JP5843924B2 - グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 - Google Patents
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Description
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)アミノ酸配列(a)において1もしくはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質
のいずれかである。
試料を上述の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法を提供する。
本発明の融合蛋白質は、PQQGDHとシトクロームとが連結された構造を有しており、必要に応じてこれらの間にリンカー部分が存在していてもよい。
本発明の融合蛋白質は、PQQGDHをコードする遺伝子配列とシトクロームをコードする遺伝子配列とを、必要に応じてリンカー部分を介して、インフレームとなるよう連結させて、これを組換え的に発現させることにより製造することができる。図1は、本発明の融合蛋白質の一例を、図2はこの融合蛋白質をコードする遺伝子の配列を示す。図中、5’側から3’側に、PQQGDHをコードする配列、リンカー部分、およびにシトクロームをコードする配列が連結されている。Acinetobacter calcoaceticus由来の天然の水溶性PQQGDHをコードする遺伝子の配列は、Mol.Gen.Genet.(1989),217:430−436に開示されており、Comamonastes testosteroniのキノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ(QHEDH)をコードする遺伝子の配列は、J.Biol.Chem.,277,2002,3727−3732に開示されている。これらの配列を基に、遺伝子操作により融合蛋白質をコードする遺伝子を構築することができる。遺伝子操作のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られている。
本発明はまた、本発明にしたがう融合蛋白質が固定化された酵素電極を特徴とする。酵素電極とは、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定化されている電極である。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く用いられている。本発明の融合蛋白質は、酵素電極において被検物質(例えばグルコース)の存在を認識し、その酸化還元反応を触媒し、その結果生じる電子を電極に伝達するよう作用する。
別の観点においては、本発明は、作用極として上述の本発明の酵素電極を用いることを特徴とするセンサーを提供する。本明細書において用いる場合、センサーとは、目的とする被検物質の濃度を電気化学的に測定する測定系をいい、通常は、作用極(酵素電極)、対極(白金等)、および参照極(Ag/AgCl等)の3電極を含む。あるいは、慣用の簡易血糖値システムにおいて用いられているような、作用極と対極とから構成される2電極系でもよい。センサーはさらに、緩衝液および被検試料を入れる恒温セル、作用極に電圧を印加する電源、電流計、記録計等を含む。センサーは、バッチ型であってもフロー型であってもよい。特にフロー型のセンサーとしては、血糖値を連続で計測できるセンサーであってもよい。すなわち、連続的に供給される血液試料、あるいは同透析試料、あるいは血液中あるいは細胞間質液中に本発明の酵素を固定した二電極系あるいは三電極系を挿入して計測するセンサーであってもよい。このような酵素センサーの構造は、当該技術分野においてよく知られており、例えばBiosensors−Fundamental and Applications−Anthony P.F.Turner,Isao Karube and Geroge S. Wilson,Oxford University Press 1987に記載されている。
本発明のグルコースセンサーを用いるグルコースの濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。センサーの恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明の融合蛋白質を固定化した酵素電極を用い、対極としては例えば白金電極を、参照電極としては例えばAg/AgCl電極を用いる。作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにグルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
PQQGDHの構造遺伝子(停止コドンを含まない)およびQHEDHの電子伝達ドメインは、5’末端に制限酵素認識部位を有するプライマーを用いて、それぞれA.calcoaceticus LMD79.41、およびC.testosteroni ATCC15667のゲノムからPCR法により増幅した。用いたプライマーは以下のとおりである:
gdhB;センス
5’−GGCCATGGATAAACATTTATTGGCTAAAATTGCTTTAT−3’(配列番号3)
アンチセンス
5’−GGGGGAGCTCCTTAGCCTTATAGGTGAAC−3’(配列番号4)
qhedhcytcドメイン;センス
5’−GGGGGAGCTCGGCAAGGCCAGGATGCCGGA−3’(配列番号5)
アンチセンス
5’−GGGGAAGCTTTCAGGGCTTGGGCCGGATGG−3’(配列番号6)
