ES2555295T3 - Electrodo enzimático - Google Patents

Abstract

Un electrodo enzimático que comprende una capa enzimática que contiene partículas de carbono que llevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleótido de flavina-adenina (FAD) como coenzima; y una capa de electrodo, en el que las partículas de carbono consisten en partículas de carbono con un diámetro de partícula de no más de 100 nm y una superficie específica de al menos 200 m2/g y en el que la capa de electrodo está compuesta por metal.

Description

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DESCRIPCION

Electrodo enzimatico Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un electrodo enzimatico sobre el que se sustenta una tinta que contiene glucosa- deshidrogenasa, en particular, un electrodo enzimatico usado como sensor de la glucosa, y un metodo para producir el electrodo enzimatico.

Antecedentes de invencion

Un electrodo enzimatico normalmente se refiere a un electrodo en el que se fija una enzima sobre la superficie de un electrodo tal como un electrodo de oro, un electrodo de platino, o un electrodo de carbono. Aprovechandose de la especificidad de la reaccion de la enzima, el electrodo enzimatico se ha usado ampliamente como un biosensor para detectar espedficamente diversas sustancias fisiologicamente activas. En particular, el electrodo enzimatico se puede usar como un sensor de la glucosa para medir la concentracion de glucosa en sangre como un marcador importante en la diabetes.

Ejemplos de oxidorreductasas usadas para un electrodo enzimatico incluyen deshidrogenasas representadas por la glucosa-deshidrogenasa (GDH), y oxidasas representadas por la glucosa-oxidasa (GOD). La GOD tiene una alta especificidad de sustrato respecto a la glucosa y una excelente estabilidad termica. Ya que es posible la produccion en masa de esta enzima, su coste de produccion es inferior al de otras enzimas, lo cual resulta ventajoso. Tambien, un sistema que usa GDH es poco probable que se vea influido por el oxfgeno disuelto en una muestra para hacer medidas. Por lo tanto, incluso cuando la medida se lleva a cabo bajo condiciones de baja presion parcial de oxfgeno o incluso cuando la medida se lleva a cabo con una alta concentracion de muestra, lo que requiere una gran cantidad de enzima, la glucosa se puede medir de forma precisa.

En los casos donde estas oxidorreductasas se aplican al electrodo enzimatico, ha habido el problema de que el valor de la corriente de respuesta del electrodo es bajo. Por lo tanto, con el fin de mejorar el valor de la corriente de respuesta del electrodo, los inventores de la presente invencion propusieron un electrodo enzimatico que tuviese una protema de transferencia de electrones junto con un mediador de electrones (vease el documento de patente 2, mas adelante).

El mediador de electrones se refiere a una sustancia redox, tal como un complejo metalico no protemico o un compuesto organico, siendo la sustancia capaz de mediar en la transferencia de electrones desde una oxidorreductasa a un electrodo. Ejemplos de ellos incluyen ferricianuro de potasio, metosulfato de fenazina, ferroceno y sus derivados.

Protema de transferencia de electrones se refiere a una protema capaz de ser reducida por los electrones que recibe procedentes de un donador de electrones y que luego se oxida donando los electrones a un aceptor de electrones en un sistema de oxidacion-reduccion en el cuerpo. Ejemplos de la transferencia de electrones incluyen el citocromo b y el citocromo c, y preferiblemente el citocromo b562 o similares.

En el documento de patente 1, una protema de transferencia de electrones, junto con una oxidorreductasa, se inmoviliza sobre un electrodo, y por eso se puede promover la transferencia de electrones desde un elemento redox al electrodo o a un mediador de electrones, obteniendo por ello un electrodo enzimatico con un alto valor de la corriente de respuesta.

Para la medida de la concentracion de glucosa usando estos electrodos enzimaticos, en general, se pone una solucion reguladora en una celda con termostato, y se anade a ella una coenzima, CaCl2 y el mediador de electrones. Se mantiene luego la mezcla a temperatura constante. Despues de eso, como electrodo de trabajo, por ejemplo, se usa un electrodo enzimatico en el que se inmoviliza una enzima sobre un electrodo de carbono. Y se usan un contraelectrodo (por ejemplo, electrodo de platino) y un electrodo de referencia (por ejemplo, electrodo de Ag/AgCl). Se aplica un voltaje constante al electrodo de carbono anteriormente mencionado y despues de que la corriente electrica alcance un estado estacionario, se anade la muestra que contiene glucosa y luego se mide el aumento en la corriente electrica.

Por eso, estos metodos convencionales requieren el mediador de electrones que se va a incluir en el electrodo, que va a estar inmovilizado sobre la superficie del electrodo, o que se va a anadir a la celda con termostato como una solucion acuosa. Y, se necesita proporcionar, por separado, el mediador de electrones y la oxidorreductasa. Por lo tanto, el procedimiento era complicado y hubo problemas con el coste de la produccion en masa.

Documento de patente 1: JP 2003-121407 A

Documento de patente 2: WO 02/73181

Documento de patente 3: WO 2005/023111

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El documento WO 2007/055100 describe un electrodo enzimatico elaborado mezclando un polvo de carbono que tiene un nanonivel de partfculas de platino sobre el, con una glucosa-deshidrogenasa cuya coenzima es el dinucleotido de flavina-adenina.

En el Analytical Chimica Acta, 192(2): 339-343, 1987, Pelleschi et al., se construyen sensores de glucosa inmovilizando glucosa-deshidrogenasa sobre electrodos de carbono y de platino.

En WO 03/021247 se describen biosensores que comprenden una macromolecula inmovilizada en la superficie de un electrodo.

Descripcion de la invencion

Problemas que se van a resolver mediante la invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un electrodo enzimatico, que no requiere que se use un mediador de electrones y que no es inferior a los que usan el mediador de electrones, permitiendo que se obtenga un alto valor de la corriente de respuesta y que se obtenga un amplio intervalo dinamico, en particular cuando se usa como un sensor de la glucosa.

