JP2002125689A - 融合蛋白質 - Google Patents
融合蛋白質Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ビオチン結合部位とグルコース脱水素酵素活性
を有する融合蛋白質を提供する。 【解決手段】 ＰＱＱグルコース脱水素酵素とストレプ
トアビジンのビオチン結合部位とを融合した蛋白質の遺
伝子を構築し、さらに該遺伝子を組み込んでなる組み換
えベクターを微生物に形質転換することによって得られ
た形質転換体を培養し、該培養物から採取される融合蛋
白質、その製造方法、およびこれを用いた分析方法。
を有する融合蛋白質を提供する。 【解決手段】 ＰＱＱグルコース脱水素酵素とストレプ
トアビジンのビオチン結合部位とを融合した蛋白質の遺
伝子を構築し、さらに該遺伝子を組み込んでなる組み換
えベクターを微生物に形質転換することによって得られ
た形質転換体を培養し、該培養物から採取される融合蛋
白質、その製造方法、およびこれを用いた分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）にストレプトアビジンのビオチン結合部位を含む
蛋白が連結された融合蛋白質、ならびにその製造方法、
およびそのグルコースの定量、免疫分析への応用に関す
る。
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）にストレプトアビジンのビオチン結合部位を含む
蛋白が連結された融合蛋白質、ならびにその製造方法、
およびそのグルコースの定量、免疫分析への応用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があ
ることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子
量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々
のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、
水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその
存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５
４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされ
アミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３
６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨは、ペリプラズムに局在する、分子量約５０ｋ
Ｄａの２つの同一のサブユニットからなるホモダイマー
である。ＰＱＱＧＤＨ活性は、ホモダイマー酵素が形成
される場合にのみ発現され、サブユニット単独ではＰＱ
ＱＧＤＨ活性を示さないことが報告されている。水溶性
ＰＱＱＧＤＨの生理学的役割はまだよく解明されていな
い。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーと
して臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物
を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロ
セスモニタリングにおいて重要な項目となっている。従
来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）あ
るいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を
用いる酵素法により定量されていた。しかし、ＧＯＤを
用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する
過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキ
シダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。またＧ
ＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進められてきた
が、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存することから
高濃度のグルコース試料には適さないこと、あるいは溶
存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可能性があっ
た。そこで、これまでのグルコース酵素定量方法に用い
られてきた酵素にかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨ
の応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに
対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧ
ＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として
酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認
識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待さ
れている。また、その触媒能力が高いことから様々分野
への応用が期待されている。
を補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコー
スを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があ
ることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子
量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々
のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、
水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株においてその
存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９（８），１５
４８−１５５５）、その構造遺伝子がクローニングされ
アミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３
６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨは、ペリプラズムに局在する、分子量約５０ｋ
Ｄａの２つの同一のサブユニットからなるホモダイマー
である。ＰＱＱＧＤＨ活性は、ホモダイマー酵素が形成
される場合にのみ発現され、サブユニット単独ではＰＱ
ＱＧＤＨ活性を示さないことが報告されている。水溶性
ＰＱＱＧＤＨの生理学的役割はまだよく解明されていな
い。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーと
して臨床診断上極めて重要な指標である。また、微生物
を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の定量がプロ
セスモニタリングにおいて重要な項目となっている。従
来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）あ
るいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を
用いる酵素法により定量されていた。しかし、ＧＯＤを
