasa mutante, una celula hospedadora transformada con dicho vector y un metodo de preparacion de la glucosa oxidasa mutante de la invencion mediante el cultivo del transformante, la recogida y la purificacion de la glucosa oxidasa mutante del cultivo.

La invencion tambien engloba un metodo de determinacion de la glucosa en una muestra. El metodo comprende poner en contacto la muestra con la glucosa oxidasa de la invencion y medir la cantidad de glucosa oxidada por la glucosa oxidasa.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un dispositivo de determinacion de la glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de la invencion y un mediador de electrones.

El dispositivo de ensayo puede tener una estructura similar a cualquiera de las tiras de ensayo de biosensores amperometricos convencionales que se encuentran disponibles en el mercado para monitorizar el nivel de glucosa en sangre. Un ejemplo de dicho dispositivo tiene dos electrodos (electrodo de trabajo y el de referencia o contraelectrodo) situados sobre un sustrato aislante, un puerto de reactivo y un receptor de la muestra. El puerto de reactivo contiene la glucosa oxidasa mutada de la invencion y un mediador. Cuando se anade una muestra tal como una muestra de sangre al receptor de muestras, la glucosa contenida en la muestra reaccionara con la glucosa oxidasa para generar corriente, que indica la cantidad de glucosa de la muestra. Los ejemplos ffpicos de sensores electroqmmicos adecuados para la determinacion de sustratos enzimaticos se conocen, por ejemplo, por los documentos WO 2004/113900 y US 5.997.817. Como alternativa a los sensores electroqmmicos, se podffan usar tecnologfas de deteccion optica. Por lo general, dichos dispositivos opticos se basan en los cambios de color que se producen en un sistema de reactivos que comprende la enzima, un mediador de electrones y un indicador. Los cambios de color se pueden cuantificar usando mediciones de fluorescencia, de absorcion o de remision. Los ejemplos ffpicos de dispositivos opticos adecuados para la determinacion de sustratos enzimaticos se conocen, por ejemplo, por los documentos US 7.008.799, US 6.036.919 y US 5.334.508.

En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un kit para determinar la glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de la invencion y un mediador de electrones.

Los kit para medir la glucosa se pueden construir usando la enzima de la presente invencion. Ademas de la glucosa oxidasa de la invencion, el kit contiene el tampon necesario para la medicion, el mediador apropiado y, si es necesario, enzimas tales como la peroxidasa, solucion patron de glucosa para la preparacion de una curva de calibracion y las instrucciones de uso. La glucosa oxidasa de la presente invencion se puede proporcionar en diversas formas, por ejemplo, como un reactivo liofilizado o como una solucion en una solucion de almacenamiento apropiada.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un electrodo enzimatico que tiene la glucosa oxidasa de la invencion inmovilizada en el electrodo.

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En otro aspecto, la presente invencion proporciona un sensor enzimatico para determinar la glucosa que comprende el electrodo enzimatico de la invencion como electrodo de trabajo.

La concentracion de glucosa en una muestra se puede determinar midiendo la cantidad de electrones generada mediante la reaccion enzimatica. En la tecnica, se conocen diversos sistemas de sensores, entre los que se incluyen el electrodo de carbono, electrodo metalico y electrodo de platino. La glucosa oxidasa mutada de la presente invencion se inmoviliza sobre los electrodos. Los ejemplos de los medios para la inmovilizacion incluyen la reticulacion, la encapsulacion en una matriz macromolecular, el recubrimiento con una membrana de dialisis, el polfmero de reticulacion optico, el polfmero electroconductor, el polfmero de oxidacion-reduccion y cualquier combinacion de los mismos.

Cuando la medicion se realiza en un sistema amperometrico, se usa un electrodo de carbono, electrodo de oro o platino electrodo provisto de una enzima inmovilizada como electrodo de trabajo, junto con un contraelectrodo (tal como electrodo de platino) y un electrodo de referencia (tal como electrodo de Ag/AgCl). Los electrodos se insertan en un tampon que contiene un mediador y se mantienen a una temperatura predeterminada. Se aplica un voltaje predeterminado en el electrodo de trabajo, a continuacion, se anade una muestra y se mide el aumento del valor de la corriente electrica. Los ejemplos del mediador usado en el ensayo incluyen ferricianuro de potasio, ferroceno, derivado de osmio, derivado de rutenio, metosulfato de fenazina, etc. En general, tambien se pueden usar los denominados sistemas de dos electrodos con un electrodo de trabajo y un contraelectrodo o electrodo de pseudo- referencia.

Ademas, la glucosa se puede determinar usando un mediador de electrones inmovilizado en un sistema amperometrico usando electrodo de carbono, electrodo de oro o electrodo de platino. La enzima se inmoviliza sobre el electrodo junto con un mediador de electrones tal como ferricianuro de potasio, ferroceno, derivado de osmio, metosulfato de fenazina en una matriz macromolecular mediante adsorcion o enlace covalente para preparar un electrodo de trabajo. Se inserta en tampon junto con un contraelectrodo (tal como electrodo de platino) y un electrodo de referencia (tal como electrodo de Ag/AgCl) y se mantiene a una temperatura predeterminada. Se aplica un voltaje predeterminado al electrodo de trabajo, a continuacion, se anade la muestra y se mide el aumento del valor de la corriente electrica.

El contenido de todas las patentes y los documentos de referencia citados en la presente memoria descriptiva se incorpora en su totalidad en el presente documento por referencia.

EJEMPLOS

La presente invencion se ilustrara detalladamente por medio de los siguientes ejemplos, aunque la presente invencion no se limita a dichos ejemplos.

Ejemplo 1: Plasmido que expresa GOx de Penicillium amagasakiens

Se uso pET22 gox de tipo silvestre como plasmido de expresion de GOx de Penicillium amagasakiens (GenBank AADO1493). Este plasmido tiene un fragmento de ADN que contiene la region del gen estructural de GOx derivado de Penicillium amagasakiens a excepcion de la secuencia senal, que se inserta en el sitio de clonacion Nhel/EcoRl de un vector pET22. El gen de GOx de este plasmido esta controlado por un promotor T7. El pET22 gox de tipo silvestre contiene un gen de resistencia a la ampicilina.

