WO2004005499A1 - グルコース脱水素酵素 - Google Patents

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WO2004005499A1
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    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)

Definitions

  • the present invention relates to the production of glucose dehydrogenase (PQQGDH) using pyroquinoquinone quinone as a coenzyme and its use in the determination of glucose.
  • PQQGDH glucose dehydrogenase
  • dalcose has been quantified by an enzymatic method using dalco-monosoxidase (GOD) or glucos-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH).
  • GOD dalco-monosoxidase
  • G6PDH glucos-6-phosphate dehydrogenase
  • G6PDH has been used for glucose determination based on spectroscopic techniques, but NAD (P), a neat enzyme, must be added to the reaction system.
  • PQQGDH is a glucose dehydrogenase that uses pyro-quinoline quinone as a coenzyme, and catalyzes a reaction that generates darconolactone by oxidizing glucose.
  • P QQGDH includes a membrane-bound enzyme and a water-soluble enzyme.
  • Membrane-bound PQQGDH is a syndal peptide protein with a molecular weight of about 87 kDa, and is widely found in various gram-negative bacteria. For example, see AM. Cleton- Jansen et al "J. Bacteriol. (1990) 172, 6308-6315.
  • the presence of water-soluble PQQGDH has been confirmed in several strains of Acinetobacter calcoaceticus. (Biosci. Biotech. Biochem.
  • the water-soluble P QQGDH derived from A. calcoaceticus is a homodimer with a molecular weight of about 50 kDa
  • the primary structure of the protein is different from other PQQ enzymes. There is almost no homology in construction.
  • Glucose sensor recognizes that PQQGDH has a high level of glucose and has oxidizing activity, and that PQQGDH is a coenzyme-linked enzyme and does not require oxygen as an electron acceptor. It is expected to be applied to devices such as devices and other fields. However, PQQGDH had a problem of low selectivity for glucose.
  • an object of the present invention is to provide a modified water-soluble PQQGDH having high selectivity for glucose. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted extensive research to improve water-soluble PQQ GDH by genetic engineering to increase its selectivity for glucose, and to develop a modified PQQ GDH that can be applied to clinical tests and food analysis. By introducing an amino acid mutation in a specific region of water-soluble PQQ GDH, an enzyme having high selectivity for glucose was successfully obtained.
  • the present invention relates to a water-soluble glucose dehydrogenase having a pyromouth quinoline quinone as a coenzyme, wherein one or more amino acid residues of a natural water-soluble glucose dehydrogenase are replaced with other amino acid residues. And has a higher glucose content than the natural water-soluble glucose dehydrogenase! And / or to provide a modified type of dulose dehydrogenase having selectivity.
  • the modified glucose dehydrogenase of the present invention has higher selectivity for glucose than natural water-soluble dalcose dehydrogenase.
  • the modified PQQGDH of the present invention has lower reactivity to lactose or maltose than wild type as compared to the reactivity to glucose.
  • the activity with respect to lactose or maltose is 50% or less, more preferably 40% or less, and still more preferably 30% or less.
  • the modified glucose dehydrogenase of the present invention in the region from residue 186 to residue 206 of the water-soluble PQQ GDH derived from Acinetobacter calcoaceticus or an equivalent region in another species, Or more amino acid residues have been replaced with other amino acid residues (ie, different amino acid residues than the corresponding amino acid residue in naturally occurring PQQ glucose dehydrogenase).
  • amino acid positions are numbered with the starting methionine as 1.
  • the term “equivalent” refers to an organism in which two or more structurally similar but not identical proteins have an equivalent amino acid residue or region. Has a biological or biochemical function.
  • water-soluble PQQGDH derived from organisms other than Acinetobacter calcoaceticus the first of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus
  • the region is referred to as "a region equivalent to the region of residues 186 to 206 of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus".
  • the seventh amino acid residue in the region is referred to as “an amino acid residue at a position equivalent to the 192nd residue of water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus”.
  • the modified glucose dehydrogenase of the present invention is the water-soluble PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus at the 192nd glutamine residue or the 193rd leucine residue, or the amino acid residue at an equivalent position in another species is another. Has been substituted with an amino acid residue.
