CN104520700B - 酶电极 - Google Patents

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Abstract

一种酶电极，其特征在于，其包含电极以及与所述电极接触且含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒的检测层，通过所述检测层中的直接电子转移，在所述酶与所述电极间进行电子授受。

Description

酶电极
技术领域
本发明涉及酶电极。
背景技术
已有具备电极和形成在电极上的含有酶的检测层的酶电极。酶电极具有将通过酶反应而生成的电子从电极中取出的结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平01-075956号公报
专利文献2：日本特开昭63-050748号公报
专利文献3：日本特开平10-100306号公报
专利文献4：日本特开2006-234788号公报
非专利文献
非专利文献1：Brianna C.Thompson et al.,Macromol.Rapid Commun.2010,31,1293-1297
非专利文献2：A.Kros et.al.,Third generation Polyethylenedioxythiophene(PEDOT)based glucose sensor,Symposia Papers Presented Before the Division of EnviromentalChemistry,American Chemical Society Anaheim,CA March 21-25,1999
非专利文献3：A.Kros et.al.,Poly(pyrrole)versus poly(3,4-ethylenedioxythiophene):implications for biosensor applications,Sensors andAcutuators B 106(2005)289-295
非专利文献4：C.G.J.Koopal et al.,Glucose sensor utilizing polypyrroleincorporated in track-etch membranes as the mediator,Biosensor and Bioelectronics 7(1992)461-471
发明内容
发明所要解决的问题
通常，当酶电极的检测层中含有的酶成为不活化状态时，作为酶电极的功能受损。酶的不活化原因之一在于由热导致的不活化。例如，在保存、输送时的环境下，有可能对酶电极施加导致其不活化的热。另外，在酶电极的使用中，也有可能施加热。从延长酶电极的寿命的意义上而言，优选酶电极显示出适合的耐热性。
本发明的一个方面的目的在于提供耐热性提高的酶电极。
用于解决问题的手段
为了实现上述目的，本发明的一个方面采用以下的构成。即，本发明的一个方面为酶电极，其特征在于，其包含电极以及与上述电极接触且含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒的检测层，通过上述检测层中的直接电子转移在上述酶与上述电极间进行电子授受。水溶性导电性聚合物例如为聚苯胺磺酸。
本发明的一个方面中的氧化还原酶可以具有包含细胞色素的亚单元。另外，氧化还原酶可以具有包含细胞色素的结构域。另外，氧化还原酶可以采用至少由催化亚单元和包含细胞色素的亚单元构成的寡聚酶。另外，氧化还原酶可以进一步采用至少由催化结构域和包含细胞色素的结构域构成的酶。上述催化亚单元和上述催化结构域各自可以包含吡咯并喹啉醌、黄素腺嘌呤二核苷酸中的至少任意一种。
另外，本发明的一个方面中的导电性颗粒可以含有碳。
上述聚苯胺磺酸的浓度例如为0.01～5％。另外，上述聚苯胺磺酸的官能团为羟基或磺基。
另外，本发明的一个方面中的、上述电极与上述检测层中的至少之一优选含有导电性颗粒。
另外，本发明的一个方面的酶电极的特征在于，耐热性提高。
本发明的其他方面之一为一种生物传感器，其具备酶电极，上述酶电极包含电极以及与上述电极接触且含有氧化还原酶、聚苯胺磺酸和导电性颗粒的检测层，通过上述检测层中的直接电子转移在上述酶与上述电极间进行电子授受。
另外，本发明的其他方面之一为一种电子设备，其具备酶电极，上述酶电极包含电极以及与上述电极接触且含有氧化还原酶、聚苯胺磺酸和导电性颗粒的检测层，通过上述检测层中的直接电子转移在上述酶与上述电极间进行电子授受。
