JP2000510230A

JP2000510230A - 大豆ペルオキシダーゼ電気化学センサ

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Publication number: JP2000510230A
Application number: JP09515039A
Authority: JP
Inventors: ヘラー、アダム; ヴリーク、マーク・エス
Original assignee: ヘラー、アダム; ヴリーク、マーク・エス
Priority date: 1995-10-11
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 2000-08-08
Also published as: EP0856064A1; DK0856064T3; EP0856064B1; DE69621814D1; WO1997013870A1; DE69621814T2; ATE219147T1; ES2178715T3; US5665222A; AU7017896A

Abstract

(57)【要約】生物学的環境下において、３７℃或はそれを越える温度で持続して安定し、過酸化水素を測定することができる電気化学バイオセンサ。該電気化学バイオセンサは、好ましくは大豆からとれる耐熱性ペルオキシダーゼを含有し、生物分析流通系（bioanalytical flow systems）に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】大豆ペルオキシダーゼ電気化学センサ発明の分野本発明は、過酸化水素の電気化学検出用バイオセンサに関する。特に本発明は、固定化耐熱性ペルオキシダーゼ、例えば大豆ペルオキシダーゼを含有し、３７ ℃以上の温度で感度を持続する電気化学センサに関する。発明の背景電気化学、特に、過酸化水素の電流滴定、時間電流滴定（chronoamperometric ）、及び時間電量滴定（chronocoulometric）センサは、免疫試薬（immunoreage nts）の検定及び検出、同様にグルコース、ラクタート及びコレステロールを含む生物化学物質の検定、核酸センサ、並びに他の親和力反応を検出するセンサに使用されている。過酸化水素バイオセンサは、グルコース及びラクタートのような生体内での生物化学物質の観測にも利用されている。グルコースを生体内で観測することは、（真性）糖尿病の処置に関係している。ラクタートの観測は、酸素欠乏或は虚血の確認に重要である。グルコースの観測は、皮下或は皮膚経由で、即ち皮膚を経由してグルコースを運搬し、グルコース濃度を測定することによって可能である。グルコースを検定する一般的な方法は、過剰なグルコースオキシダーゼの存在下で、検査用のサンプル内のグルコースを酸素分子で反応させる方法からなる。この反応により過酸化水素及びグルコン酸のラクトーンが生成され、過酸化水素は、過酸化水素センサで検出される。ラクタート又はコレステロールを測定する場合も同様に、過酸化水素が、それぞれラクタートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼの存在下で、生成される。過酸化水素は、白金或は他の比較的安定した白金系金属電極で電子酸化（elec trooxidation）することによって電気化学的に検出される。しかし、白金電極は、生物流体内で汚損する為、その使用が制限されている。化学洗浄又は電気化学酸化及び還元によって白金電極の表面を定期的に清浄或は修繕をしなければ、過酸化水素の電子酸化の速度のポテンシャルディペンデンス（potential dependence ）、即ち白金系検出器の感度が変化する。前述の汚損の問題については、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼからなる膜でコーティングされた非腐食性金属或は炭素電極を使用することで従来は対応していた。ペルオキシダーゼは、過酸化水素によって酸化し、次いで直接又は拡散継電種（diffusing electron-relaying species）を伴う過程を経て、電子還元（electroreduced）する。過酸化水素を検出するためにペルオキシダーゼを含有する電流滴定酵素電極についての説明は以上である。これら従来のセンサにおいて、ペルオキシダーゼは、ホースラディッシュ、アースロマイセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）、及び牛乳から得られる。例として、1990年Bioelectrodchem．Bioenerg．24:30 5-311のKulys and Schmid、1991年Anal.Chim.Acta，254:81-88のWang et al.、1 991年Anal．Chim．Acta 250:203-248のGorton et al．及び1989年J．Electroana l．Chem．Interfacial Electrochem．260:487-494のPaddock et．al．を参照されたい。しかし、これらセンサは、３７℃或はそれを越える温度で、著しい感度損失をすることなく、長時間動作することができなかった。従来のペルオキシダーゼ電極は、電子伝導型ヒドロゲルを介して酵素を電極に “導通接続”する手法に基づいていた。，酵素“導通接続”型ヒドロゲルは、過酸化水素をよく透過させ、電子を伝導するので、ペルオキシダーゼと架橋ポリマー網状体（cross-linked polymer network）とを共有結合すると、高感度な過酸化水素センサが製造できた。ここでは文献として援用されているU.S.特許第5,32 0,725号のGregg and Heller、1994年Diagnostic Biosensor PolymersのVreeke a nd Heller、Usmani and Akmal，eds.，ACS Symposium Series556、及び1992年An al．Chem．64:3084-3090のVreek et al．