CN1229139A - 葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码葡萄糖氧化酶(GO)基因的DNA序列及其在培育抗病转基因植物中的应用,包括含有GO DNA序列的植物表达载体,由表达载体转化的植物细胞,以及由转化细胞产生的对病原菌表现高抗性的转基因植物及其后代,包括植物种子、整体植物或植物体的部分或组织器官。除生产抗病转基因植物外,本发明还适用于生产工业和医用葡萄糖氧化酶的其它各种生物表达系统,例如但不仅限于植物、昆虫、酶母或细菌表达系统。

Description

葡萄糖氧化酶基因在培育抗病基因植物中的应用

本发明涉及编码葡萄糖氧化酶(GO)基因的DNA序列及其在培育抗病转基因植物中的应用，包括含有GO DNA序列的植物表达载体，由表达载体转化的植物细胞，以及由转化细胞产生的对病原菌表现高抗性的转基因植物及其后代，包括植物种子、整体植物或植物体的部分或组织器官。

细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到了很大限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。

植物在接受到病原物的信号(Elicitor)后，导致受侵染部位组织的快速死亡，称为超敏反应(Hypersensitive response，HR)，使病原物失去营养供给，并将病原物限制在最小范围内。寄主植物启动自身的防卫系统，如合成纤维素、木质素和结构蛋白加固细胞壁，合成植保素和抗菌蛋白及酚类化合物的氧化(Hahlbrock &Scheel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40：347-369，1989)、防卫基因的表达(Bowles，Annu.Rev.Biochem.59：873-907，1990；Dixon & Harrison，Adv.Genet.28：165-234，1990)、受侵染细胞的过敏性死亡(Keen，Plant Mol.Biol.19：109-122，1992)以及最终诱导系统获得性抗性(Chen et al.，Science 162：1883-1886，1993)。所有这些反应都与植物-病原互作中早期活性氧类(active oxygen species，AOS)的快速合成有关。在氧化激增(Oxidative burst)过程中产生的AOS，如超氧离子(O₂ ^-)、羟自由基(OH·)、过氧化氢(H₂O₂)，不仅具有直接杀伤病原菌的作用，而且对激发植物的防卫体系具有重要作用。

葡萄糖氧化酶(GO)催化β-D-葡萄糖+O₂→葡萄糖酸+H₂O₂，由Muller(1928)首次报道。后来Kim等(Can.J.Microbiol.36：199-205，1989)发现用于防治土传病害的生防菌Talaromycesflavus的主要抗菌机制是通过GO产生H₂O₂。现已从Talaromycesflavus、Penicillium notatum、P.amagasakiense和黑曲霉(Aspergillus niger)中纯化出了GO(Swobada & Massey，J.Biol.Chem.240：2209-2215，1965)。其中，A.niger是GO活性较强的一基酸，22个前导肽，8个糖基化位点，16％的碳水化合物，包括种真菌。黑曲霉GO为一个二聚体，每个亚基70kd，含583个氨甘露糖、半乳糖、氨基葡萄糖，及1分子的辅酶FAD。FAD的结合改变了GO的构型，使焦磷酸区不再处于酶的表面。GO除了以葡萄糖作为底物外，还催化2-脱氧-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖的氧化，但对后三者的活性较低。

由于碳水化合物的作用，赋予GO一定的特性，如100℃不沉淀、0.75％SDS溶液中稳定、5％三氯乙酸缓慢沉淀、水溶性好、高盐环境下沉淀等。

GO在食品保鲜方面有着广泛的应用，牛奶中加入0.1U/ml的GO及0.3mg/ml的葡萄糖可抑制牛奶中荧光假单孢菌(Pseudomonasfluorescens)的繁殖。目前在斯里兰卡、巴基斯坦、肯尼亚等发展中国家有大量应用。另外，还有将GO加入牙膏以防止蛀牙的报道。

