CN103472108A - 酶电极 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶电极。本发明提供一种酶电极，是包含担载有以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）的碳粒子和与上述碳粒子接触的电极层的酶电极，其特征在于，上述碳粒子和/或上述电极层包含粒径100nm以下且比表面积至少200m2/g以上的碳粒子。

Description

酶电极
本发明申请是PCT专利申请PCT/JP2008/002573、申请日为2008年9月18日、发明名称为“酶电极”的发明专利申请的分案申请，母案进入中国的申请号为200880107747.X。
技术领域
本发明涉及担载有含有葡萄糖脱氢酶的油墨的酶电极、特别是作为葡萄糖传感器使用的酶电极、用于制造该酶电极的油墨及该酶电极的制造方法。
背景技术
酶电极通常是指在金电极、铂电极、碳电极等电极表面上担载有酶的电极。酶电极被广泛用作利用酶的反应特异性、特异性地检测各种生理活性物质的生物传感器。特别是可以作为用于测定作为对糖尿病重要的标记的血中葡萄糖浓度的葡萄糖传感器使用。
作为酶电极中使用的氧化还原酶，例如有以葡萄糖脱氢酶（GDH）为代表的脱氢酶、及以葡萄糖氧化酶（GOD）为代表的氧化酶。GOD有以下优点：对葡萄糖的基质特异性高，热稳定性优异，能够大量生产酶，所以生产成本比其他酶便宜。另外，使用了GDH的体系不易受到测定样品中的溶解氧的影响，所以即使在氧分压低的环境下进行测定、或测定要求大量酶的高浓度样品时，也可以精度良好地测定葡萄糖。
将上述氧化还原酶应用于酶电极时，存在电极的应答电流值低的问题。于是，本发明的发明人等为了提高电极的应答电流值，提出了具有电子媒介和电子传递蛋白质的酶电极（参见下述专利文献2）。
电子媒介是指能够介导由氧化还原酶向电极的电子传递的非蛋白质性金属配位化合物、有机化合物等氧化还原物质，例如可以举出铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯、二茂合铁及它们的衍生物。
电子传递蛋白质是指能够在生物体的氧化还原体系中，由施电体接受电子而被还原，然后将电子传递给受电体而被氧化的蛋白质。作为电子传递蛋白质的例子，可以举出细胞色素b、细胞色素C，优选细胞色素b562等。
在专利文献1中，通过将电子传递蛋白质与氧化还原酶一同固定在电极上，可以促进从氧化还原酶向电极的、或向电子媒介的电子传递，由此可以得到应答电流值高的酶电极。
使用上述酶电极的葡萄糖浓度测定通常在恒温池内放入缓冲液，加入辅酶、CaCl2及电子媒介，维持在一定温度后，作为作用电极，使用例如在碳电极上固定了酶的酶电极，使用对电极（例如铂电极）及参考电极（例如Ag/AgCl电极）。对上述碳电极施加一定的电压，电流恒定后，加入含葡萄糖的试样测定电流的增加。
由此，上述现有方法必须将电子媒介包含在电极内或固定在电极表面、或作为水溶液加入到恒温池中，还必须与氧化还原酶分开准备电子媒介。因此，工艺复杂，大量生产化存在成本方面的难点。
专利文献1:特开2003-121407号公报
专利文献2:国际公开02/73181号小册子
专利文献3:国际公开2005/023111号小册子
发明内容
发明解决的课题
本发明的目的在于提供不使用电子媒介、不比使用电子媒介时逊色、特别是作为葡萄糖传感器使用时能够得到高应答电流值、且还能够得到宽的动态范围的酶电极。
用于解决课题的手段
在本发明中，作为用于测量葡萄糖的传感器，使用包含担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子、和与上述碳粒子接触的电极层的酶电极时，通过使上述碳粒子和/或构成上述电极层的碳粒子的粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上，上述电极层和担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子之间、或构成电极层的碳粒子和担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子之间的电子移动顺利进行，使其发挥作为酶电极的功能。