用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する
過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキ
シダーゼをアッセイ系に添加する必要があった。またＧ
ＯＤを用いるバイオセンサーの開発も進められてきた
が、反応が水溶液中の溶存酸素濃度に依存することから
高濃度のグルコース試料には適さないこと、あるいは溶
存酸素濃度によって測定値に誤差が生じる可能性があっ
た。そこで、これまでのグルコース酵素定量方法に用い
られてきた酵素にかわる新たな酵素としてＰＱＱＧＤＨ
の応用が注目されている。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに
対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧ
ＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として
酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認
識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待さ
れている。また、その触媒能力が高いことから様々分野
への応用が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ストレプト
アビジンのビオチン結合部位を含む蛋白質（以下ストレ
プトアビジン）と連結されたＰＱＱＧＤＨを構築し、繁
用性の高いＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
アビジンのビオチン結合部位を含む蛋白質（以下ストレ
プトアビジン）と連結されたＰＱＱＧＤＨを構築し、繁
用性の高いＰＱＱＧＤＨを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＰＱＱＧＤ
Ｈにストレプトアビジンを連結した融合蛋白質を形成す
ることにより、本発明を完成した。
Ｈにストレプトアビジンを連結した融合蛋白質を形成す
ることにより、本発明を完成した。
【０００５】 すなわち、本発明は、リンカーペプチド
を介して連結されたＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジン
との融合蛋白質を提供する。好ましくは、ＰＱＱＧＤＨ
としてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅ
ｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨである該融合蛋白質
である。また、好ましくはストレプトアビジンとしてＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉ、より好まし
くはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ Ｉ
ＦＯ１３４２９株由来のストレプトアビジンを含む該融
合蛋白質である。
を介して連結されたＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジン
との融合蛋白質を提供する。好ましくは、ＰＱＱＧＤＨ
としてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅ
ｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨである該融合蛋白質
である。また、好ましくはストレプトアビジンとしてＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉｄｉｎｉｉ、より好まし
くはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ Ｉ
ＦＯ１３４２９株由来のストレプトアビジンを含む該融
合蛋白質である。
【０００６】 本発明はまた、本発明の融合蛋白質をコ
ードする遺伝子、ならびに該遺伝子を含むベクターおよ
び形質転換体、および該遺伝子が主染色体に組み込まれ
た生物を提供する。本発明はまた、本発明の融合蛋白質
を含むグルコースアッセイキット、ならびにグルコース
センサーまたは免疫分析キットを提供する。
ードする遺伝子、ならびに該遺伝子を含むベクターおよ
び形質転換体、および該遺伝子が主染色体に組み込まれ
た生物を提供する。本発明はまた、本発明の融合蛋白質
を含むグルコースアッセイキット、ならびにグルコース
センサーまたは免疫分析キットを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】融合蛋白質の構造 本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱＧＤＨにストレプトアビ
ジンが連結された構造を有する融合蛋白質である。
ジンが連結された構造を有する融合蛋白質である。
【０００８】 本発明の融合蛋白質はＰＱＱＧＤＨとス
トレプトアビジンとの間のリンカー領域のアミノ酸配列
は蛋白質加水分解を受けやすいことが知られている部分
配列を含まないように設計すべきである。ＰＱＱＧＤＨ
においては、アミノ酸残基の一部が欠失または置換され
ていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていて
もよい。特定の領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基
で置換することにより、酵素の熱安定性や基質に対する
親和性を改良することができる（たとえば、特開平１０
−２４３７８６、特願平１１−１０１１４３、特願平１
１−１２４２８５を参照）。これらの改変されたＰＱＱ
ＧＤＨが連結された融合蛋白質も本発明の範囲内であ
る。
トレプトアビジンとの間のリンカー領域のアミノ酸配列
は蛋白質加水分解を受けやすいことが知られている部分
配列を含まないように設計すべきである。ＰＱＱＧＤＨ
においては、アミノ酸残基の一部が欠失または置換され
ていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていて
もよい。特定の領域のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基
で置換することにより、酵素の熱安定性や基質に対する
親和性を改良することができる（たとえば、特開平１０
−２４３７８６、特願平１１−１０１１４３、特願平１
１−１２４２８５を参照）。これらの改変されたＰＱＱ
ＧＤＨが連結された融合蛋白質も本発明の範囲内であ
る。
【０００９】好ましくは、ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水
溶性ＰＱＱＧＤＨである。当業者は、他の細菌に由来す
る水溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にした
がってストレプトアビジンを連結して発現させることに
より、本発明の融合蛋白質を得ることができる。これら
の融合蛋白質も本発明の範囲内である。
ｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水
溶性ＰＱＱＧＤＨである。当業者は、他の細菌に由来す
る水溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にした
がってストレプトアビジンを連結して発現させることに
より、本発明の融合蛋白質を得ることができる。これら
の融合蛋白質も本発明の範囲内である。
【００１０】またストレプトアビジンとしてはビオチン
と結合能力を有するものであればよく、ストレプトアビ
ジンのビオチン結合部位の蛋白質をＰＱＱＧＤＨに連結