另外，本发明的其他方面之一为一种装置，其包含酶电极以及将通过上述酶电极中的酶反应产生的电流供给至负荷的供给部，上述酶电极包括电极以及与上述电极接触且含有氧化还原酶、聚苯胺磺酸和导电性颗粒的检测层，通过上述检测层中的直接电子转移在上述酶与上述电极间进行电子授受。另外，本发明的其他方式可以包括包含上述生物传感器的电子设备、包含上述装置的电子设备。
另外，本发明的其他方面之一为一种酶电极的制造方法，其包括：在电极上形成含有氧化还原酶、聚苯胺磺酸和导电性颗粒且通过直接电子转移在上述酶与上述电极间进行电子授受的检测层。
另外，本发明的其他方面之一为一种试剂，其特征在于，含有氧化还原酶、聚苯胺磺酸和导电性颗粒，并且使耐热性提高。
发明效果
根据本发明的一个方面，能够提供耐热性提高的酶电极。
附图说明
图1是示意性地示出实施方式的酶电极的结构的图。
图2是示意性地示出检测层内部的图。
图3是表示在固定了热处理的时间的情况下热处理时的温度与应答电流的关系的图。
图4是表示在固定了热处理的温度且改变热处理的时间的情况下时间与应答电流的关系的图。
图5是表示聚苯胺磺酸的浓度与耐热性的关系的图。
图6是表示聚苯胺磺酸的浓度与耐热性的关系的图。
图7是表示试验4的结果(添加到试剂中的聚合物浓度的影响)的图。
图8是表示试验5的结果(由热处理时间带来的影响)的图。
具体实施方式
以下，参照附图对作为本发明的一个实施方式的酶电极进行说明。以下举出的实施方式各自为例示，本发明不限定于下述实施方式的构成。
[酶电极的构成]
图1是示意性地示出实施方式的酶电极的侧面的图。图1中，酶电极10具备电极1和形成在电极1的表面(图1中为上表面)上的检测层2。
<电极>
电极1使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)、钯等金属材料或者炭等碳材料而形成。电极1例如形成在如图1所示的绝缘性基板3上。绝缘性基板3由聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)等热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂等各种树脂(塑料)、玻璃、陶瓷、纸等绝缘性材料形成。形成电极1的电极材料及绝缘性基板3的材料可以采用公知的任何材料。电极1及绝缘性基板3的大小、厚度可以适当设定。以下，也有时将绝缘性基板3与电极1的组合称为“基材”。
<检测层>
图2示意性地示出图1所示的检测层2内的状态。如图2所示，检测层2与电极1接触，含有氧化还原酶4(以下也有时简记为“酶4”)和导电性聚合物(聚苯胺，例如聚苯胺磺酸)5，且不含有电子传递介质。
如图2所示，在检测层2内，酶4的分子具有与导电性聚合物5复杂地相互缠绕的结构。通过酶反应而生成的电子可以直接转移至电极1或者顺着导电性聚合物5转移至电极1。即，实施方式的酶电极10中，通过检测层2中的直接电子转移，在酶4与电极1之间进行电子授受。
这样，酶电极10为直接电子转移型酶电极。“直接电子转移型酶电极”是在酶与电极间进行电子授受的类型的酶电极，在检测层中通过酶反应生成的电子在没有电子传递介质等氧化还原物质参与的情况下直接传递至电极，由此在酶与电极间进行电子授受。
另外，在采用葡萄糖氧化酶(GOD)作为酶时，通过酶反应生成的过氧化氢(H2O2)在电极上被氧化，这种经由通过酶反应生成的物质将电子传递至电极的类型的酶电极与“直接电子转移型酶电极”也有区别。
需要说明的是，在生理学的反应体系中，发生直接电子转移的极限距离据称为，对于由电极和生物分子(酶)构成的电化学反应体系中的电子授受而言，在比此更长的距离下，除非伴有酶、介质的物质迁移(例如由扩散产生的迁移)，否则也难以检测到电极上的电子授受。
根据酶电极10，在检测层2中，酶4的分子与导电性聚合物5相互缠绕，由此，认为起到能够使来自外部的热能对酶4产生的作用(酶分子的结构变化)趋于缓和的作用。
另外，在检测层2内，通过将导电性聚合物5的导电性部位配置在酶4的电子传递部位(酶反应中进行电子授受的部位)附近，成为容易在酶4与电极1之间发生电子转移的状态。作为本发明的一个方面的效果，认为通过将酶4的周围用导电性聚合物5包围而形成了容易维持分子的高级结构的环境。另外认为达到了如下状态：由酶4产生的电子经由导电性聚合物5的导电性部位，形成了多个适合从酶4向电极1传递的电子传递路径。因此，作为本发明的一个方面的效果，认为：即使由于来自外部的热能而对酶4产生作用(物理的变化、配置的变化)，通过确保多个适合的电子传递路径，也能够使从酶4向电极1的电子转移受到大幅或急剧阻碍的情况得到缓解。因此，实施方式的酶电极10具有适合的耐热性。