Ejemplo 2: Mutagenesis del gen estructural de GOx derivado de Penicillium amagasakiens

(1) Mutagenesis de los restos 132 y 373

Se sometio a mutagenesis el gen estructural de GOx derivado de Penicillium amagasakiens contenido en el pET22 gox de tipo silvestre obtenido en el Ejemplo 1, de modo que la serina del resto 132 y la fenilalanina del resto 373 de la GOx codificada por este gen se sustituyeron con otros restos de aminoacidos.

En concreto, se sustituyeron el codon (TCC) para la serina del resto 132 y el codon (TTC) para la fenilalanina del resto 373 del gen estructural de GOx contenido en el plasmido pET22 gox de tipo silvestre descrito en el Ejemplo 1 con otros codones de aminoacidos usando un kit de mutagenesis dirigida disponible en el mercado (Stratagene Corp., kit de mutagenesis dirigida QuikChange II).

Las secuencias de los cebadores directo e inverso usados en la sustitucion de los restos de aminoacidos se muestran en las tablas que figuran mas adelante.

En la anotacion que representa una mutacion, el numero representa una posicion de la secuencia de aminoacidos que contiene la secuencia senal de GOx; el alfabeto descrito antes del numero representa un resto de aminoacido antes de la sustitucion del aminoacido; y el alfabeto descrito despues del numero representa un resto de aminoacido despues de la sustitucion del aminoacido. Por ejemplo, S132A representa la sustitucion de la serina del resto 132 con alanina.

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En la reaccion PCR, se sometio una solucion de reaccion de la composicion que se muestra a continuacion a reaccion a 95 °C durante 30 segundos y luego a 15 ciclos repetitivos, cada uno de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 8 minutos, seguidos de 68 °C durante 30 minutos y el mantenimiento a 4 °C.

Composicion de la solucion de reaccion

ADN de molde (5 ng/il): 2 |il

10 x tampon de reaccion: 5 |il

Cebador directo (100 ng/il): 1,25 |il

Cebador inverso (100 ng/il): 1,25 il

dNTP: 1 il

Agua destilada: 38,5 il

ADN polimerasa: 1 il

Total: 50 il

Tras la reaccion PCR, se anadieron 0,5 il de Dpn\ a la solucion de reaccion y se incubo a 37 °C durante 1 hora para degradar el plasmido molde.

Se transformaron celulas competente DH5a de Escherichia coli (supE44, AlacU169 (^801acZAM15), hsdR17, recA1, endAI, gyrA96, thi-1, relAI) con la solucion de reaccion obtenida. A partir de colonias desarrolladas en un medio agar LB (Bacto triptona al 1 %, extractos de levadura al 0,5 %, cloruro de sodio al 1 %, agar al 1,5 %) que contema ampicilina (50 ig/ml), se preparo ADN plasmfdico y se secuencio para confirmar que la mutacion de interes se habfa introducido en el gen estructural de GOx.

Se digirio el plasmido en el que se habfa confirmado la introduccion de la mutacion con las enzimas de restriccion Nde\ y EcoR\ para escindir el gen estructural de GOx sometido a mutagenesis, que, a su vez, se habfa insertado en un vector pET22. Se transformo DH5a con este plasmido, y se extrajo un plasmido de las colonias obtenidas para obtener un plasmido de expresion de DGOx mutante.

Tabla 1

Cebador para S132 Sustitucion de: Nombre del Secuencia SEC \D N'

aminoacido: cebador

S132A: S132AFw 5'CTTGATAAACGGTGACGCGTGGACTCGCCC 3' 22

S132A: S132ARv 5'GGGCGAGTCCACGCGTCACCGTTTATCAAG 3' 23


: Tabla 2

Cebador para F373 Sustitucion de: Nombre del Secuencia SEC \D N'

aminoacido: cebador

F373A: F373AFw 5'CAGGCCGTCTTCGCGGCCAATTTCACTGAG 3' 24

F373A: F373ARv 5'CTCAGTGAAATTGGCCGCGAAGACGGCCTG 3' 25

F373L: F373LFw 5'GTCAGGCCGTCTTCCTGGCCAATTTCACTGAG 3' 26

F373L: F373LRv 5'CTCAGTGAAATTGGCCAGGAAGACGGCCTGAC 3' 27

F373P: F373PFw 5'CAGGCCGTCTTCCCGGCCAATTTCACTGAG 3' 28

F373P: F373PRv 5'CTCAGTGAAATTGGCCGGGAAGACGGCCTG 3' 29

F373W: F373WFw 5'CAGGCCGTCTTCTGGGCCAATTTCACTGAG 3' 30

F373W: F373WRv 5'CTCAGTGAAATTGGCCCAGAAGACGGCCTG 3' 31

F373Y: F373YFw 5'CAGGCCGTCTTCTACGCCAATTTCAC 3' 32

F373Y: F373YRv 5'GTGAAATTGGCGTAGAAGACGGCCTG 3' 33

Ejemplo 3: Analisis de la actividad enzimatica de la GOx mutante

Se produjo GOx mutante usando el plasmido de expresion de GOx mutante obtenido en el Ejemplo 2, y se estudio su actividad enzimatica.

(1) Cultivo

Se transformo la cepa BL21 de Escherichia coli (DE3) con el plasmido de expresion de GOx de tipo silvestre preparado en el Ejemplo 1 o el plasmido de expresion de GOx mutante preparado en el Ejemplo 2. Se cultivaron estos transformantes por separado con agitacion a 37 °C durante 12 horas en 3 ml de un medio LB (que contema 100 ig/ml ampicilina) usando un tubo en forma de L. Se inoculo 1 ml de cada una de estas soluciones de cultivo a un matraz Erlenmeyer de 500 ml con un deflector que contema 100 ml de un medio LB (que contema 100 ig/ml de ampicilina), y se cultivo con rotacion a 37 °C. En el punto temporal en el que se alcanzo una DE600 de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 0,6, se anadio IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosido), a una concentracion final de 0,5 mM, tras lo que se cultivo a 20 °C durante 24 horas.

