ES2314216T3 - Glucosa deshidrogenasa. - Google Patents
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Abstract
Glucosa deshidrogenasa modificada que presenta pirroloquinolina-quinona como coenzima y que presenta una mayor selectividad por la glucosa que la glucosa deshidrogenasa silvestre soluble en agua, en la que (a) Gln168 de PQQGDH soluble en agua derivada de Acinetobacter calcoaceticus está sustituido por otro residuo de aminoácido; (b) Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por otro residuo de aminoácido (c) tanto Gln168 como Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 están sustituidos por otros residuos de aminoácido; o (d) Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por otro residuo de aminoácido, y Asn428 está sustituido por otro residuo de aminoácido.
Description
Glucosa deshidrogenasa.
La presente invención se refiere a una glucosa
deshidrogenasa que presenta pirroloquinolina-quinona
como coenzima (PQQGDH) y a su preparación y su aplicación para la
cuantificación de glucosa.
La concentración de glucosa en sangre es un
marcador importante para el diagnóstico de la diabetes. Además, la
cuantificación de la concentración de glucosa se usa en la
monitorización del proceso de producción fermentativa usando
microorganismos. De manera convencional, la cuantificación de
glucosa se realiza mediante un método enzimático usando, glucosa
oxidasa (GOD) o glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G6PDH). Sin embargo, el método de la GOD requiere
la adición de catalasa o peroxidasa al sistema de ensayo para
cuantificar los niveles de peróxido de hidrógeno generado por la
reacción oxidativa de la glucosa. La G6PDH se ha usado para la
cuantificación de glucosa basándose en espectroscopía. Este método
implica la adición de coenzima NAD(P) al sistema de
ensayo.
Recientemente, la aplicación de PQQGDH, una
enzima que usa pirroloquinolina-quinina como
coenzima está atrayendo la atención, en lugar de la enzima usada en
el método de cuantificación de glucosa existente. La PQQGDH es una
glucosa deshidrogenasa que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima y cataliza la
reacción de oxidación de la glucosa para producir
gluconolactona.
Se conocen dos tipos de PQQGDH: unida a la
membrana y soluble en agua. La PQQGDH unida a la membrana es una
proteína de un solo péptido con un peso molecular aproximado de 87
kDa y se encuentra en una amplia variedad de bacterias Gram
negativas. Véase, por ejemplo, J. Bacteriol. (1990) 172,
6308-6315, A. M. Cleton-Jansen et
al. Por otro lado, la PQQGDH soluble en agua se ha encontrado
en algunas cepas de Acinetobacter calcoaceticus (Biosci.
Biotech. Biochem. (1995), 59 (8), 1548-1555) y se ha
clonado su gen estructural y se ha determinado su secuencia de
aminoácidos (Mol. Gen. Genet. (1989), 217:430-436).
La PQQGDH soluble en agua derivada de A. calcoaceticus es
una enzima homodimérica con un peso molecular aproximado de 50 kDa.
Muestra poca homología en la estructura primaria con otras enzimas
de PQQ.
Recientemente, se publicaron los resultados del
análisis estructural de rayos X de la PQQGDH soluble en agua y se
revelaron su conformación y su centro activo (A. Oubrie, et
al. (1999) J. Mol. Bio., 289, 319-333, A.
Oubrie, et al. (1999) The EMBO Journal, 18 (19),
5187-5194 y A. Oubrie, et al. (1999), PNAS 96
(21), 11787-11791). Estos informes demuestran que
la PQQGDH soluble en agua es una proteína de hélice \beta que
consiste en seis motivos W.
Se espera que la PQQGDH tenga potencial en los
ensayos de glucosa, por ejemplo, como dispositivo de reconocimiento
de un detector de glucosa, debido a que presenta una actividad
sumamente oxidativa hacia la glucosa y no requiere oxígeno como
aceptor de electrones ya que está acomplejada con una coenzima. Sin
embargo, la baja selectividad de la PQQGDH por la glucosa era un
obstáculo para este uso.
El objeto de esta invención es proporcionar una
PQQGDH soluble en agua modificada con una alta selectividad por la
glucosa.