另外认为，在检测层2内，通过基于导电性高分子(导电性聚合物5)的塞贝克效应的热电转换特性，缓解了热应激对酶4的影响。特别是在采用聚苯胺磺酸作为导电性聚合物5的情况下，聚苯胺磺酸的显示π电子共轭体系的分子链长，因此塞贝克效应也更高，其不是水分散性的而是水溶性的，因此与酶4的亲和性(共混)良好，在检测层2内，容易在结构上将酶4包括在其内。因此认为，至少在酶电极10的制作时，对酶4的热影响的抑制效果提高。
<<氧化还原酶>>
可作为酶4采用的氧化还原酶可以包含细胞色素。另外，氧化还原酶可以包含电子传递亚单元。作为具有电子传递亚单元的氧化还原酶，例如，可以从包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶(CyGDH)、吡咯并喹啉醌葡萄糖脱氢酶(PQQGDH复合物)、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、来源于农杆菌的葡萄糖-3-脱氢酶(Glucose-3-Dehydrogenase)(G3DH from Agrobacterium tumefasience)、纤维二糖脱氢酶中选择至少一种氧化还原酶。作为电子传递亚单元，优选采用包含细胞色素的亚单元。作为具有包含细胞色素的亚单元的氧化还原酶，可以采用例如上述的CyGDH、PQQGDH与细胞色素的融合蛋白质。另外，氧化还原酶可以包含电子传递结构域。作为具有电子传递结构域的氧化还原酶，例如，可以从胆固醇脱氢酶(CDH)、PQQ乙醇脱氢酶(QHEDH(PQQ Ethanol dh)、“QHGDH”(fusion enzyme；GDH with hemedomain of QHGDH，GDH与QHGDH的血红素结构域的融合酶))中选择至少一种氧化还原酶。电子传递结构域优选采用包含细胞色素的结构域。例如，优选采用上述的QHEDH的细胞色素结构域。
作为上述的包含细胞色素的亚单元的例示的PQQGDH与细胞色素的融合蛋白质、以及作为包含细胞色素的结构域的例示的QHGDH的细胞色素结构域公开在例如国际公开WO2005/030807号公报中。
另外，氧化还原酶可以包含催化亚单元，而且，该催化亚单元可以具有电子传递亚单元。作为催化亚单元的一例，可以举出包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶的α亚单元。作为氧化还原酶，优选采用至少由催化亚单元和包含细胞色素的亚单元构成的寡聚酶。另外，氧化还原酶优选采用至少由催化结构域和包含细胞色素的结构域构成的酶。
另外，氧化还原酶可以进一步包含催化结构域，而且，该催化结构域可以具有电子传递结构域。作为催化结构域的一例，可以举出胆固醇脱氢酶的核黄素结构域。
上述的催化亚单元及催化结构域各自可以包含吡咯并喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少任意一种。
<<聚苯胺磺酸>>
作为可作为导电性聚合物5采用的聚苯胺磺酸，可以采用具有各种属性(例如，水溶性)的聚苯胺磺酸。聚苯胺磺酸6的浓度例如为0.01～5％，优选为0.01～2％。另外，聚苯胺磺酸的官能团为羟基或磺基。
<<导电性颗粒>>
虽然未进行图示，但酶电极10的检测层2可以进一步含有导电性颗粒。通过使检测层2含有导电性颗粒，可以期待电子向电极的更理想的传递。导电性颗粒例如可以含有碳。具体而言，导电性颗粒可以采用金、铂、银、钯这样的金属制颗粒或者以碳作为材料的高级结构体。高级结构体例如可以含有导电性炭黑、科琴黑、碳纳米管(CNT)、富勒烯这样的碳颗粒或碳微粒。导电性颗粒可以选择如上所述的金属和碳中的至少之一。
需要说明的是，检测层2表面可以由醋酸纤维素(CA)这样的外层膜覆盖。
[酶电极的制作方法]
上述的酶电极10例如以如下方式制作。即，在绝缘性基板3的单面上形成作为电极1发挥功能的金属层。例如，在预定厚度(例如约100μm)的薄膜状的绝缘性基板3的单面上，通过物理蒸镀(PVD、例如溅射)或者化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此，形成具有期望厚度(例如约30nm)的金属层。也可以形成利用碳材料形成的电极层来代替金属层。
接着，在电极1上形成检测层2。即，制备含有包含细胞色素的氧化还原酶4和作为导电性聚合物5的聚苯胺磺酸的溶液(试剂)。将溶液(试剂)滴加到电极1的表面上。通过干燥使溶液(试剂)在电极1上固化，由此可以得到在电极1上形成有检测层2的酶电极10。
[实施例]
以下，对酶电极的实施例进行说明。
<试验1>
<<试剂溶液的制备>>
首先，制备以下的实施例1、比较例的两种试剂溶液。