(2) Preparacion de la fraccion de cuerpo de inclusion

Se recogieron y se lavaron celulas bacterianas de la solucion de cultivo asf cultivada. A continuacion, se suspendieron las celulas bacterianas humedas obtenidas en un tampon de fosfato de potasio 20 mM (pH 6,8), y se sonicaron. A continuacion, se centrifugo el homogeneizado a 17.400 xg a 4 °C durante 20 minutos, y se uso el precipitado como una fraccion insoluble. Se lavo la fraccion insoluble obtenida con una solucion de lavado (1) (tampon de fosfato de potasio pH 6,8 + NaCl 100 mM + EDTA 1 mM + Triton X-100 al 1 %) y se centrifugo a 10.000 xg a 4 °C durante 10 minutos. Se lavo el precipitado con una solucion de lavado (2) (tampon de fosfato de potasio, pH 6,8 + NaCl 100 mM + EDTA 1 mM) y se centrifugo a 10.000 xg a 4 °C durante 10 minutos. Se lavo el precipitado adicionalmente con una solucion de lavado (3) (urea 20 mM + tampon de fosfato de potasio 2 mM, pH 6,8) y se centrifugo a 10.000 xg a 4 °C durante 10 minutos. El cuerpo de inclusion se recogio como un precipitado. La mayor parte de este cuerpo de inclusion es GOx.

(3) Replegamiento del cuerpo de inclusion

Se suspendio el cuerpo de inclusion preparado de esta manera en un tampon de solubilizacion (urea 8 M + ditiotreitol (DTT) 30 mM + tampon de fosfato de potasio 20 mM, pH 6,8), y se uso esta suspension como una fraccion de cuerpo de inclusion solubilizada. Se diluyo el cuerpo de inclusion solubilizado con un tampon de solubilizacion a una concentracion de protema de 0,1 mg/ml, y se sometio a dialisis frente a un volumen de 100 veces o superior de un tampon de replegamiento (glutation 1 mM (forma reducida) + glutation 1 mM (forma oxidada) + dinucleotido flavina adenina 0,05 mM + glicerol al 10 % (p/v) (vol/vol) + tampon de fosfato de potasio 20 mM, pH 6,8) durante 24 horas. A continuacion, se volvio a someter a dialisis la solucion resultante contra tampon de fosfato de potasio 20 mM (pH 6,8) durante 12 horas y se centrifugo a 17.400xg a 4 °C durante 3 minutos para eliminar los agregados de protemas. Se uso el sobrenadante como una muestra de GOx para determinar las actividades de la glucosa oxidasa (GOx) y la glucosa deshidrogenasa (GDH) a 25 °C para la GOx de tipo silvestre y la GOx mutante.

(4) Determinacion de la actividad de GOx

La actividad de GOx se determino mediante la determinacion del cambio de absorbancia a 546 nm con el tiempo derivado de un colorante generado usando peroxidasa, un reactivo de Trinder (TODB) y 4-aminoantipirina de peroxido del hidrogeno generado a traves de la reaccion con el sustrato. La reaccion se realizo en las condiciones mostradas a continuacion.

La reaccion se inicio mediante la adicion de sustrato a una solucion de reaccion (tampon de fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0 + 4-aminoantipirina 1,5 mM + TODB 1,5 mM + 2 U/ml de peroxidasa; todas las concentraciones siendo concentraciones finales) que contema la solucion de enzima, y se determino el cambio de absorbancia a 546 nm. Se usaron diversas concentraciones de glucosa como sustrato. 1 U se define como la cantidad de una enzima que forma 1 |imol de peroxido de hidrogeno durante 1 minuto. Se uso 38 mM-1 cm-1 como coeficiente de absorcion molar de TODB a pH 7,0. A continuacion, se muestra la formula para calcular un valor de actividad a partir del cambio en la absorbancia.

U/ml = AABS546/min x 2/38 x 10 U/mg = U/ml/mg de protema/ml

(5) Determinacion de la actividad de GDH

La actividad de GDH se determino mediante la cuantificacion del cambio de absorbancia a 600 nm con el tiempo derivado del desvanecimiento de DCIP reducido a traves de la reaccion con el sustrato. La reaccion se realizo en las condiciones mostradas a continuacion.

La reaccion se inicio mediante la adicion de sustrato a una solucion de reaccion (tampon de fosfato de potasio 10 mM, pH 7,0 + PMS 0,6 mM + DCIP 0,06 mM; todas las concentraciones siendo concentraciones finales) que contema la solucion de enzima, y se determino el cambio en la absorbancia a 600 nm. Como sustrato, se usaron los usados en la determinacion de la actividad de GOx. 1 U se define como la cantidad de una enzima que reduce 1 |imol de DCIP. El valor de la actividad se calculo de acuerdo con la formula mostrada a continuacion. Se uso 16,3 mM-1 cm-1 como coeficiente de absorcion molar de DCIP a pH 7,0.

U/ml = AABS600/min x 1/16,3 x 10

U/mg = U/ml/mg de protema/ml

En las Tablas 3 y 4, se muestran los resultados de la determinacion de la actividad de la GOx de tipo silvestre y la GOx mutante (diferentes series). Por otra parte, en la Figura 1, se muestra un grafico que presenta las proporciones de las actividades de oxidasa y deshidrogenasa de diversos mutantes a una concentracion de sustrato de glucosa

de 10 mM con respecto a las actividades de tipo silvestre. Los mutantes S132 y F373 resultaron tener una menor actividad de oxidasa y una mayor actividad de deshidrogenasa en comparacion con el tipo silvestre. Entre ellos, el mutante S132A resulto tener una mayor actividad de deshidrogenasa, 4 veces superior o mas a la del tipo silvestre, y una actividad de oxidasa aproximadamente un 40 % inferior a la del tipo silvestre.