Como resultado de la extensa investigación para
modificar mediante ingeniería genética la PQQGDH soluble en agua
convencional para desarrollar una PQQGDH que muestre una mayor
selectividad por la glucosa y que pueda aplicarse al diagnóstico
clínico y al análisis de alimentos, el inventor obtuvo de manera
satisfactoria una enzima con una mayor selectividad introduciendo
mutaciones en aminoácidos en ciertas regiones de la PQQGDH
soluble
en agua.
en agua.
La presente invención proporciona una glucosa
deshidrogenasa modificada soluble en agua que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
uno o más residuos de aminoácido de una glucosa deshidrogenasa
silvestre soluble en agua están sustituidos por otros residuos de
aminoácido y que presenta una alta selectividad por la glucosa en
comparación con la glucosa deshidrogenasa silvestre soluble en agua
tal como se caracteriza por las reivindicaciones adjuntas. La
glucosa deshidrogenasa modificada de la invención presenta una mayor
selectividad por la glucosa en comparación con la glucosa
deshidrogenasa silvestre soluble en agua. Preferiblemente, la
glucosa deshidrogenasa modificada de la invención presenta una
menor reactividad para la lactosa y maltosa que para la glucosa en
comparación con la enzima silvestre. Más preferiblemente, la glucosa
deshidrogenasa modificada de la invención presenta una reactividad
para la lactosa o maltosa inferior al 50%, incluso más
preferiblemente el 40% y lo más preferiblemente el 30% de la
reactividad para la glucosa (100%).
En el presente documento se describe una glucosa
deshidrogenasa modificada en la que uno o más residuos de
aminoácido en una región de aminoácidos 162-182 de
la PQQGDH soluble en agua derivada de Acinetobacter
calcoaceticus o en una región equivalente de otra especie están
sustituidos por otros residuos de aminoácido (es decir, residuos de
aminoácido diferentes de los encontrados en una glucosa
deshidrogenasa de PQQ que se produce de manera natural).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "equivalente" con referencia a las posiciones o
regiones de residuos de aminoácido significa que algunos residuos
de aminoácido o regiones presentan una función biológica o
bioquímica equivalente en dos o más proteínas que son
estructuralmente similares pero que no son idénticas. Por ejemplo,
se dice que una cierta región en la PQQGDH soluble en agua derivada
de organismos distintos de Acinetobacter calcoaceticus es
"equivalente a la región de residuos de aminoácido
186-206 de PQQGDH soluble en agua derivada de
Acinetobacter calcoaceticus" cuando la secuencia de
aminoácidos de una región de este tipo presenta una alta similitud
con respecto a la secuencia de aminoácidos en la región
162-182 de la PQQGDH soluble en agua derivada de
Acinetobacter calcoaceticus, y puede predecirse la misma
función de manera razonable basándose en la estructura secundaria
de las regiones relevantes en las proteínas. Adicionalmente, se
dice que el 7º residuo de aminoácido de esa región es "un residuo
de aminoácido en la posición equivalente a la del residuo de
aminoácido 168 de la PQQGDH soluble en agua derivada de
Acinetobacter calcoaceticus".
Preferiblemente, en la glucosa deshidrogenasa
modificada de la invención, Gln168 de PQQGDH soluble en agua
derivada de Acinetobacter calcoaceticus está sustituido por
otros residuos de aminoácido.
En otro aspecto, la invención muestra una
glucosa deshidrogenasa modificada que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1
está sustituido por otro residuo de aminoácido. Preferiblemente,
Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1
está sustituido por alanina, glicina, ácido glutámico, leucina,
fenilalanina, serina o ácido aspártico.
En otro aspecto, la invención muestra una
glucosa deshidrogenasa modificada que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
tanto Gln168 como Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en
la SEQ ID NO: 1 están sustituidos por otros residuos de aminoácido.
Preferiblemente, Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en
la SEQ ID NO: 1 está sustituido por alanina, glicina, ácido
glutámico, leucina, fenilalanina, serina o ácido aspártico. Más
preferiblemente, Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en
la SEQ ID NO: 1 está sustituido por ácido glutámico, y Gln168 está
sustituido por alanina, glicina, ácido glutámico, leucina,
fenilalanina, serina o ácido aspártico.