H₂O₂不仅能够直接杀死病原菌(Peng & Kuc，Phytopathol.82：696-699，1992)，还可通过诱导细胞壁结构蛋白的氧化交联阻止病菌的侵入(Bradley et al.，Cell 70：21-30，1992；Brisson etal.，Plant Cell 6：1703-1712，1994)及通过激活水杨酸合成以诱导防卫基因的表达，使植物产生系统获得性抗性(Leon et al.，PlantPhysiol.108：1673-1678，1995；Chen et al.，Science162：1883-1886，1993)。用悬浮细胞试验，H₂O₂能激活植保素的合成(Apostol et al.，Plant Physiol.90：109-116，1989；Davis et al.，Phytochem.32：607-611，1993；Degousee et al.，Plant Physiol.104：945-952，1994)。在近来的研究中，还发现在不亲和的植物-病原互作中氧化激增产生的H₂O₂不仅可作为区域信号导致细胞死亡，而且还可作为扩散信号诱导周围未侵染细胞中防卫基因如谷胱甘肽S转移酶基因的表达(Levine et al.，Cell 79：583-593，1994)。葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖的氧化，生成葡萄糖酸并产生H₂O₂，目前已在数种细菌和真菌中检测到GO的存在，但在植物和动物中仍未发现。

本发明的目的是通过从黑曲霉基因组中克隆葡萄糖氧化酶基因，构建植物表达载体并转入植物，以增强植物的抗病性。

本发明克隆了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明涉及编码葡萄糖氧化酶或其部分的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列及其功能等同的序列。

按照本发明的核苷酸序列，其编码具有如SEQ ID NO：2所示的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列或其部分及其它功能等同的蛋白质。

本发明还涉及适于在植物细胞中表达如上所述的核苷酸序列的重组表达载体。

按照本发明以上所述的重组表达载体，其中包含的葡萄糖氧化酶基因表达盒包括：

a)5′端非编码区；

b)如上所述的核苷酸序列；

c)3′端非编码区。

按照本发明所述的的重组表达载体，其中a)所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成；b)所说的3’端非编码区包含一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。

本发明还涉及含有如上所述的核苷酸序列的任何转基因植物。

按照本发明所述的转基因植物，为抗真菌和细菌病害的转基因植物。

按照本发明所述的转基因植物，其中的转基因植物可以是任何一种单子叶植物或双子叶植物的完整植株或部分、种子及其后代。

按照本发明所述的转基因植物，其中所说的植物包括由转基因植物作为亲本杂交或转育所产生的植物。

本发明的核苷酸序列及其功能等同的序列在生产工业及医用葡萄糖氧化酶的各种生物表达系统中的应用，其中的一个优选实施方案为在大肠杆菌中表达葡萄糖氧化酶基因。

根据本发明的上述应用，其中的生物表达系统可以是植物、昆虫、酵母或细菌。

附图简要说明

图1为pBIGO的构建流程图及图谱。

图2为转基因烟草的Southern杂交检测图，其中，1为λDNA/EcoR I+Hind III，2，3，4，5，6，7分别为转基因烟草植株Kh1，Kh2，Kh4，Kh5，Kh6，Kh7，8为CK。

图3为转基因棉花的PCR检测图，其中，PCR扩增出一条约1.8kb的条带，说明G0基因整合进棉花基因组中；其中，1为转基因单株Xh-12，2为λDNA/EcoR I+Hind III，3为CK，非转基因对照品种新疆822。

图4为转基因棉花的抗病性鉴定图。

下面结合附图对本发明进行详细说明。

为了使外源基因在植物细胞中在转录和翻译水平上获得高效表达，在外源基因侧翼必须连接有适当的表达调控元件。因此，本发明设计了为在受体植物中高效表达上述葡萄糖氧化酶基因所需之启动子、增强子、终止子、转录产物的未翻译部分和多聚腺苷酸序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的表达载体中，所说的5′端非编码区由两个增强子序列、一个启动子序列、一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列、和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。

在本发明的融合基因表达载体中使用的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。该序列富集AAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richards et al.，Eur.J.Biochem.84：513-519，1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak et al.，NucleicAcids Research 12：857-872，1984；Cell 44：283-292，1986)。

适于与本发明GO基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如，它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，mannopine合成酶(MAS)启动子，胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶小亚基启动子、伤诱导或病菌诱导启动子、组织或器官或发育特异性表达的启动子等。其中，本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV 35S启动子。该启动子全序列如SEQ ID NO：3所示。此外，很多植物病害是维管束病害，通过加接维管束特异表达的启动子，可提高外源基因产物的抗菌作用。

根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的高效植物表达载体中，所说的3′端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。

