JP4588649B2 - 酵素機能電極およびバイオセンサおよび燃料電池 - Google Patents
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Description
・白金等の貴金属を触媒に用いる必要がない。
・燃料のクロスオーバーによるエネルギー損失が発生しない。
・一酸化炭素等による触媒被毒が発生しない。
・室温稼動など動作条件が穏やかである。
といった多くの利点を有している。
(a)配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる部位を含む蛋白質、および
(b)前記(a)に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ実質的に同等の電子伝達機能を有する蛋白質、
のいずれか一方からなることとすれば、上記チトクロームC部位の外部に露出するヘム鉄周辺に疎水性アミノ酸および極性非電荷アミノ酸の少なくとも一方からなるアミノ酸が集まりやすくなり、上記請求項1にかかる構造が容易に実現されるようになる。
(イ)導電性金属および半導体材料および金属酸化物のいずれかからなる電極。
あるいは請求項5に記載の発明によるように。
(ロ)カーボン紙、カーボンスクリーンプリント、カーボンフェルト、カーボンブラック、カーボンパウダー、カーボンペースト、カーボン繊維、単層カーボンナノチューブ、2層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブアレイ、グラッシーカーボン、ダイヤモンドコート、メソポーラスカーボングラファイト、多結晶グラファイトおよび熱分解黒鉛のいずれかのカーボン材からなる電極。
等々を採用することができる。
(ハ)前記チトクロームC部位を含む酵素が前記電極の表面に吸着される構造。
あるいは請求項8に記載の発明によるように、
(ニ)前記チトクロームC部位を含む酵素が前記電極中に混合される構造。
あるいは請求項9に記載の発明によるように、
(ホ)前記チトクロームC部位を含む酵素が前記電極の表面の官能基との間に化学結合により固定される構造。
あるいは請求項10に記載の発明によるように、
(ヘ)前記チトクロームC部位を含む酵素が前記電極の表面に結合している電子メディエータにより固定される構造。
等々の構造を採用することもできる。これらいずれの構造によっても、上記チトクロームC部位が電極表面に直接固定されることで配向性がさらに高められるようになる。すなわち、上記酵素から電極への電子伝達がより安定且つ容易に実現されるようになり、酵素機能電極としてのさらなる出力向上が図られるようになる。
図1は、この実施の形態にかかる酵素機能電極の構造の一例を模式的に示したものである。同図1に示されるように、この酵素機能電極では、特定の基質Sub−redを酸化する酵素1が電極2の表面に固定されており、この酵素1が基質Sub−redを酸化することにより同基質Sub−redから電子(e−)が引き抜かれて基質Sub−oxが得られるとともに、上記酵素1が還元されることにより同酵素1から電極2に電子が伝達される。この酵素1は、例えばPseudomonas putida(シュードモナス・プチダ)HK5株由来のキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素typeIIB(ADHIIB)のチトクロームC部位1aを含む蛋白質からなる。そしてここでは、上記酵素1から電極2への電子の伝達はこのチトクロームC部位1aを介して行われる電子移動構造となる。またここで、上記チトクロームC部位1aは、電子を放出する能力を有するヘム鉄が隣接するアミノ酸とともに外部に向けて露出する構造を有している。そして、これらヘム鉄に隣接するアミノ酸は、疎水性アミノ酸および極性非電荷アミノ酸のみからなっており、上記チトクロームC部位1aの表面にはいわば疎水面HPが形成されている。すなわち、この疎水面HPが上述した電極2の表面に近接している。これにより、上記ヘム鉄と電極面との親和性が高められるとともに、同ヘム鉄を電極面に近づけることができるようになるため、上記チトクロームC部位1aから電極2に直接電子を伝達することが可能になる。
(ADHIIBの調整方法)