即，本发明在如上所述构成的酶电极中，无论与担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子接触的电极材料的形状·大小如何，均可通过调整担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子的粒径及比表面积，提高应答电流。
另外，本发明在如上所述构成的酶电极中，通过使用碳粒子作为与担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子接触的电极材料，同时还调整其粒径及比表面积，能够进一步提高应答电流。
本发明的具体构成如下所述。
（1）一种酶电极，是包含担载有以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）的碳粒子、和与上述碳粒子接触的电极层的酶电极，其特征在于，上述碳粒子和/或上述电极层包含粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子。
（2）上述（1）所述的酶电极，其中，上述葡萄糖脱氢酶（GDH）为氧化还原酶催化亚单位或氧化还原催化亚单位和电子传递亚单位的复合体。
（3）上述（1）或（2）所述的酶电极，其中，上述电极层包含金属。
（4）上述（3）所述的酶电极，其中，上述包含金属线。
（5）上述（1）～（4）中的任一项所述的酶电极，其中，所述酶电极作为葡萄糖传感器使用。
（6）用于在酶电极中使用的油墨材料，其特征在于，包含以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）和100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子。
（7）上述（6）所述的油墨材料，其中，上述葡萄糖脱氢酶（GDH）是氧化还原酶催化亚单位或氧化还原酶催化亚单位和电子传递亚单位的复合体。
（8）一种酶电极的制造方法，其特征在于，将上述（6）或（7）所述的油墨材料涂布在电极层的表面后，使其干燥。
本发明的特征在于使用的担载有以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）的碳粒子的粒径小、比表面积大，优选粒径为100nm以下、更优选粒径为50nm以下、且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子。作为上述碳粒子，例如可以举出市售的科琴黑（粒径34nm、比表面积1400m2/g）、乌尔康（vulcan）（粒径30nm、比表面积254m2/g）及包含科琴黑的Lionpaste（Lion公司商标）等。
在本发明中，与上述碳粒子一同混合以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（本说明书中，称为“FADGDH”）制作构成酶电极的油墨材料。油墨材料可以通过在碳粒子、例如、科琴黑中加入溶剂、例如丙醇水溶液充分混合进行制造。
在本发明中，通常，酶电极通过将上述油墨材料涂布在电极层上制作酶电极。
本发明中使用的电极层可以使用碳粒子或金属。碳粒子没有特别限定，优选粒径小、比表面积大的碳粒子，更优选粒径为100nm以下、更优选粒径为50nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子。作为上述碳粒子，例如可以举出市售的科琴黑（粒径34nm、比表面积1400m2/g）、乌尔康（粒径30nm、比表面积254m2/g）及含科琴黑的Lionpaste（Lion公司商标）等。使用金属时，可以优选使用金属线，更优选使用金或不锈钢的线。
本发明中使用的葡萄糖脱氢酶可以是天然氧化还原酶的一部分被化学改变的改变型氧化还原酶。上述改变型酶可以通过例如将蛋白质的1个或1个以上氨基酸残基用其他天然或天然中不存在的氨基酸残基置换、或者缺失或加成1个或1个以上氨基酸而制造。
本发明的酶电极通过如上所述同时调整担载有葡萄糖脱氢酶的碳粒子的粒径及比表面积，在电子移动至电极层时不需要电子媒介。本发明中使用的葡萄糖脱氢酶从功能方面考虑，包含：具有葡萄糖脱氢活性的催化剂活性亚单位、和包含用于将由上述催化亚单位供给的电子给与电极层的电子传递蛋白质的电子传递亚单位。此时，在本发明中，作为氧化还原酶，可以仅使用催化亚单位，也可以使用催化亚单位和电子传递亚单位的复合体。
