CN110511913B

CN110511913B - 突变型葡萄糖氧化酶及其利用

Info

Publication number: CN110511913B
Application number: CN201910423390.6A
Authority: CN
Inventors: 早出广司; 森一茂; 小岛胜博
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2039-05-21
Also published as: US11525121B2; EP3572503B1; JP2019201637A; US10822592B2; EP3572503A1; CN110511913A; JP7290993B2; US20190359953A1; US20210009967A1

Abstract

本发明涉及突变型葡萄糖氧化酶及其利用。使用对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基而成的突变型葡萄糖氧化酶，使其藉由该具有反应性官能团的氨基酸残基结合电子受体，得到电子受体修饰葡萄糖氧化酶。

Description

突变型葡萄糖氧化酶及其利用

技术领域

本发明涉及通过在葡萄糖氧化酶中导入定点突变而赋予新功能的方法以及导入了突变的葡萄糖氧化酶。

背景技术

很早就开发出了使用葡萄糖氧化酶(GOX)的生物传感器。首先开发出了以非专利文献1为代表的被称为所谓第一代型的测定葡萄糖浓度的方法，该方法是通过将随着体系中的葡萄糖的氧化反应而发生的副反应O₂→H₂O₂的产物利用铂电极等进行氧化而测定葡萄糖浓度的方法。之后，开发出了不依赖于该不稳定的O₂或H₂O₂而在体系中添加电子受体(介质)来介导GOX与电极间的电子传递的第二代型(非专利文献2)。此外，在非专利文献3中表明，通过与石墨烯等碳纳米颗粒组合，即使不添加电子受体，也能够检测出由葡萄糖氧化反应生成的电子。

另外，发明人在非专利文献4和专利文献1中公开了被称为第2.5代型的通过对葡萄糖脱氢酶(GDH)等在分子表面进行电子受体的化学修饰而能够直接观测电子传递的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2018/062542

非专利文献

非专利文献1：Clin Chem 1978,24(1)150-152

非专利文献2：Biosensors 1989,4(2)109-119

非专利文献3：Mater Sci Eng C Mater Biol Apple 2017 Jul1；76,398-405

非专利文献4：Bioelectrochemistry 2018 Jun,121:185-190

发明内容

葡萄糖氧化酶在其热稳定性和底物特异性方面优于GDH，因此认为，若能够通过对葡萄糖氧化酶分子本身进行改造而在不向反应体系中添加游离型电子受体的情况下容易地进行电极的电子传递，则对于制作稳定且高精度的生物传感器是有用的。

但是，葡萄糖氧化酶并不容易应用于葡萄糖传感器中。即，在第一代型的传感器中，需要施加高电压，第二代型是进行电子受体的检测的系统，但存在由被测物的溶解氧浓度所带来的干扰影响，即使是第三代型的直接电子传递型传感器，也需要为了使电极容易接近酶的活性位点而进行设计，具有电极制作非常复杂、难以控制的问题。

另外，在非专利文献4和专利文献1中公开了电子受体对GDH的化学修饰，但该技术不容易应用于葡萄糖氧化酶。

本发明人为了将葡萄糖氧化酶制成可直接进行电子传递的酶，对电子受体的化学修饰进行了研究。在该研究中得到了在利用电子受体对葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中存在的侧链氨基进行随机修饰的情况下无法进行直接电子传递这样的结果，因此，从葡萄糖氧化酶的立体结构及其与GDH的结构类似性等出发，对于要利用电子受体进行修饰的氨基酸进行了详细的研究，在葡萄糖氧化酶中进行了突变导入。

其结果，为了利用电子受体对接近作为葡萄糖氧化酶的活性中心的FAD结合位点的氨基酸残基(对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基)进行修饰，将其置换成了赖氨酸残基，得到了突变型葡萄糖氧化酶。并且明确了，使所得到的突变型葡萄糖氧化酶的所导入的赖氨酸残基的侧链的氨基与电子受体通过化学修饰进行共价键合，由此得到的修饰葡萄糖氧化酶突变体具有野生型葡萄糖氧化酶所不具备的特异性电子传递能力，可知使用了该酶的酶电极能够在不从外部添加游离的电子受体的情况下应用于针对葡萄糖显示出响应的传感器。基于以上的发现完成了本发明。

本发明的要点如下所述。

[1]一种突变型葡萄糖氧化酶，其中，对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基。

[2]如[1]所述的突变型葡萄糖氧化酶，其中，在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基为赖氨酸残基。

[3]如[1]或[2]所述的突变型葡萄糖氧化酶，其具有与序列编号1～8中任一项所述的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列。

[4]如[1]～[3]中任一项所述的突变型葡萄糖氧化酶，其来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。

[5]一种电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，在[1]～[4]中任一项所述的突变型葡萄糖氧化酶上藉由上述在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基结合有电子受体。

[6]如[5]所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，电子受体为吩嗪鎓化合物。

[7]如[6]所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，吩嗪鎓化合物由下式所表示。

[化1]

R₁表示烃基，R₂表示连结基。

[8]一种酶电极，其包含基材、以及结合在该基材上的[5]～[7]中任一项所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶。