Tabla 3

: GOx (U/mg) GDH (U/mg) GDH/GOx (%)

Sustrato (mM)
Sustrato (mM)
Sustrato (mM)

: 10 100 10 100 10 100

Tipo silvestre: 9,05 (100 %) 15,0 (100 %) 2,25 (100 %) 3,83 (100 %) 24,8 25,6

F373A: 1,38 (15,2 %) 1,53 (10,3 %) 2,68 (119 %) 3,38 (88,2 %) 194 220

F373L: 7,62 (84,2 %) 10,0 (67,1 %) 4,38 (195 %) 6,27 (164 %) 57,5 62,4

F373W: 2,91 (32,2 %) - 0,496 (22,0 %) - 17,0 -

F373Y: 6,94 (76,7 %) 10,2 (68,0 %) 1,35 (60,0 %) 2,03 (53,0 %) 19,4 20,0

Tabla 4

: GOx (U/mg) GDH (U/mg) GDH/GOx (%)

: Sustrato (mM) Sustrato (mM) Sustrato (mM)

: 10 100 10 100 10 100

Tipo silvestre: 31,3 (100 %) 47,4 (100 %) 8,13 (100 %) 13,1 (100 %) 26 27,7

S132A: 10,8 (34,50%) 14,9 (31,40%) 24,3 (299 %) 53,5 (408 %) 225 360

S132C: 0,592 (1,89%) 1,86 (3,92 %) 0,779 (9,58 %) 4,21 (32,10%) 132 226

S132I: 0,171 (0,55%) 1,16 (2,46 %) 0,319 (3,92%) 2,74 (20,90 %) 186 236

S132N: 0,0098 (0,03 %) 0,0514 (0,11 %) 0,0169 (0,21 %) 0,185 (1,41 % 173 360

S132R: n.d. n.d. n.d. n.d. - -

S132D: n.d. n.d. n.d. n.d. - -

S132T: 6,94 (29,10%) 11,2 (28,90%) 1,84 (27,70%) 3,02 (26,90 %) 26,5 27,1

S132V: 0,0858 (0,36 %) 0,531 (1,38%) 0,298 (4,49 %) 1,37 (12,20%) 347 259

S132Y: n.d. n.d. n.d. n.d. - -

S132E: n.d. n.d. n.d. n.d. - -

S132H: n.d. n.d. n.d. n.d. - -

S132M: n.d. 0,0265 (0,06 %) n.d. 0,101 (0,84%) - 380

S132Q: n.d. 0,0399 (0,08 %) n.d. 0,17 (1,42 %) - 426

S132A/F373 A: 0,358 (3,96 %) 0,434 (2,90 %) 3,55 (158 %) 8,07 (211 %) 991 1,86 x 103

S132A/F373 L: 2,65 (29,30 %) 3,2 (21,40 %) 8,75 (389 %) 19,7 (515 %) 330 616

10 Ejemplo 4: Preparacion y analisis de la actividad enzimatica de GOx de tipo silvestre y mutante derivada de Aspergillus niger

Se prepararon GOx de tipo silvestre y mutante de A. niger (SwissProt P13006) como se describe en los Ejemplos 1 y 2. El resto de treonina situado en 132 y el resto de fenilalanina situado en 373 de A. niger (SwissProt P13006) 15 corresponden al resto de serina situado en 132 y al resto de fenilalanina situado en 373 de Penicillium amagasakiens (GenBank AADO1493), respectivamente.

Se preparo GOx mutante de A. niger, y se analizo su actividad enzimatica como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados de las GOx de tipo silvestre y mutante se resumen en la siguiente Tabla 5.

Tabla 5

: GOx (U/mg) GDH (U/mg) GDH/GOx (%)

: Sustrato (mM) Sustrato (mM) Sustrato (mM)

: 50 mM 200 mM 50 mM 200 mM 50 mM 200 mM

Tipo silvestre: 3,43 (100 %) 5,01 (100 %) 1,37 (100 %) 2 (100 %) 40 (100 %) 40 (100 %)

T132A: 2,46 (71,70%) 3,82 (76,20 %) 4,04 (295 %) 10,1 (502 %) 164 (411 %) 263 (658 %)

T132S: 6,64 (193 %) 10,2 (204 %) 4,43 (322 %) 7,13 (356 %) 66,7 (167 %) 69,7 (174 %)

F373Y: 2,05 (59,80 %) 3,14 (62,80%) 1,16 (84,10%) 2,08 (104 %) 56,3 (141 %) 66,2 (165 %)

5

10

15

20

25

La Tabla 6 y 7 muestran el alineamiento de las secuencias de aminoacidos que estan anotadas como glucosa oxidasas. Las secuencias enteras de estas glucosa oxidasas mutadas se exponen en SEC ID N°: 1-21. El alineamiento se creo usando la aplicacion AlignX de Vector NTI Suite 6.0. Los expertos en la materia apreciaran que otros programas informaticos de alineamiento tales como BLAST proporcionaran el mismo o sustancialmente el mismo alineamiento.

De la Tabla 6, se desprende que Ser132 de SEC ID N°: 1 se conserva entre las secuencias de aminoacidos enumeradas en la Tabla 6. Por consiguiente, el experto en la materia puede identificar facilmente el resto de Ser o Thr que corresponde a la Ser132 de la SEC ID N°: 1 dentro de la region conservada usando cualquiera de los programas informaticos disponibles en el mercado para el alineamiento de secuencias, y comprender que se prepara facilmente una glucosa oxidasa mutante mediante la introduccion de la modificacion en el resto de Ser o Thr. (Nota: *Bases de datos: gb: GenBank; sp: Swissprot; ref: RefSeq; emb: EMBL; pdb: Protein Data Bank; **SEC ID N° representan la secuencia de longitud completa).

Tabla 6

Origen*: Posicion de la mutacion SEC ID N°**

gb|AAD01493: S132 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142 1

gb|ABM63225: S132 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142 2

sp|Q92452: S132 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142 3

ref|XP 002482295: S163 153 LGGSTLINGDSWTRPDKIQID 173 4

emb|CAE47418: S132 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142 5

ref|XP 002563451: S132 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142 6

ref|XP 001217613: S156 146 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 166 7

ref|XP 001215424: S130 120 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 140 8

ref|XP 001727544: S133 123 LGGSTLINGGSWTRPDKVQID 143 9

ref|XP 002375824: S133 123 LGGSTLINGGSWTRPDKVQID 143 10

ref|XP 001216461: S133 123 LGGSTLVNGGSWTSPDKVQLD 143 11

gb|ADP03053: T110 100 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 120 12

gb|ACR56326: T132 122 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 142 13

sp|P13006: T132 122 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 142 14

gb|ABG54443: T108 98 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 118 15

gb|AAV68194: T108 98 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 118 16