催化亚单位发挥从试样中的葡萄糖获取电子、将该电子供给电子传递亚单位的作用，优选使用以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的FADGDH催化亚单位。因此，经由还原型FAD，从催化亚单位对电子传递亚单位供给电子。
催化亚单位的含量是例如换算为活性相当于5～100U的量。此处，酶1单位（1U）对每个酶其定义是已知的，例如为GDH的情况下，定义为在标准检定条件（pH6.0、37℃）下在DCIP的吸收波长600nm下经时检测基于DCIP（2,6-二氯靛酚）的还原的退色时，每1分钟氧化1μM葡萄糖的量（摩尔吸光系数为4.76×1000μM/cm）。
FADGDH只要是具有葡萄糖脱氢活性的催化亚单位或作为FADGDH复合体在上述催化亚单位上结合了电子传递亚单位的催化亚单位即可，没有特别限定，其中优选使用洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacepacia），特别优选使用洋葱伯克霍尔德菌KS1株（本说明书中称为“KS1株”）。
KS1株是从温泉附近的土壤中分离的新菌株，根据其菌学性质鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，在平成12年9月25日以微生物保藏编号第FERMBP-7306保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心（
Figure BDA00003537214500051
305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）。KS1株的详细情况公开在国际公开WO02/36779号公报，可以产出包含为催化亚单位的α亚单位（分子量约60kDa）、相当于为电子传递亚单位的细胞色素C的β亚单位（分子量约43kDa）及γ亚单位（分子量约14kDa）的GDH。其中，分子量是在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的。
为了制造本发明的酶电极，将葡萄糖脱氢酶或其复合体与碳粉末一起充分混合安装在电极上。为了将葡萄糖脱氢酶或其复合体固定在碳粒子上，如上所述安装在电极上后，例如用戊二醛等二交联性试剂进行交联处理。或者也可以使用固体高分子电解质进行固定。作为固体高分子电解质，最常使用的是Nafion。可以将以Nafion为代表的固体高分子电解质溶解在异丙醇等溶剂中，将其滴在吸附或涂布干燥了酶的酶膜上，或者与酶一同混合Nafion溶液进行干燥，由此制作酶固定化膜。
本发明的酶电极原则上不通过电子媒介进行动作，但是也不排除这种情况。使用电子媒介时，没有特别限定，例如可以使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯、钌配位化合物等。
将本发明的酶电极作为葡萄糖传感器使用时，将上述酶电极用作工作电极。作为对电极，例如可以使用铂电极，作为参考电极，例如可以使用Ag/AgCl电极。在恒温池中放入缓冲液，装置上述电极，对工作电极施加一定的电压，电流恒定后，在恒温池内加入包含葡萄糖的试样，测定电流的增加。可以按照通过标准浓度的葡萄糖溶液制作的标准曲线，计算试样中的葡萄糖浓度。
另外，作为葡萄糖传感器使用时，也可以采用下述构成：例如可以连续测定葡萄糖浓度，连续进行多次葡萄糖测定。此时，葡萄糖传感器的构成为：还具备用于从皮下组织采集血液或间质液的采集要素，使通过采集要素采集的血液或间质液接触电极。
上述葡萄糖传感器也可以构成为将电极的至少一部分埋入皮下组织进行使用。此时，电极被形成在绝缘基板上。
本发明的酶电极可以作为酶燃料电池的阳极使用。此时，可以将基于酶的基质特异性的物质作为燃料。阴极可以使用担载有铂的碳电极、铂电极等，可以构筑无隔板的酶燃料电池。作为反应溶液，可以使用磷酸缓冲液等普通缓冲液，进而也可以在体液中使用。可以通过改变施加在外部电路上的电阻值，调整电动势。
附图说明