另外，适用于本发明的GO高效植物表达载体还包括衍生于花椰菜花叶病毒或，Nopaline(Nos)基因的终止子及其他类似的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。

可使用本领域中已知的方法将本发明提供的适于在植物细胞中表达GO的融合基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19。尤其是植物表达载体pBI101，pBI121以及pBI13l系统(Jefferson，et al.，EMBO J.16：3901，1987)等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述GO基因构建体的载体是pBlueScriptKS、pBI121等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。

如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组表达载体还含有选择标记基因。所使用的选择标记基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPT II)基因，并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。

因此，归纳起来本发明提供的适于在植物细胞中表达GO基因的植物表达载体包含：

1)GO基因表达盒；

a)5′端非编码区；

b)编码GO的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

c)3′端非编码区。

2)来源于pBI121的载体部分：

a)新霉素磷酸转移酶基因(nptII)表达盒；

b)起始复制子及与植物转化相关的T-DNA左右边界序列等功能结构。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的5′端非编码区和3′端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。例如，5′端的带有加倍的增强子元件的启动子，Ω序列和Kozak序列；3′端的多联终止序列，正确切割和加工序列，多聚腺苷酸信号序列。

通过本发明所得到的符合SEQ ID NO：1的核苷酸序列可以通过DNA重组技术，连接到上面所描述的表达载体中，并使之转入并整合到植物基因组中。而且GO基因在目标植物中的表达可赋予该植物对病害具有较强的抗性。

应该指出，上面所描述的表达载体只是本发明的一个优选实施例，它并不限制本发明。凡是应用本发明所描述的GO基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。包括如下的实现方式：与其它一种或几种基因重组，构建多价基因的表达载体并转入植物；

1.与其它一种或几种基因融合，构建表达载体并转入植物；

2.与其它一种或几种基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步导入同一种植物受体。

为了在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源抗病基因，以赋予整株植物及其种子和后代以抗病能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的GO基因的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。

将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于：1)农杆菌介导的转化法(Agrobacterium-mediatedtransformation)；2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment或Particle gun或Gene gun)、电击法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic)、激光微束法(Lasermicrowave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbide fiber)、电泳法(Electrophoretic transfection)等；3)化学法，如PEG介导法、脂质体介导法等；4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法等。

一种特别令人感兴趣的在整体植株上导入外源基因的方法是本发明人使用的改进的植物子房注射法(参见CN 95119563.8，1995；Zhou et al.，Enzymol.Method.101：433-481，1983)。

根据本发明的一个优选实施方案，我们选择棉花作为GO基因转化受体植物。棉花作为一种经济作物，我们考虑其主要作为纺织工业的原料，因而转基因植物的安全性好；其次，在世界范围内被广泛种植的棉花每年因病害造成的经济损失是十分巨大的。

因而，本发明涉及编码GO的DNA序列，高效的植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物病害具有抵抗能力的转基因植物，特别是对黄、枯萎病具有抵抗能力的转基因棉花。

另一个方面，本发明提供了获得对病原菌有抗性，尤其是对黄、枯萎病菌具有抗性的植物的方法，该方法包括：

1).构建包含GO基因的植物表达载体；

2).用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对病原菌有抗性能力的转基因植物及其后代，包括任何植物的整株、部分、器官或组织和种子。

这里应特别指出的是，虽然在下述实施例中以转基因棉花为例详细描述了本发明，但这绝不意味本发明的GO基因及其重组表达载体只适用于转化和生产具有抗病能力的转基因棉花。因此，凡使用本发明所描述的GO基因及其表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有抗病能力的植物、种子和后代以及植物体的部分器官、组织或细胞，均包括在本发明之内。

除生产抗病转基因植物外，本发明还适用于生产工业和医用葡萄糖氧化酶的其他各种生物表达系统，例如但不仅限于植物、昆虫、酵母或细菌表达系统。在本发明的一个优选实施方案中是在大肠杆菌中表达葡萄糖氧化酶基因，以获取其表达产物，并用市售的葡萄糖氧化酶免疫兔子制备相应的抗体，用于检测转基因植物中基因的表达。