[9]一种生物传感器，其包含[8]所述的酶电极。

[10]一种电子受体修饰葡萄糖氧化酶的制造方法，其特征在于，在[1]～[4]中任一项所述的突变型葡萄糖氧化酶中藉由上述在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基导入电子受体。

发明的效果

以往，葡萄糖氧化酶作为葡萄糖测定的元件相较于GDH具有热稳定性和底物特异性的优点，而另一方面，为了利用电极检测信号，需要从外部添加作为电子受体的电子受体；可知通过使用由本发明得到的突变酶，能够在不从外部添加电子受体的情况下以仅有酶和电极的最低限度的构成来构建传感器。通过使用由本发明得到的电子受体修饰葡萄糖氧化酶，能够简便地制作稳定且底物特异性高的生物传感器。

附图说明

图1是示出使用包含将野生型GOX用PES修饰而得到的PES修饰酶的传感器的安培分析测定的结果的图。

图2是示出使用包含将I489K突变型GOX用PES修饰而得到的PES修饰酶的传感器的安培分析测定的结果的图。

图3是基于图1和图2的安培分析测定示出葡萄糖浓度与电流值的关系的图。

具体实施方式

<突变型葡萄糖氧化酶>

本发明的突变型葡萄糖氧化酶中，对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基。

这些氨基酸残基在葡萄糖氧化酶的立体结构中位于辅酶FAD的结合位点和底物口袋的附近，因而通过藉由这些氨基酸残基利用如后所述的电子受体进行修饰，葡萄糖氧化酶能够作为直接电子传递型氧化还原酶发挥出功能。

作为在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基，可以举出在侧链中具有氨基的赖氨酸、在侧链中具有羧基的谷氨酸和天冬氨酸、在侧链中具有巯基的半胱氨酸等。

序列编号1是来源于黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3株的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列(成熟型)，作为本发明的突变型葡萄糖氧化酶的一个方式，可以举出在序列编号1的氨基酸序列中489位异亮氨酸或335位精氨酸被置换成赖氨酸等在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基而得到的突变型葡萄糖氧化酶。

但是，本发明的突变型葡萄糖氧化酶中，只要序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸被置换成赖氨酸等在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基且具有葡萄糖氧化酶活性即可，序列编号1中的489位和335位以外的氨基酸也可以不必如序列编号1中所记载的那样，可以具有1个～多个氨基酸的置换、缺失、插入、添加等。此处，1个～多个例如为1个～50个、1个～20个、1个～10个或1个～5个(以下相同)。

另外，本发明的突变型葡萄糖氧化酶中，只要序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸被置换成赖氨酸等在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基且具有葡萄糖氧化酶活性即可，也可以是与序列编号1的氨基酸序列具有90％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的蛋白质。此处，氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义(以下相同)，该比例是将2个氨基酸序列按照一致的氨基酸数达到最大的方式并根据需要加入空位来进行比对时一致的氨基酸数在比对部分的全部氨基酸数中的比例。

另外，本发明的突变型葡萄糖氧化酶可以是在来源于其他生物的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基而得到的突变型葡萄糖氧化酶。

作为其他氨基酸序列，只要是葡萄糖氧化酶蛋白质的氨基酸序列且具有对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸(I489)或335位精氨酸(R335)的氨基酸残基就没有特别限制，可以举出例如下述表1所记载的序列编号2～8中的任一氨基酸序列。表1中示出了各氨基酸序列中的对应于I489和R335的氨基酸残基。

因此，作为本发明的突变型葡萄糖氧化酶的其他方式，可以举出在序列编号2～8中的任一氨基酸序列中对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基而得到的蛋白质。

此外，本发明的突变型葡萄糖氧化酶中，只要对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基被置换成赖氨酸残基且具有葡萄糖氧化酶活性即可，也可以是在序列编号2～8中的任一氨基酸序列中具有1个或多个氨基酸的置换、缺失、插入、添加等的氨基酸序列、或者与序列编号2～8中的任一氨基酸序列具有90％以上、95％以上或98％以上的序列同一性的蛋白质。

[表1]

需要说明的是，作为“对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基”，可以通过序列编号1的氨基酸序列与对象氨基酸序列的比对来确定。

表2和表3中示出了比对的一例。

其中，箭头分别表示“对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸的氨基酸残基”、“对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的335位精氨酸的氨基酸残基”。

需要说明的是，这些表中，P13006.1为1CF3的前体的序列，AAD01493.1为1GPE的前体的序列。

对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸的氨基酸残基是下述氨基酸序列基序中的对应于X₂的氨基酸，也可以根据对象氨基酸序列中的该基序的存在来确定。

Glu-X₁-X₂-Pro-Gly

具体地说，在序列编号2中为V511、序列编号3中为T517、序列编号4中为I512、序列编号5中为L493、序列编号6中为I512、序列编号7中为I509、序列编号8中为I510。

对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的335位精氨酸的氨基酸残基是下述的氨基酸序列基序中的对应于X的氨基酸，也可以根据对象氨基酸序列中的该基序的存在来确定。

TT(A/T)TVXS(R/A)(I/A)(T/S)

具体地说，在序列编号2中为R357、序列编号3中为A363、序列编号4中为R358、序列编号5中为S339、序列编号6中为R358、序列编号7中为R355、序列编号8中为R357。