[实施例1]
·科琴黑：0.8％
·水溶性聚苯胺(商品名AquaPASS(以下记作“AQP”))：0.45％
·包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)：0.56％
·稳定剂(蔗糖)：0.5％
·磷酸缓冲液(pH5.8)：16mM
需要说明的是，“％”表示试剂溶液中含有的试剂的重量％浓度。
[比较例]
·科琴黑:0.8％
·包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)：0.56％
·稳定剂(蔗糖)：0.5％
·磷酸缓冲液(pH5.8)：16mM
需要说明的是，“％”表示试剂溶液中含有的试剂的重量％浓度。由此可见，比较例的试剂溶液是从实施例1的试剂溶液中除去了AQP的试剂溶液。
<<酶电极(试样)的制作>>
接着，准备在单面上通过金蒸镀形成有电极(电极层)的多个绝缘性基板(基材)，在各绝缘性基板上各自分注实施例1、比较例的试剂溶液，在低湿度干燥炉中放置30分钟，使其干燥。这样，试剂在电极上固化，由此得到形成有检测层的实施例1的酶电极(试样)和比较例的酶电极(试样)。
此时，得到了将实施例1、比较例各自在30℃、80℃、100℃、120℃的各炉内温度(干燥温度)下干燥后的4种(合计8种)试样。
<<葡萄糖浓度的测定>>
接着，测定了热处理后的上述试样对100mg/dl的葡萄糖的应答电流值。葡萄糖测定中，将上述试样浸渍到加热至37℃的磷酸缓冲液(pH7.4)中，使用铂线作为对电极、使用银/氯化银电极作为参比电极，将向工作电极施加的电压设定为+0.4V(对Ag/AgCl)。
<<测定结果的评价>>
图3是表示试验1的结果，即上述的8种试样的应答电流值(μA)与干燥温度(℃)的关系的图。图3中，实施例1的试样的结果用白色柱状图表示，比较例的试样的结果用黑色柱状图表示。需要说明的是，对于每个种类，使用2个试样进行2次测定，图4所示的结果表示2次测定结果的平均值。
根据图3所示的试验结果，对于未添加AQP的试样(比较例)而言，随着干燥温度的上升，观察到明显的应答灵敏度的降低，与此相对，对于添加了AQP的试样(实施例1)而言，随着干燥温度的上升，维持了高的应答灵敏度。由此可知，添加了AQP的试样中，电极应答的耐热性大幅提高，也实现了应答灵敏度的提高。
<试验2>
通过与上述的试验1同样的方法，制备实施例1和比较例的8种试剂溶液，并且将各试剂溶液分注到与试验1中使用的基材同样的基材的电极上。然后，在低湿度干燥炉(干燥温度100℃)中使试剂溶液干燥，得到酶电极(试样)。但是，在试验2中，使炉内的干燥时间(热处理时间)变为10分钟、30分钟、60分钟、120分钟，对于实施例1、比较例各自得到4种(合计8种)酶电极(试样)。然后，通过与试验1同样的方法(测定方法及测定条件)进行对葡萄糖的应答电流值的测定。
图4是表示试验2的结果，即上述的8种试样的应答电流值(μA)与干燥时间(分钟)的关系的图。图4中，实施例1的试样的结果用白色柱状图表示，比较例的试样的结果用黑色柱状图表示。需要说明的是，对于每个种类，使用2个试样进行2次测定，图4所示的结果表示2个测定结果的平均值。
根据图4所示的试验结果，对于未添加AQP的试样(比较例)而言，随着干燥时间的长期化，观察到应答灵敏度显著降低的倾向，与此相对，对于添加了AQP的试样(实施例1)而言，与干燥时间的变化(长期化)无关，观察到维持适合的应答灵敏度的倾向。由此可知，添加了AQP的试样能够长时间具备适合的耐热性。
<试验3>
接着，制备改变了AQP的浓度的4种试剂溶液。AQP的浓度(重量％)设定为0(比较例)、0.20％、0.45％(实施例1)、1％。需要说明的是，除AQP以外，试剂溶液中的成分按照与实施例1相同的内容制备。
对于这样得到的4种试剂溶液，通过与试验1同样的方法将试剂溶液分注到电极上，在10分钟、30分钟、60分钟、120分钟(干燥温度均为100℃)的各干燥温度下干燥，得到16种酶电极(试样)。然后，通过与试验1同样的方法，进行对葡萄糖的应答电流值的测定。
<试验3的结果>
图5是表示试验3的结果，即各试样的干燥时间(热处理时间)(分钟)与应答电流值(μA)的关系的图。图5中，针对各热处理时间，示出了4个柱状图。4个柱状图左起依次表示AQP的浓度为0、0.20％、0.45％、1％时的应答电流值(应答灵敏度)。
图6是表示热处理时间30分钟、60分钟、120分钟的相对应答灵敏度(％)的图，其中将试验3中的热处理时间为10分钟时的应答灵敏度设为100％时。图6中，针对各热处理时间，示出了4个柱状图。4个柱状图左起依次表示AQP的浓度为0、0.20％、0.45％、1％时的相对应答灵敏度。