gb|AAF59929: T132 122 LGGSTLVNGGIWTRPHKAQVD 142 17

gb|ABG66642: T108 98 LGGSSLVNGGIWTRPHKAQVD 118 18

emb|CAC12802: T131 121 LGGSTLVNGGIWTRPHKVQVD 141 19

ref|XP 001588502: T130 120 LGGSTLINGAIWTRPHKIQVD 140 20

ref|XP 001395420: T163 153 LGGSTLINGGIWTRPHKSQLD 173 21

De la Tabla 7, se desprende que Phe373 de SEC ID N°: 1 se conserva entre las secuencias de aminoacidos enumeradas en la Tabla 7. Por consiguiente, el experto en la materia puede identificar facilmente el resto de Phe correspondiente a Phe373 de SEC ID N°: 1 dentro de la region conservada usando cualquiera de los programas informaticos disponibles en el mercado para el alineamiento de secuencias, y comprender que se prepara facilmente una glucosa oxidasa mutante mediante la introduccion de la modificacion en que el resto de Phe. (Nota: *Bases de datos: gb: GenBank; sp: Swissprot; ref: RefSeq; emb: EMBL; pdb: Protein Data Bank; **SEC ID N° representan la secuencia de longitud completa).

Tabla 7

Origen*: Posicion de la mutacion SEC ID N°**

gb|AAD01493: F373 363 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 383 1

gb|ABM63225: F373 363 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 383 2

sp|Q92452: F373 363 AGAGQGO--AVFFANFTETFGDY 383 3

ref|XP 002482295: F404 394 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 414 4

emb|CAE47418: F373 363 AGTGQGQ--AVFFANFTEVFGDY 383 5

ref|XP 002563451: F372 363 A-PGQGQ--AAYFANFTEVLGDH 382 6

ref|XP 001217613: F397 387 AGFGQGQ--AVYFANFTETFGED 407 7

ref|XP 001215424: F371 361 AGFGQGQ--AVYFANFTETFEED 381 8

ref|XP 001727544: F374 364 SGAGQGQ--AVYFASFNETFGDY 384 9

ref|XP 002375824: F374 364 SGAGQGQ--AVYFASFNETFGDY 384 10

ref|XP 001216461: F374 364 TGAGQGQ--AVYFANFTETFGDH 384 11

gb|ADP03053: F351 341 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 361 12

gb|ACR56326: F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383 13

sp|P13006: F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383 14

gb|ABG54443: F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 359 15

gb|AAV68194: F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 359 16

gb|AAF59929: F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383 17

gb|ABG66642: F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETLGDY 359 18

emb|CAC12802: F372 362 AGAGQGQ--VAIFATFNETFGDY 382 19

ref|XP 001588502: F373 363 LGYGQGQ--AIYFATFNETFGKY 383 20

ref XP 001395420: F422 412 EANGQGQ--AAYFATFAEIFGKD 432 21

Ejemplo 5: GOx mutantes adicionales

5 Se prepararon GOx mutantes adicionales derivadas de GOx de Penicillium amagasakiens (GenBank AADO1493) y Aspergillus niger (SwissProt P13006), y se analizo su actividad enzimatica como se describe en los Ejemplos 1-4. La proporcion de la actividad de la glucosa deshidrogenasa con respecto a la actividad de la glucosa oxidasa de cada mutante se resume en las siguientes Tablas 8a, 8b, 9a y 9b, siendo la proporcion de la glucosa oxidasa de tipo silvestre del 100 %. Las SEC ID N° de las secuencias de aminoacidos de cada GOx de tipo silvestre se muestran en 10 las Tablas 6 y 7. Tambien se muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos en torno a las posiciones mutadas en las Tablas 10a-h.

Tabla 8a

: 1GPE (AADO1493)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 10 mM Glucosa 100 mM

: Tipo silvestre 100 % 100 %

Thr53: Thr53Ser 125 % -

lIel16: Ile116Val 101 % -

Ser132: Ser132Ala 839 % 1.235 %

: Ser132Thr 95 % 93 %

: Ser132val 1.248 % 888 %

: Ser132Cys 508 % 817 %

: Ser132Ile 715 % 851 %

Ile237: Ile237Val - 182 %

Val371: Vla1371Thr 118 % 113 %

: Val371Ala 111 % 107 %

Phe373: Phe373Leu 246 % 231 %

: Phe373Tyr 171 % 165 %

: Phe373Ala 862 % 885 %

Glu434: Glu434Gln 215 % 134 %

Phe436: Phe436Trp - 1365 %

: Phe436Ala 544 % 592 %

: 1GPE (AADO1493)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 10 mM Glucosa 100 mM

: Phe436Leu - 127 %

: Phe436Tyr - 783 %

Trp448: Trp448Ala 1.630 %- 1440 %

: Trp448Ile - 4382 %

: Trp448Ser - 644 %

Trp537: Trp537Ala 546 % 550 %

Tabla 8b

: 1GPE (AADO1493)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 10 mM Glucosa 100 mM

: Tipo silvestre 100 % 100 %

Phe373: Phe373Met - 195 %

: Phe373Trp - 111 %

Phe436: Phe436Met - 155

: Phe436Glu - <no oxidasa>

Trp448: Trp448Val - 4011 %

: Trp448Met - <no oxidasa>

: Trp448Thr - 2290 %

: Trp448Cys - 4427 %

Tabla 9a

1CF3(P13006)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 50 mM Glucosa 200 mM

: Tipo silvestre 100 % 100 %

Thr132: Thr132Ala 403 % 537 %

: Thr132Ser 155 % 112 %

: Thr132Val 323 % 503 %

: Thr132Trp 545 % 416 %

: Thr132Cys 1013 % 875 %

Thr134: Thr134Ala 373 % 445 %

Phe237: Phe237Ile 142 % 120 %

Ala371: Ala371Val 223 % 180 %

Phe373: Phe373Leu 293 % 316 %

: Phe373Tyr 170 % 159 %

: Phe373Met 149 % 141 %

: Phe373Asn 235 % 206 %

Trp448: Trp448Ala 488 % 610 %

Mutante doble: Thr132Ala/Phe373Tyr 928 % 1511 %

Mutante doble: Thr132Ser/Phe373Leu 633 % 794 %

5 Tabla 9b

1CF3(P13006)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 50 mM Glucosa 200 mM