を例として参照されたいこの“導通接続”ペルオキシダーゼセンサの電流は、広い濃度範囲において制御される物質の運搬を示し、過酸化水素濃度とともに直線的に変化する。“導通接続”型ペルオキシダーゼセンサにおいて、ペルオキシダーゼは、電極をコーティングしている電子伝導型ヒドロゲルのレドックスポリマー網状体（redox polyme r network）と共有結合する。このセンサの感度は、１Acm^-2M^-1と高い。またこのセンサは、同じ電流密度において白金電極と比較した場合、ノイズが少なく、且つ白金電極と違って生物溶液内で汚損しない。 “導通接続”型ペルオキシダーゼセンサは、２５℃における大抵の使用に対しては適切な動作を十分長く行うが、３７℃或はそれを越える温度では著しく動作寿命が縮む。例えば、人間の体温に近い３７℃で、数日間継続して使用した場合、“導通接続”型ペルオキシダーゼセンサは、感度を失う。更にセンサは、３７ ℃を越える温度においては急激に感度を失うので、３７℃或はそれを越える温度で動いている生物分析系（bioanalytical systems）或はバイオリアクタ内で長時間使用することができなかった。更に５０℃を越えた温度で、対になった核酸の鎖を変性させる電気化学工程による核酸検出には、耐熱性のある電気化学装置が必要である。酵素バイオセンサの動作安定度を向上させる試みがこれまでの間になされてきた。基質の融剤を還元するための膜及び過剰な酵索を備えて構成された酵索電極が、その動作感度を向上させるために、従来は使用されていた。例えば、1993年 Anal．Chem．65:525A-533AのAlvarez-Icaza and Bilitewski、及びカリフォルニア州、イエロースプリングのイエロー・スプリング・インストルメンツ社（Yell ow Spring Instruments，Inc.）製の23AMグルコース分析器（23 AM glucose ana lyzer）及びYSIモデル23A（YSI Model 23A）の説明書を参照されたい。酵素の大半が不活性状態になった場合であっても、制限基質融剤（restricted substrate flux）を完全に変化させるには、残存する酵素で十分なので、これらのセンサは、仕様書に記載された機能を維持する。他の安定化法としては、酵素の不活性に着眼したものがある。研究者等は、酵素不活性の原因をタンパク質の折りたたみ構造（protein folding）の不可逆変化と仮定し、架橋によってタンパク質の表面を変形或は構造を固定化させて、安定性を向上させた。例えば、1994年Biotechnol．Appl．Biochem，19:51-60のChi en et al.、1993年，App．Biochem．Biotechnol．38:57-67のAsther and Muenie r、及び1988年Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，Vol 135-1 37 Mosbach，K.,Ed．を参照されたい。耐熱性は、酵素の性質に類似したリン脂質変形表面、即ち膜によって囲まれた酵素を共有結合させることによって、向上した。例として、1992年Anal．Chem., 64:1062-1068及び1993年65:2459-2467のKallury et al．を参照されたいしかし、該脂質及びそれに結合する基質は、絶縁体である。従って、この脂質安定系（ lipid-stabilized systems）は、耐熱性電気化学センサとして有効ではなかった。好熱性有機体（thermophilic organisms）から採取できる酵素を使用して、センサの耐熱性を向上させることがこれまでに検討されてきた。しかし、このような酵素は、必要な量だけ入手することができず、及び／又は必要とされる活性を有していない。耐熱性バイオセンサは、依然として市販では入手不可能である。しかもバイオセンサに利用されるような耐熱性酵素は、過酸化水素の検定には使用できなかった。大豆ペルオキシダーゼは、近年、市販で入手可能となった。製造業者が、８０ ℃で１２時間安定する酵素を要求している一方で、電気化学反応における酵素の安定性及び感度は未知である。生物化学及び免疫学検定に利用できる酵素は既に開示されており、ホースラディッシュペルオキシダーゼが有効である（ＵＳ特許第5278046号）。従って、酵素電極の動作安定性の進歩にもかかわらず、過酸化水素検出用の安定した感度のよい電極は、得られていない。過酸化水素の検出用の安定性のある高感度バイオセンサ、例えば、３７℃及びそれ以上の温度における長時間の動作にも耐えることのできる耐熱性を有するセンサを提供することは、非常に好ましいことである。発明の概要電気化学検定において、著しい耐熱性を有する過酸化水素検出用のバイオセンサは、耐熱性ペルオキシダーゼ、例えば大豆から得られるペルオキシダーゼを使用することによって提供される。本発明の好適なセンサは、耐熱性ペルオキシダーゼを浸出不可能なレドックス化合物とともにヒドロゲル形成組成物内に固定化することによって製造される（ヒドロゲルは、水溶液中で膨潤する組成物であり、体積或は重さが１．２倍増加、即ち水和の状態で２０％の重さ或は体積が加わる）。大豆ペルオキシダーゼ及びレドックスポリマーは、耐熱性を有し、汚損のない過酸化水素センサを形成するために伝導性炭素、酸化スズ、酸化インジウム、金或は白金表面で架橋することが最も好ましい。本発明の別の実施例において、耐熱性ペルオキシダーゼは、核酸プローブに結合し、特定のヌクレオチド配列を電気化学的に検出する方法に使用される。検査される核酸のサンプルは、直接或は水溶性レドックスポリマーを介して電極に吸着或は結合する。核酸或は核酸レドックスポリマーフィルム（nucleic acid-red ox polymer film）は、電極から浸出せず、その構成成分はｐＨ５乃至８の範囲の生理的塩溶液内で該フィルムから浸出されることはない。電極上の核酸は、変性又は融解しハイブリッド形成鎖を分離する。１本鎖型核酸を有する電極は、その後、耐熱性ペルオキシダーゼを含有する核酸又はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成する。