  • a gnorecose dehydrogenase having a pyro-mouth quinoline quinone as a capture enzyme is characterized in that the dartamine residue at position 192 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has another residue.
  • a modified glucose dehydrogenase substituted with an amino acid residue is provided.
  • the 192nd group of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 The glutamine residue has been substituted with an alanine residue, a glycine residue, a glutamic acid residue, a leucine residue, a akialanine residue, a serine residue, or an aspartic acid residue.
  • a glucose dehydrogenase having a pyromouth quinoline quinone as a capture enzyme wherein the glutamine residue at position 19-2 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 67
  • a modified glucose dehydrogenase in which the 7th aspartic acid residue is simultaneously substituted with another amino acid residue is provided.
  • the glutamine residue at position 19 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an alanine residue, a dalysine residue, a glutamic acid residue, a leucine residue, a phenylalanine residue, a serine residue, Or it is substituted by an aspartic acid residue.
  • the 167-aspartic acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with a glutamic acid residue, and the 192nd glutamine residue is an alanine residue or a glycine residue.
  • a glutamic acid residue, a leucine residue, a phenylalanine residue, a serine residue, or an aspartic acid residue is substituted with a glutamic acid residue, and the 192nd glutamine residue is an alanine residue or a glycine residue.
  • the 167-part aspartic acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with another residue.
  • a glucose dehydrogenase wherein the glucose dehydrogenase has been substituted with an amino acid residue and the 452 asparagine residue has been substituted with another amino acid residue.
  • the 167th aspartic acid residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with a glutamic acid residue.
  • the aspartic acid residue at position 167 is substituted with a glutamic acid residue, and the asparagine residue at position 45 is substituted with a threonine residue. I have.
  • the daltamine residue at position 19 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has another amino acid residue.
  • a modified glucose dehydrogenase wherein the modified glucose dehydrogenase is substituted with an amino group, and the asparagine residue at position 452 is substituted with another amino acid residue.
  • the glutamine residue at position 19 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an alanine residue, a glycine residue, a glutamic acid residue, a leucine residue, or a glutamine residue.
  • the 452nd asparagine residue is substituted with another amino acid residue.
  • the glutamine residue at position 19 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an alanine residue, a glycine residue, a glutamic acid residue, a leucine residue, a phenylalanine residue, a serine residue, or It is substituted with an aspartic acid residue, and the 45th asparagine residue is substituted with a threonine residue.
  • the leucine residue at position 193 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has another amino acid residue.
  • a modified glucose dehydrogenase substituted with a group is provided.
  • the 193rd leucine residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with an alanine residue, a glycine residue, a methionine residue, a tributophane residue or a lysine residue.
  • modified glucose dehydrogenase of the present invention has the sequence: Gly-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
  • Xaal, Xaa2 are any natural amino acid residues, provided that when Xaal is Gin, Xaa2 is not Leu).
  • Xaal is Ala, Gly, Glu, Leu, Phe, Ser or Asp, and Xaa2 is Ala or Gly.
  • the present invention also provides a gene encoding the above-mentioned modified glucose dehydrogenase, a vector containing the gene, a transformant containing the gene, and a Dal containing the modified glucose dehydrogenase of the present invention.
  • a course assay kit and a glucose sensor are provided.
  • the enzyme protein of the modified glucose dehydrogenase of the present invention has high selectivity for glucose and high acid activity for glucose, it has high selectivity and high sensitivity for glucose. Can be applied to the measurement of BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the structure of a plasmid pGB2 used to construct a mutant gene encoding the modified PQQGDH of the present invention.
  • FIG. 2 shows the construction of a mutant gene encoding the modified PQQGDH of the present invention. Here's how.
  • FIG. 3 is a graph showing the substrate concentration dependence of the activity of the modified PQQGDH of the present invention.
  • one or more amino acid residues in the region from residue 186 to residue 206 of Acinetobacter calcoaceticus-derived water-soluble PQQGDH or an equivalent region in another species have one or more amino acid residues. It has been substituted with another amino acid residue.