Medios para resolver los problemas

En la presente invencion, se ha descubierto que, cuando un electrodo enzimatico como el reivindicado compuesto de una capa enzimatica que contiene partfculas de carbono, sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa, y se usa una capa de electrodo que esta en contacto con las partfculas de carbono anteriormente mencionadas, como un sensor para medir glucosa, en el que el diametro de las partfculas de carbono anteriormente mencionadas no es superior a 100 nm, y su superficie espedfica es de al menos 200 m2/g, los electrones se transfieren uniformemente entre la capa de electrodo anteriormente mencionada y las partfculas de carbono que sustentan la glucosa- deshidrogenasa, y por eso se puede lograr la funcion como electrodo enzimatico.

Por lo tanto, la presente invencion permite que se aumente la corriente de respuesta en el electrodo enzimatico anteriormente compuesto, ajustando el diametro de partfcula y la superficie espedfica de la partfcula de carbono sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa, sin tener en cuenta la forma o el tamano del material del electrodo que esta en contacto con la partfcula de carbono sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa.

La estructura concreta de la presente invencion es como sigue:

(1) Un electrodo enzimatico que comprende una capa enzimatica que contiene partfculas de carbono que llevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleotido de flavina-adenina (FAD) como una coenzima; y una capa de electrodo en contacto con dichas partfculas de carbono, en la que las partfculas de carbono consisten en partfculas de carbono con un diametro de partfcula de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g, y en el que la capa de electrodo esta compuesta de metal.

(2) El electrodo enzimatico segun (1), en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalttica de oxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.

(3) El electrodo enzimatico segun (1) o (2), en el que la capa de electrodo esta compuesta de alambre de metal.

(4) Un sensor de glucosa que comprende el electrodo enzimatico segun cualquiera de (1) a (3).

(5) Un metodo para producir en electrodo enzimatico segun la reivindicacion 5.

(6) El metodo segun (5), en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalttica de oxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalftica de oxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.

La partfcula de carbono usada en la presente invencion, sobre la cual se sustenta la glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleotido de flavina-adenina como una coenzima, se caracteriza por su pequeno diametro de partfcula y una gran superficie espedfica. Se usa la partfcula de carbono que tiene un diametro de partfcula de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g y se prefiere un diametro de partfcula de no mas de 50 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g. Ejemplos de semejante partfcula de carbono incluyen negro Ketchen que se puede conseguir comercialmente (diametro de partfcula de 34 nm, superficie espedfica de 1400 m2/g), VULCAN (diametro de partfcula de 30 nm, superficie espedfica de 254 m2/g) y Lion Paste (una marca de fabrica de Lion Corporation) que contiene negro Ketchen.

En la presente invencion, las partfculas de carbono anteriormente mencionadas se mezclan junto con la glucosa- deshidrogenasa usando el dinucleotido de flavina-adenina (FAD) como una coenzima (en la presente memoria descriptiva, referida como “FADGDH”) para preparar un material que constituye una tinta que compone un electrodo

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enzimatico. El material que constituye una tinta se puede producir anadiendo un disolvente, por ejemplo, una solucion acuosa de propanol a las parftculas de carbono, por ejemplo negro Ketchen, y realizando bien la mezcla.

En la presente invencion, el electrodo enzimatico se produce, en general, revistiendo una capa de electrodo con el material anteriormente mencionado que constituye una tinta.

Para la capa de electrodo usada en la presente invencion, se usa un metal. Se prefiere usar un alambre de metal, mas preferiblemente un alambre de oro o un alambre inoxidable.

La glucosa-deshidrogenasa usada en la presente descripcion puede ser una oxidorreductas modificada en la que parte de la oxidorreductasa natural esta modificada qmmicamente. Semejante enzima modificada se puede producir, por ejemplo, sustituyendo uno o mas residuos aminoacido de la protema con otros residuos aminoacido que se producen de forma natural o de forma no natural, o suprimiendo o anadiendo uno o mas aminoacidos.

Como se describio anteriormente, el electrodo enzimatico segun la presente invencion no requiere el mediador de electrones en la transferencia de electrones a la capa electrodo ajustando el diametro de partmula y la superficie espedfica de la partmula de carbono sobre la que se sustenta la glucosa-deshidrogenasa. La glucosa- deshidrogenasa usada en la presente invencion esta, desde el punto de vista de las funciones, compuesta de una subunidad cataftticamente activa que tiene una actividad de deshidrogenacion de la glucosa y una subunidad de transferencia de electrones que comprende una protema de transferencia de electrones para ceder electrones proporcionados a partir de la subunidad catalftica anteriormente mencionada a la capa de electrodo. En este caso, en la presente invencion, se puede usar sola la subunidad catalftica como oxidorreductasa, o se puede usar como un complejo de la subunidad catalftica y la subunidad de transferencia de electrones.

La subunidad catalftica tiene funciones de sacar un electron de la glucosa de una muestra y donar este electron a la subunidad de transferencia de electrones. Se usa la subunidad catalftica FADGDH con dinucleotido de flavina- adenida (FAD) como una coenzima. Por lo tanto, se proporciona el electron a la subunidad de transferencia de electrones desde la subunidad catalftica a traves de la FAD reducida.

Se establece el contenido de la subunidad catalfticas en, por ejemplo, una cantidad que corresponde a de 5 a 100 U en terminos de actividad. Aqrn, se conoce la definicion de 1 unidad de enzima (1 U) para cada enzima. Por ejemplo, en el caso de la GDH, cuando se mide con el tiempo la decoloracion basada en la reduccion del DCIP (2,6- dicloroindofenol) bajo condiciones estandar de ensayo (pH 6,0; 37°C), a una longitud de onda de absorcion de 600 nm, que es la longitud de onda de absorcion del DCIP, se define 1 unidad como la cantidad de enzima que oxida 1 |jM de glucosa cada minuto (el coeficiente de extincion molar es de 4,76 x 1000 jM/cm).