: Tipo silvestre 100 % 100 %

Thr134: Thr134Ile - 300 %

1CF3(P13006)

: Tipo de enzima Proporcion de Dh/Ox frente al tipo silvestre


: Glucosa 50 mM Glucosa 200 mM

: Thr134Met - 170 %

Phe237: Pre237Ala <no oxidasa>

: Phe237Val - 210 %

: Phe237Met - 280 %

: Phe237Ser - 780 %

: Phe237Asp - 1.600 %

: Phe237Leu - 170 %

: Phe237Thr - 2.900 %

: Phe237Asn - 600 %

: Phe237Arg - <no oxidasa>

: Phe237Cys - 650 %

Phe436: Phe436Leu - 1.760 %

: Phe436Ile - 1.818 %

: Phe436Met - 140 %

Trp448: Trp448Gly - 819 %

: Trp448Val - 11.134%

: Trp448Leu - 7742 %

: Trp448Ser - 426 %

: Trp448Asn - 642 %

: Trp448Asp - 4.368 %

: Trp448Lys - <no oxidasa>

: Trp448Ile - 940 %

: Trp448Met - 1.100 %

: Trp448Phe - 400 %

: Trp448Thr - 310 %

: Trp448Cys - 590 %

: Trp448Gln - 680 %

: Trp448Tyr - 270 %

Tabla 10a. Secuencia de aminoacidos en torno a Thr535

Origen: Posicion de la mutacion Secuencias de aminoacidos en torno a la/s posicion/es mutada/s

gbAAD01493: T53 43 YDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 63

gbABM63225: T53 43 YDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 63

spQ92452: T53 43 YDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 63

refXP 002482295: T84 74 YDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 94

embCAE47418: T53 43 YDYIIAGGGLTGLTVAAKLSE 63

refXP 002563451: T53 43 YDYVIAGGGLTGLTVAAKLSE 63

refXP 001217613: T77 67 FDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 87

refXP 001215424: T51 41 FDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 61

refXP 001727544: T53 43 FDYVIAGGGLTGLTVATKLTE 63

refXP 002375824: T53 43 FDYVIAGGGLTGLTVATKLTE 63

refXP 001216461: T53 43 VDYIIAGGGLTGLTVAAKLTE 63

gbADP03053: T30 20 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 40

gbACR56326: T52 42 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 62

spP13006: T52 42 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 62

gbABG54443: T28 18 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 38

gbAAV68194: T28 18 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 38

gbAAF59929: T52 42 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 62

gbABG66642: T28 18 VDYIIAGGGLTGLTTAARLTE 38

embCAC12802: T51 41 VDDIIAGGGLTGLTTAARLTE 61

refXP 001588502: T50 40 FDYIVAGGGLTGLTAAAILSK 60

Tabla 10b. Secuencia de aminoacidos en torno a lle116

gbAAD01493: I116 106 VPL--INNRTNN1KAGKGLGGST 126

gbABM63225: I116 106 VPL--INNRTNN1KAGKGLGGST 126

spQ92452: I116 106 VPL--INNRTNN1KAGKGLGGST 126

refXP 002482295: I147 137 VPL--INNRTNN1KAGKGLGGST 157

embCAE47418: I116 106 VPL--INNRTSS1KSG KG LGGST 126

refXP 002563451: I116 106 VPL--INNRTGE1KSGLGLGGST 126

refXP 001217613: I140 130 VPL--INNRTDN1KSGKGLGGST 150

refXP 001215424: I114 104 VPL--INNRTDN1KSGKGLGGST 124

refXP 001727544: I117 106 VPLA-VNNRTEL1RSGNGLGGST 127

refXP 002375824: I117 106 VPLA-VNNRTEL1RSGNGLGGST 127

refXP 001216461: I117 106 VPMG-INNRTLD1KSGKGLGGST 127

gbADP03053: I94 83 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 104

gbACR56326: I116 105 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 126

spP13006: I116 105 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 126

gbABG54443: I92 81 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 102

gbAAV68194: I92 81 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 102

gbAAF59929: I116 105 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGST 126

gbABG66642: I92 81 VELA-TNNQTAL1RSGNGLGGSS 102

embCAC12802: I115 104 VELA-TNNLTEL1RSGNGLGGST 125

refXP 001588502: I114 103 LNQT-ADIPQQT1RSGRGLGGST 124

Tabla 10c. Secuencia de aminoacidos en torno a S/T132, W133 y T134

gbAAD01493: S132,W133,T134 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142

gbABM63225: S132,W133,T134 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142

spQ92452: S132,W133,T134 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142

refXP 002482295: S163,W164,T165 153 LGGSTLINGDSWTRPDKIQID 173

embCAE47418: S132,W133,T134 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142

refXP 002563451: S132,W133,T134 122 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 142

refXP 001217613: S156,W157,T158 146 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 166

refXP 001215424: S130,W131,T132 120 LGGSTLINGDSWTRPDKVQID 140

refXP 001727544: S133,W134,T135 123 LGGSTLINGGSWTRPDKVQID 143

refXP 002375824: S133,W134,T135 123 LGGSTLINGGSWTRPDKVQID 143

refXP 001216461: S133,W134,T135 123 LGGSTLVNGGSWTSPDKVQLD 143

gbADP03053: T110,W111,T112 100 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 120

gbACR56326: T132,W133,T134 122 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 142

spP13006: T132,W133,T134 122 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 142

gbABG54443: T108,W109,T110 98 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 118

gbAAV68194: T108,W109,T110 98 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 118

