WO2007055100A1

WO2007055100A1 - 酵素電極

Info

Publication number: WO2007055100A1
Application number: PCT/JP2006/321291
Authority: WO
Inventors: Yuka Inose
Original assignee: Ultizyme International Ltd.
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2007-05-18

Abstract

　本発明においては、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ）を混合することにより、電子伝達蛋白質及び電子メディエータを使用することなく、高い応答電流値と溶存酸素の影響のない電流値が得られる実用的な酵素電極を提供することができる。

Description

明細書

酵素電極

技術分野

[0001] 本発明は、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末及びフラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)を含む酵素電極、特に、グルコースセンサとして優位に使用される酵素電極に関するものである。

背景技術

[0002] 酵素電極とは、通常、金電極、白金電極、カーボン電極等の電極表面上に酵素が固定ィ匕された電極のことをいう。酵素電極は、酵素の反応特異性を利用して、種々の生理活性物質を特異的に検出するバイオセンサーとして広く使用されている。特に、糖尿病に重要なマーカーとして血中のグルコース濃度を測定するためのグルコースセンサとして使用することができる。

[0003] 酵素電極に使用される酸化還元酵素としては、例えば、グルコースォキシダーゼ（ GOD)に代表される酸化酵素がある。 GODは、グルコースに対する基質特異性が高くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるという利点があるが、溶存酸素の影響を受けやすぐ測定結果の誤差が大きくなつてしまうという欠点を有する。

[0004] 他の酸化還元酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ (GDH)に代表される脱水素酵素がある。 GDHを使用した系は、一般に、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けにくいため、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酵素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコースを測定することができる利点を有する。しかしながら、 GDHを酵素電極として使用する際に高い応答電流が得られ、かつ溶存酸素の影響を受けないためには具体的にどのような GDHをどのような電極材料と組み合わせればよいかは不明であった。

[0005] また、コレステロール酸ィ匕酵素、フルクトシアルアミン酸ィ匕酵素等を用いて、それぞれ血中のコレステロールやフルクトシルァミンの濃度を測定するための酵素電極も研究されている。

[0006] これらの酸化還元酵素を酵素電極に応用する場合、電極の応答電流値が低いことが問題であった。そこで、本発明の発明者らは、電極の応答電流値を向上するために、電子メディエータと共に電子伝達蛋白質を有する酵素電極を提案した。

[0007] 電子メディエータとは、酸化還元酵素から電極への電子伝達を媒介し得る非蛋白質性の金属錯体、有機化合物などの酸ィ匕還元物質をいい、例えば、フェリシアンィ匕カリウム、フエナジンメトサルフェート、フエ口センおよびこれらの誘導体が挙げられる。

[0008] 電子伝達蛋白質とは、生体の酸ィ匕還元系において、電子供与体から電子を受け取つて還元され、次いで電子受容体に電子を渡して酸ィ匕されることのできる蛋白質をいう。電子伝達蛋白質の例としては、チトクローム b、チトクローム C,好ましくはチトク口ーム b562などが挙げられる。

[0009] 国際公開 02Z73181号パンフレットにおいては、電子伝達蛋白質を酸化還元酵素とともに電極上に固定ィ匕することにより、酸化還元元素から電極への、あるいは電子メディエータへの電子伝達を促進することができ、これにより応答電流値の高ヽ酵素電極を得ている。

[0010] これらの酵素電極を用いたグルコース濃度の測定は、一般に、恒温セルに緩衝液を入れ、補酵素、 CaCl 2及び電子メディエータを加えて一定温度に維持した後に、作用電極として酵素電極を使用し、対極 (例えば白金電極)及び参照電極 (例えば Ag ZAgCl電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になつた後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。

[0011] このように、これら従来の方法では、電子メディエータを電極内に含有又は電極表面に固定ィ匕する力、あるいは恒温セルに水溶液としてカ卩えなければならず、酸ィ匕還元酵素とは別に電子メディエータを準備しなければならず、プロセス複雑ィ匕し、量産化するにはコスト的に難点があった。

[0012] また、特許文献国際公開 88Z08447号パンフレット及び特開平 2— 99849号公報においては、白金を含有する白金化炭素粉末にグルコースォキシダーゼ酵素（G OD)を含ませた電極により高、応答電流値が得られて、るが、前述したように GOD を用いた電極では、溶存酸素の影響が大きぐ測定環境によって測定値に大きな差異が生じてしま、実用的でな!、。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本発明は、電子メディエータを使用することなぐ電子メディエータを使用した場合に比べて遜色がなぐ特にグルコースセンサとして使用する際に高い応答電流値が得られ、かつダイナミックレンジも広く得られ、しかも、溶存酸素の影響が少なく測定環境に影響されずに高精度の測定値を得ることができる実用性の高い酵素電極を提供することを目的とするものである。