2g/L(グラム/リットル)の硝酸ナトリウム、2g/Lの硫酸アンモニウム、2g/Lのリン酸一水素カリウム、1g/Lのリン酸二水素カリウム、0.2g/Lの硫酸マグネシウム七水和物、0.5g/Lの酵母エキスを含む培地(pH7.0)に、炭素源としてn−ブタノールを数回に分けて終濃度0.3%になるまで添加した。そして、この培地にてシュードモナス・プチダHK5株を30℃にて、定常期の初期まで培養した。この培養菌体を遠心分離により回収し、氷冷水で2回洗浄した後、50mM(ミリモル/リットル)リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄し、20mL(ミリリットル)の50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に湿菌体1gを懸濁させ、30℃で2時間インキュベートした。その後、上記菌体を再度回収し、50mMトリス緩衝液(pH8.0)で2回洗浄した後、50mMトリス緩衝液(pH8.0)4mLで再懸濁させ、フレンチプレスにて16,000lb/in2(ポンド/平方インチ)、4℃下の条件で細胞を破壊させた。こうして破壊された細胞を100,000g、90分で遠心処理をし、上清に可溶性画分を回収し、この可溶性画分を、10mMの塩化カルシウムを含む50mMトリス緩衝液(pH7.9)で予め平衡化したDEAE−セルロースカラム(5by18cm)にアプライした。ここで得られるADHIIBはカラムに吸着しないため、同じ緩衝液にて溶出されてきたアルコール還元活性のある画分を回収した。この活性画分に硫酸アンモニウムを30%濃度になるように加え、遠心処理にて沈殿蛋白を除去した。ここで得られたADHIIBを含む遠心の上清を、30%の硫酸アンモニウムを含む50mMトリス緩衝液(pH8.0)で予め平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(東ソー社製)にアプライした。そして、20%の硫酸アンモニウムを含むトリス緩衝液(pH8.0)のネガティブ濃度勾配(50mM−10mM)により、カラムから溶出されてくる活性画分を回収した。この活性画分を限外濾過膜で濃縮した後、10mMトリス緩衝液(pH8.5)で透析し、この透析した活性画分を、10mMトリス緩衝液(pH8.5)で予め平衡化したDEAE−Toyopearlカラムにアプライした。そして、ADHIIBをカラムに吸着させた後、50mMトリス緩衝液(pH8.0)への濃度勾配をかけることで、活性画分を溶出した。次いで、この活性画分を限外濾過膜で濃縮した後、Superdex S−200カラム(Pharmacia社製)にアプライし、50mMトリス緩衝液(pH8.0)で溶出してくる活性画分を回収した後、280nm(ナノメートル)と420nmにおける吸光度を測定することで、精製酵素として実験に使用した。
図10(a)および(b)はDET試験に用いられる電極の側面構造および平面構造をそれぞれ模式的に示したものである。同図10に示されるように、まず電極を構成する導
電体としてφ3mmのグラッシーカーボン電極30を用意し、その上面にゴムパッキン31を取り付けた後、さらにその上部に1mg/mLのADHIIBおよび10mM塩化カルシウムを含む50mMトリス緩衝液(pH7.7)を20μL(マイクロリットル)のせ、これを市販の透析膜(MWCO:25000)32で覆って固定した。そしてこの電極を、先の図7に示したような3極式の電気化学測定セルに用いた。具体的には、15mLの10mM塩化カルシウムを含む50mMトリス緩衝液(pH7.7)中に浸し、上記グラッシーカーボン電極30を作用電極とするとともに、対極に白金電極、参照電極に銀/塩化銀電極を用いて、400mV(vs銀/塩化銀電極)の定電位測定を行った。電流値が一定になったところで、0.1%のエタノールを加え、エタノールの酸化電流を観察した。図11は、時間の経過に伴うこのエタノールの酸化電流の変化をグラフで示したものである。同図11に示されるように、エタノール添加直後からエタノールの酸化電流が増加し、約690nAの酸化電流が観察された。
表面をエチレンジアミン処理したグラッシーカーボン電極(φ3mm)に、1mg/mL(ミリグラム/ミリリットル)のADHIIB溶液5μL、1ポリL−リジン、1%ポリスチレンスルホン酸、0.125%グルタルアルデヒド溶液を各1μLずつのせて、30℃で4時間、酵素の固定をおこなった。このADHIIBを固定した電極を作用電極として、15mLの10mM塩化カルシウムを含む50mMトリス緩衝液(pH7.7)中に浸し、対極に白金電極、参照電極に銀/塩化銀電極を用い、具体的には、0〜0.4V(vs銀/塩化銀電極)の間で50mV/sの掃引速度で電位掃引する条件でCV測定を行った。図13は、このCV測定の結果を示したものであり、作用電極の電位を順方向に掃引したときの酸化電流曲線L1および逆方向に掃引したときの還元電流曲線L2を示している。同図13に示されるように、ADHIIBの酸化還元電流はヒステリシスを有するかたちで観察される。そして、その酸化還元電位は一般に、酸化時および還元時におけるピーク電流値の平均値として算出され、上記測定の結果、270mV(vs銀/塩化銀電極)であった。ここで、酸素が水に還元される電位が約1V(vs銀/塩化銀電極)であることから、ADHIIBをアノード極、酸素を水に還元する白金をカソード極とする電池を構成することにより、700mV(vs銀/塩化銀電極)の開放電位を有する燃料電池を得ることができた。