  • the modified PQQGDH of the present invention is a modified PQQGDH wherein the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a glutamine residue at position 192 substituted with an araene residue or a glycine residue or a leucine residue at position 193. Substituted with alanine, glycine, methionine, tryptophan, or lysine residues.
  • the modified PQQGDH of the present invention further comprises, in addition to the above-mentioned substitutions, an amino acid residue at position 167 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 at the same time as another amino acid residue, It is preferably substituted with a glutamic acid residue. Also preferably, in the modified PQQGDH of the present invention, in addition to the above substitution, the 452nd asparagine residue is substituted with another amino acid residue, particularly preferably a threonine residue.
  • the modified glucose dehydrogenase of the present invention has the sequence: Glv-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu (Where Xaal, Xaa2, are any natural amino acid residues, provided that when Xaal is Gin, Xaa2 is not Leu).
  • Xaal is Ala, Gly, Glu, Leu, Phe, Ser or Asn
  • Xaa2 is Ala or Gly.
  • the sequence of the gene encoding natural water-soluble PQQGDH from Acinetobacter calcoaceticus is defined by SEQ ID NO: 2.
  • the gene encoding the modified PQQGDH of the present invention is obtained by substituting the nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be substituted with the nucleotide sequence encoding the desired amino acid residue in the gene encoding natural water-soluble PQQGDH. Can be constructed. Various methods for such site-specific nucleotide sequence substitution are known in the art, for example, see Sambrook et al., Molecular Cloning, 'A Laboratory Manual ", 2 fe, 1989, Cold. Spring Harbor Laboratory. Press, New York;
  • the mutant gene thus obtained is inserted into a vector for gene expression (for example, plasmid) and transformed into an appropriate host (for example, Escherichia coli).
  • a vector for gene expression for example, plasmid
  • an appropriate host for example, Escherichia coli.
  • Many vector-host systems for expressing a foreign protein are known in the art, and various hosts such as bacteria, yeast, and cultured cells can be used as the host.
  • modified PQQGDH of the present invention as long as it has the desired glucose dehydrogenase activity, some of the other amino acid residues may be further deleted or substituted, and other amino acid residues may be added. May be.
  • site-specific nucleotide sequence substitution are well known in the art.
  • those skilled in the art should compare the primary structure of water-soluble PQQGDH derived from other bacteria in parallel, or compare the predicted secondary structure based on the primary structure of the enzyme.
  • the transformant expressing the modified PQQGDH obtained as described above is cultured, and the cells are collected from the culture by centrifugation or the like, and then the cells are disrupted with a French press or the like, or Tick shock releases periplasmic enzymes into the medium. This is ultracentrifuged to obtain a water-soluble fraction containing PQQGDH.
  • the expressed PQQGDH can be secreted into the culture medium by using an appropriate host vector system.
  • the modified PQQGDH of the present invention is prepared by purifying the obtained water-soluble fraction by ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC, or the like. Method for measuring enzyme activity.
  • the PQQGDH of the present invention has an action of catalyzing a reaction of oxidizing glucose to produce dalconolatatone using PQQ as a coenzyme.
  • the enzyme activity can be measured by quantifying the amount of PQQ reduced by the oxidation of glucose by PQQGDH by a color reaction of a redox dye.
  • a coloring reagent for example, PMS (phenazine methosulfate) -DCIP (2,6-dichlorophenolindophenol), potassium ferricyanide, phenocenene, and the like can be used.
  • the selectivity of PQQGDH for gnorecose according to the present invention can be determined by using various substrates such as 2-deoxy D-gunolose, mannose, arose, 3-o-methinole-1-D-gnoreose, galactose, xylose, lactose and manoletoose as substrates. It can be evaluated by measuring the enzymatic activity using sugar as described above and examining the relative activity to the activity when glucose is used as a substrate.
  • the modified PQQGDH of the present invention has improved selectivity for glucose as compared to the wild-type enzyme, and has particularly high reactivity with glucose as compared with the reactivity with maltose. Therefore, the assay kit or enzyme sensor prepared using this modified enzyme has high selectivity for glucose measurement, and various sugars do not exist. It has the advantage that glucose can be detected with high sensitivity even in existing samples. Gunore Course Atsushi Kit
  • the present invention also features a glucose assay comprising a modified PQQGDH according to the present invention.