本发明的突变型葡萄糖氧化酶维持了葡萄糖氧化酶活性。

此处，“葡萄糖氧化酶活性”是指通过使用氧作为电子受体而催化葡萄糖的氧化、生成葡糖酸内酯的酶活性。葡萄糖氧化酶活性例如也可以如后述实施例那样使用MTT和PMS等电子受体代替作为底物的葡萄糖和氧来进行测定。

需要说明的是，维持葡萄糖氧化酶活性例如可以如下定义：突变型葡萄糖氧化酶的葡萄糖氧化酶活性为野生型的10％以上、20％以上或50％以上。本发明的突变型葡萄糖氧化酶可以通过定点突变导入法等公知的基因重组法来制作。即，可以获得编码葡萄糖氧化酶的DNA，使用突变导入用引物等定点地导入突变，使所得到的DNA在适当的宿主中表达，由此产生突变型葡萄糖氧化酶，根据需要进行纯化，由此得到本发明的突变型葡萄糖氧化酶。

编码葡萄糖氧化酶的DNA例如可以由黑曲霉等所期望的基因源通过PCR等方法来获得。PCR用引物可以通过基于公知的碱基序列进行化学合成来制备。另外，也可以通过以基于公知的碱基序列制作的寡核苷酸作为探针的杂交来获得。

作为编码本发明的突变型葡萄糖氧化酶的基因(突变型GOX基因)，只要具有与上述突变型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列相对应的碱基序列即可，作为具体例，可以举出包含在序列编号9的碱基序列中具有与上述氨基酸置换相对应的密码子置换的碱基序列的DNA。另外，突变型GOX基因可以为具有序列编号9的碱基序列的DNA、或者与由该序列制备得到的探针在严格条件下杂交且编码具有葡萄糖氧化酶活性的蛋白质的DNA。

作为上述严格条件，可以举出具有优选为80％、更优选为90％以上、特别优选为95％以上的同一性的DNA彼此杂交的条件，具体地说，可以举出在0.1×SSC、0.1％SDS、60℃下进行清洗的条件。

将所得到的DNA重组到可在宿主细胞中发挥功能的载体中，利用该载体转化宿主细胞，使DNA进行表达，由此可以生产突变型葡萄糖氧化酶。

葡萄糖氧化酶基因的获得、突变的导入、基因的表达等中使用的载体可以根据宿主适当选择，例如作为在埃希氏菌属细菌中发挥功能的载体，具体而言，可以举出pTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122、pET等。基因的表达中使用的启动子也可以根据宿主适当选择，例如作为在埃希氏菌属细菌中发挥功能的启动子，可以举出lac、trp、tac、trc、PL、tet等。

为了利用重组载体转化宿主细胞，例如可以举出基于钙处理的感受态细胞法、脂质体转染法、原生质体法或电穿孔法等。

作为宿主细胞，可以举出埃希氏菌属细菌等肠内细菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等芽胞杆菌属细菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母、黑曲霉(Aspergillus niger)等丝状菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞等，但并不限于这些，只要是适于异种蛋白质生产的宿主细胞即可使用。

可以将宿主细胞在适当的条件下培养，以重组蛋白质的形式生产突变型葡萄糖氧化酶。突变型葡萄糖氧化酶的纯化可以利用柱色谱等公知的方法进行。另外，在突变型葡萄糖氧化酶包含纯化用的标签序列的情况下，也可以利用针对该标签的亲和色谱等进行纯化。

<利用电子受体进行的修饰>

本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶是在上述突变型葡萄糖氧化酶上藉由上述在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基结合电子受体而成的。

此处，电子受体只要是从氧化还原酶接受电子而被还原、在电极上再次被氧化、且不具有催化作用的化合物即可，例如可以举出吩嗪鎓化合物、二茂铁、醌化合物(例如1,4-萘醌、2-甲基-1,4-萘醌、9,10-菲醌、1,2-萘醌、2,5-二甲基对苯醌、甲基苯醌、2,6-二甲基苯醌、1,2-萘醌-4-磺酸钠、1,4-蒽醌、9,10-蒽醌、四甲基苯醌、百里醌)、苯二胺化合物(例如N,N-二甲基-1,4-苯二胺、N,N,N’,N’-四甲基-1,4-苯二胺二盐酸盐)、辅酶Q0、AZURE A氯化物、酚藏花红、6-氨基喹喔啉、甲苯胺蓝、四硫富瓦烯等。

吩嗪鎓化合物例如可以举出如下所示的化合物，具体地说，可以例示5-甲基吩嗪鎓、5-乙基吩嗪鎓)。

[化2]

R₁表示烃基，可以为饱和烃基、可以为不饱和烃基、也可以为芳香族烃基。烃基的碳原子数例如为1～10。

R₂表示连接吩嗪鎓骨架与葡萄糖氧化酶的侧链的连结基，例如可例示可以在主链或侧链中包含氧原子、硫原子或氮原子等杂原子的亚烷基或亚烯基。连结基的主链的原子数例如为1～20、或1～10。需要说明的是，连结基在末端包含与葡萄糖氧化酶的侧链结合时的残基。