La FADGDH no esta particularmente limitada, siempre que sea una subunidad catalftica que tenga una actividad de deshidrogenacion de la glucosa, o un complejo de FADGDH en el que se une una subunidad de transferencia de electrones a la subunidad catalftica anteriormente mencionada. Entre ellas se prefiere usar la Burkholderia capacia, en particular la cepa Burkholderia capacia KS1 (en esta memoria descriptiva referida como “cepa KS1”).

La cepa KS1 es una nueva cepa aislada del suelo en las proximidades de una fuente termal, e identificada como Burkholderia capacia basandose en sus propiedades micologicas. Se ha remitido al International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japon, 305 - 8566), con el numero de referencia FERM BP-7306 desde el 25 de septiembre de 2000. En el documento WO 02/36779 se describen detalles de la cepa KS1. Puede producir GDH que contiene la subunidad a (peso molecular de aproximadamente 60 kDa) que es una subunidad catalftica, la subunidad p (peso molecular de aproximadamente 43 kDa) que corresponde al citocromo c que es una subunidad de transferencia de electrones y la subunidad y (peso molecular de aproximadamente 14 kDa). El peso molecular se midio mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS bajo condiciones de reduccion.

Con el fin de producir el electrodo enzimatico segun la presente invencion, se mezcla bien la glucosa- deshidrogenasa o un complejo suyo junto con polvos de carbono y la mezcla resultante se fija sobre el electrodo. Con el fin de inmovilizar la glucosa-deshidrogenasa, o su complejo, sobre la partmula de carbono, despues de fijarla sobre el electrodo, como se describio anteriormente, se realiza, por ejemplo, un tratamiento de reticulacion usando un reactivo reticulante binario, tal como el glutaraldetftdo. Como alternativa, tambien se puede llevar a cabo una inmovilizacion usando un polielectrolito solido. El Nafion es el que mas se usa como polielectrolito solido. Se puede hacer una peftcula de enzima inmovilizada disolviendo el polielectrolito solido, que incluye Nafion, en un disolvente tal como el isopropanol y anadiendo esta mezcla, gota a gota, a una peftcula de enzima en la que hay absorbida una enzima, o se aplica y se seca; o mezclando la solucion de Nafion con la enzima y secando.

El electrodo enzimatico segun la presente invencion, en principio, opera sin un mediador de electrones. Sin embargo, no se descarta el uso del mediador de electrones. En los casos donde se usa el mediador de electrones, no esta particularmente limitado y, por ejemplo, se puede usar ferricianuro de potasio, metosulfato de fenazina, complejos de rutenio o similares.

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En los casos donde se usa el electrodo enzimatico segun la presente invencion como sensor de la glucosa, el electrodo enzimatico anteriormente mencionado se usa como electrodo de trabajo. Como contraelectrodo se puede usar, por ejemplo, un electrodo de platino, y como electrodo de referencia se puede usar, por ejemplo, un electrodo de Ag/AgCl. Se pone una solucion reguladora en una celda con termostato y se colocan estos electrodos. Luego se aplica un voltaje constante al electrodo de trabajo y despues de que la corriente electrica alcanza un estado estacionario, se anade a la celda con termostato una muestra que contiene glucosa y se mide el aumento en la corriente electrica. De acuerdo con la curva de calibracion preparada a partir de una solucion de glucosa de concentraciones estandar, se puede calcular la concentracion de glucosa en la muestra.

Ademas, cuando se usa como sensor de la glucosa, el electrodo enzimatico puede estar compuesto de manera que, por ejemplo, la concentracion de glucosa se pueda medir de forma continua y se puedan llevar a cabo varias medidas de glucosa sin interrupcion. En este caso, el sensor de la glucosa comprende ademas un elemento colector para recoger sangre o fluido intersticial de los tejidos subcutaneos, y esta compuesto de manera que permita que la sangre o el fluido intersticial recogido por el elemento colector se ponga en contacto con el electrodo.

El sensor de glucosa anteriormente mencionado puede estar compuesto de manera que al menos una porcion del electrodo este embebido en los tejidos subcutaneos, y se use. En este caso, el electrodo se forma sobre un sustrato aislante.

El electrodo enzimatico segun la presente invencion se puede usar como el anodo de una celda enzimatica de combustible. En este caso, se puede usar como combustible un sustrato segun la especificidad de la enzima como sustrato. Para el catodo, se puede usar un electrodo de platino con soporte de carbono, un electrodo de platino o similares y se puede construir una celda enzimatica de combustible sin una pared divisoria. Como solucion de reaccion, se puede usar una solucion reguladora comun, tal como una solucion reguladora de fosfato. Ademas se puede usar en fluidos corporales. Se puede ajustar la fuerza electromotriz cambiando el valor de la resistencia que se aplica a un circuito externo.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. La Figura 1 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se usa negro Ketchen en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso negro Ketchen en la capa de electrodo.

Figura 2. La Figura 2 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso la pasta de carbono en la capa de enzima FADGDH inmovilizada, y se uso negro Ketchen en el material del electrodo.

Figura 3. La Figura 3 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso negro Ketchen en la capa de enzima FADGDH inmovilizada, y se uso la pasta de carbono

en el material del electrodo.

Figura 4. La Figura 4 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso la pasta de carbono en la capa de enzima FADGDH inmovilizada, y se uso pasta de carbono en el material del electrodo.

Figura 5. La Figura 5 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso negro Ketchen, Lion Paste, VULCAN y negro Denka en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el carbono vttreo en el material del electrodo.

Figura 6. La Figura 6 muestra la correlacion entre la superficie espedfica de la partfcula de carbono de la

capa de enzima inmovilizada y el valor de la corriente de respuesta.

Figura 7. La Figura 7 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso Lion Paste (W-311N, W-370) en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el

carbono vftreo en el material del electrodo.