詳しくは、耐熱性ペルオキシダーゼと核酸又はオリゴヌクレオチドプローブとは結合している。該プローブと核酸電極との相補的な結合或はハイブリッド形成は、添加された過酸化水素の電子還元による電流によって示される。図の簡単な説明図１は、例１で得られたデータのグラフであり、ホースラディッシュペルオキシダーゼ型センサと大豆ペルオキシダーゼ型センサとを比較している。発明の詳細な説明本発明の過酸化水素センサは、耐熱性電気化学センサであり、例えば生物分析流通系（bioanalytical flow system）並びに、皮膚上及び生体内での使用に適している。該センサは、浸出可能な成分を有していない。本発明によるセンサは、耐熱性ペルオキシダーゼを酸化還元可能な（レドックス）化合物とともに非腐食性電極上で固定化することによって概ね形成される。該センサは、３７℃付近或は３７℃を越える温度の生物流体及び組織中にて継続、例えば数日間、感度の損失が５％以下であるように著しい損失をすることなく動作する。電気化学センサは、電流滴定、電流測定、電位滴定、電位測定、或は、電量滴定、電荷通過の測定が可能である。測定は連続、断続的に、或はt1、t2間のタイムウィンドウ（time window）内で行うことができる。耐熱性ペルオキシダーゼ耐熱性ペルオキシダーゼは、市販で入手でき、例えばオハイオ州コロンブスのエンザイモル・インターナショナル社（Enzymol International Inc.）の大豆ペルオキシダーゼである。本発明の電気化学センサに耐熱性ペルオキシダーゼが有効であるためには、レドックス化合物（redox compound）の存在下において、継続使用における酵素活性の１時間当たりの損失が５％以下として安定性を定義すると、耐熱性ペルオキシダーゼは、３７℃以上、好ましくは５０℃以上で安定していなければならない。最適な耐熱性ペルオキシダーゼとしては、およそ０．１ＭのＮａＣｌ及び１０^-4Ｍの過酸化水素を含有しているｐＨ７の水溶液中で溶解しているときの１時間当たりの活性の損失が５５℃において２％以下のものがよく、その際、酵素は１０^-4Ｍ以下の過酸化水素によって酸化し、レドックス化合物を伴う反応を介して電子還元している。耐熱性ペルオキシダーゼは、天然で得られるもの、或は再結合型（recombinan t）でもよい。好ましくは、ペルオキシダーゼは、電極上で固定化された後、ペルオキシダーゼ分子に保持されたオリゴ糖側鎖を有する。伝導非腐食性電極過酸化水素検出用の耐熱性電気化学センサは、金、パラジウム、酸化スズ、酸化インジウム（indium oxide）或は炭素のような電子伝導非腐食性の基質表面に好ましくは形成される。該炭素としてはガラス質の黒鉛も可能である。ペルオキシダーゼは、ポリマーフィルムを伝導性基質にコーティングすることからなる当業界では一般的に知られている方法によって基質上で固定化される。ポリマーフィルムは、酵素を含有、並びに／又は酵素を電極に共有結合或は架橋させる、若しくは酵素と共有結合或は架橋する、若しくは電極とともに酵素と共有結合或は架橋する。好ましくは、耐熱性ペルオキシダーゼは、電極表面にて水溶性架橋体を用いて架橋することによって水溶性レドックスポリマーと相互固定化されるポリマーフィルム本発明の過酸化水素センサは、好ましくは耐熱性ペルオキシダーゼを、（１）電極表面に付着又は吸着すると浸出されることのない水溶性ポリマーが架橋することによってできるヒドロゲル内、若しくは（２）水中で膨潤する非水溶性ポリマー内に固定化し、それによって生成されたポリマーペルオキシダーゼ組成物を非腐食性電極にコーティングすることによって形成する。水溶性ポリマーは、電極に付着した後は、例えば０．１乃至１．０Ｍ、ｐＨ５乃至８のＮａＣｌの水溶液中で浸出されることはない。非水溶性ポリマーは、水と均衡状態になった後は２０重量％以上の水を含有している。有効なヒドロゲルを形成するために架橋する水溶性レドックスポリマーの一例は、ここでは文献として援用されている1991 年,J.Phy.Chem.,95:5970のGregg & Hellerのポリマーがある。その他の有効なポリマーはレドックスポリマーであり、乾燥時において、１Ｋｇ当たり０．１乃至３．０モルの浸出不可能なレドックスセンター（redox center）を含有する浸出不可能なレドックスセンターは、標準使用及び動作状態において、水、プラズマ、血清、血液或は生理的緩衝液によって浸出されることはない。。有効なレドックスセンターは、標準カロメロ電極（ＳＣＥ）に対し４５０ｍＶ乃至−２００ｍＶのレドックス電位を有する。好適な浸出不可能なレドックスセンターは、上述の1991,Gregg & Hellerに記載されるように生成される安定な金属、特にオスミウム或はルテニウム等のVIII族の金属の錯体である。第２酵素層好ましくは、過酸化水素センサは、大豆ペルオキシダーゼを含む層上或は層内で固定化される第２酵素を含有している。第２酵素は、過酸化水素が生じる反応を触媒する酵素、例えばグルコースオキシダーゼである。この第２酵素は、ポリエチレンイミン若しくはポリ−Ｎ−ビニルイミダゾールのような安定しているポリマー、又は電子酸化可能なアニオン干渉体（anionic interferant）を除くナフィオン（NAFION）のようなポリアニオン（polyanion）と架橋することによって相互固定化される。第２酵素は、ペルオキシダーゼを含有するレドックスポリマー内に相互固定化されるか、又は別の膜内に、若しくは第２ポリマー層内に好ましくは含まれる。好適な第２酵素は、グルコースオキシダーゼ、ラクタートオキシダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼである。第２酵素は過剰に存在するので、約９０％の第２酵素の初期活性（initial activity）が失われた際、十分な酵素の活性が保存され、基質の９０％が酸素との反応を介して第２酵素含有層となる変化を触媒し、それによって、酸化基質及び過酸化水素が生成され、1995年Anal．Cham., 67:1326のYang et.al.、1994年,Diagnostic Biosensor PolymersのVreeke and H eller、及びUsmani and Akmal，Eds.