[图1]表示FADGDH酶固定化层使用科琴黑/电极层使用科琴黑时的葡萄糖浓度与电流值的相关。
[图2]表示FADGDH酶固定化层使用碳糊/电极材料使用科琴黑时的葡萄糖浓度与电流值的相关。
[图3]表示FADGDH酶固定化层使用科琴黑/电极材料使用碳糊时的葡萄糖浓度与电流值的相关。
[图4]表示FADGDH酶固定化层使用碳糊/电极材料使用碳糊时的葡萄糖浓度与电流值的相关。
[图5]表示FADGDH酶固定化层使用科琴黑、Lionpaste、乌尔康及DENKABLACK/电极材料使用玻璃碳时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图6]表示酶固定化层的碳粒子的比表面积和应答电流值的相关。
[图7]表示FADGDH酶固定化层使用Lionpaste（W-311N,W-370）/电极材料使用玻璃碳时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图8]表示FADGDH酶固定化层使用乌尔康/电极材料使用乌尔康时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图9]表示FADGDH酶固定化层使用Lionpaste（W-311N）/电极材料使用金线时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图10]表示FADGDH酶固定化层使用Lionpaste（W-311N）/电极材料使用不锈钢线时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图11]表示FADGDH酶固定化层使用Lionpaste（W-311N）/电极材料使用不锈钢制一体型电极时的葡萄糖浓度和电流值的相关。
[图12]表示碳粒子担载在聚合物基板上制作的市售电极。
[图13]表示在图12所示的电极上涂布酶油墨制作的酶电极上滴下含葡萄糖的试样、施加电位后的应答曲线。
[图14]表示在图13所示的应答曲线中，试样中的葡萄糖浓度和电位施加后5秒后的电流值的相关。
具体实施方式
以下，作为实施例详细说明本发明，但本发明不限定于下述实施例。
作为电极层使用碳粒子时的实施例
首先，给出电极层、酶层均使用碳粒子时的实施例。
实施例1
作为碳粒子，准备粒径为34nm、比表面积为1400m2/g、空隙率为78vol%的科琴黑（以下称为KB）。在100mgKB中加入400μlMilliQ水、1ml5%Nafion（1-丙醇48%水溶液），充分混合后，静置3日制成KB油墨，在10μlKB油墨中混合10μl100mMp.p.b.（pH7.0）、40μl8.4U/mlFADGDH制成FADGDH/KB油墨。在作为电极材料填充了KB的一体型电极（φ0.4mm）中按25U/mm2滴加FADGDH/KB油墨，在4℃下干燥2小时。以制作的酶电极为工作电极，以Pt为对电极，以Ag/AgCl参考电极为参考电极。采用3电极方式，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl的电位时伴随葡萄糖添加的应答电流值，结果示于图1。以250rpm搅拌反应溶液，在37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的电流值作为应答电流值。
如图1所示，通过慢慢提高葡萄糖浓度，观测到的电流值增加。葡萄糖的终浓度55mM下的应答电流值分别约为1500nA。5mM葡萄糖的电流密度为6998nA/mm2。如果使用满足粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的KB碳粒子，则能够得到充分的应答电流值。
比较例1