Figura 8. La Figura 8 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de la corriente

electrica cuando se uso VULCAN en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el VULCAN en el material del electrodo.

Figura 9. La Figura 9 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de corriente

electrica cuando se uso Lion Paste (W-311N) en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el alambre de

oro en el material del electrodo.

Figura 10. La Figura 10 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de corriente

electrica cuando se uso Lion Paste (W-311N) en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el alambre de

acero inoxidable en el material del electrodo.

Figura 11. La Figura 11 muestra la correlacion entre la concentracion de glucosa y el valor de corriente

electrica cuando se uso Lion Paste (W-311N) en la capa de enzima FADGDH inmovilizada y se uso el electrodo integral de acero inoxidable en el material del electrodo.

Figura 12. La Figura 12 muestra un electrodo que se puede conseguir comercialmente, hecho sustentando

5 partfculas de carbono sobre el sustrato polimerico.

Figura 13. La Figura 13 muestra una curva de respuesta despues de que las muestras que contienen glucosa

se anadieran, gota a gota, al electrodo enzimatico, elaborado aplicando la tinta enzimatica sobre el electrodo mostrado en la Figura 12, y de que se aplicase el potencial electrico.

Figura 14. La figura 14 muestra, en la curva de respuesta mostrada en la Figura 13, la correlacion entre la

10 concentracion de glucosa en la muestra y el valor de la corriente electrica 5, segundos despues de la aplicacion del potencial electrico.

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

La presente invencion se describira ahora con detalle por medio de ejemplos; sin embargo, la presente invencion no se limita a ello. Los Ejemplos 1 a 5 y 9 no forman parte de la invencion.

15 Ejemplos en el caso de usar partfculas de carbono como capa de electrodo

En primer lugar, se muestran los ejemplos en los casos donde se usan partfculas de carbono tanto para la capa de electrodo como para la capa enzimatica.

Ejemplo 1

Se proporciona como partfcula de carbono, negro Ketchen (de ahora en adelante referido como KB) con un diametro 20 de partfcula de 34 nm, una superficie espedfica de 1400 m2/g, y una porosidad del 78% en volumen. Al KB (100 mg) se le anadio agua Milli Q (400 jl) y Nafion al 5% (solucion acuosa de 1-propanol al 48%) (1 ml). Se realizo bien la mezcla y se dejo reposar durante 3 dfas para proporcionar una tinta de KB. Se uso una mezcla de solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 jl) y 8,4 U/ml de FADGDH (40 jl) con la tinta KB (10 jl) como una tinta FADGDH/KB. A un electrodo integral (9 0 4 mm), lleno de KB como material del electrodo, se anadio, gota 25 a gota, la tinta FADGDH/KB para obtener 25 U/mm2 y se seco a 4°C durante 2 horas. Se uso el electrodo enzimatico preparado como electrodo de trabajo, se uso Pt como contraelectrodo y se uso el electrodo de referencia de Ag/AgCl como electrodo de referencia. La Figura 1 muestra los resultados de las medidas de un valor de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa, cuando se aplico un potencial electrico de +250 mV frente a Ag/AgCl usando solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion en un sistema de tres 30 electrodos. La medida se llevo a cabo a 37°C, mientras que la solucion de la reaccion estaba siendo agitada a 250 rpm. El valor de la corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida al restar el valor de la corriente electrica obtenida con una glucosa 0 mM, del valor medido a cada concentracion de glucosa.

Como se muestra en la Figura 1, aumentando gradualmente la concentracion de glucosa, aumento el valor observado de la corriente electrica. A una concentracion final 55 mM de glucosa, el valor de la corriente de 35 respuesta era de aproximadamente 1500 nA. A 5 mM de glucosa, la densidad de corriente era de 6998 nA/mm2. Se confirmo que, cuando se uso la partfcula de carbono de KB, con un diametro de partfcula de no mas de 100 nm, y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g, se obtuvo un valor de corriente de respuesta suficiente.

Ejemplo comparativo 1

Se preparo un electrodo enzimatico con los mismos procedimientos que los descritos en el Ejemplo 1, excepto que 40 en vez de KB se uso, como partfcula de carbono, CP que tema un diametro de partfcula de 7000 nm y una superficie espedfica de 1 m2/g. Es decir, al CP (100 mg), se le anadio agua Milli Q (400 jl) y Nafion al 5% (solucion acuosa de 1-propanol al 48%) (1 ml). Se realizo bien la mezcla y se dejo reposar durante 3 dfas para proporcionar una tinta de CP. Se uso una mezcla de solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 jl) y 8,4 U/ml de FADGDH (40 jl) con la tinta CP (10 jl) como una tinta FADGDH/CP. A un electrodo integral (9 0,4 mm), lleno de KB 45 como material del electrodo, se anadio, gota a gota, la tinta FADGDH/CP para obtener 25 U/mm2 y se seco a 4°C durante 2 horas. Se uso el electrodo enzimatico preparado como electrodo de trabajo, se uso Pt como contraelectrodo, y se uso el electrodo de referencia de Ag/AgCl como electrodo de referencia. La Figura 3 muestra los resultados de las medidas de un valor de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico de +250 mV frente a Ag/AgCl usando solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) 50 (10 ml) como solucion de reaccion en un sistema de tres electrodos. La medida se llevo a cabo a 37°C, mientras que

la solucion de la reaccion estaba siendo agitada a 250 rpm. El valor de la corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida al restar el valor de la corriente electrica obtenida con una glucosa 0 mM, del valor medido a cada concentracion de glucosa.