本发明提供一种电子受体修饰葡萄糖氧化酶的制造方法，其特征在于，在上述突变型葡萄糖氧化酶中藉由上述在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基导入电子受体。由此，能够使电子受体与葡萄糖氧化酶结合，得到修饰酶。

为了利用电子受体对葡萄糖氧化酶进行修饰，例如可例示下述方法：在如上所述的电子受体中导入琥珀酰亚胺等官能团，使其与导入到突变型葡萄糖氧化酶中的赖氨酸残基的侧链氨基反应，由此进行修饰。

还可例示下述方法：在如上所述的电子受体中导入马来酰亚胺等官能团，使其与导入到突变型葡萄糖氧化酶中的半胱氨酸残基的侧链巯基反应，由此进行修饰。

此外还可例示下述方法：在如上所述的电子受体中导入噁唑啉等官能团，使其与导入到突变型葡萄糖氧化酶中的谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链羧基反应，由此进行修饰。

需要说明的是，也可以另外使用交联剂。

例如，在用PES修饰的情况下，可例示下述方法：使如下所述的在PES中导入有NHS基的化合物与导入到突变型葡萄糖氧化酶中的赖氨酸残基的侧链氨基反应，由此进行修饰。

例如，可以使酶与电子受体的比例为1：500～1：10000来进行修饰反应。

[化3]

需要说明的是，在野生型葡萄糖氧化酶本来就具有在侧链中具有反应性官能团的氨基酸残基作为对应于序列编号1所记载的氨基酸序列的489位异亮氨酸或335位精氨酸的氨基酸残基的情况下，可以在不导入突变的情况下利用电子受体进行修饰。

<生物传感器>

通过使本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶与电极基材结合，可以得到直接电子传递型的酶电极，这样的酶电极可以用作葡萄糖传感器等生物传感器的构成要素。

作为电极基材，可以使用金属电极或碳电极，这些电极可以通过在绝缘性基板的表面上设置金属层或碳层而制作。

此处，直接电子传递型的酶电极是指能够在不使用游离的电子受体的情况下将由酶反应产生的电子传递至电极的电极。

结合有本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶的酶电极可以利用公知的方法制作，作为一例，如下进行制作。

首先，在绝缘性基板的单面上形成作为电极发挥功能的金属层。例如，在规定厚度(例如100μm左右)的膜状的绝缘性基板的单面上，通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)将金属材料成膜，由此形成具有所期望的厚度(例如30nm左右)的金属层。也可以形成由碳材料形成的电极层来代替金属层。

在这样得到的电极层的表面涂布电子受体修饰葡萄糖氧化酶的溶液，使其干燥，由此能够使电子受体修饰葡萄糖氧化酶结合在电极表面。

另外，也可以将本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶固定在电极表面。

将电子受体修饰葡萄糖氧化酶固定在电极表面的方法没有特别限制，可例示使用导电性聚合物或交联剂的方法、使用单分子膜形成分子的方法。

例如，在使用单分子膜形成分子的情况下，如日本特开2017-211383所公开，首先使单分子膜形成分子结合在电极上。之后，使单分子膜形成分子的反应性官能团与葡萄糖氧化酶的氨基或羧基等反应，由此可以藉由单分子膜形成分子将葡萄糖氧化酶固定在电极上。

另外，在利用导电性聚合物或交联剂将酶固定在电极上的情况下，例如，可以如WO2014/002999或日本特开2016-121989等所记载，通过在电极上添加葡萄糖氧化酶以及导电性聚合物、交联剂等试剂来制作酶电极。

作为葡萄糖传感器，可以举出使用如上所述的在电极表面结合有本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶的酶电极作为工作电极的葡萄糖传感器。传感器是指对目标待测物质的浓度进行电化学测定的测定系统，通常包含工作电极(酶电极)、对电极(铂等)和参比电极(Ag/AgCl等)这3个电极。或者也可以是在惯用的简易血糖值系统中所使用的那样由工作电极和对电极构成的2电极系统。传感器优选进一步包含加入缓冲液和待测试样的恒温池、对工作电极施加电压的电源、电流计、记录仪等。传感器可以是间歇型也可以是流动型。特别是作为流动型的传感器，可以是能够连续测量血糖值的传感器。即，可以是在连续供给的血液试样或连续供给的透析试样、或者血液中或细胞间质液中插入结合有本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶的二电极系统或三电极系统来进行测量的传感器。这样的酶传感器的结构在该技术领域中是熟知的，例如记载于Biosensors-Fundamental and Applications(生物传感器基础和应用)-Anthony P.F.Turner,Isao Karube and Geroge S.Wilson，牛津大学出版社1987中。

葡萄糖的浓度的测定可以如下进行。在传感器的恒温池中加入缓冲液，维持在一定温度。作为工作电极，使用结合有本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶的酶电极，作为对电极，例如使用铂电极，作为参比电极，例如使用Ag/AgCl电极。对工作电极施加一定的电压，在电流达到稳定后，向恒温池中加入包含葡萄糖的试样，测定电流的增加。根据利用标准浓度的葡萄糖溶液制作出的校准曲线，可以计算出试样中的葡萄糖浓度。