なお、この発明にかかる酵素機能電極およびバイオセンサおよび燃料電池は、上記実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
Claims (13)
- 電極上に特定の基質を酸化する酵素を備え、前記基質から前記酵素を介して前記電極に電子が伝達される酵素機能電極であって、
前記酵素はチトクロームC部位を含む蛋白質からなって前記電子がこの酵素のチトクロームC部位を通じて前記酵素から前記電極に伝達される電子移動構造を有するとともに、前記チトクロームCのヘム鉄は該ヘム鉄と隣接するアミノ酸とともに外部に向けて露出されてなり、このヘム鉄と隣接するアミノ酸は、疎水性アミノ酸および極性非電荷アミノ酸の少なくとも一方からなる
ことを特徴とする酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位は、シュードモナス・プチダHK5株が有するキノヘムプロテインであるアルコール脱水素酵素typeIIB由来である
請求項1に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位は、
(a)配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる部位を含む蛋白質、および
(b)前記(a)に示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ実質的に同等の電子伝達機能を有する蛋白質、のいずれか一方からなる
請求項1または2に記載の酵素機能電極。 - 前記電極は、導電性金属および半導体材料および金属酸化物のいずれかからなる
請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記電極は、カーボン紙、カーボンスクリーンプリント、カーボンフェルト、カーボンブラック、カーボンパウダー、カーボンペースト、カーボン繊維、単層カーボンナノチューブ、2層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブアレイ、グラッシーカーボン、ダイヤモンドコート、メソポーラスカーボングラファイト、多結晶グラファイトおよび熱分解黒鉛のいずれかのカーボン材からなる
請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記電極は、疎水性の表面および疎水性の官能基で修飾される表面のいずれかを有してなる
請求項1〜5のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位を含む酵素は、前記電極の表面に吸着されてなる
請求項1〜6のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位を含む酵素は、前記電極中に混合されてなる
請求項1〜6のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位を含む酵素は、前記電極の表面の官能基との間に化学結合により固定されてなる
請求項1〜6のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位を含む酵素は、前記電極の表面に結合している電子メディエータにより固定されてなる
請求項1〜6のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 前記チトクロームC部位を含む酵素は、イオン導電性を有する膜およびゲル状物質のいずれかにより保護されてなる
請求項1〜10のいずれか一項に記載の酵素機能電極。 - 請求項1〜11のいずれか一項に記載の酵素機能電極を通じて前記基質の濃度を測定するバイオセンサ。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の酵素機能電極からなるアノード極と、酸素に電子を伝達することのできる触媒および酵素のいずれかを保持するカソード極とを備え、前記アノード極と前記カソード極とが電気的に結合されるとともに、それら各電極間がイオン導電性を有する物質で隔てられてなる燃料電池。
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