Como se muestra en la Figura 2, aumentando gradualmente la concentracion de glucosa, aumento el valor 55 observado de la corriente electrica. A una concentracion final 55 mM de glucosa, el valor de la corriente de

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respuesta era de aproximadamente 800 nA. Con una glucosa 5 mM, la densidad de corriente era de 3160 nA/mm2. Se confirmo que, comparando la Figura 1 y la Figura 2, en los casos donde se uso el electrodo integral lleno con el mismo KB como una capa de electrodo, el valor de la corriente de respuesta disminuyo desde 1500 nA a aproximadamente 800 nA cambiando del material que constituye la tinta con la que este electrodo esta revestido, de la tinta FADGDH/KB a la tinta FADGDH/CP. Es decir, se confirmo que, cuando se usaba la misma capa de electrodo, cuanto mas pequeno era el diametro de partfcula de la partfcula carbono sobre la que se sustentaba la enzima y mas grande era la superficie espedfica, mayor se hada la corriente de respuesta.

Ejemplo 2

Al KB (100 mg), se anadio agua Milli Q (400 jl) y Nafion al 5% (solucion acuosa en propanol al 48%) (1 ml). Se realizo bien la mezcla y se dejo reposar durante 3 dfas para proporcionar una tinta KB. Se uso una mezcla de solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 jl) y 8,4 U/ml de FADGDH (40 jl) con la tinta KB (10 jl) como una tinta FADGDH/KB. A un electrodo integral (9 0,4 mm), lleno de pasta de carbono (CP) como material del electrodo, se anadio, gota a gota, la tinta FADGDH/CP para obtener 25 U/mm2 y se seco a 4°C durante 2 horas. La Figura 3 muestra la correlacion entre el valor de la corriente electrica en estado estacionario y la concentracion de glucosa en la solucion de la reaccion. Como se muestra en la Figura 3, en el caso de la presente enzima, el valor de la corriente electrica a 55 mM era de aproximadamente 110 nA incluso aunque se use la mismo area del electrodo y la misma cantidad de la enzima. La densidad de corriente del presente electrodo enzimatico con una glucosa 5 mM era de 690 nA/mm2.

Ejemplo comparativo 2

Se preparo un electrodo enzimatico con los mismos procedimientos que los descritos en el Ejemplo 1, excepto que en vez de KB se uso, como partfcula de carbono, pasta de carbono (de ahora en adelante referida como CP) que tema un diametro de partfcula de 7000 nm y una superficie espedfica de 1 m2/g. A la CP (100 mg), se anadio agua Milli Q (400 jl) y Nafion al 5% (solucion acuosa en propanol al 48%) (1 ml). Se realizo bien la mezcla y se dejo reposar durante 3 dfas para proporcionar una tinta Cp. Se uso una mezcla de solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 jl) y 8,4 U/ml de FADGDH (40 jl) con la tinta CP (10 jl) como una tinta FADGDH/CP. A un electrodo integral (9 0,4 mm), lleno de CP como material del electrodo, se anadio, gota a gota, la tinta FADGDH/CP para obtener 25 U/mm2 y se seco a 4°C durante 2 horas. La Figura 4 muestra la correlacion entre el valor de la corriente electrica en estado estacionario y la concentracion de glucosa en la solucion de la reaccion. Como se muestra en la Figura 4, en el caso del electrodo de FADGDH/CP, el valor de la corriente electrica a 55 mM era de aproximadamente 55 nA incluso aunque se usen el mismo area del electrodo y la misma cantidad de la enzima. La densidad de corriente del presente electrodo enzimatico con una glucosa 5 mM era de 330 nA/mm2.

Se confirmo que, comparando la Figura 3 y la Figura 4, en los casos donde se uso el electrodo integral lleno con la misma CP como capa de electrodo, el valor de la corriente de respuesta disminuyo desde 690 nA a aproximadamente 55 nA, cambiando el material que constituye una tinta con la que se reviste este electrodo, de la tinta FADGDH/KB a la tinta FADGDH/CP. Es decir, se confirmo que, cuando se uso la misma capa de electrodo, cuanto mas pequeno era el diametro de partfcula de la partfcula carbono sobre la que se sustentaba la enzima y mas grande era la superficie espedfica, mayor se hada la corriente de respuesta.

Ejemplo 3

Con el fin de examinar la influencia de la superficie espedfica de una partfcula de carbono sobre la que se sustenta la enzima, usando el mismo electrodo de carbono vftreo (GC) como una capa de electrodo, se midio la corriente de respuesta, usando como partfcula de carbono, ademas del KB usado anteriormente, VULCAN (VC, una marca de fabrica de Cabot) que tiene un diametro de partfcula de 30 nm, y una superficie espedfica de 254 m2/g, Lion Paste (LP, una marca de fabrica de Lion Corporation) que es una pasta compuesta de negro de acetileno (Denka Black, DB, Denki Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha) que tiene un diametro de partfcula 35 nm y una superficie espedfica de 68 m2/g y KB.

En primer lugar, con el KB (100 mg) se mezclaron agua Milli Q (200 jl) y Nafion al 5% (1200 jl) para proporcionar una tinta KB. Con el VC (100 mg) se mezclaron agua Milli Q (200 jl) y Nafion al 5% (1200 jl) para proporcionar una tinta VC. Se mezclo la tinta KB y la tinta VC, la solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 4.6 U/jl de FADGDH, en una relacion de volumenes de 1:3,8:3,2, para proporcionar tinta enzimatica KB y tinta enzimatica VC, respectivamente. A continuacion, con el DB (50 mg) se mezclaron agua Milli Q (850 jl) y Nafion al 5% (600 jl) para proporcionar una tinta DB. Se mezclo la tinta DB, la solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 4,6 U/jl de FADGDH, en una relacion de volumenes de 1:1,4:1,6, para proporcionar una tinta enzimatica DB. Tambien, usando Lion Paste con KB como componente principal, se mezclo Lion Paste W-311N, Nafion al 5%, solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 4,6 U/jl de FADGDH, en una relacion de volumenes de 1:1:4:4, para proporcionar tinta enzimatica LP. Ademas, sin usar partfculas de carbono, se mezclaron Nafion al 5%, solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 4,6 U/jl de FADGDH, en una relacion de volumenes de 1:5:4, para proporcionar una tinta enzimatica.