实施例实施例1：编码GO蛋白质的结构基因的制备

1.1 GO基因的克隆

根据黑曲霉GO基因的DNA序列，设计PCR引物进行PCR扩增。

PCR引物：

GO-1：5’CT

CATGCAGACTCTCCTTGTG  3’

       Pst I

GO-2：5’CA

TTATCACTGCATGGAAGCATAA  3’

       Xho I

扩增条件为94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1.5分钟。循环35次。由于GO基因内部有一个Pst I位点和一个EcoR I位点，PCR产物首先经EcoR I/Xho I双酶切后电泳，回收950bp的EX片段克隆到pBlueScriptKS的EcoR I/Xho I位点得到pEX；回收870bp的PE片段再经Pst I酶切后克隆到pBlueScript KS的EcoR I/Pst I位点得到pPE。将EX片段克隆到pPE的EcoR I/XhoI位点即得到整个GO基因，命名为pGO。连同起始密码子ATG和终止密码子TGA共1818个碱基对(序列如SEQ ID No：1)。它所编码的GO蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

1.2对pGO中所克隆GO基因的序列分析

(1)变性模板的制备：用小量提取质粒DNA方法，制备待测pGO质粒DNA。取1.5～2μg DNA(约2～5μl)加水至总体积32μl，然后加入8μl 2M NaOH，轻轻混匀，室温变性10分钟，然后加入4μlH₂O，7μl 3M NaAc(pH 4.8)，120μl无水乙醇，12000rpm离心8分钟，用70％乙醇洗2次所得的沉淀，真空抽干，溶于10μl水中，放冰上待用。

(2)退火：向变性后的模板DNA中加入2μl退火buffer，2μl测序引物，轻轻混匀，瞬时离心后于65℃温育退火5分钟，迅速移至37℃继续温育10分钟，然后于室温放置5分钟以上。

(3)标记反应：先吸2μl酶稀释buffer、然后向其中加入0.5μlT₇测序酶，置于冰上，然后向退火后的模板、引物混合物中加入LabelMix 3μl，α-³²P dATP 1μl；稀释后的T₇测序酶2μl，在管中轻轻吸打混匀，瞬时离心甩一下，室温反应5分钟。

(4)链延伸终止反应：在4个离心管上分别标上A、C、G、T，并分别加入2.5μl相应的链终止液(Mix short)在37℃至少保温1分钟，从(3)中标记反应液中分别移取4.5μl反应物加入到A、C、G、T四个管中，混匀后置37℃反应5分钟，各加入5μl终止液，于37℃保温2分钟。

(5)测序胶的制备：应用Bio-rad公司的测序仪。

(6)量取50ml 6％测序丙烯酰胺凝胶贮备液(6％Sequencing gel：1.5g甲叉双丙烯酰胺，28.5g丙烯酰胺，240g尿素，50ml 10×TBE，加水定容至500ml)，加入500μl 10％过硫酸胺，50μl TEMED，混匀，缓慢注入到洗净的测序板装置中，插入点样梳，室温聚合45分钟以上。

(7)装置好电泳装置，加入1×TBE电泳缓冲液(10×TBE：108gTris，9.3g Na₂EDTA.2H₂O，55g硼酸，用H₂O定溶于1000ml(pH8.3))。将样品80℃变性2分钟，置于冰上，上样电泳。如有必要，当溴酚兰到达板底部时，进行二次上样，继续电泳到二次上样溴酚兰至板底部。

(8)停止电泳，下胶，压片，-70℃放射自显影过夜，冲片阅读。

(9)结果证明该质粒中带有与设计相符的GO基因插入片段。实施例2：GO的大肠杆菌表达

(1)挑取单菌落接种于LB液体培养基(加有Amp 100mg/L)，于37℃，其中首选转基因植物及其产品振荡培养过夜。

(2)取50ml过夜培养物接种于5ml LB液体培养基(加有Amp100mg/L)，于37℃振荡培养2小时。

(3)加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为1mmol/L，进行诱导。

(4)分别在诱导后的1、3、5小时取出1ml经过诱导的培养物，迅速在室温下以12000×g离心1分钟，弃上清。

(5)将每一沉淀重悬于100μl的1×SDS凝胶加样缓冲液中，将所有收集的样品贮存于0℃，以备在凝胶上加样。

   1×SDS凝胶加样缓冲液：

   50mmol/L TrisCl

   100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

   2％SDS(电泳级)