することによって本融合蛋白質を構築できる。
と結合能力を有するものであればよく、ストレプトアビ
ジンのビオチン結合部位の蛋白質をＰＱＱＧＤＨに連結
することによって本融合蛋白質を構築できる。
【００１１】好ましくはストレプトアビジンはＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来、より好まし
くは同ＩＦＯ１３４２９株由来のストレプトアビジンあ
るいはストレプトアビジンのビオチン結合部位の蛋白質
をＰＱＱＧＤＨに連結することにより本融合蛋白質を構
築できる。
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来、より好まし
くは同ＩＦＯ１３４２９株由来のストレプトアビジンあ
るいはストレプトアビジンのビオチン結合部位の蛋白質
をＰＱＱＧＤＨに連結することにより本融合蛋白質を構
築できる。
【００１２】融合蛋白質の製造方法 図１は、本発明の融合蛋白質の概要およびこれをコード
するベクターの構築方法を示す。本発明の融合蛋白質
は、ＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジンとを連結させた
インフレーム融合を行うことにより作成することができ
る。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子の配列は、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９
８９），２１７：４３０−４３６に開示される。Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来ストレプト
アビジンをコードする遺伝しの配列はＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８６），１４
（４）：１８７１−１８８２に開示される。
するベクターの構築方法を示す。本発明の融合蛋白質
は、ＰＱＱＧＤＨとストレプトアビジンとを連結させた
インフレーム融合を行うことにより作成することができ
る。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子の配列は、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９
８９），２１７：４３０−４３６に開示される。Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来ストレプト
アビジンをコードする遺伝しの配列はＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８６），１４
（４）：１８７１−１８８２に開示される。
【００１３】本発明の融合蛋白質をコードする遺伝子
を、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をストレプトアビ
ジンとを連結することにより構築する。このとき、各蛋
白質の遺伝子がインフレームで融合蛋白質として発現さ
れるように連結する。リンカーとしては、天然または合
成の任意の配列を用いることができる。例えば、ベクタ
ー中の適当な配列を用いてもよく、合成遺伝子を調製し
てもよい。このような遺伝子操作のための種々の方法
は、当該技術分野において知られている。このようにし
て得た融合蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子発現用の
ベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な
宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を
発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分
野において知られており、宿主としては例えば、細菌、
酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができ
る。
を、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子をストレプトアビ
ジンとを連結することにより構築する。このとき、各蛋
白質の遺伝子がインフレームで融合蛋白質として発現さ
れるように連結する。リンカーとしては、天然または合
成の任意の配列を用いることができる。例えば、ベクタ
ー中の適当な配列を用いてもよく、合成遺伝子を調製し
てもよい。このような遺伝子操作のための種々の方法
は、当該技術分野において知られている。このようにし
て得た融合蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子発現用の
ベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な
宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を
発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分
野において知られており、宿主としては例えば、細菌、
酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができ
る。
【００１４】上述のようにして得られた、融合蛋白質を
発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離など
で菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕
する。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨ活性を含む水
溶性画分を得ることができる。あるいは本融合蛋白質が
不溶性の顆粒として産生されている場合には、細胞破砕
液より遠心分離機によって沈澱として顆粒を回収し、こ
れを尿素等の変性剤で可溶化したのち、透析により蛋白
質立体構造を巻き戻し、活性のある融合蛋白質として水
溶性画分として回収する。あるいは、適当な宿主ベクタ
ー系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを培養
液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分
を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することに
より、本発明の融合蛋白質を調製する。
発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離など
で菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕
する。これを超遠心分離し、ＰＱＱＧＤＨ活性を含む水
溶性画分を得ることができる。あるいは本融合蛋白質が
不溶性の顆粒として産生されている場合には、細胞破砕
液より遠心分離機によって沈澱として顆粒を回収し、こ
れを尿素等の変性剤で可溶化したのち、透析により蛋白
質立体構造を巻き戻し、活性のある融合蛋白質として水
溶性画分として回収する。あるいは、適当な宿主ベクタ
ー系を用いることにより、発現したＰＱＱＧＤＨを培養
液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分
を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することに
より、本発明の融合蛋白質を調製する。
【００１５】酵素活性の測定方法 本発明の融合蛋白質は、ＰＱＱを補酵素として、グルコ
ースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒
