CN104583765A - 酶电极 - Google Patents

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Abstract

一种酶电极，其包含电极和检测层，所述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与酶的至少一部分和导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，非导电性高分子具有在其添加浓度与所述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。

Description

酶电极
技术领域
本发明涉及酶电极。
背景技术
已有包含作为基材的电极以及使用交联剂、粘合剂将酶和导电性颗粒固定在电极的表面上而得到的检测层的酶电极。酶电极具有将通过酶反应生成的电子从电极中取出的结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭63-222256号公报
专利文献2：日本特开平2-99849号公报
专利文献3：国际公开WO2007/055100号公报
专利文献4：国际公开WO2009/037838号公报
专利文献5：日本特开2004-317421号公报
专利文献6：日本特开2007-222786号公报
专利文献7：美国专利第6770729号公报
发明内容
发明所要解决的问题
一般而言，为了适当地保持检测层中含有的酶和导电性颗粒、并且确保检测层对基材的适当的密合性，考虑提高交联剂、粘合剂的浓度。然而，单纯提高交联剂、粘合剂的浓度时，会阻碍检测层内的良好的电子传递路径的形成，存在酶电极的应答灵敏度与交联剂、粘合剂的浓度成比例地降低的倾向。
另外，近年来，酶电极有小型化的倾向，一方面期望以少量的粘合剂维持检测层在基材上适当的固定状态，另一方面期望酶电极具有良好的应答灵敏度及重现性。
本发明的一个方式基于上述情况而完成，其目的在于提供一种酶电极，该酶电极具有的检测层被适当地固定于基材上，另一方面该检测层能够得到适当的应答灵敏度。
用于解决问题的手段
为了实现上述目的，本发明的一个方式采用以下的构成。即，本发明的一个方式为一种酶电极，其为包含电极和检测层的酶电极，其中，上述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，上述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，上述非导电性高分子具有在其添加浓度与上述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
上述一个方式中的上述含有氮(N)或氧(O)的连接链例如为共价键。另外，共价键例如为酰胺酯键。另外，作为上述连接链，除了酰胺酯键以外，还有肽键、碳二亚胺、希夫碱。另外，上述一个方式中，可以以酰胺酯键来自于噁唑啉基的方式构成。另外，上述一个方式中，可以以相对于上述非导电性高分子含有4.5mmol/g的上述噁唑啉基的方式构成。
上述一个方式中，上述导电性颗粒可以选自碳、金属中的至少一种。另外，可以以上述导电性颗粒的平均粒径为100nm以下的方式构成。或者，可以以上述导电性颗粒的比表面积为200m2/g以上的方式构成。另外，可以采用上述导电性颗粒含有羧基、氨基、醛基、羟基和苯基中的至少一种基团的构成。此外，上述导电性颗粒可以含有选自碳纳米管和富勒烯中的一种以上的微粒。
另外，上述的一个方式中，可以以上述酶、上述导电性颗粒、上述非导电性高分子的重量比率为0.023～2.0:0.1～1.0:2.5～10.0的方式构成。
另外，本发明的其他方式之一为一种生物传感器，其为具备包含电极和检测层的酶电极的生物传感器，其中，上述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，上述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，上述非导电性高分子具有在其添加浓度与上述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
另外，本发明的其他方式之一为一种电子设备，其为具备包含电极和检测层的酶电极的电子设备，其中，上述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，上述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，上述非导电性高分子具有在其添加浓度与上述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