，ACS Symposium Series 556:180-193に記載の如く検出される。過剰な第２酵素、通常はオキシダーゼが存在することによって、電極は、オキシダーゼが熱で失活した後も感度を維持する。従来の技術によるセンサにおいて、オキシダーゼは十分な感度を維持したが、不安定な“導通接続”型ペルオキシダーゼにはそれができなかった。本発明は、既知のペルオキシダーゼを失活させるような条件の下で感度を維持する耐熱性ペルオキシダーゼを提供することによって上記課題を解決している。生体適合性オーバーコーティング（BIOCOMPATIBLE OVERCOATING）本発明のセンサは、生体内及び３７℃付近若しくはそれ以上の温度で動いている流通系内において、生物化学分析物の精密な観測に特に適している。この有用性に寄与する要因としてはセンサの向上した安定性、特に耐熱性が含まれるまた、本発明のセンサは、体内での使用の際、問題となる浸出可能な成分を有しておらず、流通系内でレドックス成分を消耗することはない。生体内で使用する場合、センサは、第２酵素、通常はオキシダーゼによって触媒される反応によって変化する基質の透過性が非常に高い生体適合性フィルム（ biocompatible film）で好ましくはコーティングされる。この生体適合フィルムは、センサの溶液側に設けられる。一般的に生体適合性オーバーコーティングは、ヒドロゲル、例えば生きた組織或は血液等の生理的環境（physiological environment）と均衡状態にあり、２０重量％以上の水を含有するポリマー組成物で形成される。例としては、ポリ（エチレンオキシド）テトラアクリレート（poly（ethylene oxide）tetraacryl ate）のような架橋ポリ（エチレンオキシド）である。ポリマー組成物は非毒性で且つ生物系に適合しなければならない。過酸化水素の電気化学検定本発明の方法において、過酸化水素の検定は、固定化された耐熱性ペルオキシダーゼを用いて行われる。耐熱性ペルオキシダーゼは、例えばヒドロゲルを介して非腐食性電子伝導型基質上で浸出不可能なレドックス化合物と好ましくは相互固定化される。好適実施例においては、耐熱性ペルオキシダーゼは、レドックスヒドロゲル（redox hydrogel）を形成するために架橋する固定化された浸出不可能なレドックスポリマーを介して、電極に“導通接続”している。本発明の過酸化水素センサは、入手可能な、例えばホースラディッシュから得られるペルオキシダーゼ酵素（peroxidase enzyme）を従来ならば不活性化させるような高温の生物流体内において動作する。本発明のセンサは、３７℃を越える温度で動作し、５０℃を越えた温度でも継続動作の１時間当たりの感度の損失が２％以下で動作する。センサは、生体内で使用するために滅菌することができ、フローアナライザー（flow analyzer）であるバイオリアクター内で高温に耐えることができる。耐熱性ペルオキシダーゼを備えた電子伝導レドックスヒドロゲルを使用することによって、浸出可能な成分を有さず、且つ高温、例えば６５℃で動作が可能であり、非常に安定性のある過酸化水素センサが製造できる。この耐熱性センサは、感度と安定性との両者に関しては、過酸化水素が検定される際、電子酸化するプラチナ及び他のVIII族の金属電極に比肩する。本発明のセンサは、プラチナタイプに勝る特徴ある利点を有しており、汚損しにくい。電気化学核酸検定他の好適な実施例において、耐熱性ペルオキシダーゼは、特定のヌクレオチド配列の電気化学検定に使用される。耐熱性ペルオキシダーゼは、核酸プローブに結合している。検査される核酸のサンプルは、好ましくは非浸出水溶性ポリマー又は膨潤可能な非水溶性ポリマーを介して、上記の非腐食性電極に不可逆的に吸着、結合又は架橋する。ポリマー付着型核酸は電極から浸出不可能であり、上記の如く、該ポリマーは、固定化された浸出不可能なレドックスセンターを含有する。核酸電極は、１本鎖の核酸を含有するか或はハイブリッド形成された核酸鎖の分離を行うために例えば温度が５０℃を越える熱のような変性条件下に置かれる洗浄後、１本鎖核酸電極は、ハイブリッド形成条件下で核酸耐熱性ペルオキシダーゼプローブと反応する。特定の核酸ぺアリング（nucleic acid pairing）の分析に適したハイブリッド形成条件は、核酸分子によって変化する。この変化は当業者には理解されるものであり、所望の分析に適した条件は、既知の方法によって算出できる。例えば1986年、ニューヨーク州のサイエンティフィック・アメリカン・ブックス社（Scientific American Books，Inc）の237ページからハイブリッド形成が記載されているダーネル等（Darnel et.al.）著Molecular Cell Bi ologyのような一般的な生物化学或は分子生物学の参考書によるハイブリッド形成速度論の記載を参照されたい。核酸耐熱性ペルオキシダーゼプローブと核酸電極とのハイブリッド形成は、添加した過酸化水素の電子還元から生ずる電流による信号で示される。検出後、ペルオキシダーゼ標識型ハイブリッド形成体（peroxidase-labeled h ybrid）は融解或は変性し、耐熱性ペルオキシダーゼを含有する鎖は核酸電極から洗い流され、それによって酵索と電極との接触が断たれる。変性状態での電気触媒過酸化物還元電流が流れなくなると、前述のハイブリッド形成の結果を確認できる。融解、即ち核酸溶液の温度を上昇させ２本鎖を１本鎖にすることで変性を行うと、過酸化水素の電子還元電流が減少する。従って、ハイブリッド形成の有無を決定するだけでなく、本発明の方法により異なる温度で、程度も異なって変性するハイブリッド形成体を区別することができる。本発明の電気化学的な検出法の性能は特定の核酸の配列を決定、及び速い核酸配列（rapid nucleic acid seque ncing）に対する自動化された電気化学方法に特に有効である。本発明は、更に以下の例によって特徴づけられる。以下の例は、前述の本発明の範囲を限定するものではない。本発明の概念の範囲内での変形例は当業者にとって理解できること明白である。