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Se anadio, gota a gota, tinta enzimatica KB (tinta KB en la Figura 5), tinta enzimatica VC (tinta KB en la Figura 5), tinta enzimatica DB (tinta DB en la Figura 5), tinta enzimatica Lion Paste (tinta LP en la Figura 5), o tinta enzimatica (tinta en la Figura 5) (5 jl), a un electrodo de carbono vttreo (GC) pulido (9 3 mm) y se seco a 4°C durante 2 horas. Este electrodo fue sometido a un tratamiento de reticulacion usando vapores de solucion de glutaraldehndo al 25%, durante 30 minutos y luego se sumergio en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) durante 20 minutos. Este electrodo se sumergio en solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) a 4°C durante una noche para que se equilibrase. En un sistema de tres electrodos que usa el electrodo enzimatico preparado como electrodo de trabajo, Pt como contraelectrodo y Ag/AgCl como electrodo de referencia, y que usa tambien solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion, se midio un valor de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico de +250 mV frente a Ag/AgCl, y se preparo una curva de calibracion (150 rpm, 37°C).

Los resultados de las medidas de la glucosa, usando el electrodo enzimatico asf obtenido, se muestran en la Figura 5. A medida que aumentaba la concentracion de glucosa, se observo un aumento en la corriente electrica en cualquiera de los electrodos enzimaticos. Entre ellos, cuando se uso la tinta enzimatica KB o la tinta enzimatica Lion Paste, se obtuvo una respuesta similar, siendo la respuesta excepcionalmente alta comparada con la de las otras tintas. Cuando se uso la tinta enzimatica VC, se obtuvo la respuesta suficientemente alta para ser practicamente aceptable, mientras que era inferior a la de las dos tintas anteriores. Por el contrario, cuando se uso la tinta enzimatica DB, se obtuvo unicamente una senal tan baja como la del caso de usar la tinta enzimatica sin partfculas de carbono. La correlacion entre el valor de la corriente de respuesta de estos sensores a una concentracion 5 mM de glucosa y la superficie espedfica de la pardcula de carbono de la tinta usada, se muestra en la Figura 6. Con VULCAN (VC), que tiene una superficie espedfica de 254 m2/g, se obtuvo una respuesta virtualmente satisfactoria, mientras que con el negro de acetileno que tiene una superficie espedfica de 68 m2/g, no se obtuvo una respuesta satisfactoria de corriente. Por eso, se demostro que habfa una elevada correlacion entre el valor de la corriente de respuesta y la superficie espedfica de la pardcula de carbono que se va a usar, y se requiere que la pardcula de carbono tenga una superficie espedfica de al menos 200 m2/g para ser usada. Tambien, se requena que el diametro de pardcula no fuera de mas de 100 nm.

Ejemplo 4

Se mezclaron Nafion (5%), Lion Paste W-311N o W-370C, solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 8,5 U/jl de FADGDH, en una relacion de volumenes de 1:1:4:4, para proporcionar una tinta enzimatica. Cada una de las tintas enzimaticas se anadio, gota a gota, al electrodo de carbono vftreo (GC) (9 3 mm) de manera que la cantidad de FADGDH fuese de 17 U (2,4 U/mm2) y se seco a 4°C, durante 2 horas. Este electrodo fue sometido a un tratamiento de reticulacion usando vapores de solucion de glutaraldehndo al 25%, durante 30 minutos y luego se sumergio en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), a temperatura ambiente durante 20 minutos, para retirar el glutaraldelddo sin reaccionar. Este electrodo se sumergio en solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) durante 30 minutos para que se equilibrase. Usando este como electrodo de trabajo, un alambre de platino como contraelectrodo y un electrodo de referencia de Ag/AgCl como electrodo de referencia, y usando tambien solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion, se midio un valor de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico de +250 mV frente a Ag/AgCl. La medida se llevo a cabo a 37°C mientras que se agitaba la solucion de reaccion a 250 rpm. El valor de la corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida al restar el valor de la corriente electrica obtenida con una glucosa 0 mM del valor medido a cada concentracion de glucosa.

Los resultados de las medidas de la glucosa usando el electrodo enzimatico asf obtenido se muestran en la Figura 7. A medida que aumentaba la concentracion de glucosa, se observo un aumento en la corriente electrica en cualquiera de los electrodos enzimaticos. Cuando se uso Lion Paste W-311N o W-370C como pardcula de carbono en la capa enzimatica, la densidad de corriente observada a una concentracion 5 mM de glucosa fue de 1694 nA/mm2 o 1452 nA/mm2, respectivamente. Se confirmo que cuando se uso Lion Paste que tiene KB como componente principal, se obtuvo una alta respuesta de corriente independientemente de los tipos de productos.

Ejemplo 5

Como pardcula de carbono se proporciono VULCAN (VC) que tema un diametro de pardcula de 30 nm y una superficie espedfica de 254 m2/g. Al VC (100 mg), se anadio agua Milli Q (400 jl) y Nafion al 5% (solucion acuosa en propanol al 48%) (1 ml). Se realizo bien la mezcla y se dejo reposar durante 3 dfas para proporcionar una tinta VC. Se uso una mezcla de solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 jl) y 8,4 U/ml de FADGDH (40 jl) con la tinta VC (10 jl) como una tinta FADGDH/KB. A un electrodo integral (9 0,75 mm), lleno de VC como material del electrodo, se anadio, gota a gota, la tinta FADGDH/CP para conseguir 25 U/mm2 y se seco a 4°C durante 2 horas. El electrodo enzimatico preparado se uso como electrodo de trabajo, se uso Pt como contraelectrodo y se uso un electrodo de referencia de Ag/AgCl como electrodo de referencia. La Figura 5 muestra los resultados de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico de +250 mV frente a Ag/AgCl usando solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion en un sistema de tres electrodos. La medida se llevo a cabo a 37°C mientras que la solucion de reaccion estaba siendo agitada a 250 rpm. El valor de la corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida al

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restar el valor de la corriente electrica obtenida con una glucosa 0 mM, del valor electrico medido a cada concentracion de glucosa.