   1％溴酚蓝

   10％甘油

(6)不含二硫苏糖醇的1×SDS凝胶加样缓冲液可贮存于室温。二硫苏糖醇可配成1mol/L贮存液冻存于-20℃备用。

(7)融化样品，100℃加热3分钟，于室温以12000×g离心1分钟，每种悬液取15μl加样于适当浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶上，用只含空白载体的细菌悬液作为对照。

(8)用考马斯亮蓝染色或用Western印迹法鉴定所诱导的蛋白。实施例3：GO抗体制备

(1)称取5mg葡萄糖氧化酶(Boehringer Mannheim)，加1ml无菌生理盐水溶解。

(2)加入1ml弗氏完全佐剂(Sigma)，用注射器吸打几次使之彻底乳化。皮下多点注射免疫实验兔。

(3)2周后第二次免疫，5mg葡萄糖氧化酶加1ml无菌生理盐水溶解后，加入1ml弗氏不完全佐剂。彻底乳化后肌肉注射。

(4)分别于2周和4周后进行第三、四次免疫，5mg葡萄糖氧化酶加1ml无菌生理盐水溶解后静脉注射。

(5)静脉抽血1ml，4000rpm离心20分钟。取血清进行抗原抗体结合试验。实施例4：GO基因植物表达载体的构建

4.1 GO基因表达盒的构建

如前所述，本实施例所构建的GO基因表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、NOS终止子。利用质粒pTΩ4A，经Pst I和Xho I双酶切后，回收3.5kb片段作为载体，将pGO中的GO基因用Pst I和Xho I切下后连接到所回收的载体上去，得到重组质粒pTGO。

4.2 GO基因植物表达载体的构建

用Hind III/EcoR I切下pTGO中的5.3kb的GO基因表达盒，克隆到植物表达载体pBI121中的Hind III/EcoR I位点上，获得重组质粒pBIGO。这就是所构建的GO植物表达载体。其质粒图谱及构建过程如附图1所示。实施例5：GO植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定

5.1 LBA4404感受态细胞的制备

挑取LBA4404单菌落接种于5ml YEB(含链霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD₆₀₀值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的CaCl₂重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。

5.2重组质粒转入LBA4404细胞

在200μl LBA4404感受态细胞中分别加入2μg重组质粒pBIGODNA，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB培养基，28℃ 250rpm预培养4～5小时，然后涂铺含有卡那霉素的YEB固体平板，28℃培养24～48小时。长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。

5.3烟草的遗传转化

(1)农杆菌的准备：28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS(Murashige& Skoog，1962)培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600＝0.2～0.4。

(2)浸染：取烟草无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。

(3)共培养：将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基(MS+IAA0.5mg/L+6-BA 2mg/L)中(上面垫两层滤纸)于25℃避光共培养3天。

(4)选择培养：将叶片继代到选择培养基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。

(5)抗性小苗的获得：将愈伤组织转移至生根培养基(MS+Kan100mg/L+Carb 500mg/L)，每隔两周继代培养一次，最后种植到小塑料钵中。

5.4转基因烟草的Southern鉴定

取1～3克烟草鲜叶片，加等量Al₂O₃用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0，500mMNaCl，10mM β-巯基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml 10％SDS，轻轻混匀，于65℃加热10～20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAc 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃、12000rpm离心15分钟，取上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用RNase处理，纯化备用。

(1)将植物DNA用Pst I酶切过夜，通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并照相。

(2)将胶置于小盘中加入200ml变性液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)振荡45分钟。

(3)弃去变性液，用蒸馏水漂洗数次，加入中和液(1M Tris，pH7.4，1.5M NaCl)200ml，振荡30分钟，然后更换新的中和液，继续中和15分钟。

(4)剪相应大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，于蒸馏水中均匀湿透后，将NC膜浸于10×SSC(20×SSC：每1000ml含NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g pH7.0)中，放置20分钟。

(5)使用Bio-rad公司的转膜仪转膜1小时。

(6)去掉胶块，标记好加样孔位置，用6×SSC洗膜5分钟，然后紫外照射5分钟，以固定DNA。2×SSC洗膜，室温风干。

(7)将NC膜卷入杂交瓶中，加入20ml预杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml鱼精DNA)，使膜均匀浸润无气泡，然后置于DNA分子杂交仪中68℃预杂交过夜。