実験例例１ホースラディッシュ及び大豆から得られるペルオキシダーゼの過酸化水素センサでの比較ホースラディッシュから得たペルオキシダーゼ酵素（ＨＲＰ）E.C.1.11.1.7（シグマ／Sigma P-8375タイプVI-A，1380 ABTS units/mg）と大豆から得たペルオキシダーゼ酵素（ＳＢＰ）（エンジモル・インターナショナル社／Enzymol Int' l.,Inc.，ＨＰグレード１３０ピロガロ（HP grade 130 pyrogallo）units/mg）とを比較した。レドックスポリマー（POs-EA）は、ポリ（４−ビニルピリジン）のピリジン窒素（pyridine nitrogen）をＯｓ（ｂｐｙ）₂Ｃｌ^+/2+で部分的に錯体を作り、次いで1991年J.Phys.Chem．95:5970のGregg and Hellerに記載の如く２−ブロモエチルアミン（2-bromoethylamine）で一部４級化合物化することによって合成された。ＰＯｓ−ＥＡのオスミウム含有レドックスセンターは、ガラス質炭素とペルオキシダーゼヘムセンター（peroxidase heme center）との間の電子伝導用に提供され、ピリジニウム−Ｎ−エチルアミン（pyridinium-N-ethylamlne）官能基は水和を促進し、架橋用第１級アミンを提供する。非変形ピリジンと、オスミウム錯体型ピリジン（osmium complexed pyridines）と、ブロモエチルアミン４級型ピリジン（bromoethylamine quaternized pyridines）との比を１：３．３５：０．６とした。ガラス質炭素回転ディスク型電極（vitreous carbon rotating disk electrod e）（3mm）は、1992年Anal．Chem．64:3084-3090のVreeke et.al．に記載されているように作成したものである。該電極は、５Ｆｍ、１Ｆｍ、及び０．３Ｆｍのアルミナで順次研磨し、その後超音波処理（sonication）を施した。ACMDI 1906 シャフトと結合しているパインインストルメント回転子（Pine Instruments rot ator）AFMSRXは、一定の物質移動を行うために使用された。ペルオキシダーゼ酵素であるＨＲＰ或はＳＢＰから成る過酸化水素検出層は、３ｍｍのガラス質炭素電極に適用した。酵素とレドックスポリマーとは、（１）ジエポキシドポリ（エチレングリコール400ジグリシジルエーテル）（diepoxide poly(ethylene glycol 400 diglycidyl ether)）（PEGDGE）（テクニカルグレード／technical grade，ポリサイエンス／Polysciences＃08210製）によって、或は（２）ペルオキシダーゼオリゴ糖（peroxidase oligosaccharide）の部分的な過ヨウ素酸塩（１０₄ ^-）の酸化によってアルデヒドとなり、レドックスポリマーのアミンとでシッフ塩基形成をすることによって、架橋した。ジエポキシド架橋型フィルムは、３：２：１の比で混合された５ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ−ＮＨ₂−Ｏｓ、５ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ若しくはＳＢＰ、並びに２．５ｍｇ／ｍｌのPEGDGEを含有する１．３ｕｌの溶液を適用することによって生成された。シッフ塩基形成による架橋は、ＮａＩＯ₄によって酵素のオリゴ糖の一部が酸化した後で起きた。この過程において、ＨＲＰ或はＳＢＰ（２ｍｇ）は、１００ｍｌ、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム中で溶解した。１２ｍｇ／ｍｌのＮａＩＯ₄を５０ｍｌ添加した後、酵素溶液を２時間暗闇の中に置いた。その後、５ｍｇ／ｍｌのＰＯｓ−ＥＡの溶液と酵素溶液とを１０：３の比で混合したそして、ＰＯｓ−ＥＡ−酵素溶液を、研磨されたガラス質の炭素表面に塗布した。前記フィルムは、使用に先立って、室温で最低２４時間乾燥及び加流させた。電気化学測定は、プラチナ箔カウンター（platinum foil counter）及びＡｇ／ＡｇＣｌ生物分析型標準電極（Ag/AgCl Bioanalytical Systems reference el ectrode）を有する標準３電極セル（standard three electrode cell）内のｐＨ７．４の改良型ダルベッコ緩衝液（modified Dulbecco's buffer(PBS)）中で行われた。全ての電位は、Ａｇ／ＡｇＣｌ標準電極の電位を基準として報告された。ＥＧ＆Ｇポテンショスタット／ガルバノスタットモデル１７３(EG & Ｇpotent iostat/galvanostat model 173）或は生物分析システムＣＶ−１Ｂ（Bioanalyti cal Systems CV-1B）が電気化学測定に使用された。温度制御は、ＥＧ＆Ｇ電気化学セル（EG & G electrochemical cell）及びモデル９１０１循環水浴（フィッシャーサイエンティフィック製）（model 9101 circulating water bath(Fish er Scientific)）を用いて行った。該電気化学セルの体積は１２５ｍｌであった過酸化水素の濃縮ストック溶液（concentrated stock solutions）のアリコートは、試験溶液の体積を適当な一定値に保つために添加された。ストック過酸化水素溶液（stock hydrogen peroxide solution）の濃度（３０％、アルドリッチ／Aldrich製）は、その密度を測定することによって確認した使用する過酸化水素の溶液は、常に新しいものを用意した。過酸化水素センサ安定度測定は、０．１ｍＭの過酸化水素濃度で行われた。過酸化水素溶液は、固有では非安定であり、過酸化水素は電極で電子還元するので、定期的に、特に試験が長引いたとき或は高温のときは、過酸化水素溶液を新たに追加した。電極は、最初に酵素：レドックスポリマーの比を、次いで、ローディング（lo ading）、即ち電極表面の固体の総量を、ともに２５℃で変化させることによって、感度を最適にした。