作为碳粒子，代替KB，使用粒径为7000nm、比表面积为1m2/g的CP，按与实施例1相同的程序制作酶电极。即，在100mgCP中加入400μlMilliQ水、1ml5%Nafion（1-丙醇48%水溶液），充分混合后，静置3日制成CP油墨，在10μlCP油墨中混合10μl100mMp.p.b.（pH7.0）、40μl8.4U/mlFADGDH制成FADGDH/CP油墨。在作为电极材料填充了KB的一体型电极（φ0.4mm）中按25U/mm2滴加FADGDH/CP油墨，在4℃下干燥2小时。以制作的酶电极为工作电极、Pt为对电极、Ag/AgCl参考电极为参考电极。采用3电极方式，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl的电位时伴随葡萄糖添加的应答电流值，结果示于图2。以250rpm搅拌反应溶液，在37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的电流值作为应答电流值。
如图2所示，通过缓慢提高葡萄糖浓度，观测到的电流值增加。葡萄糖的终浓度55mM下的应答电流值分别约800nA。5mM葡萄糖下的电流密度为3160nA/mm2。通过比较图1和图2，确认使用作为电极层填充了相同的KB的一体型电极时，通过将涂布在其上的油墨材料由FADGDH/KB油墨变成FADGDH/CP油墨，应答电流值由1500nA降低至约800nA。即，使用相同的电极层时，担载有酶的碳粒子的粒径越小，另外，比表面积越大，能够得到越高的应答电流。
实施例2
在100mgKB中加入400μlMilliQ水、1ml5%Nafion（1-丙醇48%水溶液），充分混合后，静置3日制成KB油墨，在10μlKB油墨中混合10μl100mMp.p.b.（pH7.0）、40μl8.4U/mlFADGDH，制成FADGDH/KB油墨。在作为电极材料填充了碳糊（CP）的一体型电极（φ0.4mm）上按25U/mm2滴加FADGDH/KB油墨，在4℃下干燥2小时。达到恒定的电流值和反应溶液中的葡萄糖浓度的相关示于图3。如图3所示，为本酶时，尽管使用相同的电极面积、酶量但55mM下的电流值为110nA左右。本酶电极在5mM葡萄糖下的电流密度为690nA/mm2。
比较例2
作为碳粒子，代替KB，使用粒径为7000nm、比表面积为1m2/g的碳糊（以下称为CP），按与实施例1相同的程序制作酶电极。即，在100mgCP中加入400μlMilliQ水、1ml5%Nafion（1-丙醇48%水溶液），充分混合后，静置3日制成CP油墨，在10μlCP油墨中混合10μl100mMp.p.b.（pH7.0）、40μl8.4U/mlFADGDH制成FADGDH/CP油墨。在作为电极材料填充了CP的一体型电极（φ0.4mm）上按25U/mm2滴加FADGDH/CP油墨，在4℃下干燥2小时。达到恒定的电流值和反应溶液中的葡萄糖浓度的相关示于图4。如图4所示，为FADGDH+CP电极的情况下，尽管使用相同的电极面积、酶量，但55mM下的电流值为55nA左右。本酶电极在5mM葡萄糖下的电流密度为330nA/mm2。
通过比较图3和图4，确认了使用作为电极层填充了相同CP的一体型电极的情况下，通过将涂布在其上的油墨材料由FADGDH/KB油墨改为FADGDH/CP油墨，应答电流值由690nA降低至约55nA。即，使用相同的电极层时，担载有酶的碳粒子的粒径越小、比表面积越大，能够得到越高的应答电流。
实施例3
使用相同的玻璃碳（GC）电极作为电极层，为了观察担载有酶的碳粒子的比表面积的影响，作为碳粒子，除上述使用的KB以外，使用包含粒径为30nm、比表面积为254m2/g的乌尔康（VC、Cabot公司的商标）、粒径为35nm、比表面积为68m2/g的乙炔黑（DENKABLACK、DB、电气化学工业公司的商标）及KB的糊、即Lionpaste（LP、Lion公司的商标），测定应答电流。
首先，以在100mgKB中混合了200μlMilliQ、1200μl5%Nafion的混合物作为KB油墨，以在100mgVC中混合了200μlMilliQ、1200μl5%Nafion的混合物作为VC油墨。将KB油墨或VC油墨:100mMp.p.b.（pH7.0）:4.6U/μlFADGDH按1:3.8:3.2的体积比混合得到的混合物分别作为KB酶油墨或VC酶油墨。然后，将在50mgDB中混合了850μlMilliQ、600μl5%Nafion得到的混合物作为DB油墨，将DB油墨:100mMp.p.b.（pH7.0）:4.6U/μlFADGDH按1:1.4:1.6的体积比混合得到的混合物作为DB酶油墨。另外，使用以KB为主成分的Lionpaste，将LionpasteW-311N:5%Nafion:100mMp.p.b.（pH7.0）:4.6U/μlFADGDH按1:1:4:4的体积比进行混合得到的混合物作为LP酶油墨。进而，不使用碳粒子，将5%Nafion:100mMp.p.b.（pH7.0）:4.6U/μlFADGDH按1:5:4的体积比进行混合得到的混合物作为酶油墨。