En otro aspecto, la invención muestra una
glucosa deshidrogenasa modificada que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1
está sustituido por otro residuo de aminoácido y Asn428 está
sustituido por otro residuo de aminoácido. Preferiblemente, Asp143
de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está
sustituido por ácido glutámico. Más preferiblemente, Asp143 de la
secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido
por ácido glutámico, y Asn428 está sustituido por treonina.
En otro aspecto, la invención muestra una
glucosa deshidrogenasa modificada que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1
está sustituido por otro residuo de aminoácido, y Asn428 está
sustituido por otro residuo de aminoácido. Preferiblemente, Gln168
de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está
sustituido por alanina, glicina, ácido glutámico, leucina,
fenilalanina, serina o ácido aspártico, y Asn428 está sustituido por
otro residuo de aminoácido. Más preferiblemente, Gln168 de la
secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido
por alanina, glicina, ácido glutámico, leucina, fenilalanina,
serina o ácido aspártico, y Asn428 está sustituido por
treonina.
En el presente documento se describe también una
glucosa deshidrogenasa modificada que presenta
pirroloquinolina-quinona como coenzima, en la que
Leu169 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1
está sustituido por otro residuo de aminoácido. Leu169 de la
secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 puede esta
sustituido por alanina, glicina, metionina, triptófano o lisina.
En otro aspecto, la glucosa deshidrogenasa
modificada de la invención comprende la secuencia de
aminoácidos:
Gly-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
en la que Xaa1 no es Gln y Xaa2 es
cualquier residuo de aminoácido. Preferiblemente, Xaa1 es Ala, Gly,
Glu, Leu, Phe, Ser o Asp, y Xaa2 es Ala o
Gly.
La invención proporciona también un gen que
codifica la glucosa deshidrogenasa modificada de la invención, un
vector que comprende el gen de la invención y un transformante que
comprende el vector, así como un kit de ensayo de glucosa y un
detector de glucosa que comprende la glucosa deshidrogenasa
modificada de la invención.
Puesto que la proteína enzimática de la glucosa
deshidrogenasa modificada de la invención muestra una alta
selectividad por y una alta actividad de oxidación para la glucosa,
puede aplicarse en la medición sumamente específica y sensible de
la glucosa.
La figura 1 muestra una estructura del plásmido
pGB2 usado para construir genes mutantes que codifican para las
PQQGDH modificadas de la presente invención.
La figura 2 muestra un método para la
construcción de genes mutantes que codifican para las PQQGDH
modificadas de la presente invención.
La figura 3 es una gráfica que muestra la
dependencia de la concentración de sustrato de la actividad de las
PQQGDH modificadas de la presente invención.
La presente solicitud describe una glucosa
deshidrogenasa modificada de la invención, uno o más residuos de
aminoácido en la región de aminoácidos 162-182 de
PQQGDH soluble en agua derivada de Acinetobacter
calcoaceticus o en una región equivalente de otra especie están
sustituidos por otros residuos de aminoácido. En una realización de
la presente invención, preferiblemente, Gln168 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por alanina
o glicina.
En otro aspecto de la PQQGDH modificada de la
invención, además de las modificaciones tal como se describieron
anteriormente, Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en la
SEQ ID NO: 1 está sustituido también por otro aminoácido,
preferiblemente por ácido glutámico. También preferiblemente, en la
PQQGDH modificada de la presente invención, además de las
modificaciones tal como se describieron anteriormente, Asn428 de la
secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está
sustituido también por otro aminoácido, preferiblemente por
treonina. La participación de Asp143 y Asn428 en el reconocimiento y
la unión de sustrato por la PQQGDH se describe en la descripción
pública de patente japonesa números 2001-346587 y
2001-197888, respectivamente. En general, sin
embargo, no puede hacerse ninguna predicción referente a los cambios
de selectividad por el sustrato y la actividad enzimática que
puedan producirse alterando simultáneamente los residuos de
aminoácido en diferentes dominios. En algunos casos se suprimirá
completamente la actividad enzimática. Por tanto, fue un
descubrimiento sorprendente en la presente invención que pudiera
lograrse una selectividad mejorada por la glucosa introduciendo
mutaciones dobles.