“導通接続”型ＨＲＰ及びＳＢＰ電極双方のダイナミックレンジ（dynamic ranges）及び感度が図１により比較されている。図１では又、２種類の架橋法によって製造された最適なセンサが比較されている。図１によると、ＮａＩＯ₄酸化及びシッフ塩基形成によって架橋すると、ジエポキシドと架橋しているＨＲＰセンサに比べて、感度のよいＨＲＰセンサが製造される。一方で、上記架橋法によって作られた２種類のＳＢＰセンサにおいては感度に殆ど違いがみられないことが判明した。表１に示されるように、酸化及びシッフ塩基法によって架橋したＨＲＰ型電極は、２５℃で連続動作したときは安定し、０．０Ｖでの連続動作における１時間当たりの活性の損失はわずか０．１％であった。しかし、同じ電極を４５℃で試験した場合、動作時間当たり１０％以上の感度を損失した。ジエポキシド（PEGDGE）架橋によって架橋したＨＲＰ型電極の感度は、２５℃ においては過ヨウ素酸塩／シッフ塩基架橋によって製造されたＨＲＰ型電極の感度より悪かった。このセンサは、２５℃での動作の１時間当たり０．９％の感度を損失した。しかし、４５℃においては、このＨＲＰ型センサは、動作時間当たりわずか５．６％だけ感度を損失した。 PEGDGE架橋型ＳＢＰセンサの向上した動作感度は、PEGDGE架橋型ＨＲＰセンサの感度と表１にて比較されている。ＳＢＰ型センサは、高温で非常に安定し、５５℃で作動しているときの感度の損失は１時間当たりわずか０．１５％であり、６５℃においては１．７％であった。このセンサは、７５℃において４時間の半減期を有した。ＳＢＰセンサの安定度は、同じPEGDGE架橋法によって製造されたＨＲＰセンサとは違い、５５℃では１時間当たり１０％、６５℃においては５０％の活性損失があった。ＳＢＰ型過酸化水素センサの感度は、温度に依存するが、活性化エネルギーは適度であった。電流は、温度が５℃から２０℃だけ上昇して２５℃になったとき、わずか３０％しか上昇せず、２５℃から５０℃だけ上昇して７５℃になったとき、倍増したにすぎなかった。表１各温度における電極の感度の時間当たりの損失率（％） *測定条件：Ag/AgClに対して0mV、1000RPM、 pH7.4、PBSにおける100uMのH₂O₂ 本願明細書中の公報及び特許出願書類は全て、本発明に関する技術分野における通常の技術レベルのものである。公報及び特許出願書類は全て、個々が明確に記述された場合と同程度で用いられている。本発明は、各特定の、並びに好適な実施例及び技術に関して述べられているしかし、本発明の趣旨及び範囲内で多数の変形例が可能となることは理解できよう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年９月２５日（１９９７．９．２５）【補正内容】例として、1990年Bioelectrodchem．Bioenerg．24:305-311のKulys and Schmid 、1991年Anal．Chim．Acta，254:81-88のWang et al.、1991年Anal．Chim．Acta 250:203-248のGorton et al．及び1989年J．Electroanal．Chem.Interfacial E lectrochem．260:487-494のPaddock et．al.を参照されたいしかし、これらセンサは、３７℃或はそれを越える温度で、著しい感度損失をすることなく、長時間動作することができなかった。従来のペルオキシダーゼ電極は、電子伝導型ヒドロゲルを介して酵素を電極に “導通接続”する手法に基づいていた。酵素“導通接続”型ヒドロゲルは、過酸化水素をよく透過させ、電子を伝導するので、ペルオキシダーゼと架橋ポリマー網状体（cross-linked polymer network）とを共有結合すると、高感度な過酸化水素センサが製造できた。U.S.特許第5,320,725号のGregg and Heller、1994年D iagnostic Biosensor PolyTnersのVreeke and Heller、Usmani and Akmal，eds. ，ACS Symposium Series 556、及び1992年Anal．Chem．64:3084-3090のVreek et al．を例として参照されたい。この“導通接続”ペルオキシダーゼセンサの電流は、広い濃度範囲において制御される物質の運搬を示し、過酸化水素濃度とともに直線的に変化する。“導通接続”型ペルオキシダーゼセンサにおいて、ペルオキシダーゼは、電極をコーティングしている電子伝導型ヒドロゲルのレドックスポリマー網状体（redox polymer network）と共有結合する。このセンサの感度は、１Acm^-2M^-1と高い。またこのセンサは、同じ電流密度において白金電極と比較した場合、ノイズが少なく、且つ白金電極と違って生物溶液内で汚損しない。 “導通接続”型ペルオキシダーゼセンサは、２５℃における大抵の使用に対しては適切な動作を十分長く行うが、３７℃或はそれを越える温度では著しく動作寿命が縮む。例えば、人間の体温に近い３７℃で、数日間継続して使用した場合、“導通接続”型ペルオキシダーゼセンサは、感度を失う。更にセンサは、３７ ℃を越える温度においては急激に感度を失うので、３７℃或はそれを越える温度で動いている生物分析系（bioanalytical systems）或はバイオリアクタ内で長時間使用することができなかった。更に５０℃を越えた温度で、対になった核酸の鎖を変性させる電気化学工程による核酸検出には、耐熱性のある電気化学装置が必要である。酵素バイオセンサの動作安定度を向上させる試みがこれまでの間になされてきた。基質の融剤を還元するための膜及び過剰な酵素を備えて構成された酵素電極が、その動作感度を向上させるために、従来は使用されていた。例えば、1993年 Anal．Chem．65:525A-533AのAlvarez-Icaza and Bilitewski、及びカリフォルニア州、イエロースプリングのイエロー・スプリング・インストルメンツ社（Yell ow Spring Instruments，Inc.）