する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨに
よるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの
量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができ
る。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フ
ェロセンなどを用いることができる。
ースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒
する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨに
よるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの
量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができ
る。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フ
ェロセンなどを用いることができる。
【００１６】グルコースアッセイキット 本発明はまた、本発明に従う融合蛋白質を含むグルコー
スアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースア
ッセイキットは、本発明に従う融合蛋白質を少なくとも
１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キット
は、本発明の融合蛋白質に加えて、アッセイに必要な緩
衝液、電子受容体、キャリブレーションカーブ作製のた
めのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
電子受容体としてはＰＭＳ、ＤＣＩＰ、フェリシアン化
カリウム、さらにシトクロームなどを用いることができ
る。本発明に従う融合蛋白質は種々の形態で、例えば、
凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の
溶液として提供することができる。好ましくは本発明の
融合蛋白質はホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素
の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
スアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースア
ッセイキットは、本発明に従う融合蛋白質を少なくとも
１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キット
は、本発明の融合蛋白質に加えて、アッセイに必要な緩
衝液、電子受容体、キャリブレーションカーブ作製のた
めのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。
電子受容体としてはＰＭＳ、ＤＣＩＰ、フェリシアン化
カリウム、さらにシトクロームなどを用いることができ
る。本発明に従う融合蛋白質は種々の形態で、例えば、
凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の
溶液として提供することができる。好ましくは本発明の
融合蛋白質はホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素
の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００１７】グルコースセンサー 本発明はまた、本発明に従う融合蛋白質を用いるグルコ
ースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電
極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明
の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を
用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透
析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマ
ー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセン
あるいはその誘導体に代表される電子メディエーターと
ともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定して
もよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ま
しくは本発明の融合蛋白質はホロ化した形態で電極上に
固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別
の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型
的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の融合蛋白
質をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する
試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングす
る。
ースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電
極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明
の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を
用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透
析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマ
ー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセン
あるいはその誘導体に代表される電子メディエーターと
ともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定して
もよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ま
しくは本発明の融合蛋白質はホロ化した形態で電極上に
固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別
の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型
的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の融合蛋白
質をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する
試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングす
る。
【００１８】 グルコース濃度の測定は、以下のように
して行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱ
ＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一
定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシ
アン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用