En otro aspecto, la glucosa deshidrogenasa
modificada de la presente invención comprende la secuencia de
aminoácidos:
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
en la que Xaa1 no es Gln y Xaa2 es
cualquier residuo de aminoácido. Preferiblemente, Xaa1 es Ala, Gly,
Glu, Leu, Phe, Ser o Asn, y Xaa2 es Ala o
Gly.
La secuencia del gen que codifica la PQQGDH
silvestre soluble en agua derivada de Acinetobacter
calcoaceticus se define en la SEQ ID NO: 2. Los genes que
codifican para las PQQGDH modificadas de la presente invención
pueden construirse sustituyendo las secuencias de nucleótidos que
codifican ciertos aminoácidos de la PQQGDH silvestre soluble en
agua por las secuencias de nucleótidos que codifican para los
aminoácidos que van a sustituirse. En la técnica se ha elaborado
una amplia gama de métodos para mutagénesis de sitio específico, tal
como se describe en, por ejemplo, Sambrook et al.,
"Molecular cloning; A Laboratory Manual", segunda edición,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
El gen mutante obtenido de esta manera se
inserta en un vector de expresión (tal como un plásmido) y se
transforma en un huésped apropiado (tal como E. coli). En la
técnica se ha desarrollado una amplia variedad de sistemas
huésped-vector para expresar proteínas exógenas. Por
ejemplo, pueden usarse como huéspedes bacterias, levadura y células
cultivadas.
Siempre que se conserve su actividad glucosa
deshidrogenasa, la PQQGDH modificada de la invención puede contener
además deleción, sustitución o adición de otros residuos de
aminoácido. En la técnica se encuentra disponible una amplia gama
de métodos para la sustitución de sitio específico.
Además, los expertos en la técnica pueden
determinar una región en una PQQGDH soluble en agua derivada de
otras bacterias que es equivalente a la región de los residuos de
aminoácido 186-206 de la PQQGDH soluble en agua
derivada de Acinetobacter calcoaceticus comparando la
disposición de la estructura primaria de las proteínas o comparando
las estructuras secundarias predichas a partir de las estructuras
primarias de las enzimas. Por tanto, pueden obtenerse glucosa
deshidrogenasas modificadas adicionales con una selectividad por la
glucosa mejorada sustituyendo residuos de aminoácido en esta región
por otros residuos de aminoácido. Tales glucosa deshidrogenasas
modificadas están también dentro del alcance de la presente
invención.
Tras cultivar los transformantes que expresan la
PQQGDH modificada, obtenida tal como se describió anteriormente, se
recogen las células mediante centrifugación y entonces se rompen
mediante prensa francesa, o pueden liberarse las enzimas
periplásmicas al medio mediante choque osmótico. Tras la
ultracentrifugación pueden obtenerse fracciones solubles en agua
que contienen la PQQGDH. De manera alternativa, puede secretarse la
PQQGDH expresada al cultivo usando un sistema
huésped-vector apropiado. Entonces se purifica la
fracción soluble en agua así obtenida mediante cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de afinidad o HPLC, para obtener
la PQQGDH modificada de la invención.
La PQQGDH de la presente invención cataliza la
oxidación de la glucosa para producir gluconolactona usando PQQ
como coenzima. La actividad enzimática puede cuantificarse mediante
una reacción de desarrollo de color de un colorante redox para
medir la cantidad de PQQ reducida con la oxidación de glucosa por
PQQGDH. Los ejemplos de reactivos de desarrollo de color incluyen
PMS (metosulfato de fenazina), DCIP
(2,6-diclorofenolindofenol), ferricianuro de
potasio y ferroceno.
La selectividad por la glucosa de la presente
invención puede evaluarse midiendo la actividad enzimática relativa
con respecto a la actividad por la glucosa usando una variedad de
azúcares tales como
2-desoxi-D-glucosa,
manosa, alosa,
3-o-metil-D-glucosa,
galactosa, xilosa, lactosa y maltosa como sustrato.
La PQQGDH modificada de la presente invención
muestra una selectividad por la glucosa mejorada en comparación con
la enzima de tipo silvestre. Especialmente, presenta una alta
reactividad para la glucosa en comparación con la de la maltosa.