另外，本发明的其他方式之一为一种装置，其包含酶电极和供给部，上述酶电极包含电极和检测层，上述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，上述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，上述非导电性高分子具有在其添加浓度与上述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域；供给部将通过对上述酶电极通电而引起的酶反应产生的电流供给至负荷。另外，本发明的其他方式可以包括包含上述生物传感器的电子设备、包含上述装置的电子设备。
另外，本发明的其他方式之一是一种酶电极的制造方法，其包括：制备含有酶、导电性颗粒和高分子的试剂溶液的步骤、将上述试剂溶液应用于电极上的步骤、和通过使所应用的试剂溶液干燥而在上述电极上形成含有上述酶、上述导电性颗粒和上述高分子且上述高分子通过含有氮或氧的连接链与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接的检测层的步骤，上述非导电性高分子具有在其添加浓度与上述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。上述试剂溶液的制备时添加的上述非导电性高分子的浓度例如为0.25％～10％。
另外，本发明的其他方式之一为一种酶电极，其包括电极和检测层，上述检测层含有酶、导电性颗粒以及与上述酶的至少一部分和上述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一形成酰胺酯键的高分子。
发明效果
根据本发明的一个方式，可以提供一种具有检测层的酶电极，检测层被适当地固定于基材上，并且能够得到适当的灵敏度。
附图说明
图1是示意性地表示实施方式的酶电极的侧面或截面的图。
图2示意性地示出图1所示的检测层2内的状态。
图3是表示检测层对电极的密合性与应答灵敏度的关系的图。
具体实施方式
以下，参照附图对作为本发明的一个实施方式的酶电极进行说明。以下举出的实施方式各自为例示，本发明不限定于以下的实施方式的构成。
[酶电极的构成]
图1是示意性地表示实施方式的酶电极的侧面或截面的图。图1中，酶电极10具备电极(电极层)1和形成在电极1的表面(图1中为上面)上的检测层2。
<电极>
电极1使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)、钯这样的金属材料、或者碳这样的碳材料来形成。电极1例如形成在图1所示的绝缘性基板3上。基板3由聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)等热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂等各种树脂(塑料)、玻璃、陶瓷、纸等绝缘性材料形成。形成电极1的电极材料及绝缘性基板3的材料可以采用公知的任意材料。电极1及绝缘性基板3的大小、厚度可以适当设定。以下，也有时将绝缘性基板3与电极1的组合称为“基材”。
<检测层>
图2示意性地示出图1所示的检测层2内的状态。如图2所示，检测层2中，酶5和导电性颗粒6通过含有噁唑啉基的聚合物被固定化。具体而言，在检测层2内，分布有酶5、导电性颗粒6、噁唑啉基7和丙烯酸/苯乙烯链8，通过噁唑啉基7的开环与酶5或导电性颗粒6的羧基的反应，形成酰胺酯键。
即，检测层2含有2个以上的酶5、2个以上的导电性颗粒6以及与2个以上的酶5的至少一部分和2个以上的导电性颗粒6的至少一部分中的至少之一形成酰胺酯键的2个以上的非导电性高分子(酰胺酯9)。
通过酰胺酯9与酶5或导电性颗粒6连接，在检测层2内的状态成为酶5和导电性颗粒6被牢固地保持或负载。另外，通过酰胺酯键，酶5和导电性颗粒6在检测层2内成为均匀分布的状态。由此，成为形成了数量适度的使通过酶反应生成的电子经由导电性颗粒6到达电极1的电子传递路径的状态。因此，实现了酶电极的应答灵敏度的提高。另一方面，检测层2对电极1显示出适当的密合性。
<<酶>>
酶5例如为氧化还原酶。例如为葡萄糖脱氢酶(GDH)。作为GDH，优选采用不需要电子介质的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FADGDH)。另外，作为酶5，可以采用包含细胞色素的氧化还原酶。例如，可以举出包含细胞色素的葡萄糖脱氢酶(Cy-GDH)、D-果糖脱氢酶、纤维二糖脱氢酶等。
<<导电性颗粒>>
导电性颗粒6可以采用金、铂、银、钯这样的金属制颗粒或者以碳作为材料的高级结构体。高级结构体例如可以含有选自导电性炭黑、科琴黑(注册商标)、碳纳米管(CNT)、富勒烯中的一种以上的微粒(碳微粒)。导电性颗粒6可以选择如上所述的金属和碳中的之一。另外，导电性颗粒6可以含有羧基、氨基、醛基、羟基、苯基中的至少一种作为用于交联的官能团。
需要说明的是，检测层2的表面可以由醋酸纤维素(CA)这样的外层膜覆盖。
<<酶、导电性颗粒、粘合剂的重量比率等>>
构成检测层2的酶、导电性颗粒、粘合剂的重量比率例如优选为酶:导电性颗粒:粘合剂＝(0.023～2.0):(0.1～1.0):(2.5～10.0)。另外，导电性颗粒的平均粒径例如优选为100[nm]以下，比表面积例如优选为200[m2/g]以上。