将5μlKB酶油墨（图5中的KBink）、VC酶油墨（图5中的VCink）、DB酶油墨（图5中的DBink）、Lionpaste酶油墨（图5中的LPink）或酶油墨（图5中的ink）滴加在研磨后的玻璃碳（GC）电极（φ3mm）上，于4℃下干燥2小时。将该电极使用25%戊二醛溶液的蒸气进行30分钟交联处理后，在10mMTris-HCl（pH7.0）中浸渍20分钟。将该电极浸渍在100mMp.p.b.（pH7.0）中，于4℃下平衡一夜。采用以制作的酶电极为工作电极、以Pt为对电极、以Ag/AgCl为参考电极的3电极方式，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl的电位时伴随葡萄糖添加产生的应答电流值，制作标准曲线（150rpm、37℃）。
使用由此制作的酶电极测定葡萄糖，结果示于图5。随葡萄糖浓度升高，任一酶电极均观测到电流的增加。其中，使用KB酶油墨及Lionpaste酶油墨时能够得到相等且与其他油墨相比特别高的应答。使用VC酶油墨时也是前2者差，但是能够得到实用上没有问题的高应答。相反，使用DB酶油墨时只能得到与使用未使用碳粒子的酶油墨时同等的低信号。上述传感器在葡萄糖浓度为5mM下的应答电流值与使用的油墨的碳粒子的比表面积的相关示于图6。采用比表面积为254m2/g的乌尔康（VC）时，能够得到基本令人满意的应答电流，而使用比表面积为68m2/g的乙炔黑时无法得到令人满意的应答电流。如上所述，应答电流值与使用的碳粒子的比表面积高度相关，必须使用比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子。另外，粒径必须均为100nm以下。
实施例4
将5%Nafion：LionpasteW-311N或W-370C：100mMp.p.b.（pH7.0）：8.4U/μlADGDH按1:1:4:4的体积比分别混合，制成酶油墨。将各酶油墨滴在研磨后的玻璃碳（GC）电极（φ3mm）上，使FADGDH的量为17U（2.4U/mm2），在4℃下干燥2小时。将该电极使用25%戊二醛溶液的蒸气进行30分钟交联处理，在10mMTris-HCl（pH7.0）中于室温下浸渍20分钟，除去未反应的戊二醛，进而在100mMp.p.b.（pH7.0）中浸渍30分钟，进行平衡化。将其作为工作电极、将铂线作为对电极、将Ag/AgCl参考电极作为参考电极，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl的电位时伴随葡萄糖添加产生的应答电流值。以250rpm搅拌反应溶液，在37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的恒定电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的恒定电流值作为应答电流值。
使用由此制成的酶电极测定葡萄糖，结果示于图7。随葡萄糖浓度升高观测到电流的增加。作为酶层中使用的碳粒子使用LionpasteW-311N或W-370C时，在葡萄糖浓度为5mM下观测的电流密度分别为1684nA/mm2、1452nA/mm2。以KB为主成分的Lionpaste的情况下，确认了无论产品的种类如何，均能够得到高应答电流。
实施例5
作为碳粒子，准备粒径为30nm、比表面积为254m2/g的乌尔康（VULCAN:VC）。在100mgVC中加入400μlMilliQ水、1ml5%Nafion（1-丙醇48%水溶液），充分混合后，静置3日制成VC油墨，在10μlVC油墨中混合10μl100mMp.p.b.（pH7.0）、40μl8.4U/mlFADGDH。制成FADGDH/VUL油墨。在将VC作为电极材料进行填充的一体型电极（φ0.75mm）上按25U/mm2滴加FADGDH/VC油墨，在4℃下使其干燥2小时。以制作的酶电极为工作电极、Pt为对电极、Ag/AgCl参考电极为参考电极。采用3电极方式时，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl的电位时随葡萄糖添加产生的应答电流值，结果示于图5。以250rpm搅拌反应溶液，在37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的电流值作为应答电流值。