本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶还可以用作葡萄糖检测试剂盒的构成要素。在葡萄糖检测试剂盒中，除了包含本发明的电子受体修饰葡萄糖氧化酶以外，还可以包含显色或发光试剂、稀释用缓冲液、标准物质、使用说明书等。

[实施例]

下面举出实施例进一步具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

[突变导入]

将人工合成的野生型黑曲霉1CF3的结构基因插入到pET30c载体中，构建作为野生型1CF3表达载体的pET30c 1CF3 WT。将其作为模板，按照489位异亮氨酸被置换成赖氨酸的方式进行定点突变导入。具体地说，使用市售的定点突变导入试剂盒(Stratagene公司，QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit(定点突变试剂盒))，按照上述pET30c1CF3 WT所含有的1CF3结构基因中489位异亮氨酸被置换成赖氨酸的方式进行密码子改造。利用这样构建的pET30c 1CF3 I489K和pET30c 1CF3 WT分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到突变型1CF3或野生型1CF3表达大肠杆菌。

[突变酶的制作方法]

1.将大肠杆菌BL21(DE3)/pET30c 1CF3 WT,I489K在3mL的LB培养基(卡那霉素终浓度50μg/mL)中在37℃、需氧条件下预培养12小时，接种到100mL的上述LB培养基中之后，在达到OD660＝0.6的时刻进行IPTG诱导(终浓度0.5mM)，在20℃振荡培养24小时。集菌后，将湿菌体再悬浮于20mM P.P.B(pH7.0)中，进行超声波破碎，通过离心分离(10000g、4℃、20分钟)得到水溶性级分和不溶性级分。

2.将不溶性级分悬浮在1mL的清洗缓冲液1(100mM NaCl、1mM EDTA、1％TritonX；20mM Tris-HCl(pH8.0))中，在1500rpm、4℃下温育1小时后，进行离心分离(10000g、4℃、10分钟)。

3.对于所得到的不溶性级分，继续使用清洗缓冲液2(100mM NaCl、1mM EDTA；20mMTris-HCl(pH8.0))、清洗缓冲液3(2M尿素；20mM Tris-HCl(pH8.0))进行同样的操作。

4.将样品悬浮在0.75mL的裂解缓冲液(8M尿素、30mM二硫苏糖醇；20mM Tris-HCl)中，在1500rpm、4℃下温育4小时后进行离心分离(10000g、4℃、10分钟)，将所得到的溶解包涵体级分用重折叠缓冲液(1mM还原型谷胱甘肽、1mM氧化型谷胱甘肽、黄素腺嘌呤二核苷酸、10％甘油；20mM P.P.B(pH7.5))稀释至终浓度达到0.05mg/mL，在10℃静置96小时。

5.将样品使用Amicon Ultra 30 K(Merk Millipore)通过超滤进行浓缩(约100倍浓缩)。将浓缩后试样在20mM乙酸Na(pH5.0)中透析12小时、在20mM P.P.B(pH7.0)中透析24小时，之后进行离心分离(20000g、4℃、5分钟)，将上清作为纯化酶。

[电子受体的化学修饰]

关于arPES修饰，使用50mM Tricine(pH8.3)作为缓冲液，制备纯化酶(突变型I489K或野生型WT)与arPES的摩尔比为1：500、1：1000、1：5000、1：10000的4种反应溶液，在1200rpm、25℃下振荡2小时。为了进行缓冲液交换，将各样品使用Amicon Ultra 30 K进行超滤(14000g、4℃、5分钟)，将浓缩后的样品用20mM P.P.B稀释，将该操作重复进行10次。突变型藉由489位和其以外的天然侧链氨基进行PES修饰，与之相对，野生型藉由天然侧链氨基进行PES修饰。

[化4]

[酶活性测定]

酶活性评价对于修饰酶和未修饰酶在PMS存在下或非存在下进行。

通过观测565nm处的吸光度的经时变化来测定由arPES或PMS所致的MTT的还原反应。关于反应条件，只要没有特别说明，在以下条件下进行。

通过将底物加入到包含酶溶液的反应溶液(200μL；20mM PPB(pH7.0)+1.0mM MTT、浓度全部为终浓度)中而开始反应，测定565nm的吸光度变化。(加入PMS的情况下，终浓度设定为0.6mM。)底物使用终浓度100mM葡萄糖，设使1μmol的MTT还原的酶量为1单位，由下式计算出活性值。MTT在pH7.0的摩尔吸光系数设定为20mM^-1cm^-1。

[数1]

单位/ml＝△ABS/分钟×l/20^*1×40^*2

*1：MTT在pH7.0的摩尔吸光常数

*2：反应溶液中的酶溶液的稀释倍率

将结果示于表4。

对于野生型的修饰后样品，未观察到在MTT系统中的脱氢酶活性，因此表明在野生型中修饰后的arPES未进行电子转移。另一方面，突变体修饰后，任一浓度比的样品在MTT系统中均观察到活性，因此表明修饰后的arPES进行了电子转移。表明修饰时的浓度比在活性最高的1：1000时是最佳的。上述内容提示，在葡萄糖氧化酶中，修饰在第489位所置换的赖氨酸残基上的arPES担负着电子传递。