[酶电极的制作方法]
以下，上述的酶电极10例如以如下方式制作。即，在绝缘性基板3的单面上形成作为电极1发挥功能的金属层。例如，在预定的厚度(例如约100μm)的薄膜状的绝缘性基板3的单面上通过物理蒸镀(PVD、例如溅射)或者化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此，形成具有期望的厚度(例如约30nm)的金属层。也可以形成用碳材料形成的电极层来代替金属层。
接着，在电极1上形成检测层2。即，制备包含导电性颗粒6、酶5、作为粘合剂的含有噁唑啉基的非导电性高分子聚合物的电极溶液。将电极溶液滴加到电极1的表面上。通过干燥使电极溶液在电极1上固化，由此能够得到在电极1上形成有检测层2的酶电极10。
[实施例]
以下，对酶电极的实施例进行说明。
<检测层的配方>
首先，制备分别含有导电性颗粒、酶和粘合剂的实施例1、实施例2和比较例的电极溶液(试剂溶液)。实施例1、实施例2和比较例中，分别使用科琴黑(注册商标、以下记作“KJB”)作为导电性颗粒，并且使用Cy-GDH作为酶。
与此相对，在实施例1中，使用EPOCROS(注册商标，以下记作“EPC”)作为粘合剂，其为含有作为含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的噁唑啉基的高分子聚合物之一。在实施例2中，使用聚(2-乙基-2-噁唑啉)(以下记作“PEO”)作为粘合剂，其为含有作为含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的噁唑啉基的高分子聚合物之一。另外，在比较例中，使用VYLONAL(注册商标)作为粘合剂。实施例1、实施例2和比较例中的电极溶液的终浓度如下所示。含有作为含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的噁唑啉基的高分子聚合物为“非导电性高分子”的一例。
<<实施例1的配方>>
·KJB：0.4重量％
·酶(Cy-GDH)：3.5mg/mL
·磷酸Na缓冲液：10mM pH7
·EPC(EPOCROS WS-700、分子量4万陶氏化学公司(日本催化剂)制造)
作为实施例1，制备EPC的浓度分别为0.25[重量％]、0.5[重量％]、1.0[重量％]、3.0[重量％]的4种电极溶液(试样)。
<<实施例2的配方>>
·KJB：0.4重量％
·酶(Cy-GDH)：3.5mg/mL
·磷酸Na缓冲液：10mM pH7
·PEO(分子量5万的含有噁唑啉的聚合物、西格玛奥德里奇制造)
作为实施例，制备PEO的浓度分别为0.25[重量％]、0.5[重量％]、1.0[重量％]、3.0[重量％]的4种电极溶液(试样)。
<<比较例的配方>>
·KJB：0.4重量％
·酶(Cy-GDH)：3.5mg/mL
·磷酸Na缓冲液：10mM pH7
·VYLONAL(注册商标)MD-1200(东洋纺织、水分散型高分子量共聚聚酯树脂、以下记作“MD-1200”)
作为比较例，制备MD-1200的浓度分别为0.25[重量％]、0.5[重量％]、1.0[重量％]、3.0[重量％]的4种电极溶液(试样)。
需要说明的是，实施例1、实施例2和比较例中使用的KJB的平均粒径为100[nm]以下，比表面积为200[m2/g]以上。另外，实施例1的噁唑啉基在分子中的比率为4.5[mmol/g]。
<A.应答灵敏度试验>
<<酶电极的制作>>
准备通过溅射在作为绝缘性基板的聚醚酰亚胺(PEI)表面上形成有金(Au)的金属层(电极)的基材，在电极表面上以相对于电极的单位面积(cm2)为10.0μL/cm2的条件滴加电极溶液(试样、试剂溶液)。然后，在23℃、40％RH的气氛下自然干燥。这样，得到了形成有利用上述各粘合剂将酶和导电性颗粒固定在电极表面上的检测层的酶电极。检测层含有具有含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的非导电性高分子。
<<应答灵敏度的测定方法>>
接着，对使用酶电极的葡萄糖浓度的测定方法的例子进行说明。作为测定方法，通过对电极系统施加400mV的电位差的计时安培分析法，测定对葡萄糖的应答灵敏度。
首先，准备作为测定液的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)，并保持于37℃。接着，将使用铂电极作为对电极、使用Ag/AgCl电极作为参比电极的酶电极与恒电位仪进行电连接，并且浸渍到0.1M磷酸缓冲液中。然后，对工作电极施加恒定电压(400mV对Ag/AgCl)。
关于葡萄糖浓度的测定，首先，测定葡萄糖终浓度为0mg/dL时的电流值(nA)，然后，在持续滴加2M的葡萄糖溶液的同时，连续地测定25mg/dL、50mg/dL、150mg/dL、250mg/dL时的电流值。电流值与应答灵敏度相当。
<<试验结果>>