Por tanto, el kit de ensayo y el detector enzimático preparados
usando la enzima modificada de la invención mostrarán una alta
selectividad por la glucosa y presentarán ventajas para detectar la
glucosa con una alta sensibilidad incluso en muestras que contienen
una variedad de azúcares.
La presente invención proporciona también un kit
de ensayo de glucosa que contiene la PQQGDH modificada de la
invención. El kit de ensayo de glucosa de la invención puede
contener una cantidad suficiente de la PQQGDH modificada para
llevar a cabo al menos un ensayo. A parte de la PQQGDH modificada,
el kit puede comprender normalmente los tampones requeridos para el
ensayo, un mediador, una disolución patrón de glucosa para generar
una curva de calibración e instrucciones para su uso. La PQQGDH
modificada puede suministrarse en una variedad de formas, por
ejemplo, como reactivo liofilizado o disoluciones madre apropiadas.
Preferiblemente, la PQQGDH modificada de la presente invención
puede suministrarse en forma de una holoenzima, pero puede
suministrarse en forma de apoenzima y convertirse en una holoenzima
antes de su uso.
La presente invención proporciona también un
detector de glucosa que contiene la PQQGDH modificada de la
invención. Pueden usarse como electrodo carbono, oro o platino, y
la enzima de la presente invención se inmoviliza sobre el
electrodo. Los métodos de inmovilización incluyen, por ejemplo,
métodos que usan reactivos de reticulación, inclusión en una matriz
macromolecular, recubrimiento con membrana de diálisis, métodos que
usan polímero de fotorreticulación, polímero electroconductor y
polímero redox. La enzima puede inmovilizarse también en un
polímero o adsorberse sobre el electrodo junto con un mediador
electrones, tal como ferroceno o su derivado. También pueden usarse
combinaciones de lo anterior. Preferiblemente, la PQQGDH modificada
de la presente invención se inmoviliza sobre el electrodo en forma
de una holoenzima, pero también puede inmovilizarse en forma de
apoenzima y PQQ se suministra como otra capa o en disolución.
Normalmente, la PQQGDH modificada de la presente invención se
inmoviliza sobre el electrodo usando glutaraldehído, entonces se
bloquean restos funcionales libres del glutaraldehído mediante
tratamiento con un reactivo que presenta grupos amina.
La medición de la concentración de glucosa se
lleva a cabo tal como se describe a continuación. Se colocan
tampón, PQQ, CaCl_{2} y un mediador en una célula de temperatura
constante y se mantienen a temperatura constante. Pueden usarse
como mediador ferricianuro de potasio y metosulfato de fenazina. Se
usa un electrodo en el que se inmoviliza la PQQGDH modificada de la
presente invención como electrodo de trabajo, junto con un
contraelectrodo (por ejemplo, platino) y un electrodo de referencia
(por ejemplo, electrodo de Ag/AgCl). Se aplica un voltaje constante
al electrodo de carbono. Después de que la corriente alcanza un
valor constante, se añade una muestra que contiene glucosa y se
mide el aumento de la corriente. La concentración de glucosa en la
muestra puede calcularse usando una curva de calibración generada
mediante disoluciones de glucosa de concentración patrón.
Los ejemplos de trabajo descritos a continuación
ilustran adicionalmente la invención sin limitar la presente
invención.
Se llevó a cabo la mutagénesis basándose en el
gen estructural de PQQGDH derivada de Acinetobacter
calcoaceticus (SEQ ID NO: 2). Se construyó el plásmido pGB2
insertando el gen estructural de PQQGDH derivada de Acinetobacter
calcoaceticus en el sitio de clonación múltiple del vector
pTrc99A (Pharmacia) (figura 1). Se sustituyó la secuencia de
nucleótidos que codifican Gln168 o Leu169 por la secuencia de
nucleótidos que codifican alanina, glicina, metionina, triptófano o
lisina mediante un método convencional de mutagénesis dirigida al
sitio. También se sustituyó la secuencia de nucleótidos que
codifican Asp143 y Asp428 por la secuencia de nucleótidos que
codifican ácido glutámico y glicina, respectivamente. Se realizó la
mutagénesis de sitio específico usando el plásmido pGB2 tal como se
muestra en la figura 2. Las secuencias de cebadores diana
oligonucleotídicos sintéticos usados para la mutagénesis se
muestran en la tabla 1. Con el fin de construir un mutante que
contiene dos mutaciones, se usaron simultáneamente dos cebadores
diana oligonucleotídicos para la mutagénesis.