製の23AMグルコース分析器（23 AM glucose ana lyzer）及びYSIモデル23A（YSI Model 23A）の説明書を参照されたい。最適な耐熱性ペルオキシダーゼとしては、およそ０．１ＭのＮａＣｌ及び１０^-4 Ｍの過酸化水素を含有しているｐＨ７の水溶液中で溶解しているときの１時間当たりの活性の損失が５５℃において２％以下のものがよく、その際、酵素は１０^-4 Ｍ以下の過酸化水素によって酸化し、レドックス化合物を伴う反応を介して電子還元している。耐熱性ペルオキシダーゼは、天然で得られるもの、或は再結合型（recombinan t）でもよい。好ましくは、ペルオキシダーゼは、電極上で固定化された後、ペルオキシダーゼ分子に保持されたオリゴ糖側鎖を有する。伝導非腐食性電極過酸化水素検出用の耐熱性電気化学センサは、金、パラジウム、酸化スズ、酸化インジウム（indium oxide）或は炭素のような電子伝導非腐食性の基質表面に好ましくは形成される。該炭素としてはガラス質の黒鉛も可能である。ペルオキシダーゼは、ポリマーフィルムを伝導性基質にコーティングすることからなる当業界では一般的に知られている方法によって基質上で固定化される。ポリマーフィルムは、酵素を含有、並びに／又は酵素を電極に共有結合或は架橋させる、若しくは酵素と共有結合或は架橋する、若しくは電極とともに酵素と共有結合或は架橋する。好ましくは、耐熱性ペルオキシダーゼは、電極表面にて水溶性架橋体を用いて架橋することによって水溶性レドックスポリマーと相互固定化される。ポリマーフィルム本発明の過酸化水素センサは、好ましくは耐熱性ペルオキシダーゼを、（１）電極表面に付着又は吸着すると浸出されることのない水溶性ポリマーが架橋することによってできるヒドロゲル内、若しくは（２）水中で膨潤する非水溶性ポリマー内に固定化し、それによって生成されたポリマーペルオキシダーゼ組成物を非腐食性電極にコーティングすることによって形成する。水溶性ポリマーは、電極に付着した後は、例えば０．１乃至１．０Ｍ、ｐＨ５乃至８のＮａＣｌの水溶液中で浸出されることはない。非水溶性ポリマーは、水と均衡状態になった後は２０重量％以上の水を含有している。有効なヒドロゲルを形成するために架橋する水溶性レドックスポリマーの一例は、1991年,J.Phy.Chem.,95:5970のGregg & Hellerのポリマーがある。その他の有効なポリマーはレドックスポリマーであり、乾燥時において、１Ｋｇ当たり０．１乃至３．０モルの浸出不可能なレドックスセンター（redox center）を含有する。浸出不可能なレドックスセンターは、標準使用及び動作状態において、水、ブラズマ、血清、血液或は生理的緩衝液によって浸出されることはない。好適な浸出不可能なレドックスセンターは、上述の1991,Gregg & Hellerに記載されるように生成される安定な金属、特にオスミウム或はルテニウム等のVIII族の金属の錯体である。第２酵素層好ましくは、過酸化水素センサは、大豆ペルオキシダーゼを含む層上或は層内で固定化される第２酵素を含有している。第２酵素は、過酸化水素が生じる反応を触媒する酵素、例えばグルコースオキシダーゼである。この第２酵素は、ポリエチレンイミン若しくはポリ−Ｎ−ビニルイミダゾールのような安定しているポリマー、又は電子酸化可能なアニオン干渉体（anionic interferant）を除くナフィオン（NAFION）（登録商標）のようなポリアニオン（polyanion）と架橋することによって相互固定化される。第２酵素は、ペルオキシダーゼを含有するレドックスポリマー内に相互固定化されるか、又は別の膜内に、若しくは第２ポリマー層内に好ましくは含まれる。好適な第２酵素は、グルコースオキシダーゼ、ラクタートオキシダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼである。第２酵素は過剰に存在するので、約９０％の第２酵素の初期活性（initial activity）が失われた際、十分な酵素の活性が保存され、基質の９０％が酸素との反応を介して第２酵素含有層となる変化を触媒し、それによって、酸化基質及び過酸化水素が生成され、1995年Anal．Cham., 67:1326のYang et.al.、1994年，Diagnostic Biosensor PolymersのVreeke and Heller、及びUsmani and Akmal，Eds.，ACS Symposium Series 556:180-193に記載の如く検出される。過剰な第２酵素、通常はオキシダーゼが存在することによって、電極は、オキシダーゼが熱で失活した後も感度を維持する。従来の技術によるセンサにおいて、オキシダーゼは十分な感度を維持したが、不安定な“導通接続”型ペルオキシダーゼにはそれができなかった。本発明は、既知のペルオキシダーゼを失活させるような条件の下で感度を維持する耐熱性ペルオキシダーゼを提供することによって上記課題を解決している。生体適合性オーバーコーティング（BIOCOMPATIBLE OVERCOATING）本発明のセンサは、生体内及び３７℃付近若しくはそれ以上の温度で動いている流通系内において、生物化学分析物の精密な観測に特に適している。この有用性に寄与する要因としてはセンサの向上した安定性、特に耐熱性が含まれる。また、本発明のセンサは、体内での使用の際、問題となる浸出可能な成分を有しておらず、流通系内でレドックス成分を消粍することはない。生体内で使用する場合、センサは、第２酵素、通常はオキシダーゼによって触媒される反応によって変化する基質の透過性が非常に高い生体適合性フィルム（ biocompatible film）で好ましくはコーティングされる。この生体適合フィルムは、センサの溶液側に設けられる。表１各温度における電極の感度の時間当たりの損失率（％） *測定条件：Ag/AgClに対して0mV、1000RPM、 pH7.4、PBSにおける100uMのH₂O₂ 本発明は、各特定の、並びに好適な実施例及び技術に関して述べられている。しかし、本発明の趣旨及び範囲内で多数の変形例が可能となることは理解できよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．