gbAAF59929: T132,W133,T134 122 LGGSTLVNGGTWTRPHKAQVD 142

gbABG66642: T108,W109,T110 98 LGGSSLVNGGTWTRPHKAQVD 118

embCAC12802: T131,W132,T133 121 LGGSTLVNGGTWTRPHKVQVD 141

refXP_001588502: T130,W131,T132 120 LGGSTLINGATWTRPHKIQVD 140

Tabla 10d. Secuencia de aminoacidos en torno a I/F237

gbAAD01493: I237 227 LCGHPRGVSM1MNNLDE--NQVR 247

gbABM63225: I237 227 LCGHPRGVSM1MNNLDE--NQVR 247

spQ92452: I237 227 LCGHPRGVSM1MNNVDE--NQVR 247

refXP 002482295: I268 258 LCGHPRGVSM1MNNVDE--NQVR 278

embCAE47418: I237 227 LCGHPRGVSM1YNNLDE--NQVR 247

refXP 002563451: I237 227 HCGHPRGVSM1PNNLHE--NQIR 247

refXP 001217613: I261 251 HCGHPRGVSM1PNNLLE--DQVR 271

refXP 001215424: I235 225 HCGHPRGVSM1PNNLLE--DQVR 245

refXP 001727544: I238 228 HCGHPRGVSM1PNAVHE--DQTR 248

refXP 002375824: I238 228 HCGHPRGVSM1PNAVHE--DQTR 248

refXP 001216461: I238 228 HCGHPRGVSM1LNSLHE--DQTR 248

gbADP03053: F215 205 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 225

gbACR56326: F237 227 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 247

spP13006: F237 227 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 247

gbABG54443: F213 203 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 223

gbAAV68194: F213 203 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 223

gbAAF59929: F237 227 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 247

gbABG66642: F213 203 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 223

embCAC12802: F236 226 GCGDPHGVSMFPNTLHE--DQVR 246

refXP 001588502: F235 225 SCGNPHGVSMFPNSLHANWNQTR 247

Tabla 10e. Secuencia de aminoacidos en torno a V/A/I371 y F373

gbAAD01493: V371,F373 363 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 383

gbABM63225: V371,F373 363 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 383

spQ92452: V371 ,F373 363 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 383

refXP 002482295: V402,F404 394 AGAGQGQ--AVFFANFTETFGDY 414

embCAE47418: V371,F373 363 AGTGQGQ--AVFFANFTEVFGDY 383

refXP 002563451: A370,F372 363 A-PGQGQ--AAYFANFTEVLGDH 382

refXP 001217613: V395,F397 387 AGFGQGQ--ABVYFANFTETFGED 407

refXP 001215424: V369,F371 361 AGFGQGQ--AVYFANFTETFEED 381

refXP 001727544: V372,F374 364 SGAGQGQ--AVYFASFNETFGDY 384

refXP 002375824: V372,F374 364 SGAGQGQ--AVYFASFNETFGDY 384

refXP 001216461: V372,F374 364 TGAGQGQ--AVYFANFTETFGDH 384

gbADP03053: A349,F351 341 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 361

gbACR56326: A371 ,F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383

spP13006: A371 ,F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383

gbABG54443: A347,F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 359

gbAAV68194: A347,F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 359

gbAAF59929: A371 ,F373 363 AGAGQGQ--AAWFATFNETFGDY 383

gbABG66642: A347,F349 339 AGAGQGQ--AAWFATFNETLGDY 359

embCAC12802: A370,F372 362 AGAGQGQ--VAIFATFNETFGDY 382

refXP 001588502: 1371,F373 363 LGYGQGQ--A1YFATFNETFGKY 383

5 _______________Tabla 10f. Secuencia de aminoacidos en torno a E434 y F436

gbAAD01493: E434,F436 426 LDED--VAFAELFMDT--EGKINFD 446

gbABM63225: E434,F436 426 LDED--VAFAELFMDT--EGKINFD 446

spQ92452: E434,F436 426 LDED--VAFAELFMDT--EGKINFD 446

refXP 002482295: E435,F467 457 LDED--VAFAELFMDT--EGKINFD 477

embCAE47418: E434,F436 426 LEED--VAYAELFM DT--SGKINFD 446

refXP 002563451: E433,F435 425 LDED--VAFAELFFDT--EGKINFD 445

refXP 001217613: E458,F460 450 LNED--VAYAELFLDT--SGQINFD 470

refXP 001215424: E432,F434 424 LNED--VAYAELFLDT--SGQI NFD 444

refXP 001727544: E435,F437 427 LNED--VAFAELFLDT--EGKINFD 447

refXP 002375824: E435,F437 427 LNED--VAFAELFLDT--EGKINFD 447

refXP 001216461: E435,F437 427 LEDD--VAFVEFFFDS--NGMINFD 447

gbADP03053: E412,F414 404 VNHN--VAYSELFLDT--AGVASFD 424

gbACR56326: E434,F436 426 VKDN--VAYSELFLDT--AGVASFD 446

spP13006: E434,F436 426 VNHN--VAYSELFLDT--AGVASFD 446

gbABG54443: E410,F412 402 VKDN--VAYSELFLDT--AGVASFD 422

gbAAV68194: E410,F412 402 VKDN--VAYSELFLDT--AGVASFD 422

gbAAF59929: E434,F436 426 VNHN--VAYSELFLDT--AGVASFD 426

gbABG66642: E410,F412 402 VKDN--VAYSELFLDT--AGVASFG 422

embCAC12802: E433,F435 425 VNHN--VAYSELFLDT--AGAVSFT 445

refXP 001588502: E434,F436 426 TKDN--IAYSELFMDT--EGAINFD 446

Tabla 10g. Secuencia de aminoacidos en torno a W448

Origen: Posicion de la Secuencias de aminoacidos en torno a la/s

mutacion: posicion/es mutada/s

gbAAD01493: W448 438 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 458

gbABM63225: W448 438 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 458

spQ92452: W448 438 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 458

refXP 002482295: W479 469 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 489

embCAE47418: W448 438 DT--SGKINFDLWDLIPFTRGSV 458

refXP 002563451: W447 437 DT--EGKINFDIWNLIPFTRGSV 457

refXP 001217613: W472 462 DT--SGQINFDLWDLIPFTRGST 482

refXP 001215424: W446 436 DT--SGQINFDLWDLIPFTRGST 456

refXP 001727544: W449 439 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 459