課題を解決するための手段

[0014] 本発明においては、ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末とフラビンァデニンジヌクレオチド（FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素（FADGDH )との組み合わせにより、電子伝達蛋白質及び電子メディエータを使用しなくても、電極上のカーボンと酸化還元酵素間での電子の移動がスムーズになり、高い応答電流値が得られ、かつ溶存酸素の影響がな!、酵素電極としての機能を果たせることを見出したものである。

[0015] 本発明の酵素電極は、このように電極との電子の移動に電子メディエータを必要としない。したがって、本発明の酵素電極をアノード触媒として使用し、隔壁のない酵素燃料電池、特に、ワイヤレスシステムと組み合わせることで燃料電池型ワイヤレスグルコースセンサを構築することができる。

[0016] 本発明の酵素電極は、また、測定サンプルの溶存酸素の影響を受けないという利点を有する。したがって、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、測定結果に誤差を及ぼさずに正確に測定できると、う利点を有する。

[0017] 本発明の具体的構成は次のとおりである。

(1)ナノレベルの白金粒子が担持されて!、るカーボン粉末及びフラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)触媒サブュニットを含む酵素電極。

(2)ナノレベルの白金粒子が直径 lOnm以下である上記（1)に記載の酵素電極。 (3)ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末の比表面積が 200m²/g 以上である上記（1)又は（2)に記載の酵素電極。

(4)ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末の白金粒子の含有量が 2 0〜70%である上記（1)〜（3)の!、ずれかに記載の酵素電極。

(5)ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末のカーボン粉末の直径が lOOnm以下である上記（1)〜（4)の!ヽずれかに記載の酵素電極。

(6)グルコースセンサとして使用される上記（1)〜（6)の、ずれかに記載の酵素電極

(7)燃料電池のアノード電極として使用される上記（1)〜（6)のいずれかに記載の酵素電極。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]図 1は、 FADGDH触媒サブユニット（PtC)電極を作用極として使用して、ダルコース濃度 OmMの電流値を基準とした電流グルコース濃度曲線を示す。

[図 2]図 2は、 FADGDH複合体（PtC)電極（空気中及び Ar雰囲気下）、 FADGDH 複合体 (CP)電極あるいは PtC電極を作用極として使用して、グルコース濃度 OmM の電流値を基準とした電流ダルコース濃度曲線を示す。

[図 3]図 3は、 FADGDH複合体（PtC)電極あるいは FADGDH複合体（CP)電極をアノードとして酵素燃料電池を構築して得られた抵抗電力曲線を示す。

[図 4]図 4は、 FADGDH複合体（PtC)電極あるいは FADGDH複合体（CP)をァノードとして酵素燃料電池を構築して得られた電流グルコース濃度曲線を示す。

[図 5]図 5は、 GOD (PtC)電極あるいは GOD (CP)電極を作用極として使用して、グルコース濃度 OmMの電流値を基準とした電流グルコース濃度曲線を示す。

[図 6]図 6は、 PQQGDH触媒サブユニット（PtC)電極を作用極として使用して、ダルコース濃度 OmMの電流値を基準とした電流グルコース濃度曲線を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2005— 324150号および 2006— 065657号の明細書に記載の内容は全て引用により本明細書に取り込まれるものとする。

[0020] 本発明で使用するナノレベルの白金粒子とは、平均粒径が lOnm以下、好ましくは 2〜5nmレベルの平均粒径を有する白金粒子を意味する。このようなナノレベルの白金粒子が担持された炭素粒子は、例えば、白金を含有するジニトロジァミン白金硝酸溶液を純水で希釈して水溶液とし、これに粉末状のカーボン、例えば、アセチレンブラックの粉末を加えて混合、分散し、この混合液に試薬特級エタノールを加えて、還流加熱することによって製造することが提案されている（特開平 9— 47659号公報参照）。また、ターゲットとしてカーボンターゲットの上に白金ターゲットを配置することによってスパッタ法によって白金担持カーボン電極を得ることも提案されている（特開 2 003— 121407号公報参照）。