(8)探针的标记：采用Promega公司随机引物试剂盒标记。取适量待标记DNA片段，95～100℃变性2分钟迅速置于冰上，在一新的

   Eppendrof管中，依次加入：

   5×labeling buffer                      10μl

   dCTP，dGTP，dTTP，混合物                2μl

   变性模板                                25ng

   BSA                                     2μl

   α-³²P-dATP                            5μl

   Klenow酶                                1μl

   加H₂O至总体积                          50μl

(9)轻轻混匀，室温反应60分钟。95℃变性2分钟置于冰上。加入2μl 0.5M EDTA。

(10)向预杂交完毕的袋中加入变性探针30～50μl，重新封好继续于68℃杂交8～10小时。

(11)取出杂交膜用2×SSC、0.5％SDS洗膜30分钟，用2×SSC、0.1％SDS洗15分钟，再用0.1×SSC、0.5％SDS于42℃洗膜30分钟～数小时，中间更换新的洗膜液。

(12)1×SSC洗膜2分钟，用吸水纸吸去水珠，用保鲜膜包好膜，暗室中压片。

(13)-70℃放射自显影3-6h后洗片。

结果表明，转基因烟草的Southern杂交结果为阳性(图2)。实施例6：制备花粉管通道法转化植物用植物表达

         载体pBIGO超纯度质粒DNA

6.1大量提取质粒pBIGO

(1)接单菌落于20ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，250rpm条件下振荡培养过夜。

(2)将菌液转入4000ml液体LB培养基中，继续培养8～12小时；

(3)5000rpm离心5分钟，收集菌体；

(4)用STE 100ml悬浮洗涤菌体，合并各管于2个500ml离心管中，重新离心去上清；

(5)分别向每管加入80ml Solution I(50mM蔗糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0)，将菌体悬浮后加入160ml新配制的SolutionII(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻混匀数次，冰上放置10分钟，再加入120ml预冷的Solution III(每100ml含5M KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；

(6)8000rpm离心15分钟，收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟；

(7)8000rpm离心15分钟，70％乙醇洗涤一次，溶于4ml TE(10mM Tris pH8.0，1mM EDTA pH8.0)中，加RNase 8μl(10mg/ml)37℃处理1小时；

(8)用酚、氯仿抽提纯化，乙醇沉淀后溶于3ml TE中。

6.2超速离心进一步纯化提取的质粒DNA(用Beckman公司超速离心机)

(1)在一个50ml离心管中加入2.9ml DNA溶液，6.6ml饱和氯化铯溶液及1ml溴化乙锭溶液(EB，10mg/ml)，混匀待用。

(2)上步中如有许多沉淀，则8000rpm离心5分钟。

(3)将上述混合液转入两个5.2ml超速离心管中，用Beckman超速离心机专用设备热封管口。

(4)用vTi80转头室温真空离心20小时，6,5000rpm。

(5)在暗室中紫外光下，先在离心管上部用针头穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出质粒亮带。

(6)用水饱和正丁醇抽提数次去EB。

(7)用TE稀释三倍后，用二倍无水乙醇4℃沉淀，离心，溶解后稀释待用。实施例7：植物子房注射法(花粉管通道法)转化棉花

编码GO抗病蛋白质的基因在植物中的高效表达，对于产生具有高抗病性的转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是至关重要的环节。在本发明之前，本领域科技人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能或难以通过器官发生或胚胎发生途径再生成植株。在这种情况下，本发明通过植物子房注射技术或称花粉管通道法，成功地获得了具有高抗病能力的转基因棉花。子房注射外源基因转化植物的优点在于：1)适合于所有的基因型；2)方法简单，有效；3)不受实验室条件、仪器设备的限制，且费用低；4)速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。

在本实施例中，子房注射外源基因的时间是在棉花开花授粉后约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射器将外源基因溶液注射到子房内，外源基因即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合的过程。

棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花辨不能张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进入胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花辨连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，将吸取外源基因溶液的微量注射器，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的注入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到注入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中实现基因的整合。一般注射的外源基因溶液为10μl，DNA总量约为0.25～0.5μg。外源基因注射后，为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将注射外源基因的幼铃所在的枝条项端摘掉，以保持幼铃的充分营养，有利于成铃和铃内种子的发育。