Se preparó un molde insertando el fragmento
KpnI-HindIII que contenía parte del gen que codifica
PQQGDH derivada de Acinetobacter calcoaceticus en el
plásmido vector pKF18k (TaKaRa). Se preparó una mezcla del molde
(50 fmol), cebador de selección (5 pmol) suministrado en un kit
Mutan-Express Km, cebador diana fosforilado (50
pmol) y el tampón de apareamiento suministrado en el kit (1/10 del
volumen total (20 \mul)), y se desnaturalizó el ADN de plásmido
dando hebras monocatenarias calentando a 100ºC durante 3 minutos. Se
diseñó el cebador de selección para la reversión de la mutación
ámbar doble en el gen de resistencia a kanamicina del plásmido
pKF18k. Se colocó el ADN de plásmido sobre hielo durante 5 minutos
para aparear los cebadores. Se sintetizó una hebra complementaria
añadiendo los siguientes reactivos: 3 \mul de tampón de extensión
suministrado en el kit, 1 \mul de ADN ligasa de T4, 1 \mul de
ADN polimerasa de T4 y 5 \mul de agua esterilizada. Se transformó
BMH71-18mutS de E. coli, una cepa deficiente
en reparación de apareamiento erróneo de ADN, con el ADN
sintetizado y se cultivó durante la noche con agitación enérgica
para amplificar el plásmido.
Entonces se extrajo el plásmido de la bacteria y
se transformó en MV1184 de E. coli, y se extrajo el plásmido
de las colonias. Se determinó la secuencia del plásmido para
confirmar la introducción satisfactoria de las mutaciones deseadas.
Se sustituyó el fragmento génico Kpn I-Hind III que
codifica PQQGDH de tipo silvestre en el plásmido pGB2 por el
fragmento que contenía la mutación para construir una serie de genes
de PQQGDH mutados.
Se insertó un gen que codifica PQQGDH modificada
o de tipo silvestre en el sitio de clonación múltiple de pTrc99A
(Pharmacia) y se transformó el plásmido construido en DH5\alpha de
E. coli. Se cultivaron los transformantes en 450 ml de caldo
L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de
cloranfenicol usando un frasco Sakaguchi a 37ºC con agitación
enérgica, y entonces se inoculó en 7 l de caldo L que contenía
CaCl_{2} 1 mM y PQQ 500 \muM. Después de tres horas de cultivo,
se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,3 mM y se
continuó el cultivo durante otras 1,5 horas. Se recogieron las
células mediante centrifugación (5000 xg, 10 min., 4ºC) y se
lavaron con NaCl al 0,85% dos veces. Se rompieron las células con
una prensa francesa (110 MPa) y se centrifugaron dos veces (10000
xg, 15 min., 4ºC) para eliminar el residuo. Se sometió a
ultracentrifugación el sobrenadante (160.500 xg (40.000 rpm), 90
min., a 4ºC) para obtener una fracción soluble en agua. Se usó esta
fracción en los experimentos posteriores como preparación enzimática
bruta.
Se convirtió cada una de las preparaciones
enzimáticas brutas de PQQGDH de tipo silvestre y PQQGDH modificadas
obtenidas en el ejemplo 2 en una holoenzima en presencia de PQQ 1
\muM y CaCl_{2} 1 mM durante 1 hora o más. Se dividió la
disolución en alícuotas de 187 \mul cada una y se mezclaron con 3
\mul de reactivos de activación (48 \mul de DCIPA 6 mM, 8
\mul de PMS 600 mM, 16 \mul de tampón fosfato 10 mM pH 7,0) y
10 \mul de D-glucosa de diversas concentraciones
para medir la actividad enzimática.