[0021] このような白金担持カーボンは、これに限定されるものではないが、例えば、触媒比表面積 100〜1000m²Zg、好ましくは 200m²Zg以上であることが望ましい。また白金含有量は総質量の 20〜70%、好ましくは 40〜60%が望ましい。また、担体であるカーボン粉末はカーボン粉末の直径が lOOnm以下、好ましくは 50nm以下であることが望ましい。また、金属比表面積 30〜： L00m²/gを有していることが望ましい。このような白金担持カーボン粉末としては、例えば、石福金属興業株式会社 (商品名 IFP C40— II、 IFPC20など IFPCシリーズ）、あるいは田中貴金属工業株式会社 (商品名 TEC10V30E— Pt, TEC10V40E— Pt、 TEC10V50E— Ptなど）などから入手可能である。

[0022] 本発明で使用されるフラビンアデ-ンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするダルコース脱水素酵素 (FADGDH)とは、触媒機能を発揮するための補酵素として FADを分子内に有しており、外部電子受容体の存在下でグルコースの脱水素化反応を触媒する酵素を意味する。このような酵素としてはァスパラギルス 'ォリゼ由来の FADG DH (Tchan-gi Bak, Biochim. Biophys. Acta 139, 277- 293(1967)) ,ァスパラギラス.テレウス由来 FADGDH(Seiya Tsujimura et al" Biosci. Biotechnol. Bioch em., 70(3) 654-659(2006)),あるいは後述するブルクホルデリア 'セパシァ由来 FA DGDHのように FADを補酵素として有しておりそのサブユニット単独でグルコース脱水素酵素活性を示す触媒サブユニットと電子伝達サブユニットとから構成されている酵素が知られている。本発明では、酸化還元酵素として FADGDHそのもの、あるいはブルクホルデリア ·セパシァ由来 FADGDHにお!/、て報告されて、る FADGDH触媒サブユニットのみで使用してもよ、し、触媒サブユニットと電子伝達サブユニットの複合体を使用してもよい。

[0023] 触媒サブユニットは、試料中のグルコース力電子を取り出し、この電子を電子伝達サブユニットに供与する役割を果たすものであり、フラビンアデ-ンジヌクレオチド（

FAD)補酵素とする FADGDH触媒サブユニットが使用される。したがって、電子伝達サブユニットに対しては、還元型 FADを介して、触媒サブユニットから電子が供与される。

[0024] 触媒サブユニットの含有量は、例えば、活性に換算して 5〜： LOOUに相当する量とされる。ここで、酵素 1単位（1U)は、各酵素ごとにその定義が知られており、例えば GDHの場合は、標準検定条件（pH6. 0、 37°C)の下で DCIP (2, 6—ジクロロフエノールインドフエノール）の還元にもとづく退色を、 DCIPの吸収波長である 600nmにおいて経時的に計測したときに、 1分ごとに 1 μ Μグルコースを酸ィ匕する量 (モル吸光係数は 4. 76 X 1000 μ M/cm)として定義される。

[0025] FADGDHは、グルコース脱水素活性を有する触媒サブユニット又は FADGDH 複合体として前記触媒サブユニットに電子伝達サブユニットが結合したものであれば特に限定されないが、その中でもブルクホルデリア'セパシァ、特にブルクホルデリア •セパシァ KS 1株（本明細書では「KS 1株」と!、う）を用いるのが好まし!/、。

[0026] KS 1株は、温泉付近の土壌力も分離した新規菌株であるが、その菌学的性質からブルクホルデリア 'セパシァであると同定されており、平成 12年 9月 25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (〒 305 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に微生物受託番号第 FERM BP— 7306として寄託されている。 KS 1株は、その詳細については、国際公開 WO02Z36779号公報に開示されている力触媒サブユニットである αサブユニット（分子量約 60kDa) 、電子伝達サブユニットであるシトクロム Cに相当する βサブユニット（分子量約 43kD a)及び γサブユニット（分子量約 14kDa)を含む GDHを産出することができる。ただし、分子量は、還元条件下での SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動において測定したものである。

[0027] 本発明の酵素電極を製造するためには、酸化還元酵素又はその複合体を白金担持カーボン粉末と共によく混合して電極に装着する。酸化還元酵素又はその複合体を白金担持カーボン電極に固定ィ匕するためには、上記のように電極に装着後、例えば、ダルタルアルデヒドなどの二架橋性試薬で架橋処理する。あるいは固体高分子電解質を用いて固定ィ匕することもできる。固体高分子電解質として最もよく用いられているのが Nafion (ナフイオン）である。ナフイオンをはじめとする固体高分子電解質をイソプロパノールなどの溶媒に溶解し、これを酵素吸着あるいは塗布乾燥させた酵素膜の上に滴下、あるいは酵素とともにナフイオン溶液を混合し乾燥することで酵素固定ィ匕膜を作成することができる。