对收获种子的后代进行抗病及分子检测，获得抗病棉植株。实施例8：转基因抗病棉的分子生物学检测及抗病性测试

对所获得的转基因棉花植株分别进行了PCR检测及抗病性鉴定。证实了GO基因已导入到棉花中并表达。

附图3提供了抗病棉植株PCR检测结果的照片。PCR扩增出一条1.8kb的特异带，证明了GO基因已成功地转入到棉花基因组中。在转基因棉的抗黄、枯萎病温室和田间病圃鉴定中，获得了抗病性明显提高的单株，见图4。如图4所示，转基因棉花播种出苗后，用枯萎7号小种按3％(w/w)的比例混入营养钵土壤进行接种。四周后再用黄萎北京菌系接种，具体方法是用1.2×10⁷cfu/ml的黄萎病菌液，每个营养钵加10ml，进行大菌量枯、黄萎病混合鉴定。结果表明，转基因棉花抗黄、枯萎病能力明显高于对照棉花。序列表

(1)SEQ ID NO：1的信息：

(I)序列特征：

(A)名称：GO基因

(B)长度：1818碱基对

(C)类型：核苷酸

(D)链型：单链

(E)拓扑结构：线性

(II)分子类型：编码葡萄糖氧化酶基因的核苷酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：1ATGCAGACTCTCCTTGTGAGCTCGCTTGTGGTCTCCCTCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC        60ATCAGGAGCAATGGCATTGAAGCCAGCCTCCTGACTGATCCCAAGGATGTCTCCGGCCGC        120ACGGTCGACTACATCATCGCTGGTGGAGGTCTGACTGGACTCACCACCGCTGCTCGTCTG        180ACGGAGAACCCCAACATCAGTGTGCTCGTCATCGAAAGTGGCTCCTACGAGTCGGACAGA        240GGTCCTATCATTGAGGACCTGAACGCCTACGGCGACATCTTTGGCAGCAGTGTAGACCAC        300GCCTACGAGACCGTGGAGCTCGCTACCAACAATCAAACCGCGCTGATCCGCTCCGGAAAT        360GGTCTCGGTGGCTCTACTCTAGTGAATGGTGGCACCTGGACTCGCCCCCACAAGGCACAG        420GTTGACTCTTGGGAGACTGTCTTTGGAAATGAGGGCTGGAACTGGGACAATGTGGCCGCC        480TACTCCCTCCAGGCTGAGCGTGCTCGCGCACCAAATGCCAAACAGATCGCTGCTGGCCAC        540TACTTCAACGCATCCTGCCATGGTGTTAATGGTACTGTCCATGCCGGACCCCGCGACACC        600GGCGATGACTATTCTCCCATCGTCAAGGCTCTCATGAGCGCTGTCGAAGACCGGGGCGTT        660CCCACCAAGAAAGACTTCGGATGCGGTGACCCCCATGGTGTGTCCATGTTCCCCAACACC        720TTGCACGAAGACCAAGTGCGCTCCGATGCCGCTCGCGAATGGCTACTTCCCAACTACCAA        780CGTCCCAACCTGCAAGTCCTGACCGGACAGTATGTTGGTAAGGTGCTCCTTAGCCAGAAC        840GGCACCACCCCTCGTGCCGTTGGCGTGGAATTCGGCACCCACAAGGGCAACACCCACAAC        900GTTTACGCTAAGCACGAGGTCCTCCTGGCCGCGGGCTCCGCTGTCTCTCCCACAATCCTC        960GAATATTCCGGTATCGGAATGAAGTCCATCCTGGAGCCCCTTGGTATCGACACCGTCGTT       1020GACCTGCCCGTCGGCTTGAACCTGCAGGACCAGACCACCGCTACCGTCCGCTCCCGGATC       1080ACCTCTGCTGGTGCAGGACAGGGACAGGCCGCTTGGTTCGCCACCTTCAACGAGACCTTT       1140GGTGACTATTCCGAAAAGGCACACGAGCTGCTCAACACCAAGCTGGAGCAGTGGGCCGAA       1200GAGGCCGTCGCCCGTGGCGGATTCCACAACACCACCGCCTTGCTCATCCAGTACGAGAAC       1260TACCGCGACTGGATTGTCAACCACAACGTCGCGTACTCGGAACTCTTCCTCGACACTGCC       1320GGAGTAGCCAGCTTCGATGTGTGGGACCTTCTGCCCTTCACCCGAGGATACGTTCACATC       1380CTCGACAAGGACCCCTACCTTCACCACTTCGCCTACGACCCTCAGTACTTCCTCAACGAG       1440CTGGACCTGCTCGGTCAGGCTGCCGCTACTCAACTGGCCCGCAACATCTCCAACTCCGGT       1500GCCATGCAGACCTACTTCGCTGGGGAGACTATCCCCGGTGATAACCTCGCGTATGATGCC       1560GATTTGAGCGCCTGGACTGAGTACATCCCGTACCACTTCCGTCCTAACTACCATGGCGTG       1620GGTACTTGCTCCATGATGCCGAAGGAGATGGGCGGTGTTGTTGATAATGCTGCCCGTGTG       1680TATGGTGTGCAGGGACTGCGTGTCATTGATGGTTCTATTCCTCCTACGCAAATGTCGTCC       1740CATGTCATGACGGTGTTCTATGCCATGGCGCTAAAAATTTCGGATGCTATCTTGGAAGAT       1800TATGCTTCCATGCAGTGA                                                 1818