需要说明的是，试验3中，对于1种试样，使用同一种类的2个试样进行了2次测定。图5和图6所示的结果表示2次测定结果的平均值。
由图5和图6所示的结果确认，在AQP的浓度为0(未添加)的情况下，随着热处理时间延长，应答灵敏度降低，在热处理时间为60分钟、120分钟时，应答灵敏度几乎消失。与此相对，确认了：在AQP的浓度为0.20％的情况下，热处理时间为30分钟、60分钟、120分钟时的应答灵敏度比热处理时间为10分钟时的应答灵敏度降低，但与AQP的浓度为0的情况相比，显示出良好的应答灵敏度。并且确认了：在AQP的浓度为0.45％的情况下，热处理时间为30分钟、60分钟、120分钟时的应答灵敏度与热处理时间为10分钟时的应答灵敏度相比几乎没有变化，或者达到热处理时间为10分钟时的应答灵敏度以上。并且确认了：在AQP的浓度为1％的情况下，在热处理时间为30分钟、60分钟和120分钟时，与热处理时间为10分钟时的应答灵敏度相比，均显示出2倍以上的应答灵敏度。根据上述的结果，从酶电极制作的容易性考虑，用于使酶电极得到合适的耐热性的聚苯胺磺酸的上限浓度为5％以下，优选为1％以下。另外，用于得到合适的耐热性的下限浓度为0.01％以上，优选为0.2％以上，进一步优选为0.45％以上。
<试验4>
接着，对进行关于添加到试剂溶液中的导电性聚合物的浓度的影响的试验的结果进行说明。
<<酶电极(葡萄糖传感器)的制备步骤>>
葡萄糖传感器的制备步骤如下所述。即，在电极上滴加0.1μl混合试剂，在室温下静置20分钟后，使用烘箱在120℃的炉内温度下干燥30分钟。
[混合试剂的组成(“％”为重量％浓度)]
·炭黑：4％
·吐温20水溶液：1.6％(表面活性剂)
·稳定剂：0.5％
·磷酸缓冲液(pH7.0)：16mM
·葡萄糖脱氢酶(GDH)水溶液：5.6mg/ml
·聚苯胺磺酸水溶液(0、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.75％、1％、1.5％、2％)
·水(H2O)
<<评价步骤>>
作为通过上述制备的葡萄糖传感器的电极，使用银/氯化银电极(Ag/AgCl(BAS公司制造))作为工作电极和参比电极，使用铂(Pt)线作为对电极。使用这样的葡萄糖传感器，在PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)溶液中利用电流分析法测定葡萄糖应答电流(应答灵敏度)。具体而言，将外加电压设定为+0.4V(对Ag/AgCl)，在PBS溶液中，在背景电流达到平台期后，添加2M葡萄糖水溶液，使得终浓度为100mg/dL。关于葡萄糖传感器对葡萄糖水溶液添加的应答电流值，记录添加后的应答电流值，并减去背景电流值，将所得的值作为应答电流值。
<<试验4的结果>>
图7是表示通过上述的评价步骤得到的试验4的结果的曲线图。由图7所见可知，在120℃下，在0.1～2％的浓度下均得到了适当的应答电流值。通常，酶在高温下失活。与此相对，即使经过120℃这样的高温，也能得到适当的应答电流值，由此可知，通过聚苯胺磺酸对酶进行了适当保护而使之不受热。并且，聚苯胺磺酸的浓度可采用的范围从酶电极制作的容易性考虑为5％以下，优选为2％以下，进一步优选为1％以下，另外，从图7所示的结果还可以了解到：作为用于得到合适的耐热性的下限浓度，其为0.01％以上，优选为0.2％以上，进一步优选为0.45％以上。
<试验5>
接着，作为试验5，对关于葡萄糖传感器的热处理时间所带来的影响进行试验的结果进行说明。在试验5中，使用通过将0.1μl具有在试验4中说明过的组成的混合试剂滴加到电极上，在室温下静置20分钟后，使用烘箱在预定的炉内温度(100℃)下经过多种不同的干燥时间(热处理时间为10分钟、30分钟、60分钟、120分钟)的热处理而得到的多个葡萄糖传感器。试验5中的葡萄糖传感器的电极构成及评价步骤与试验4相同。
图8是表示试验5的结果的曲线图。图8中，关于4种热处理时间(10分钟、30分钟、60分钟、120分钟)，示出了表示聚合物浓度与应答电流值的关系的4个曲线图。可以看出，在任何一种聚合物浓度下，均得到了能够适合作为葡萄糖传感器使用的应答电流值而不受热处理时间的影响。因此可知，使用了聚苯胺磺酸的葡萄糖传感器即使长时间放置于高温下，应答灵敏度也不会受到大幅影响(能够发挥适当的耐热性)。
[实施方式的作用效果]
根据上述的酶电极10，通过在电极1上形成包含氧化还原酶4和导电性聚合物5(例如聚苯胺磺酸)的检测层2，能够得到合适的耐热性。由此，能够抑制由热引起的酶或试剂的功能降低、或者功能损失。这样，酶电极10在其输送、保存、使用的各过程中发挥合适的耐热性，由此能够延长酶电极10的寿命。