[0028] 本発明の酵素電極は、原則として電子メディエータなしで動作する力これを排除するものではない。電子メディエータを使用する場合は、特に限定されないが、例えばフェリシアンィ匕カリウム、フエナジンメトサルフォートなどを使用することができる。

[0029] 本発明の酵素電極をグルコースセンサとして使用する場合は、上述の酵素電極を作用極として使用する。対極としては例えば白金電極を、参照電極として例えば Ag ZAgCl電極を用いることができる。恒温セルに緩衝液を入れてこれらの電極を装置し、作用極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、恒温セルにダルコ一スを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。

[0030] また、グルコースセンサとして使用する場合、例えば、グルコース濃度を連続的に測定し数回のグルコース測定を継続的に行うことができるように構成することもできる。この場合、グルコースセンサは、皮下組織力も血液または間質液を採取するための採取要素をさらに備え、採取要素によって採取した血液または間質液を、電極に接触させることができるように構成される。

[0031] 上記グルコースセンサは、電極の少なくとも一部を、皮下組織に埋め込んで使用するよう〖こ構成することもできる。この場合、電極は絶縁基板上に形成される。

[0032] 本発明の酵素電極は酵素燃料電池のアノードとして使用することができる。この際、酵素の基質特異性に従った物質を燃料とすることができる。力ソードには、白金担持カーボン電極、白金電極などを使用することができ、隔壁のない酵素燃料電池を構築することができる。反応溶液としては、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液を用いることもできるが、さらには体液中においても使用できる。外部回路にかける抵抗値を変えることで起電力を調整することができる。

[0033] 以下、実施例と比較例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

[0034] 白金触媒担持カーボン (商品名 IFPC40-IIとして石福金属興業より入手。以下、単に「PtC」 t 、う）粉末を lmgあたりミネラルオイル 1 μ 1と混合した。

FADGDH触媒サブユニット 500Uを PtC (白金触媒担持カーボン粉末） 20mgと混合し凍結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を研磨した後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行、、 FADGDH触媒サブユニット（ PtC)酵素電極を作製した。同様に、 FADGDH触媒サブユニット 500Uをカーボンペースト（以下 CP) 20mgと混合し凍結後カーボンペースト電極に充填し、 FADGD H触媒サブユニット (CP)電極を作製した。

[0035] それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として印加電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対する応答電流値を測定した。溶液として CaClを ImM含む MOPS (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。

2

[0036] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流ダルコース濃度曲線として示したものが図 1である。図 1からわ力るように、 FADGDH触媒サブユニット (CP)電極では応答電流値がほとんど観測されな力つたのに対し、 F ADGDH触媒サブユニット（PtC)電極では 35 μ Α程度までの応答電流値が観測された。

[0037] 以上の結果から、白金担持カーボンに FADGDH触媒サブユニットを含む電極がアノード電極材料として有用であることがわかった。

実施例 2

[0038] 500U FADGDH複合体を IFPC— II粉末（オイルベース） 20mgとともに凍結乾燥した。これを乳鉢を用いてよく混合し、 PtC粉末 (オイルベース）を詰めたカーボンペースト電極（Φ 3mm)表面に充填した。表面を研磨した後、室温にて 1%ダルタルアルデヒド溶液に 30分間浸漬し架橋処理し、 lOmMTris— HCl (pH7. 0)に 20分間浸漬することで未反応のダルタルアルデヒドをブロッキングし、リン酸緩衝液 100m M (pH7. 0)中で 1時間平衡化した（本明細書では、この電極を FADGDH複合体（ PtC)電極と!/、う）。 FADGDH複合体（PtC)電極につ、て白金線を対極とし、 Ag/ AgClを参照電極として印加電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対する応答電流値を測定した。次に、カーボンペーストと FADGDH複合体を混合して白金が担持されて、な、カーボン電極に FADGDH複合体を固定化した電極 (本明細書では、この電極を「FADGDH複合体 (CP)電極」という）を作成し、同様に応答電流値を測定した。また、白金粉末 (IFPC— II粉末）（オイルベース）のみを充填した Pt C電極にっヽても評価を行った。測定は全て 37°Cで行った。