電気化学過酸化水素センサであって、非腐食性電極と、前記非腐食性電極で固定化された耐熱性ペルオキシダーゼと、から成り、浸出可能な成分を有さず、３７℃以上で動作可能であり、継続動作での１時間当たりの感度の損失が２％以下であることを特徴とするセンサ。２．前記耐熱性ペルオキシダーゼは大豆から得られることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。３．前記ペルオキシダーゼは、レドックスヒドロゲルを介して前記電極で固定化されることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。４．前記ペルオキシダーゼは、レドックスポリマーと架橋することを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。５．前記ペルオキシダーゼは、核酸或はオリゴヌクレオチドと共有結合することを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。６．前記ペルオキシダーゼは、再結合型タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。７．前記センサは、更に過酸化水素の生成を触媒する酵素からなることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。８．前記酵素は、グルコースオキシダーゼと、ラクタートオキシダーゼと、コレステロールオキシダーゼとからなるグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の過酸化水素センサ。９．前記センサは更に、前記電極の少なくとも一部を被覆し、過酸化水素を透過させる生体適合性ポリマーコーティングからなることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。１０．前記過酸化水素センサは、少なくとも５０℃の温度で動作することができ、継続動作の１時間当たりの感度の損失が５％以下であることを特徴とする請求項１に記載の過酸化水素センサ。１１．過酸化水素の電気化学分析方法であって、過酸化水素の存在下において、非腐食性電極で浸出不可能なレドックス化合物と相互固定化される耐熱性ペルオキシダーゼからなる電極によって電気信号を発生させるステップと、前記発生した電気信号と過酸化水素の存在とを過酸化水素のサンプル内にて関係づけるステップと、からなる方法。１２．分析物の測定を継続して行う方法であって、非腐食性電極で浸出不可能なレドックス化合物と相互固定化される耐熱性ペルオキシダーゼと、前記電極で固定化されており、特定の分析物の存在下において過酸化水素を発生させる反応を触媒する第２酵素と、からなるセンサを、身体流体若しくは組織の上又は中に配置するステップと、前記電極によって発生した電気信号と前記身体流体或は組織内にある前記分析物の量とを関係づけるステップと、からなる方法。１３．生体内でグルコース濃度を観測する方法であって、非腐食性電極で浸出不可能なレドックス化合物と相互固定化される耐熱性ペルオキシダーゼと、前記電極で固定化されるグルコースオキシダーゼと、からなるセンサを被験者の身体流体或は組織内に配置するステップと、前記電極によって発生した電気信号と、前記身体流体或は組織内にあるグルコースの量とを関係づけるステップと、からなる方法。１４．３７℃以上で動作するバイオリアクター内の分析物の濃度を観測する方法であって、非腐食性電極で浸出不可能なレドックス化合物と相互固定化される耐熱性ペルオキシダーゼからなるセンサを、前記バイオリアクター内に前記バイオリアクターの内容物と接触させて、配置するステップと、前記電極によって発生する電気信号と、前記バイオリアクター内の前記分析物とを関係づけるステップと、からなる方法。１５．核酸プローブとサンプルの核酸とのハイブリッド形成を検出する方法であって、非腐食性電極でサンプルの核酸を固定化するステップと、前記サンプル核酸電極を耐熱性ペルオキシダーゼと結合した核酸プローブとともにハイブリッド形成条件下に置くステップと、添加された過酸化水素の存在下で前記電極によって発生した電気信号と、前記サンプルの核酸と前記核酸プローブとのハイブリッド形成とを関係づけるステップと、からなる方法。１６．前記方法は更に、前記電極と前記耐熱性ペルオキシダーゼ核酸プローブとの電気的な接触を分断するステップを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。１７．前記分断するステップは、前記サンプル核酸電極と耐熱性ペルオキシダーゼ核酸プローブとのハイブリッド形成体を変性するステップであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．前記変性ステップは、前記サンプル核酸電極と前記耐熱性ペルオキシダーゼ核酸プローブとが置かれている条件を変化させることによって起こるステップであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。１９．サンプルの核酸の配列の組成物を分析する方法であって、非腐食性電極でサンプルの核酸を固定化するステップと、前記サンプル核酸電極を、ハイブリッド形成条件の下に、耐熱性ペルオキシダーゼと結合した核酸プローブとともに置くステップと、核酸プローブと、前記サンプルの核酸及び前記サンプルの核酸配列の組成物とのハイブリッド形成、並びに添加された過酸化水素の存在下において、前記電極によって発生する電気信号を関係づけるステップと、からなる方法。２０．サンプルの核酸の配列の組成物を分析する方法であって、非腐食性電極にサンプルの核酸を固定化するステップと、前記サンプル核酸電極を、変化するハイブリッド形成条件下に、耐熱性ペルオキシダーゼと結合した核酸プローブとともに置くステップと、核酸プローブと、前記サンプルの核酸及び前記サンプルの核酸配列の組成物とのハイブリッド形成の変化、並びに前記変化するハイブリッド形成条件下の添加された過酸化水素の存在下において、電極によって生成される電気信号の変化を関係づけるステップと、からなる方法。