Se midió la actividad enzimática en tampón
MOPS-NaOH (pH 7,0) que contenía PMS (metosulfato de
fenazina)-DCIP
(2,6-diclorofenolindofenol). Se registraron cambios
en la absorbancia de DCIP con un espectrofotómetro a 600 nm y se
definió la tasa de reducción de absorbancia como la tasa de reacción
de la enzima. En esta medición, se definió la actividad enzimática
que reducía 1 \mumol de DCIP en un minuto como 1 unidad. El
coeficiente de absorción molar de DCIP a pH 7,0 fue de 16,3
mM^{-1}.
Se calculó Km a partir de las representaciones
de la concentración de sustrato frente a la actividad enzimática.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Se examinó la especificidad por el sustrato de
la preparación bruta de las enzimas modificadas. Se convirtió cada
una de las preparaciones enzimáticas brutas de PQQGDH de tipo
silvestre y PQQGDH modificadas obtenidas en el ejemplo 2 en una
holoenzima en presencia de PQQ 1 \muM y CaCl_{2} 1 mM durante 1
hora o más. Se dividió la disolución en alícuotas de 187 \mul
cada una y se mezclaron con 3 \mul de reactivos de activación (48
\mul de DCIPA 6 mM, 8 \mul de PMS 600 mM, 16 \mul de tampón
fosfato 10 mM pH 7,0) y sustrato. Se añadió disolución de glucosa u
otros azúcares (400 mM) como sustrato hasta una concentración final
de 20 mM o 100 mM y se incubó la mezcla durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Se midió la actividad enzimática de la misma
manera que en el ejemplo 3. Los valores se calcularon como la
actividad relativa para la glucosa (100%). Los resultados se
muestran en las tablas 3-6.
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Además, se midió la actividad enzimática de la
enzima modificada de la presente invención que porta una doble
mutación. Los resultados se muestran en las tablas 7, 8. Cada enzima
modificada de la presente invención mostraba una mayor reactividad
para la glucosa que para la maltosa.
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Se examinó la dependencia en la concentración de
sustrato de las enzimas modificadas de la presente invención. Se
convirtió cada enzima modificada en una holoenzima en presencia de
PQQ 1 \muM y CaCl_{2} 1 mM durante 1 hora o más. Siguiendo el
método para medir la actividad enzimática descrito en el ejemplo 3,
se midieron los cambios en la absorbancia de DCIP con un
espectrofotómetro a 600 nm como indicador. Los resultados se
muestran en la figura 3. La PQQGDH modificada de la presente
invención se saturaba a una concentración mayor de glucosa en
comparación con el tipo silvestre. Para las PQQGDH tanto de tipo
silvestre como modificada, no se observó inhibición del sustrato
hasta la concentración de glucosa de 200 mM y se observó que la Ksi
era de 200 mM o más.
Se absorbió cada una de las preparaciones
enzimáticas brutas de tipo silvestre y Gln168Asp obtenidas en el
ejemplo 2 en una columna de cromatografía de intercambio catiónico
cargada con TSKgel CM-TOYOPEARL 650M (Toso Co.) y
equilibrada con tampón fosfato 10 mM, pH 7,0. Se lavó la columna con
750 ml de tampón fosfato 10 mM, pH 7,0 y se eluyó la enzima con
tampón fosfato 10 mM, pH 7,0 que contenía NaCl desde 0 M hasta 0,2
M. La velocidad de flujo era de 5 ml/min. Se recogieron las
fracciones que mostraban actividad GDH y se dializaron frente a
tampón MOPS-NaOH 10 mM (pH 7,0) durante la noche. De
esta manera se purificó la proteína PQQGDH modificada que mostraba
una única banda en la electroforesis. Se midió la actividad
enzimática para diversos sustratos de la enzima purificada. Los
resultados se muestran en las tablas 9-10.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se añadieron veinte mg de pasta de carbono a 5
unidades de la enzima modificada Gln168Ala y se liofilizó. Se
aplicó la mezcla sobre la superficie de un electrodo de pasta de
carbono cargado con aproximadamente 40 mg de pasta de carbono y se
pulió el electrodo sobre un papel de filtro. Se trató este electrodo
con tampón MOPS (pH 7,0) que contenía el 1% de glutaraldehído
durante 30 minutos a temperatura ambiente y entonces se trató con
tampón MOPS (pH 7,0) que contenía lisina 20 mM durante 20 minutos a
temperatura ambiente para bloquear el glutaraldehído sin
reaccionar. Se equilibró el electrodo en tampón MOPS 10 mM (pH 7,0)
durante una hora o más a temperatura ambiente, entonces se almacenó
a 4ºC.