[0039] 図 2には、これらの電極を使用して、グルコース濃度に対する応答電流値を測定し、グルコース濃度 OmMの電流値を基準値とした電流ダルコース濃度曲線を示した。図 2から明らかなように、 FADGDH複合体（PtC)電極および FADGDH複合体（

、てグルコース濃度依存的に応答値の増加が見られた。 FADGDH 複合体 (PtC)電極は、 FADGDH複合体 (CP)電極に比較して応答電流値が 10倍程度高くなつていることがわかる。また、（CP)電極では応答電流がほとんど得られなかった。 FADGDH複合体（PtC)電極においては、白金担持カーボンを電極材料として用いたことにより、酵素の電子伝達サブユニットと電極との電子伝達効率が向上したと考えられる。

[0040] 次に、グルコース濃度 OmMにおいてそれぞれの電極力得られた電流値を表 1に示した。

[表 1] アノード F A D G D H複合体 F A D G D H複合体 F A D G D H複 P t c

( P t C ) 空気中 ( P t C ) A r中合体（C P )

ダルコ一ス濃度 0 mM - 7 7 0 0 1 2 0 0 1 5 一 4 0 における電流（n A) また、アルゴン雰囲気下における FAGDH複合体 (PtC)電極のグルコース濃度に対する応答電流曲線を図 2に示した。図 2は、 FAGDH複合体 (PtC)電極は Ar中にぉ、て測定した値と大気中で測定した値に大きな差が生じな、ことを示して、る。このように、 FAGDH複合体 (PtC)電極は、溶存酸素の影響が極めて少なぐかつ高 V、応答電流が得られることがわ力つた。

[0041] 以上の結果から、白金担持カーボンに FADGDH複合体を含む電極がアノード電極材料として有用であることがわかった。

[0042] 実施例 1と実施例 2を比較すると、 FADGDH触媒サブユニット (PtC)電極の方力 ADGDH複合体 (PtC)電極より、応答電流が大きく観察されていることがわかる。これは、これらの実施例においては、酵素量を室温における活性値で揃え電極を作製したため、 FADGDH触媒サブユニット（PtC)電極中の蛋白質量力 ^ADGDH複合体（PtC)電極のそれの 3倍程度になって!/、るためと考えられる。

実施例 3

[0043] FADGDH複合体（PtC)電極または FADGDH複合体（CP)電極をアノード、 PtC 電極または白金電極を力ソードとして、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 0)を反応溶液として酵素燃料電池を構築した。反応溶液に 40mMとなるようグルコースを添加し、外部回路に掛ける抵抗を段階的に変え、各抵抗値で得られる起電力を測定し、電力 (式 W=V2ZRより）の評価を行った。また、開回路電圧のグルコース濃度依存性の検討も行った。

[0044] 得られた抵抗電力曲線を図 3に示す。アノード及び力ソードにおいて白金粉末を用いることにより、アノードにおいては電極と電子伝達サブユニット間の電子伝達効率力力ソードにおいては酸素の還元反応の触媒効率が向上したことによると考えられる。また、その効果はアノードにおいて顕著であった。 [0045] それぞれの電池についての開回路電圧のグルコース濃度依存性の評価の結果を図 4に示す。どの電池もグルコース濃度依存的に開回路電圧が上昇した力アノードとして FADGDH複合体 (PtC)電極を用いたことでより広、ダイナミックレンジを得ることができた。

[0046] なお、図 3及び図 4において、 Aはアノード、 Cは力ソードを示し、アノードにおいては FADGDH複合体は省略して、単に「CP」又は「PtC」と記載されて、る。

また、 FADGDH複合体 (PtC)電極をアノードとしたことで低濃度のグルコースにお!、て開回路電圧値はマイナスを示した。これはアノードにお、て電子伝達サブュニットを介した酸素の還元反応が起きて、ることによるものと考えられる。現在用いられているワイヤレスシステムはマイナス値を測定することが出来ないが、どの電池にぉヽても低血糖値に当たるグルコース濃度約 ImM (20mg/dl)にお!/、てプラスの電圧値が得られていること力ワイヤレスシステムと組み合わせてセンサを構築することが可能であると考えられる。

[0047] さらに、 FADGDH複合体（PtC)電極をアノード、白金電極を力ソードとした電池について Ar雰囲気下において開回路電圧のグルコース濃度依存性を検討したところ、グルコース濃度 OmMでの開回路電圧はプラスの値を示し、空気雰囲気下における結果と比べダイナミックレンジが狭くなつた。これは力ソード側の反応が律速になったためと考えられる。