另外，酶电极10可以采用于例如在如上所述的葡萄糖测定中采用的生物传感器、电子设备(例如，测定装置)。或者，也可以考虑作为将通过酶反应产生的电流(由传递至电极的电子产生的电流)通过连接电极与负荷的供给部作为电力供给至负荷的电源装置的一部分来应用。电子设备可以包括包含应用了实施方式的酶电极的生物传感器的电子设备、包含应用了实施方式的酶电极的上述装置(电源装置)的电子设备。上述实施方式中所说明的构成要素可以适当组合。
符号说明
1···电极
2···检测层
3···绝缘性基板
4···酶
5···导电性聚合物
10···酶电极

Claims (18)

1.一种酶电极，其特征在于，
所述酶电极包含电极以及与所述电极接触且含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒的检测层，
通过所述检测层中的直接电子转移，在所述氧化还原酶与所述电极间进行电子授受。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其中，所述水溶性导电性聚合物为聚苯胺磺酸。
3.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述氧化还原酶具有包含细胞色素的亚单元。
4.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述氧化还原酶具有包含细胞色素的结构域。
5.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述氧化还原酶为至少由催化亚单元和包含细胞色素的亚单元构成的寡聚酶。
6.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述氧化还原酶为至少由催化结构域和包含细胞色素的结构域构成的酶。
7.根据权利要求5所述的酶电极，其特征在于，所述催化亚单元包含吡咯并喹啉醌、黄素腺嘌呤二核苷酸中的至少任意一种。
8.根据权利要求6所述的酶电极，其特征在于，所述催化结构域包含吡咯并喹啉醌、黄素腺嘌呤二核苷酸中的至少任意一种。
9.根据权利要求1或2所述的酶电极，其特征在于，所述导电性颗粒含有碳。
10.根据权利要求2所述的酶电极，其中，所述聚苯胺磺酸的浓度为0.01～2％。
11.根据权利要求2或10所述的酶电极，其中，所述聚苯胺磺酸的官能团为羟基或磺基。
12.根据权利要求1或10所述的酶电极，其中，所述酶电极中，耐热性得到了提高。
13.一种生物传感器，其具备酶电极，所述酶电极包含电极以及与所述电极接触且含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒的检测层，通过所述检测层中的直接电子转移在所述氧化还原酶与所述电极间进行电子授受。
14.一种电子设备，其包含权利要求13所述的生物传感器。
15.一种电源装置，其包含酶电极以及将通过所述酶电极中的酶反应产生的电流供给至负荷的供给部，所述酶电极包含电极以及与所述电极接触且含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒的检测层，通过所述检测层中的直接电子转移在所述氧化还原酶与所述电极间进行电子授受。
16.一种电子设备，其包含权利要求15所述的装置。
17.一种酶电极的制造方法，其包括：在电极上形成含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒且通过直接电子转移在所述氧化还原酶与所述电极间进行电子授受的检测层。
18.一种试剂，其特征在于，含有氧化还原酶、水溶性导电性聚合物和导电性颗粒，并且使耐热性提高了。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI637167B (zh) * 2013-08-07 2018-10-01 日商愛科來股份有限公司 Substance measuring method and measuring device using electrochemical biosensor
US10788439B2 (en) 2014-03-25 2020-09-29 The Procter & Gamble Company Apparatus for sensing environmental moisture changes