Se midió la concentración de glucosa usando el
detector de glucosa así preparado. Se cuantificó la concentración
de glucosa en el intervalo de desde 0,1 mM hasta 5 mM usando el
detector de glucosa preparado con la PQQGDH modificada de la
invención.
La PQQGDH modificada soluble en agua de la
presente invención presenta una alta selectividad por la glucosa,
por tanto es útil como dispositivo de un detector para medir la
glucosa en sangre.
<110> Sode, Koji
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<120> Glucosa deshidrogenasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Documento K 3138 EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/JP03/08418
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
02-07-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento JP
2003-71760
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-03-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento JP
2002-196177
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
04-07-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 454
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Acinetobacter
calcoaceticus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 1612
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<212> ADN
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<213> Acinetobacter
calcoaceticus
\newpage
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<400> 2
\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Acinetobacter
calcoaceticus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> INCIERTA
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<222> 4
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<223> Xaa es cualquier residuo de
aminoácido
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<220>
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<221> INCIERTA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
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<223> Xaa es cualquier residuo de
aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGly Arg Asn Xaa Xaa Ala Tyr Leu
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 4
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 5
\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 6
\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 7
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 8
\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 9
\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 10
\hskip1cm
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<210> 11
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 11
\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 13
\hskip1cm
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<210> 14
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador para mutación puntual
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<400> 19
\hskip1cm
Claims (14)
1. Glucosa deshidrogenasa modificada que
presenta pirroloquinolina-quinona como coenzima y
que presenta una mayor selectividad por la glucosa que la glucosa
deshidrogenasa silvestre soluble en agua, en la que
- (a)
- Gln168 de PQQGDH soluble en agua derivada de Acinetobacter calcoaceticus está sustituido por otro residuo de aminoácido;
- (b)
- Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por otro residuo de aminoácido
- (c)
- tanto Gln168 como Asp143 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 están sustituidos por otros residuos de aminoácido; o
- (d)
- Gln168 de la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por otro residuo de aminoácido, y Asn428 está sustituido por otro residuo de aminoácido.
2. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1(b), en la que Gln168 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por
alanina, glicina, ácido glutámico, leucina, fenilalanina, serina o
ácido aspártico.
3. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1(c), en la que Asp143 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por otro
residuo de aminoácido, y Gln168 está sustituido por alanina,
glicina, ácido glutámico, leucina, fenilalanina, serina o ácido
aspártico.
4. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1(c), en la que Asp143 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por ácido
glutámico, y Gln168 está sustituido por alanina, glicina, ácido
glutámico, leucina, fenilalanina, serina o ácido aspártico.
5. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1(d), en la que Gln168 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por
alanina, glicina, ácido glutámico, leucina, fenilalanina, serina o
ácido aspártico, y Asn428 está sustituido por otro residuo de
aminoácido.
6. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1(d), en la que Gln168 de la secuencia de
aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 1 está sustituido por
alanina, glicina, ácido glutámico, leucina, fenilalanina, serina o
ácido aspártico, y Asn428 está sustituido por treonina.
7. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos:
Gly-Arg-Asn-Xaa1-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
en la que Xaa1 no es Gln y Xaa2 es
cualquier residuo de
aminoácido.
8. Glucosa deshidrogenasa modificada según la
reivindicación 7, en la que Xaa1 es Ala, Gly, Glu, Leu, Phe, Ser o
Asp, y Xaa2 es Ala o Gly.
9. Gen que codificauna glucosa deshidrogenasa
modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector que comprende el gen según la
reivindicación 9.
11. Transformante que comprende el gen según la
reivindicación 9.
12. Transformante según la reivindicación 11, en
el que el gen según la reivindicación 9 está integrado en su
cromosoma.
13. Kit de ensayo de glucosa que comprende la
glucosa deshidrogenasa modificada según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
14. Detector de glucosa que comprende la glucosa
deshidrogenasa modificada según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
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