比較例 1

[0048] グルコース酸化酵素（GOD) 25Uを PtC (白金担持カーボン粉末） lmgと混合し凍結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を研磨した後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行い、 GOD (PtC)電極を作製した。同様に、グルコース酸化酵素（GOD) 500Uを CP (カーボンペースト） lmgと混合し凍結後 CP (カーボンペースト）電極に充填し、 GOD (CP)電極を作製した。

それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として、印加電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコース濃度に対する応答電流値を測定した。溶液として CaClを lm含む PPB (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。

2

同様に、アルゴン雰囲気下における GOD (PtC)電極のグルコース濃度に対する応答電流も測定した。

[0049] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流ダルコース濃度曲線として示したものが図 5である。図 5からわ力るように、 GOD (CP)電極では応答電流値がほとんど観測されなかったのに対し、 GOD (PtC)電極では 16 0 A程度の応答電流が観測された。し力しながら、アルゴン雰囲気下における GO D (PtC)電極による応答電流値である GOD (PtC) Arは、 90 μ Α程度の応答電流の増加であり、大気中での測定の約半分にとどまつていることがわかる。これは、 Ar雰囲気下では GODと酸素が反応して生成する過酸化水素は存在しておらず GODとの直接電子移動による電極反応に基づき応答電流が観測されているのに対して、大気中のものでは溶存酸素の強い影響を受けた結果大きな誤差が生じているものと推察される。

[0050] PQQGDH触媒サブユニット 500Uを PtC (白金担持カーボン粉末） 20mgと混合し凍結乾燥後、白金粉末を詰めたカーボンペースト電極表面に充填し、表面を研磨した後ダルタルアルデヒドによる架橋処理を行、、 PQQGDH触媒 (PtC)電極を作製した。同様に、 PQQGDH触媒ユニット 500Uをカーボンペースト 20mgと混合し凍結後カーボンペースト電極に充填し、 PQQGDH触媒 (CP)電極を作製した。

[0051] それぞれの電極を作用極、白金線を対極とし、 AgZAgClを参照電極として、印加電位 + 250mVをかけてバッチ形式でグルコースに対する応答電流値を測定した。溶液として CaClを ImM含む MOPS (pH7. 0) 10mMを用いて、 37°Cで測定した。

2

[0052] 得られた応答電流を、グルコース OmMでの応答電流値を基準として、電流ダルコース濃度曲線として示したものが図 6である。図 6からわ力るように、 PQQGDH触媒 (CP)電極では応答電流値がほとんど観測されな力つた力 PQQGDH触媒 (PtC )電極では数百 nAの応答電流値が観測されていることがわかる。これは、 PQQGD Hを酸化還元酵素として用いた場合、炭素粉末との組み合わせの代わりにナノレべルの白金粒子が担持されているカーボン粉末との組み合わせに替えても、 FADGD Hとは異なり、数百 nAの応答電流し力得られな、ことを示して、る。

[0053] 以上の実施例は、本発明の例示であって、ここに示した実施例以外の材料、条件を用いても本発明の特許請求の範囲に包含され限り、同様の効果を奏するものであり、また、他の様々な変更、改良等が可能であることはいうまでもない。

産業上の利用可能性

以上の結果から、白金担持カーボンと FADGDHをとの組み合わせ力なる電極が、他の組み合わせによる酵素電極に比較して、高い応答電流値と溶存酸素の影響がな、測定値得られ、実用的な電極材料として極めて優位であることがわ力つた。

Claims

請求の範囲

[1] ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末及びフラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)を補酵素とするグルコース脱水素酵素 (FADGDH)を含む酵素電極。

[2] ナノレベルの白金粒子が直径 lOnm以下である請求項 1に記載の酵素電極。

[3] ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末の比表面積が 200m²/g以上である請求項 1又は 2に記載の酵素電極。

[4] ナノレベルの白金粒子が担持されて、るカーボン粉末の白金粒子の含有量が 20

〜70%である請求項 1〜3のいずれかに記載の酵素電極。

[5] ナノレベルの白金粒子が担持されているカーボン粉末のカーボン粉末の直径が 10

Onm以下である請求項 1〜4のいずれかに記載の酵素電極。

[6] グルコースセンサとして使用される請求項 1〜6のいずれかに記載の酵素電極。

[7] 燃料電池のアノード電極として使用される請求項 1〜6のいずれかに記載の酵素電極。