Como se muestra en la Figura 8, aumentando gradualmente la concentracion de glucosa, aumento el valor de la corriente electrica observada. A una concentracion final 55 mM de glucosa, el valor de la corriente de respuesta fue de aproximadamente 3500 nA. Con una glucosa 5 mM, la densidad de corriente fue de 2327 nA/mm2. Como se describio anteriormente, se confirmo que la tinta VC que usa VC que tiene un diametro de partfcula de 30 nm y una superficie espedfica de 254 m2/g, se obtuvo un valor satisfactorio de la corriente de respuesta cuando se uso un carbono vftreo para la capa de electrodo como se muestra en el Ejemplo 3, o cuando se uso VC para la capa de electrodo como se muestra en el presente ejemplo.

Como se describio anteriormente, se confirmo que cuando se uso la partfcula de carbono tanto para la capa de electrodo como para la capa enzimatica, si se uso el mismo tipo de partfcula de carbono en la capa de electrodo, cuanto mas pequeno era el diametro de partfcula de la partfcula de carbono usado en la capa enzimatica y mayor era su superficie espedfica, mayor se hada la corriente de respuesta y, en particular, cuando se uso una partfcula de carbono que tema un diametro de partfcula de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g, se obtuvo una corriente de respuesta satisfactoria. Y, se confirmo tambien, que si se usaba el mismo tipo de partfcula de carbono en la capa enzimatica, cuanto mas pequeno era el diametro de partfcula de la partfcula de carbono usado en la capa de electrodo y mayor era su superficie espedfica, mayor se hada la corriente de respuesta y, en particular, cuando se uso una partfcula de carbono que tema un diametro de partfcula de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g, se mejoro la corriente de respuesta.

Ejemplos en el caso de usar alambre de metal como capa de electrodo

A continuacion, se describiran ejemplos en el caso de usar un alambre de metal como capa de electrodo y usar una tinta LP como capa de enzima.

Ejemplo 6

Se sumergio un alambre de oro (9 0,5 mm) en una solucion pirana (peroxido de hidrogeno:acido sulfurico concentrado = 1:3) durante 5 minutos para ser lavado, lo que se repitio 3 veces. Este alambre de oro se revistio con una tinta de enzima preparada usando Lion Paste W-311N bajo las mismas condiciones que las descritas en la explicacion del Ejemplo 4 y se seco a 4°C durante 2 horas. Este electrodo se sometio a un tratamiento de reticulacion de la misma manera que la descrita en la explicacion del Ejemplo 4 para ser equilibrado, y despues se uso como electrodo de trabajo. En un sistema de tres electrodos que usa un alambre de oro sin revestimientos como electrodo contador y un electrodo de referencia de Ag/AgCl como electrodo de referencia, se midio un valor de corriente de respuesta tras la adicion de glucosa de la misma manera que la descrita en la explicacion del Ejemplo 4.

Los resultados de las medidas de glucosa usando el electrodo de enzima asf obtenido se muestran en la Figura 9. Segun aumento la concentracion de glucosa, se observo un aumento en la corriente electrica. La densidad de corriente observada a 5 mM de concentracion de glucosa fue 201 nA/mm2.

Ejemplo 7

Se mezclaron Nafion (5 %), Lion Paste W-311N, fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 8,4 U/pl de FADGDH en una relacion de volumen de 1:1:4:4 para proporcionar una tinta de enzima. Con la tinta de enzima, se revistieron 10 mm del extremo de un alambre de acero inoxidable (9 0,5 mm) y se seco a 4°C durante 2 horas. Este alambre de acero inoxidable se sometio a un tratamiento de reticulacion usando vapores de solucion de glutaraldefudo al 25 % durante 30 minutos y despues se sumergio en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0) a temperatura ambiente durante 20 minutos para retirar el glutaraldefudo sin reaccionar. Este alambre de acero inoxidable se sumergio adicionalmente en fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) durante 1 hora para ser equilibrado. Usando esto como electrodo de trabajo, un alambre de platino como electrodo contador, Ag/AgCl como electrodo de referencia, asf como usando fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion, se midio un valor de corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico a +400 mV frente a Ag/AgCl. La medida se llevo a cabo a 37°C mientras la solucion de reaccion estaba siendo agitada a 250 rpm. El valor de corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida restando el valor de corriente electrica de estado estacionario obtenido a 0 mM de glucosa del valor de corriente electrica de estado estacionario medido a cada concentracion de glucosa.

Los valores de corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se uso como electrodo de trabajo cada alambre de acero inoxidable en el que estaba inmovilizada la enzima se muestran en la Figura 10. Segun aumento la concentracion de glucosa, se observo un aumento en la corriente electrica. La densidad de corriente observada a 5 nM de concentracion de glucosa fue 232 nA/mm2.

Ejemplo 8

Se uso una porcion de acero inoxidable (0,165 mm2) del extremo de un electrodo integral de acero inoxidable como electrodo de trabajo y la otra porcion de acero inoxidable (0,942 mm2) se uso como electrodo contador. El electrodo

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de trabajo se sumergio en una tinta de enzima en la que se mezclaron 5 % de Nafion, Lion Paste W-311N, fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 8,4 U/|jl de FADGDH en una relacion de volumen de 1:1:4:4 y despues se seco a 4°C durante 2 horas. Este electrodo se sometio a un tratamiento de reticulacion usando vapores de solucion de glutaraldetndo al 25% durante 30 minutos y despues se sumergio en fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) durante 30 minutos para ser equilibrado. En un sistema de tres electrodos usando un potencioestato con este electrodo, asf como usando Ag/AgCl como electrodo de referencia, se midio un valor de corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplico un potencial electrico a +400 mV frente a Ag/AgCl. La medida se llevo a cabo usando fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) (10 ml) como solucion de reaccion, a 37°C y una velocidad de agitacion de 150 rpm. El valor de corriente de respuesta se definio como la diferencia obtenida restando el valor de corriente electrica de estado estacionario obtenido a 0 mM de glucosa del valor de corriente electrica de estado estacionario medido a cada concentracion de glucosa.