实施例1、实施例2和比较例的葡萄糖浓度的测定结果如下述表1、表2、表3所示。各表中的值表示应答灵敏度(nA)，其中Glu表示葡萄糖。
[表1]
[表2]
[表3]
根据表1、表2、表3所示的测定结果，对于实施例1、实施例2而言，虽然观察到一部分测定数据的偏差，但如果将测定数据作为整体来看，则在实施例中观察到正相关，表明存在相对于粘合剂的添加量的增加可观察到应答灵敏度的维持或提高的区域。即，实施例1、实施例2具有在粘合剂(非导电性高分子)的添加浓度与酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。与此相对，对于比较例而言，虽然观察到一部分数据的偏差，但如果将测定数据作为整体来看，则观察到负相关，观察到相对于粘合剂的添加量的增加应答灵敏度降低的倾向。如比较例所示，通常在将非导电性高分子添加到酶电极中的情况下，应答灵敏度有降低的倾向，但在实施例1、实施例2中，添加非导电性高分子时，观察到应答灵敏度的提高。由实施例1、实施例2可知，使用含有噁唑啉基的高分子聚合物作为粘合剂时，尽管其添加量增加，也能够获得应答灵敏度的提高。
<B.密合力(或强度)试验方法>
接着，对于使用实施例1、实施例2、比较例的各电极溶液制作的酶电极，进行检测层对电极的密合力(检测层的强度)的试验。
<<酶电极的制作>>
准备与在应答灵敏度试验中使用的基材(在绝缘性基板上形成有电极的基材)同样的基材，将实施例1、实施例2、比较例的各电极溶液以相对于电极的单位面积(cm2)为10.0μL/cm2的条件滴加(应用)到电极表面上。然后，在23℃、40％RH的气氛下自然干燥。这样，制作用于密合力(或强度)试验的形成在电极上的检测层(酶电极)。
<<密合力(或强度)试验>>
依据JISK5600-5-6附着性(划格法)，实施检测层对电极的密合力的试验。
<<试验结果>>
将划格法得到的试验结果示于以下的表4中。试验结果分为0～5，0表示最良好的密合力，5表示最差的密合力。
[表4]
EPC PEO MD1200
0.25％ 4 4 4
0.50％ 3 4 4
1％ 2 2 3
3％ 1 1 1
5％ 1 1 3
7％ 4
10％ 1
根据上述试验结果，对于实施例1、实施例2而言，随着粘合剂(含有噁唑啉基的高分子聚合物)添加量的增加，观察到密合力的提高。另一方面，对于比较例而言，未观察到粘合剂的添加量与密合力的关系，作为整体观察到密合力差的倾向。
<C.应答灵敏度试验结果与密合力(或强度)的关系>
图3是表示A.应答灵敏度试验中得到的结果与B.密合力(或强度)试验中得到的结果的关系的曲线图。图3中，白色圆的点表示实施例1(EPC)，点附近的罗马字母A～D表示EPC的浓度(添加量)。即，A＝0.25％、B＝0.50％、C＝1％、D＝3％。
另外，图3中的黑色圆的点表示实施例2(PEO)，点附近的罗马字母A～F表示PEO的浓度(添加量)。即，A＝0.25％、B＝0.50％、C＝1％、D＝3％、E＝5％、F＝10％。
另外，图3中的三角形的点表示比较例(MD-1200)，点附近的罗马字母A～F表示MD-1200的浓度(添加量)。即，A＝0.25％、B＝0.50％、C＝1％、D＝3％、E＝5％、F＝7％。
曲线图的纵轴为电流值(应答灵敏度)(nA)，表示葡萄糖浓度为150mg/dL时的试验结果。另一方面，曲线图的横轴表示密合力(或强度)。但是，表示与表4所示的划格法中使用的分类用的数值相反的含义。即，5表示密合力最好，0表示密合力最差。
如图3所示，比较例中，观察到如下倾向：即使为了提高密合力而增加粘合剂的浓度，灵敏度也几乎没有变化或者稍有降低。与此相对，实施例1、实施例2(采用含有作为含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的噁唑啉基的高分子作为粘合剂的实施例)中，与比较例相比，应答灵敏度高，并且未观察到由粘合剂浓度的上升引起的灵敏度降低的倾向，可知能够维持高于比较例的应答灵敏度。
由此可见，通过制作包含含有作为含有氮(N)或氧(O)的共价连接链的噁唑啉基的高分子的检测层，所制作的酶电极能够具有使用现有的交联剂、粘合剂无法实现的对基材(电极)的高密合性和高应答灵敏度。根据上述实施例，非导电性高分子的浓度例如为0.25％～10％，优选为0.5％～5％，进一步优选为1％～3％。
[实施方式的作用效果]
根据上述的酶电极10，通过适当的酶5和导电性颗粒6的固定化，能够得到良好的应答灵敏度，另一方面，对基材能够具有适当的密合性。特别是，与现有的粘合剂相比，能够减少适当的固定化所要求的浓度或量，因此，认为有助于酶电极10的小型化。
需要说明的是，酶电极10例如可以应用于如上所述的葡萄糖测定中采用的生物传感器、电子设备(例如，测定装置)。或者，也可以考虑作为将通过酶反应产生的应答电流(由向电极传递的电子产生的电流)经由连接电极与负荷的供给部以电力的形式供给至负荷的电源装置的一部分来应用。电子设备可以包括包含采用实施方式的酶电极的生物传感器的电子设备、包含采用实施方式的酶电极的上述装置(电源装置)的电子设备。
符号说明
1···基材(电极)