US10782261B2 (en) 2014-03-25 2020-09-22 The Procter & Gamble Company Apparatus for sensing environmental humidity changes
US10914644B2 (en) 2014-03-25 2021-02-09 The Procter & Gamble Company Apparatus for sensing material strain
US10794850B2 (en) * 2014-03-25 2020-10-06 The Procter & Gamble Company Apparatus for sensing environmental pH changes
US10788437B2 (en) 2014-03-25 2020-09-29 The Procter & Gamble Company Apparatus for sensing environmental changes
JP6773406B2 (ja) * 2014-12-24 2020-10-21 アークレイ株式会社 酵素電極
JP6823420B2 (ja) * 2015-10-15 2021-02-03 アークレイ株式会社 バイオセンサ
US10577637B2 (en) * 2015-10-15 2020-03-03 Arkray, Inc. Enzyme electrode
JP6783108B2 (ja) * 2015-10-15 2020-11-11 アークレイ株式会社 酵素電極
US20170108458A1 (en) * 2015-10-15 2017-04-20 Arkray, Inc. Biosensor
JP6817111B2 (ja) * 2016-03-16 2021-01-20 アークレイ株式会社 電気化学式バイオセンサを用いた物質の測定方法及び測定装置
EP3249050B1 (en) * 2016-05-23 2019-01-23 ARKRAY, Inc. Enzyme electrode and biosensor using the same
TWI634698B (zh) * 2016-05-26 2018-09-01 財團法人工業技術研究院 電化學單元結構及製法
US10983087B2 (en) 2016-05-26 2021-04-20 Industrial Technology Research Institute Structures and manufacture method of electrochemical units
JP6901717B2 (ja) 2016-08-29 2021-07-14 国立研究開発法人産業技術総合研究所 グルコースセンサ用試薬、グルコースセンサ、グルコースセンサの製造方法、および、グルコース測定装置
CN109425643B (zh) * 2017-08-25 2022-10-25 爱科来株式会社 基于酶电化学阻抗测量法的新型生物传感技术
CN110514704B (zh) * 2018-05-22 2024-02-13 爱科来株式会社 新型生物传感方法
EP3572503B1 (en) 2018-05-22 2021-01-27 ARKRAY, Inc. Mutant glucose oxidase and use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1452717A (zh) * 2000-09-25 2003-10-29 旭化成株式会社 酶电极
CN101339155A (zh) * 2007-07-04 2009-01-07 株式会社船井电机新应用技术研究所 酶电极和酶传感器

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6350748A (ja) 1986-08-20 1988-03-03 Sanyo Electric Co Ltd 酵素電極システム
JPS6475956A (en) 1987-09-18 1989-03-22 Bridgestone Corp Enzyme electrode
GB8817997D0 (en) * 1988-07-28 1988-09-01 Cambridge Life Sciences Enzyme electrodes & improvements in manufacture thereof
JPH04122849A (ja) * 1990-09-14 1992-04-23 Sumitomo Metal Ind Ltd 酵素電極