いることができる。またこれらのメディエーターに加え
てシトクロームを添加する場合もある。作用電極として
本発明の融合蛋白質を固定化した電極を用い、対極（例
えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ
電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加し
て、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加
えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液
により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料
中のグルコース濃度を計算することができる。
して行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱ
ＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一
定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシ
アン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用
いることができる。またこれらのメディエーターに加え
てシトクロームを添加する場合もある。作用電極として
本発明の融合蛋白質を固定化した電極を用い、対極（例
えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ
電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加し
て、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加
えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液
により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料
中のグルコース濃度を計算することができる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 融合蛋白質の構築 融合蛋白質の構築方法ならびに発現用のベクターを図１
に示す。融合蛋白質を構築するためのそれぞれの遺伝子
フラグメントは以下のようにして調製した。ＰＱＱＧＤ
Ｈの構造遺伝子はＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ Ｌ
ＭＤ７９．４１（ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）由来の天然のＰ
ＱＱＧＤＨ構造遺伝子をテンプレートとして、所望の制
限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。
ＰＣＲ反応には、次の１組のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いた。 このＰＣＲプライマーにより増幅された遺伝子フラグメ
ントをＮｃｏＩとＳａｃＩの２種類の制限酵素で消化し
た後、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）のクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部
位に挿入した。得られたプラスミドｐＧＢ１６と命名し
た。一方、ストレプトアビジンのビオチン結合領域を含
む蛋白質をコードする構造遺伝子はＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ ＩＦＯ１３４２９から調製
したゲノム遺伝子から、同領域をコードする遺伝子断片
を所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により
増幅した。ＰＣＲ反応には、次の１組のオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。 このＰＣＲプライマーにより増幅されたストレプトアビ
ジンのビオチン結合領域を含む蛋白質をコードする構造
遺伝子約４５０ｂｐの遺伝子断片を制限酵素ＳａｃＩお
よびＸｂａＩで消化した。さらに先に構築したプラスミ
ドｐＧＢ１６を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化
し、そこにここで調製したストレプトアビジンのビオチ
ン結合領域を含む蛋白質をコードする構造遺伝子を挿入
し、ライゲーションし、ベクター，ｐＧＢＳＡを構築し
た。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 融合蛋白質の構築 融合蛋白質の構築方法ならびに発現用のベクターを図１
に示す。融合蛋白質を構築するためのそれぞれの遺伝子
フラグメントは以下のようにして調製した。ＰＱＱＧＤ
Ｈの構造遺伝子はＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ Ｌ
ＭＤ７９．４１（ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）由来の天然のＰ
ＱＱＧＤＨ構造遺伝子をテンプレートとして、所望の制
限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により増幅した。
ＰＣＲ反応には、次の１組のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いた。 このＰＣＲプライマーにより増幅された遺伝子フラグメ
ントをＮｃｏＩとＳａｃＩの２種類の制限酵素で消化し
た後、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）のクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部
位に挿入した。得られたプラスミドｐＧＢ１６と命名し
た。一方、ストレプトアビジンのビオチン結合領域を含
む蛋白質をコードする構造遺伝子はＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ ＩＦＯ１３４２９から調製
したゲノム遺伝子から、同領域をコードする遺伝子断片
を所望の制限酵素部位を含むように、ＰＣＲ反応により
増幅した。ＰＣＲ反応には、次の１組のオリゴヌクレオ
チドプライマーを用いた。 このＰＣＲプライマーにより増幅されたストレプトアビ
ジンのビオチン結合領域を含む蛋白質をコードする構造
遺伝子約４５０ｂｐの遺伝子断片を制限酵素ＳａｃＩお
よびＸｂａＩで消化した。さらに先に構築したプラスミ
ドｐＧＢ１６を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化
し、そこにここで調製したストレプトアビジンのビオチ
ン結合領域を含む蛋白質をコードする構造遺伝子を挿入
し、ライゲーションし、ベクター，ｐＧＢＳＡを構築し
た。
【００２０】実施例２ 融合蛋白質の製造および精製 宿主細胞としては、挿入変異によりＰＱＱＧＤＨ構造遺
伝子が壊されているＥ．ｃｏｌｉ ＰＰ２４１８株（Ｃ
ｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）
を用いた。この株を実施例１で得られたプラスミドｐＧ
ＢＳＡでそれぞれトランスフォームし、各形質転換体を
Ｌ−ブロス中で６００ｎＭ ＰＱＱおよび５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２の存在下で３７℃で好気的に培養した。中期対数