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(I)序列特征：

(A)名称：GO

(B)长度：605个氨基酸

(C)类型：氨基酸

(D)链型：单链

(E)拓扑结构：线性

(II)分子类型：葡萄糖氧化酶的氨基酸序列

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：2Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala Leu Pro His Tyr    20Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg    40Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu    60Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg    80Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His    100Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn    120Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln    140Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala    160Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His    180Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr    200Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val    220Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr    240Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln    260Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn    280Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn    300Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu    320Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val    340Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile    360Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe    380Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu    400Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn   420Tyr Arg Asp Trp Ile Mal Asn His Asn Val Ala Tyr ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala   440Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile   460Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu   480Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly   500Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala   520Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val   540Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val   560Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro pro Thr Gln Met Ser Ser   580His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp   600Tyr Ala Ser Met Gln

(3)SEQ ID NO：3的信息：

(I)序列特征：

(A)长度：802碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(II)分子类型：外源基因表达盒5’端带有加倍增强子的35S启动子序列DNA

(III)假定的：非

(IV)反义：非

(V)序列描述：SEQ ID NO：3CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG TGGAGCTCTC  60bTTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA TACAGTCTCA GAAGACCAAA  120bGGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC   180bCAGCTATCTG TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC   240bATCATTGCGA TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG   300bATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA   360bAGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG   420bGGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC   480bAGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA   540bTCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA   600bTGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA   660bGCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC   720bTTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA   780bTCACCTCTAG AGGATCCCCG GG                                            802b

Claims (11)

1.编码葡萄糖氧化酶或其部分的如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列及其功能等同的序列。

2.根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码具有如SEQID NO：2所示的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列或其部分及其它功能等同的蛋白质。

3.适于在植物细胞中表达权利要求1的核苷酸序列的重组表达载体。

4.根据权利要求3的重组表达载体，其中包含的葡萄糖氧化酶基因表达盒包括：

a)5′端非编码区

b)根据权利要求1的核苷酸序列

c)3′端非编码区。

5.根据权利要求4的重组表达载体，其中a)所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成；b)所说的3’端非编码区包含一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。

6.含有权利要求1所指定的核苷酸序列的任何转基因植物。

7.根据权利要求6的转基因植物，其中的一个优选实施方案为抗真菌和细菌病害的转基因植物。

8.根据权利要求6的转基因植物，其中的转基因植物可以是任何一种单子叶植物或双子叶植物的完整植株或部分、种子及其后代。

9.根据权利要求6～8任一项权利要求所述的转基因植物，其中所说的植物包括由转基因植物作为亲本杂交或转育所产生的植物。

10.权利要求1所述的核苷酸序列及其功能等同的序列在生产工业及医用葡萄糖氧化酶的各种生物表达系统中的应用。

11.根据权利要求10的应用，其中的生物表达系统包括植物、昆虫、酵母或细菌。

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