EP0771867A3 (en) * 1995-10-30 1998-09-02 Ciba-Geigy Japan Limited Enzyme electrode
JP2966795B2 (ja) 1996-09-30 1999-10-25 科学技術振興事業団 機能性薄膜とその製造方法
US7390391B2 (en) * 2001-09-14 2008-06-24 Arkray, Inc. Concentration measuring method, concentration test instrument, and concentration measuring apparatus
JP4621841B2 (ja) * 2002-06-17 2011-01-26 アークレイ株式会社 グルコース脱水素酵素を用いたグルコース濃度測定方法およびグルコースセンサ
JP2004163385A (ja) * 2002-09-17 2004-06-10 Toto Ltd バイオセンサおよびバイオセンサの製造方法
CN100487442C (zh) * 2002-12-20 2009-05-13 爱科来株式会社 薄型分析用具
GB2421951B (en) 2003-09-30 2008-02-27 Koji Sode Glucose dehydrogenase/cytochrome fusion protein
JP4717637B2 (ja) * 2004-01-07 2011-07-06 アークレイ株式会社 試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法
JP4632437B2 (ja) 2004-07-23 2011-02-16 キヤノン株式会社 酵素電極、酵素電極を有するデバイス、センサ、燃料電池、電気化学的反応装置
US20080248354A1 (en) * 2004-07-23 2008-10-09 Canon Kabushiki Kaisha Enzyme Electrode, and Device, Sensor, Fuel Cell and Electrochemical Reactor Employing the Enzyme Electrode
US8080385B2 (en) * 2007-05-03 2011-12-20 Abbott Diabetes Care Inc. Crosslinked adduct of polyaniline and polymer acid containing redox enzyme for electrochemical sensor
JPWO2009133679A1 (ja) * 2008-04-30 2011-08-25 日本電気株式会社 バイオセンサ用電極の製造方法、バイオセンサの製造方法、およびバイオセンサ
WO2010090271A1 (ja) * 2009-02-09 2010-08-12 アークレイ株式会社 電気化学センサーおよびその作製方法
JP2014006155A (ja) * 2012-06-25 2014-01-16 Bioengineering Laboratories Llc 酵素電極

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1452717A (zh) * 2000-09-25 2003-10-29 旭化成株式会社 酶电极
CN101339155A (zh) * 2007-07-04 2009-01-07 株式会社船井电机新应用技术研究所 酶电极和酶传感器

Also Published As

Publication number Publication date
EP2866024B1 (en) 2020-03-18
US20150129425A1 (en) 2015-05-14
JPWO2014002999A1 (ja) 2016-06-02
JP6186630B2 (ja) 2017-08-30
WO2014002999A1 (ja) 2014-01-03
EP2866024A4 (en) 2016-03-09
EP2866024A1 (en) 2015-04-29
BR112014032201A2 (pt) 2017-06-27
CN104520700A (zh) 2015-04-15

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