2···检测层
3···绝缘性基板
5···酶
6···导电性颗粒
7···噁唑啉基
8···丙烯酸/苯乙烯链
9···酰胺酯

Claims (18)

1.一种酶电极，其为包含电极和检测层的酶电极，其中，
所述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，
所述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与所述酶的至少一部分和所述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，
所述非导电性高分子具有在其添加浓度与所述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
2.根据权利要求1所述的酶电极，其中，所述连接链为共价键。
3.根据权利要求2所述的酶电极，其中，所述共价键为酰胺酯键。
4.根据权利要求3所述的酶电极，其中，所述酰胺酯键来自于噁唑啉基。
5.根据权利要求4所述的酶电极，其中，相对于所述高分子，含有4.5mmol/g的所述噁唑啉基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的酶电极，其中，所述导电性颗粒选自碳、金属中的至少一种。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的酶电极，其中，所述导电性颗粒的平均粒径为100nm以下。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶电极，其中，所述导电性颗粒的比表面积为200m2/g以上。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的酶电极，其中，所述导电性颗粒含有羧基、氨基、醛基、羟基和苯基中的至少一种基团。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的酶电极，其中，所述导电性颗粒含有选自碳纳米管和富勒烯中的一种以上的微粒。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的酶电极，其中，所述酶、所述导电性颗粒、所述非导电性高分子的重量比率为0.023～2.0:0.1～1.0:2.5～10.0。
12.一种生物传感器，其为具备包含电极和检测层的酶电极的生物传感器，其中，
所述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，
所述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与所述酶的至少一部分和所述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，所述非导电性高分子具有在其添加浓度与所述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
13.一种电子设备，其包含权利要求12所述的生物传感器。
14.一种装置，其包括：
酶电极，所述酶电极包括电极和检测层，所述检测层含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子，所述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与所述酶的至少一部分和所述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接，所述非导电性高分子具有在其添加浓度与所述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域；和
供给部，将通过对所述酶电极通电而引起的酶反应产生的电流供给至负荷。
15.一种电子设备，其包含权利要求14所述的装置。
16.一种酶电极的制造方法，
包括下述步骤：
制备含有酶、导电性颗粒和非导电性高分子的试剂溶液的步骤；
将所述试剂溶液应用于电极上的步骤；和
通过使所应用的试剂溶液干燥而在所述电极上形成含有所述酶、所述导电性颗粒和所述非导电性高分子且所述非导电性高分子通过含有氮或氧的连接链与所述酶的至少一部分和所述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一连接的检测层的步骤，
所述非导电性高分子具有在其添加浓度与所述酶电极的应答灵敏度之间存在正相关的区域。
17.根据权利要求16所述的酶电极的制造方法，其中，在所述试剂溶液的制备时添加的所述非导电性高分子的浓度为0.25％～10％。
18.一种酶电极，
其包含电极和检测层，
所述检测层含有酶、导电性颗粒以及与所述酶的至少一部分和所述导电性颗粒的至少一部分中的至少之一形成酰胺酯键的高分子。
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