refXP 002375824: W449 439 DT--EGKINFDLWDLIPFTRGSV 459

refXP 001216461: W449 439 DS--NGMINFDLWDLIPFTRGST 459

gbADP03053: W426 416 DT--AGVASFDVWDLLPFTRGYV 436

gbACR56326: W448 438 DT--AGVASFDVWDLLPFTRGYV 458

spP13006: W448 438 DT--AGVASFDVWDLLPFTRGYV 458

gbABG54443: W424 414 DT--AGVASFDVWDLLPFTRGYV 434

gbAAV68194: W424 414 DT--AGVASFDVWDLLPFTRGYV 434

gbAAF59929: W448 438 DT--AGVASFDVWDLLPFDRGYV 458

gbABG66642: W424 414 DT--AGVASFGVWDLLPFTRGYV 434

embCAC12802: W447 437 DT--AGAVSFTIWDLIPFTRGYV 457

refXP 001588502: W448 438 DT--EGAINFDLWTLIPFTRGFV 458

Tabla 10h. Secuencia de aminoacidos en torno a W/Y537

gbAAD01493: W537 527 DYVLQN-FRPNWHAVSSCSMMS 547

gbABM63225: W537 527 DYVLQN-FRPNWHAVSSCSMMS 547

spQ92452: W537 527 DYVLQN-FRPNWHAVSSCSMMS 547

refXP 002482295: W568 558 AYVLQN-FRPNWHAVSSCSMMS 578

embCAE47418: W537 527 DYVIQN-FRPNWHAVSSCSMMA 547

refXP 002563451: W536 526 DYVMMN-FRPNWHAVSTCSMMS 546

refXP 001217613: W561 551 EYVKDN-FRANWHAVGTCSMMS 571

refXP 001215424: W535 525 EYVKDN-FRANWHAVGTCSMMS 545

refXP 001727544: W538 528 DYVKEN-FRANWHAVSSCSMMS 548

refXP 002375824: W538 528 DYVKEN-FRANWHAVSSCSMMS 548

refXP 001216461: W539 529 EYVKQN-FRANWHAVSTCAMMS 549

gbADP03053: Y515 505 EYIPYH-FRPNYHGVGTCSMMP 525

gbACR56326: Y537 527 EYIPYN-FRPNYHGVGTCSMMP 547

spP13006: Y537 527 EYIPYH-FRPNYHGVGTCSMMP 547

gbABG54443: Y513 503 EYIPYN-FRPNYHGVGTCSMMP 523

gbAAV68194: Y513 503 EYIPYN-FRPNYHGVGTCSMMP 523

gbAAF59929: Y537 527 EYIPYH-FRPNYHDVGTCSMMP 547

gbABG66642: Y513 503 EYIPYN-FRPNYHGVGTCSMMP 523

embCAC12802: Y536 526 EYIKYN-FRPNYHGVGTCSMMK 546

refXP 001588502: Y538 528 SYVKQN-FRPNYHNVGSCSMMA 548

Aplicabilidad Industrial

La glucosa oxidasa mutada de la invencion se puede usar para la medicion de la glucosa, lo que es de utilidad 5 clmica en el diagnostico y el control de las afecciones diabeticas.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Una glucosa oxidasa mutante modificada en una o mas posiciones seleccionadas entre:

(a) una posicion correspondiente a la posicion 53 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con Ser;

(b) una posicion correspondiente a la posicion 116 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Ile con Val;

(c) una posicion correspondiente a la posicion 132 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1

mediante la sustitucion del resto de aminoacido Ser con Ala, Thr, Val, Cys o Ile, o mediante la sustitucion del resto

de aminoacido Thr con Ala, Ser, Val, Trp o Cys;

(d) una posicion correspondiente a la posicion 134 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Thr con Ala, Ile o Met;

(e) una posicion correspondiente a la posicion 237 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Ile con Val, o mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con Ile, Ala, Val, Met, Ser, Asp, Leu, Thr, Asn, Arg o Cys;

(f) una posicion correspondiente a la posicion 371 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1

mediante la sustitucion del resto de aminoacido Val con Thr, Ala, o mediante la sustitucion del resto de aminoacido

Ala con Val;

(g) una posicion correspondiente a la posicion 373 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con Leu, Tyr, Ala, Met, Asn o Trp;

(h) una posicion correspondiente a la posicion 434 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Glu con Gln;

(i) una posicion correspondiente a la posicion 436 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Phe con Trp, Ala, Leu, Tyr, Met, Glu o Ile;

(j) una posicion correspondiente a la posicion 448 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con Ala, Ile, Ser, Val, Met, Thr, Cys, Gly, Leu, Asn, Asp, Lys, Phe, Gln o Tyr; y

(k) una posicion correspondiente a la posicion 537 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1 mediante la sustitucion del resto de aminoacido Trp con Ala.
2. La glucosa oxidasa mutante de la reivindicacion 1, que tiene una actividad de oxidasa reducida en comparacion con la glucosa oxidasa de tipo silvestre.
3. La glucosa oxidasa mutante de la reivindicacion 1, que tiene una actividad de oxidasa inferior a su actividad de deshidrogenasa.
4. La glucosa oxidasa mutante de la reivindicacion 1, que tiene una actividad de deshidrogenasa del 50 % o mas de la glucosa oxidasa de tipo silvestre.
5. La glucosa oxidasa mutante de la reivindicacion 1, que tiene una proporcion de actividad de glucosa deshidrogenasa con respecto a la actividad de glucosa oxidasa superior a la de la glucosa oxidasa de tipo silvestre.
6. La glucosa oxidasa mutante de la reivindicacion 1 que tiene la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N° 1-21 modificadas en una o mas posiciones correspondientes a las posiciones 53, 116, 132, 134, 237, 371, 373, 434, 436, 448 o 537 de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEC ID N°: 1.
7. Un polinucleotido aislado que codifica la glucosa oxidasa mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Un vector que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 7.
9. Una celula hospedadora transformada con un vector de la reivindicacion 8.
10. Un metodo de determinacion de la glucosa en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con la glucosa oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y medir la cantidad de la glucosa oxidada por la glucosa oxidasa.
11. Un dispositivo para determinar la glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un mediador de electrones.
12. Un kit para determinar la glucosa en una muestra que comprende la glucosa oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un mediador de electrones
13. Un electrodo enzimatico que tiene la glucosa oxidasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que esta inmovilizado en el electrodo.
14. Un sensor enzimatico para determinar la glucosa que comprende el electrodo enzimatico de la reivindicacion 13 como electrodo de trabajo.