如图8所示，通过缓慢提高葡萄糖浓度，观测到的电流值增加。葡萄糖的终浓度为55mM时的应答电流值分别为约3500nA。5mM葡萄糖时的电流密度为2327nA/mm2。如上所述，使用粒径为30nm、比表面积为254m2/g的VC的VC油墨即使电极层如实施例3所述为玻璃碳，另外，即使如本实施例所述为VC，均可得到令人满意的应答电流。
如上所述，电极层、酶层均使用碳粒子时，如果将相同种类的碳粒子用于电极层，则酶层中使用的碳粒子的粒径越小、比表面积越大，能够得到越高的应答电流，特别是如果使用粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子，则能够得到令人满意的应答电流。另外，将相同种类的碳粒子用于酶层时，电极层中使用的碳粒子的粒径越小、比表面积越大，能够得到越高的应答电流，特别是如果使用粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子，则应答电流提高。
作为电极层使用金属线时的实施例
下面给出作为电极层使用金属线、作为酶层使用LP油墨时的实施例。
实施例6
将金线（φ0.5mm）在Piranha溶液（过氧化氢:浓硫酸=1:3）中浸渍5分钟×3次，进行清洗。在该金线上涂布使用LionpasteW-311N在与实施例4的说明中记载的相同条件下制作的酶油墨，在4℃下干燥2小时。采用将该电极用与实施例4的说明中记载的相同方法进行交联处理、实施平衡化作为工作电极、作为对电极使用没有进行任何涂布的金线、作为参考电极使用Ag/AgCl参考电极的3电极方式时，与实施例4的说明同样地测定伴随葡萄糖添加产生的应答电流值。
使用由此制成的酶电极测定葡萄糖，结果示于图9。随葡萄糖浓度升高观察到电流的增加。5mM葡萄糖下的电流密度为201nA/mm2。
实施例7
将5%Nafion:LionpasteW-311N:100mMp.p.b.（pH7.0）:8.4U/μlFADGDH按1:1:4:4的体积比进行混合，制成酶油墨。将酶油墨涂布在不锈钢线φ0.5mm的前端10mm，在4℃下使其干燥2小时。将该不锈钢线使用25%戊二醛溶液的蒸气进行30分钟交联处理，在10mMTris-HCl（pH7.0）中于室温下浸渍20分钟，除去未反应的戊二醛，再在100mMp.p.b.（pH7.0）中浸渍1小时，进行平衡化。以其为工作电极、以铂线为对电极、以Ag/AgCl为参考电极，以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，测定施加+400mVvs.Ag/AgCl的电位时伴随葡萄糖添加产生的应答电流值。以250rpm搅拌反应溶液，在37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的恒定电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的恒定电流值作为应答电流值。
将固定了酶的各不锈钢线作为工作电极时的、伴随葡萄糖添加产生的应答电流值示于图10。随葡萄糖浓度升高观察到电流的增加。5mM葡萄糖下的电流密度为232nA/mm2。
实施例8
将不锈钢制一体型电极的前端的不锈钢部位（0.165mm2）用作工作电极，将另一个不锈钢部位（0.942mm2）用作对电极。在将5%Nafion:LionpasteW-311N:100mMp.p.b.（pH7.0）:8.4U/μlFADGDH按1:1:4:4的体积比混合得到的酶油墨中，浸渍工作电极，然后，在4℃下干燥2小时。将该电极使用25%戊二醛溶液的蒸气进行30分钟交联处理后，在100mMp.p.b.（pH7.0）中浸渍30分钟，平衡化。将该电极使用恒电势仪，采用以Ag/AgCl为参考电极的3电极方式，测定施加+400mVvs.Ag/AgCl时伴随葡萄糖添加产生的应答电流值。以10ml100mMp.p.b.（pH7.0）为反应溶液，以搅拌速度150rpm、于37℃下进行测定。从在各葡萄糖浓度下测定的恒定电流值中减去葡萄糖为0mM时得到的恒定电流值作为应答电流值。