[表4]

将突变型(I489K)或野生型(WT)GOX用PES修饰后的PES修饰GOX的活性

[传感器制作和葡萄糖浓度测定]

1.制作酶浆(enzyme ink)(0.78mg/ml GOX、0.4％KJB储液(导电性炭黑：LIONSpecialty Chemicals)、3％Epocros(含噁唑啉基的水溶性聚合物：日本触媒)、0.5％海藻糖)。

需要说明的是，作为酶，分别使用野生型GOX(1CF3WT)、突变型GOX(1CFI489K)、arPES修饰野生型GOX(arPES-WT)、arPES修饰突变型GOX(arPES-I489K)。

2.将上述混合浆在碳印刷电极上点布160nL，将其干燥，在100℃进行2小时热处理。

3.传感器设定为3电极系统(WE：SPCE/酶浆、CE：碳印刷、RE：Ag/AgCl)，在0mVvs.Ag/AgCl、25℃下以Glu0mg/dL、50mg/dL、100mg/dL、300mg/dL、600mg/dL进行安培分析测定。

将结果示于图1～3。

在图1的具有对野生型1CF3进行了PES修饰(arPES-WT)的电极的传感器中，未能检测出依赖于葡萄糖浓度的电流，但在图2的具有对突变型1CF3进行了PES修饰(arPES-I489K)的电极的传感器中，能够检测出葡萄糖浓度依赖性的电流。

序列表

<110> 爱科来株式会社(Arkray, Inc.)

究极酵素国际股份有限公司(Ultizyme International Ltd.)

<120> 突变型葡萄糖氧化酶及其利用(Mutant Glucose Oxidase and Use Thereof)

<130> OP-19032

<150> JP2018-098011

<151> 2018-05-22

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 583

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

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Asp Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp

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<212> PRT

<213> 波兰青霉(Penicillium polonicum)

<400> 2

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275 280 285

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Glu His Ser Gly Val Gly Leu Lys Thr Val Leu Asp Lys Val Gly Val

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Gln Ala Ala Tyr Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Gln Ala

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<211> 614

<212> PRT

<213> 波兰青霉(Penicillium polonicum)

<400> 3

Met Lys Ser Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Ile Ser Val Ala Ala Ser

1 5 10 15

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<400> 4

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595 600 605

<210> 5

<211> 587

<212> PRT

<213> 尼崎青霉(Penicillium amagasakiense)

<400> 5

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<210> 6

<211> 606

<212> PRT

<213> 红绶曲霉(Aspergillus nomius) NRRL 13137

<400> 6

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165 170 175

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210 215 220

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245 250 255

Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu His Val Leu Thr Gly Gln Ile

260 265 270

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275 280 285

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325 330 335

Ile Thr Gln Leu Ile Glu Leu Pro Val Gly Leu Asn Met Gln Asp Gln

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asn Glu Asp Val Ala

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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485 490 495

Leu Gln Asn Ser Gly Glu Met Ser Asn Tyr Phe Asp Gly Glu Asp Ile

500 505 510

Pro Gly Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Asn Ala Thr Leu Asp Asp Trp Val

515 520 525

Gly Tyr Val Lys Gln Asn Phe Arg Ala Asn Trp His Ala Val Ser Thr

530 535 540

Cys Ser Met Met Ser Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Pro Thr Ala

545 550 555 560

Lys Val Tyr Gly Thr Leu Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Val Ser

565 570 575

Pro Thr Gln Val Ser Ser His Val Met Thr Ile Phe Tyr Gly Met Ala

580 585 590

Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu Ala Asp Tyr Asn Lys Ser

595 600 605

<210> 7

<211> 602

<212> PRT

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana) D1-5

<400> 7

Met Arg Phe Phe Ile Tyr Cys Gly Trp Leu Leu Ala Thr Thr Gly Ala

1 5 10 15

Tyr Leu Val Ser Glu Gln Val Asp Ile Gln Ala Ser Leu Leu Ile Asp

20 25 30

Pro Lys Asp Val Ala Asp Lys Thr Phe Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly

35 40 45

Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Thr Glu Asn Pro Asn

50 55 60

Ile Glu Val Leu Val Ile Glu Ala Gly Phe Tyr Glu Ser Asn Ser Gly

65 70 75 80

Pro Val Ile Glu Asn Pro Asn Arg Tyr Gly Glu Val Phe Gly Thr Thr

85 90 95

Val Asp His Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg Thr Asp

100 105 110

Asn Ile Lys Ala Gly Lys Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly

115 120 125

Asn Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp Glu Lys

130 135 140

Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Thr Trp Asp Asn Ile Phe Pro Tyr Met

145 150 155 160

Asn Arg Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Thr Ala Val Gln Val Ala Ala

165 170 175

Gly His Ser Phe Asp Pro Ala Cys His Gly Phe Asn Gly Thr Val His

180 185 190

Ser Gly Pro Arg Asp Asn Gly Gln Pro Trp Ser Pro Leu Met Lys Ala

195 200 205

Leu Met Asn Thr Thr Ser Ala Leu Gly Ala Pro Thr Gln Val Asp Phe

210 215 220

Asn Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met Ile Pro Asn Asn Leu Leu