増殖期で０．３ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに３０℃で
後期対数増殖期まで培養した。細胞を回収し、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でフレンチプレスによ
り破壊し（１１０Ｍｐａｓ）、超遠心分離（１６０，５
００ｇ、１ｈ、４℃）を行った。酵素活性は水溶性画分
中に認められた。この画分を回収し、１０ｍＭ リン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。
伝子が壊されているＥ．ｃｏｌｉ ＰＰ２４１８株（Ｃ
ｌｅｔｏｎ−Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）
を用いた。この株を実施例１で得られたプラスミドｐＧ
ＢＳＡでそれぞれトランスフォームし、各形質転換体を
Ｌ−ブロス中で６００ｎＭ ＰＱＱおよび５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２の存在下で３７℃で好気的に培養した。中期対数
増殖期で０．３ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに３０℃で
後期対数増殖期まで培養した。細胞を回収し、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でフレンチプレスによ
り破壊し（１１０Ｍｐａｓ）、超遠心分離（１６０，５
００ｇ、１ｈ、４℃）を行った。酵素活性は水溶性画分
中に認められた。この画分を回収し、１０ｍＭ リン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。
【００２１】実施例３ 融合蛋白質の分子量の測定 実施例２で得られた粗精製酵素を、１０ｍＭ リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカチオン交換クロマト
グラフィー（ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ）に
供し、０．８Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で溶出した。活性を示す画分を非変性条
件下でゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ−３０００、ト
ーソー社）に供したところ、活性画分は、融合蛋白質に
ついて予測されるとおり、約６５ｋＤａの分子量を有し
ていた。このようにして得られた画分を融合蛋白質標品
として以下の実験に用いた。
衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカチオン交換クロマト
グラフィー（ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ）に
供し、０．８Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で溶出した。活性を示す画分を非変性条
件下でゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ−３０００、ト
ーソー社）に供したところ、活性画分は、融合蛋白質に
ついて予測されるとおり、約６５ｋＤａの分子量を有し
ていた。このようにして得られた画分を融合蛋白質標品
として以下の実験に用いた。
【００２２】実施例４ 酵素アッセイ 酵素活性は、酵素を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ
７．０）中で、１ｍＭＣａＣｌ２および１μＭ ＰＱＱ
の存在下で室温で１０分間インキュベートした後、０．
６ｍＭ フェナジンメトサルフェート、０．０６ｍＭ
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩ
Ｐ）の存在下で、２５℃で６００ｎｍの吸光度の減少速
度を測定することにより測定した。
７．０）中で、１ｍＭＣａＣｌ２および１μＭ ＰＱＱ
の存在下で室温で１０分間インキュベートした後、０．
６ｍＭ フェナジンメトサルフェート、０．０６ｍＭ
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩ
Ｐ）の存在下で、２５℃で６００ｎｍの吸光度の減少速
度を測定することにより測定した。
【００２３】実施例５ 酵素センサーの作製および評価 ５Ｕの融合蛋白質にカーボンペースト２０ｍｇを加えて
凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボン
ペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極
の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１
％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０
ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドを
ブロッキングした。この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。
電極は４℃で保存した。作製した酵素センサーを用いて
グルコース濃度の測定を行った。本発明の融合蛋白質を
固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭ
の範囲でグルコースの定量を行うことができる。
凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボン
ペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極
の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１
％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０
ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドを
ブロッキングした。この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。
電極は４℃で保存した。作製した酵素センサーを用いて
グルコース濃度の測定を行った。本発明の融合蛋白質を
固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭ
の範囲でグルコースの定量を行うことができる。
【００２４】
【発明の効果】 上述のようにビオチン結合部位を有し
グルコース脱水素酵素活性を有する融合蛋白質が構築で
きた。さらに本融合蛋白質を大腸菌で調製できるように
なり、糖の分析が行えるようになった。
グルコース脱水素酵素活性を有する融合蛋白質が構築で
きた。さらに本融合蛋白質を大腸菌で調製できるように
なり、糖の分析が行えるようになった。
【図１】 図１は、本発明の融合蛋白質をコードするベ
クターの構築方法を示す。