将制作的不锈钢制一体型电极的、相对于葡萄糖的应答电流值的标准曲线示于图11。在采用电极方式的测定中，相对于5mM葡萄糖的应答电流值为134nA/mm2。该值为与由使用0.5mm不锈钢线试制的酶电极实施例7得到的值相同的程度。由此可以构筑使用该不锈钢制一体型电极的葡萄糖传感器。
酶电极的制作例
实施例9
通过在图12所示的碳粒子被担载在聚合物基板上制成的市售电极（（有）biodevicetechnology公司制DepChip圆型碳电极）上涂布酶油墨，构筑酶电极。作为酶油墨，使用将5%Nafion:LionpasteW-311N:100mMp.p.b.（pH7.0）:4.0U/μlFADGDH按1:1:1:7的体积比进行混合得到的混合物。将1.5μl该酶油墨涂布在图12的电极上，然后，在4℃下干燥2小时。将该电极使用恒电势仪，采用以同一电极上的Ag/AgCl为参考电极的3电极方式，测定施加+250mVvs.Ag/AgCl时伴随葡萄糖添加产生的应答电流值。
测定首先在没有将电位施加给电极的状态下将包含溶解在100mMp.p.b.（pH7.0）中的各种浓度葡萄糖的试样溶液5μl滴在酶电极上。5秒后，使用恒电势仪，采用以同一电极上的Ag/AgCl为参考电极的3电极方式，施加+250mVvs.Ag/AgCl。添加含有各种浓度的试样时观察到的电流值变化示于图13。观察到的电流值因如上所述地添加的葡萄糖浓度而不同。施加电位后，以5秒后的电流值为指标检测与葡萄糖浓度的相关。以纵轴为5秒后的电流值、以横轴为试样中的葡萄糖浓度的图表示于图14。如上所述使用本酶电极无需加入电子媒介即可测定葡萄糖浓度。
以上实施例是本发明的例示，即使使用此处所示实施例以外的材料、条件，只要包含在本发明的权利要求书内，就能够发挥同样的效果，当然也可以进行其他各种变更、改良等。例如，本发明的使用油墨材料的酶电极如上所述可以用作葡萄糖传感器中的工作电极，另外，也可以优选用作以葡萄糖为燃料的燃料电池中的阳极催化剂。

Claims (12)

1.一种酶电极，是包含担载有以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）的碳粒子、和与上述碳粒子接触的电极层的酶电极，其中，上述碳粒子包含粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子，并且其中，上述电极层包含金属。
2.如权利要求1所述的酶电极，其中，上述葡萄糖脱氢酶（GDH）是氧化还原酶催化亚单位或氧化还原催化亚单位和电子传递亚单位的复合体。
3.如权利要求1所述的酶电极，其中，上述碳粒子是乌尔康、科琴黑或Lion Paste。
4.如权利要求1所述的酶电极，其中，上述电极层包含金属的线。
5.葡萄糖传感器，其使用权利要求1～4中的任一项所述的酶电极。
6.一种酶电极的制造方法，包括将油墨材料涂布在电极层的表面后，使其干燥，其中所述油墨材料包含以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶的葡萄糖脱氢酶（GDH）和碳粒子，其中上述碳粒子包含粒径为100nm以下且比表面积为至少200m2/g以上的碳粒子，并且其中，上述电极层包含金属。
7.如权利要求6所述的方法，其中，上述葡萄糖脱氢酶（GDH）是氧化还原酶催化亚单位或氧化还原酶催化亚单位和电子传递亚单位的复合体。
8.如权利要求6所述的方法，其中，上述碳粒子是乌尔康、科琴黑或Lion Paste。
9.如权利要求6所述的酶电极的制造方法，还包括向吸附或涂布干燥了酶的酶膜添加固体高分子电解质。
10.如权利要求9所述的酶电极的制造方法，其中所述油墨材料还包含固体高分子电解质。
11.如权利要求9所述的酶电极的制造方法，其中所述固体高分子电解质是Nafion。
12.一种酶燃料电池，其使用权利要求1～4中的任一项所述的酶电极，其中所述酶电极作为阳极使用。
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