225 230 235 240

Glu Asp Gln Val Arg Ala Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn

245 250 255

Tyr Arg Arg Lys Asn Leu Lys Val Leu Thr Gly His Ala Val Gly Lys

260 265 270

Val Leu Phe Asp Gln Lys Ala Pro Ile Leu Lys Ala Ile Gly Val Asn

275 280 285

Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asn Ala Tyr Thr Lys His Glu

290 295 300

Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ser Ile Ser Pro Leu Ile Leu Glu Tyr

305 310 315 320

Ser Gly Ile Gly Leu Lys Ser Val Leu Asp Lys Ala Asn Val Thr Gln

325 330 335

Leu Val Glu Leu Pro Val Gly Ile Asn Met Gln Asp Gln Thr Thr Thr

340 345 350

Thr Val Arg Ala Arg Ser Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala

355 360 365

Ile Tyr Phe Ala Asn Phe Thr Glu Thr Phe Gly Glu Asp Ile Ala Tyr

370 375 380

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385 390 395 400

Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Val Gln Tyr

405 410 415

Glu Asn Cys Arg Asp Trp Leu Leu His Glu Asp Val Ala Tyr Ala Glu

420 425 430

Leu Phe Leu Asp Thr Ser Gly Gln Ile Asn Phe Asp Leu Trp Asp Leu

435 440 445

Ile Pro Phe Thr Arg Gly Ser Thr His Ile Leu Ser Ser Glu Pro Tyr

450 455 460

Arg Trp Gln Phe Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Phe Asn Glu Leu Asp

465 470 475 480

Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Arg Leu Ala Arg Lys Leu Gln Asn

485 490 495

Ser Gly Ala Met Ala Ser Tyr Phe Asp Gly Glu Val Ile Pro Gly Ala

500 505 510

Glu Val Pro Glu Asp Ala Thr Leu Gly Gln Trp Ala Glu Tyr Val Lys

515 520 525

Asp Asn Phe Arg Ala Asn Trp His Ala Val Gly Thr Cys Ser Met Met

530 535 540

Ser Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Ala Ala Lys Val Tyr Asp

545 550 555 560

Thr Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Val

565 570 575

Ser Ser His Val Met Thr Ile Phe Tyr Gly Met Ala Leu Arg Ile Ala

580 585 590

Glu Ser Ile Leu Glu Asp Tyr Ala Lys Ser

595 600

<210> 8

<211> 604

<212> PRT

<213> 威斯康星产红青霉(Penicillium rubens Wisconsin) 54-1255

<400> 8

Met Lys Ser Thr Ile Ile Thr Ser Ile Leu Phe Ser Val Ala Ala Val

1 5 10 15

Gln Ala Tyr Ser Pro Ala Glu Gln Ile Asp Val Gln Ser His Leu Leu

20 25 30

Ser Asp Pro Thr Lys Val Glu Gly Glu Thr Tyr Asp Tyr Val Ile Ala

35 40 45

Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Pro Lys Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Asn

65 70 75 80

Asp Gly Pro Ile Ile Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Phe Gly

85 90 95

Thr Ser Val Asp Gln Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu Ile Asn Asn Arg

100 105 110

Thr Gly Glu Ile Lys Ser Gly Leu Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile

115 120 125

Asn Gly Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gln Ile Asp Ser Trp

130 135 140

Glu Lys Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Phe Gln

145 150 155 160

Tyr Met Gln Lys Ala Glu Arg Ser Arg Pro Pro Thr Ala Ala Gln Ile

165 170 175

Glu Ala Gly His Phe Tyr Asp Pro Ala Cys His Gly Thr Asp Gly Thr

180 185 190

Val His Ala Gly Pro Arg Asp Asn Gly Lys Pro Trp Ser Pro Leu Met

195 200 205

Arg Ala Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Phe Gly Val Pro Val Gln Lys

210 215 220

Asp Phe His Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met Ile Pro Asn Asn

225 230 235 240

Leu His Glu Asn Gln Ile Arg Ala Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu

245 250 255

Pro Asn Tyr Gln Arg Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Gly Gln Lys Val

260 265 270

Gly Lys Val Leu Phe Asn Gln Thr Ala Ser Gly Pro Lys Ala Val Gly

275 280 285

Val Asn Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asn Val Tyr Ala Lys

290 295 300

Gln Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ser Pro Leu Ile Leu

305 310 315 320

Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Ile Lys Ser Val Leu Asp Lys Ala Gly Val

325 330 335

Lys Gln Leu Leu Glu Leu Pro Val Gly Leu Asn Met Gln Asp Gln Thr

340 345 350

Thr Thr Thr Val Arg Ser Arg Ala Asn Asn Ala Pro Gly Gln Gly Gln

355 360 365

Ala Ala Tyr Phe Ala Asn Phe Thr Glu Val Leu Gly Asp His Ala Ala

370 375 380

Gln Gly Ile Lys Leu Leu Asp Thr Lys Leu Asp Gln Trp Ala Glu Glu

385 390 395 400

Thr Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Ile Gln

405 410 415

Tyr Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Asp Thr Glu Gly Lys Ile Asn Phe Asp Ile Trp Asn

435 440 445

Leu Ile Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His Ile Leu Ser Ser Asp Pro