クターの構築方法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 9/04 Ｄ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｂ 9/04 1/32 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 27/30 Ｂ 1/32 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 27/30 5/00 Ａ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｓ 27/416 ３５３Ｊ ３５３Ｒ ３５３Ｔ ３５３Ｆ 27/46 ３３８ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA11 BA08 BA80 CA02 CA06 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC04 CC05 DD02 FF05E LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ68 QR04 QR22 QS39 4B065 AA04Y AA26X AA50Y AB01 AC14 AC16 BA02 CA28 CA46 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA11 DA89 EA50 FA73 FA74 GA10 HA06
Claims (11)
- 【請求項１】 ピロロキノリンキノングルコース脱水素
酵素（ＰＱＱＧＤＨ）にストレプトアビジンのビオチン
結合部位を含む蛋白質が連結された融合蛋白質。 - 【請求項２】 前記ＰＱＱＧＤＨがＡｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨである、請求項１記載の融合蛋白質。 - 【請求項３】 前記ストレプトアビジンのビオチン結合
部位を含む蛋白質ががＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来
のストレプトアビジン由来である請求項１または２に記
載の融合蛋白質。 - 【請求項４】 前記ストレプトアビジンのビオチン結合
部位を含む蛋白質ががＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｉ
ｄｉｎｉｉ由来のストレプトアビジン由来である請求項
１−３のいずれかに記載の融合蛋白質。 - 【請求項５】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質であ
る融合蛋白質 （ａ） 配列表・配列番号１記載に記載されるアミノ酸
配列からなる蛋白質。 （ｂ） アミノ酸配列（ａ）において１、もしくは数個
のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有す
る蛋白質。 - 【請求項６】 以下の（ｃ）または（ｄ）の蛋白質をコ
ードする遺伝子。 （ｃ）配列表・配列番号２に記載された塩基配列からな
るＤＮＡ （ｄ）上記（ｃ）の配列において１、もしくは数個の塩
基配列が欠失、置換もしくは付加されており、かつグル
コース脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項７】 請求項６に記載の遺伝子を含むベクタ
ー。 - 【請求項８】 請求項６に記載の遺伝子を含む形質転換
体。 - 【請求項９】 請求項６に記載の遺伝子が主染色体に組
み込まれた生物。 - 【請求項１０】 請求項１−６のいずれかに記載の融合
蛋白質を含むグルコースアッセイキット。 - 【請求項1１】 請求項１−６のいずれかに記載の融合
蛋白質を含むグルコースセンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000366248A JP2002125689A (ja) | 2000-10-25 | 2000-10-25 | 融合蛋白質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000366248A JP2002125689A (ja) | 2000-10-25 | 2000-10-25 | 融合蛋白質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002125689A true JP2002125689A (ja) | 2002-05-08 |
Family
ID=18836899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000366248A Pending JP2002125689A (ja) | 2000-10-25 | 2000-10-25 | 融合蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002125689A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004029235A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Aldehyde dehydrogenase gene |
| WO2005030807A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Koji Sode | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
-
2000
- 2000-10-25 JP JP2000366248A patent/JP2002125689A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004029235A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Aldehyde dehydrogenase gene |
| WO2004029235A3 (en) * | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Dsm Ip Assets Bv | Aldehyde dehydrogenase gene |
| US7135315B2 (en) | 2002-09-27 | 2006-11-14 | Dsm Ip Assets B.V. | Aldehyde dehydrogenase gene |
| WO2005030807A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-07 | Koji Sode | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
| GB2421951A (en) * | 2003-09-30 | 2006-07-12 | Koji Sode | Glucose dehydrogenase/cytochrome fused protein |
| JPWO2005030807A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2007-11-15 | 早出 広司 | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
| GB2421951B (en) * | 2003-09-30 | 2008-02-27 | Koji Sode | Glucose dehydrogenase/cytochrome fusion protein |
| US8354112B2 (en) | 2003-09-30 | 2013-01-15 | Arkray, Inc. | Glucose dehydrogenase/cytochrome fusion protein |
| JP2014207911A (ja) * | 2003-09-30 | 2014-11-06 | 有限会社アルティザイム・インターナショナル | グルコース脱水素酵素とシトクロームとの融合蛋白質 |
| US9353395B2 (en) | 2003-09-30 | 2016-05-31 | Arkray, Inc. | Glucose dehydrogenase/cytochrome fusion protein |
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