Se muestra en la Figura 11 una curva de calibracion del valor de corriente de respuesta del electrodo integral de acero inoxidable preparado frente a glucosa. En la medida en un sistema de electrodos, el valor de corriente de respuesta a 5 mM de concentracion de glucosa fue 134 nA/mm2. Este valor fue casi el mismo que el valor obtenido del electrodo de enzima del Ejemplo 7 preparado usando el alambre de acero inoxidable de 0,5 mm. Por tanto, se construyo un sensor de glucosa usando este electrodo integral de acero inoxidable.

Ejemplo de preparacion del electrodo enzimatico

Ejemplo 9

Se aplico una tinta enzimatica sobre un electrodo que se puede conseguir comercialmente (electrodo de carbono de tipo circular Bio Device Technology Co., Ltd., DepChip) (mostrado en la Figura 12) que se prepara sustentando partfculas de carbono sobre un sustrato polimerico, construyendo con ello un electrodo enzimatico. Como tinta enzimatica, se uso una mezcla de Nafion al 5%, Lion Paste W-211N, solucion reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 4,0 U/jl de FADGDH en una relacion de volumenes de 1:1:1:7. Esta tinta enzimatica (1,5 jl) se aplico sobre el electrodo de la Figura 12 y luego se seco a 4°C durante 2 horas. En un sistema de tres electrodos que usa un potenciostato con este electrodo, asf como Ag/AgCl sobre el mismo electrodo como electrodo de referencia, se midio un valor de la corriente de respuesta tras la adicion de glucosa cuando se aplica un potencial electrico a +250 mV frente al electrodo de Ag/AgCl.

En la medida, se anadio primero, gota a gota, una solucion de muestra (5 jl) ,que contema diversas concentraciones de glucosa disuelta en solucion acuosa reguladora de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0), al electrodo enzimatico bajo condiciones de no aplicar al electrodo potenciales electricos. Y, 5 segundos mas tarde, en un sistema de tres electrodos que usa un potenciostato asf como AgAgCl sobre el mismo electrodo como electrodo de referencia, se aplico un potencial electrico a +250 mV frente al electrodo de Ag/AgCl. En la Figura 13 se muestran los cambios del valor de la corriente electrica observados cuando se anadieron las muestras que conteman diversas concentraciones. Como se muestra, el valor de la corriente electrica observado vana dependiendo de la concentracion de la glucosa anadida. Usando el valor de la corriente electrica al cabo de 5 segundos de la aplicacion del potencial electrico como un valor de referencia, se examino la correlacion con la concentracion de glucosa. En la Figura 14 se muestra una representacion grafica que recoge el valor de la corriente electrica 5 segundos despues de la aplicacion del potencial electrico a lo largo del eje vertical y que recoge la concentracion de la glucosa en la muestra, a lo largo del eje horizontal. Segun se describe en la presente memoria descriptiva, que usa el presente electrodo enzimatico sin anadir un mediador de electrones, se midio la concentracion de glucosa.

Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de la presente invencion. Por ejemplo, el electrodo enzimatico que usa el material que constituye una tinta segun la presente invencion, como se describio con detalle, se puede usar como electrodo de trabajo en un sensor de glucosa y se puede aplicar, preferiblemente, a una enzima anodica en una pila de combustible que usa glucosa como combustible.

Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un electrodo enzimatico que comprende una capa enzimatica que contiene partfculas de carbono que llevan glucosa-deshidrogenasa (GDH) con dinucleotido de flavina-adenina (FAD) como coenzima; y una capa de electrodo, en el que las partfculas de carbono consisten en partfculas de carbono con un diametro de partfcula de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g y en el que la capa de electrodo esta compuesta por metal.
2. 2. El electrodo enzimatico segun la reivindicacion 1, en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalttica de oxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalttica de oxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.
3. 3. El electrodo enzimatico segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la capa de electrodo esta compuesta por un alambre de metal.
4. 4. Un sensor de glucosa que comprende el electrodo enzimatico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Un metodo para producir un electrodo enzimatico segun la reivindicacion 1, que comprende revestir una superficie de una capa de electrodo con un material que constituye una tinta que comprende glucosa- deshidrogenasa (GDH) con dinucleotido de flavina-adenina (FAD) como coenzima; y partfculas de carbono que tienen un diametro de no mas de 100 nm y una superficie espedfica de al menos 200 m2/g, en el que la capa de electrodo esta compuesta de metal, y luego secar.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que la glucosa-deshidrogenasa (GDH) es una subunidad catalftica de oxidorreductasa o un complejo de una subunidad catalttica de oxidorreductasa y una subunidad de transferencia de electrones.
7. 7. El metodo para producir un electrodo enzimatico segun la reivindicacion 5 o 6, que comprende ademas anadir un polielectrolito solido a una pelfcula enzimatica en la que se absorbe la enzima, o se aplica y se seca.
8. 8. El metodo para producir un electrodo enzimatico segun la reivindicacion 5 o 6, en el que el material que constituye la tinta comprende ademas el polielectrolito solido.
9. 9. El metodo para producir un electrodo enzimatico segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que dicho polielectrolito solido es Nafion™.
10. 10. Una celda enzimatica de combustible que emplea el electrodo enzimatico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el electrodo enzimatico se usa como anodo.