450 455 460

Tyr Leu Trp Gln Tyr Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Met Asn Glu Leu

465 470 475 480

Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Lys Leu Gly Arg Glu Leu Ser

485 490 495

Ser Ala Gly Glu Met Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly

500 505 510

Asp Asn Leu Pro Gln Asp Ala Thr Val Glu Gln Trp Glu Asp Tyr Val

515 520 525

Met Met Asn Phe Arg Pro Asn Trp His Ala Val Ser Thr Cys Ser Met

530 535 540

Met Ser Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln

565 570 575

Val Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Gly Met Ala Leu Arg Ile

580 585 590

Ala Glu Ser Val Leu Glu Asp Tyr Ala Lys Lys Ala

595 600

<210> 9

<211> 1770

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 9

ctgccacact acatcaggag caatggcatt gaagccagcc tcctgactga tcccaaggat 60

gtctccggcc gcacggtcga ctacatcatc gctggtggag gtctgactgg actcaccacc 120

gctgctcgtc tgacggagaa ccccaacatc agtgtgctcg tcatcgaaag tggctcctac 180

gagtcggaca gaggtcctat cattgaggac ctgaacgcct acggcgacat ctttggcagc 240

agtgtagacc acgcctacga gaccgtggag ctcgctacca acaatcaaac cgcgctgatc 300

cgctccggaa atggtctcgg tggctctact ctagtgaatg gtggcacctg gactcgcccc 360

cacaaggcac aggttgactc ttgggagact gtctttggaa atgagggctg gaactgggac 420

aatgtggccg cctactccct ccaggctgag cgtgctcgcg caccaaatgc caaacagatc 480

gctgctggcc actacttcaa cgcatcctgc catggtgtta atggtactgt ccatgccgga 540

ccccgcgaca ccggcgatga ctattctccc atcgtcaagg ctctcatgag cgctgtcgaa 600

gaccggggcg ttcccaccaa gaaagacttc ggatgcggtg acccccatgg tgtgtccatg 660

ttccccaaca ccttgcacga agaccaagtg cgctccgatg ccgctcgcga atggctactt 720

cccaactacc aacgtcccaa cctgcaagtc ctgaccggac agtatgttgg taaggtgctc 780

cttagccaga acggcaccac ccctcgtgcc gttggcgtgg aattcggcac ccacaagggc 840

aacacccaca acgtttacgc taagcacgag gtcctcctgg ccgcgggctc cgctgtctct 900

cccacaatcc tcgaatattc cggtatcgga atgaagtcca tcctggagcc ccttggtatc 960

gacaccgtcg ttgacctgcc cgtcggcttg aacctgcagg accagaccac cgctaccgtc 1020

cgctcccgca tcacctctgc tggtgcagga cagggacagg ccgcttggtt cgccaccttc 1080

aacgagacct ttggtgacta ttccgaaaag gcacacgagc tgctcaacac caagctggag 1140

cagtgggccg aagaggccgt cgcccgtggc ggattccaca acaccaccgc cttgctcatc 1200

cagtacgaga actaccgcga ctggattgtc aaccacaacg tcgcgtactc ggaactcttc 1260

ctcgacactg ccggagtagc cagcttcgat gtgtgggacc ttctgccctt cacccgagga 1320

tacgttcaca tcctcgacaa ggacccctac cttcaccact tcgcctacga ccctcagtac 1380

ttcctcaacg agctggacct gctcggtcag gctgccgcta ctcaactggc ccgcaacatc 1440

tccaactccg gtgccatgca gacctacttc gctggggaga ctatccccgg tgataacctc 1500

gcgtatgatg ccgatttgag cgcctggact gagtacatcc cgtaccactt ccgtcctaac 1560

taccatggcg tgggtacttg ctccatgatg ccgaaggaga tgggcggtgt tgttgataat 1620

gctgcccgtg tgtatggtgt gcagggactg cgtgtcattg atggttctat tcctcctacg 1680

caaatgtcgt cccatgtcat gacggtgttc tatgccatgg cgctaaaaat ttcggatgct 1740

atcttggaag attatgcttc catgcagtga 1770

Claims

1.一种突变型葡萄糖氧化酶，其由序列编号1所记载的氨基酸序列中489位异亮氨酸残基被置换成赖氨酸残基而得到的氨基酸序列构成。

2.如权利要求1所述的突变型葡萄糖氧化酶，其中，所述突变型葡萄糖氧化酶来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。

3.一种电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，在权利要求1或2所述的突变型葡萄糖氧化酶上藉由所述赖氨酸残基结合有电子受体。

4.如权利要求3所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，电子受体为吩嗪鎓化合物。

5.如权利要求4所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶，其中，吩嗪鎓化合物由下式所表示，

[化1]

式中，R₁表示烃基，R₂表示连结基。

6.一种酶电极，其包含基材、以及结合在该基材上的权利要求3～5中任一项所述的电子受体修饰葡萄糖氧化酶。

7.一种生物传感器，其包含权利要求6所述的酶电极。

8.一种电子受体修饰葡萄糖氧化酶的制造方法，其特征在于，在权利要求1或2所述的突变型葡萄糖氧化酶中藉由所述赖氨酸残基导入电子受体。