形質転換体をMMI培地で半好気条件下で30℃で10時間培養し、菌体を回収して、10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁した。これをフレンチプレスで破壊し(110MPa)、超遠心分離(160,500×g,1.5h,4℃)し、上清を10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で透析した。得られた上清を10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化したResourceSカチオン交換カラム(Amersham Biosciences)に負荷し、5−150mM NaCl/10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)の勾配を用いて酵素を溶出した。
酵素活性の測定は10mM MOPS−NaOH緩衝液(pH7.0)中において0.06mMDCIPおよび0.6mMPMSを用いて行った。1分間に1μmolのグルコースを酸化する酵素の活性を1ユニットと定義した。表1に精製酵素の動力学的パラメータを示す。
本発明の融合蛋白質250U(約100μg)あるいは野性型のPQQGDH350Uを、グラッシーカーボン電極上にグルタルアルデヒド蒸気にさらすことで固定した。1mMCaCl2を含む20mMMOPS緩衝液(pH7.0)に電極を浸し、電子受容体として10mMのフェリシアン化カリウムを用いて、印加電圧+400mV(vs Ag/AgCl)にてグルコースに対する応答を測定した。結果を図3に示す。図中、「QH−GDH」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「GB WT」は野生型PPQGDHを示す。
次に、電子受容体の非存在下において、融合蛋白質が電極に電子を伝達する能力を、野生型酵素と電子伝達蛋白質との混合物と比較して調べた。500ユニットのQH−GDHを含有する20mMMOPS緩衝液(pH7.0)をカーボンペースト(0.5gグラファイト粉末、0.3ml液体パラフィン,BAS Inc.,West Lafayette,USA)とともに混合し、凍結乾燥した。対照としては、野生型PQQGDHと等モルのcytb562またはcytb562と同質量のBSA(牛血清アルブミン)を用いた。次に、凍結乾燥した混合物をカーボンペースト電極の末端に充填した(直径3mm,BAS Inc.)。電極は、使用するまで20mMMOPS緩衝液(pH7.0)中で4℃で保存した。測定は、1mMCaCl2を含む20mMMOPS緩衝液(pH7.0)中で25℃で行った。+300mVvs.Ag/AgClの電圧を印加して、グルコースの添加に伴う電流値の増加を測定した。
種々の濃度のグルコース溶液を用いて、本発明のセンサーのキャリブレーションカーブを求めた(図5)。図中、「QH−GDH」は本実施例で作製した融合蛋白質を、「GBwt」は対照である野生型PQQGDHを表す。観察された電流増加は、最小の検出可能な濃度である0.01mMから5mMまでの濃度範囲で、グルコース濃度に比例していた。さらに、電流応答は酵素量に依存していた。センサーの感度は9.65μAM-1cm-2であった。
本発明の融合蛋白質を装着した酵素電極を用いてグルコースの連続計測を行った。この実験は、近年注目されている連続計測型血糖計測システムへの本融合酵素の応用を目的として行ったものである。本システムの構成は、連続計測型血糖計測システムの構成に順ずる。
Claims (13)
- ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素(PQQGDH)とシトクロームとの融合蛋白質であって、前記シトクロームが、PQQGDHのC末端側に融合されており、
以下の(a)および(b):
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する蛋白質:
を除き、
前記PQQGDHが水溶性PQQGDHであり、グルコース脱水素酵素活性および電子伝達機能を有する前記融合蛋白質。 - 前記PQQGDHがアシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)由来の水溶性PQQGDHである、請求項1記載の融合蛋白質。
- 前記シトクロームが、シトクロームCまたはシトクロームB562である、請求項1または2に記載の融合蛋白質。
- 前記シトクロームが、1分子中にPQQとヘムの両方を有する蛋白質であるキノヘモ蛋白質に由来する、請求項1−3のいずれかに記載の融合蛋白質。
- 前記シトクロームが、キノヘモ蛋白質アルコール脱水素酵素に由来する、請求項1−4のいずれかに記載の融合蛋白質。
- 前記シトクロームが、コマモナス・テストステローニ(Comamonas testosteroni)のキノヘモ蛋白質エタノールデヒドロゲナーゼに由来する、請求項1−5のいずれかに記載の融合蛋白質。
- 請求項1−6のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
- 請求項7に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項7に記載の遺伝子を含む形質転換体。
- 請求項7に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれている形質転換体。
- 請求項1−6のいずれかに記載の融合蛋白質が装着されている酵素電極。
- 試料中のグルコース濃度を測定する方法であって、
試料を請求項11に記載の酵素電極と接触させ、そして
グルコースの酸化に伴って発生する電子を測定する、
ことを含む方法。 - 作用極として請求項11記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
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