  • the glucose assay kit of the present invention contains the modified PQQGDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • the kit contains, in addition to the modified PQQGDH of the present invention, a buffer, a mediator, a glucose standard solution for preparing a calibration curve, and guidelines for use, for the assay.
  • the modified PQQGDH according to the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • the modified PQQGDH of the present invention is provided in a holo-form, but can also be provided in the form of an apoenzyme and holo-formated at the time of use.
  • the present invention also features a glucose sensor using the modified PQQGDH according to the present invention.
  • the electrode a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on the electrode.
  • the immobilization method include a method using a cross-linking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photo-crosslinkable polymer, a conductive polymer, and a redox polymer. May be fixed in a polymer together with an electron mediator represented by the formula (1) or adsorbed and fixed on an electrode, or may be used in combination.
  • the modified PQQGDH of the present invention can be immobilized in the form of an apoenzyme that is immobilized on an electrode in a holoylated form, and PQQ can be provided as a separate layer or in solution.
  • the modified PQQ GDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to book dartartaldehyde.
  • the glucose concentration can be measured as follows. Put buffer solution in a thermostatic cell, PQQ and C a C 1 2, and a mediator in addition to maintaining a constant temperature. Mediators include potassium ferricyanide, phenazine Tosulfate or the like can be used. An electrode on which the modified PQ QGDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an AgZAgCl electrode) are used. After applying a constant voltage to the carbon electrode and the current becomes steady, add a sample containing glucose and measure the increase in current. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared using a standard concentration of glucose solution.
  • Example 1 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
  • Example 1
  • Plasmid pGB2 is obtained by inserting a structural gene encoding PQQGDH derived from Acinetobacter calcoaceticus into a manoleci cloning site of a vector pTrc99A (manufactured by Fanolemasia) (FIG. 1).
  • the nucleotide sequence coding for the 192nd glutamine residue or the 193rd leucine residue was determined by site-directed mutagenesis according to the usual method, and the alanine residue, glycine residue, methionine residue, tributphan residue, or lysine, respectively. The residue was replaced with the coding base sequence. Further, the nucleotide sequence encoding the 167th aspartic acid residue or the 452nd asparagine residue was replaced with a nucleotide sequence encoding a glutamic acid residue or a glycine residue, respectively. The site-specific mutation was performed using the plasmid pGB2 according to the method shown in FIG.
  • Table 1 shows the sequence of the synthetic oligonucleotide target primer used for the mutation. In order to generate a mutant having two mutations, two types of oligonucleotide target primers are required. Table 1 shows mutations introduced in the same manner as above using
  • a Kpn I-Hind III fragment containing a part of the gene encoding PQQ GDH derived from Acinetobacter 'calcoaceticus was incorporated into a vector plasmid pKFl8k (Takara Shuzo Co., Ltd.) and used as a template.
  • the mixture was mixed with 1/10 of 1) the annealing buffer of the same kit and heat-treated at 100 ° C for 3 minutes to denature the plasmid to form a single strand.
  • the selection primer is for reversing the double-ampper mutation on the kanamycin resistance gene of pKF18k. This was placed on ice for 5 minutes to allow the primer to aerate. To this was added 3 ⁇ l of the same kit tension buffer, 11 pieces of ligated DNA ligase, 11 pieces of ligated DNA polymerase, and 5 ⁇ l of sterile water to synthesize a complementary strand. This was transformed into E. coli BMH71- 18 mutS, a DN ⁇ ⁇ -mismatch repair-deficient strain, and The culture was performed to amplify the plasmid.
  • the gene encoding wild-type or modified PQQGDH is inserted into the multicloning site of pTrc99A (Pharmacia), an E.co1i expression vector, and the constructed plasmid is inserted into E.coli. coli DH5 strain.
  • isopropylthiogalactoside was added to a final concentration of 0.3 mM, and then the cells were cultured for 1.5 hours.
  • the cells were collected from the culture by centrifugation (5000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), and the cells were washed twice with a 0.85% NaC1 solution.
  • the collected cells were crushed by a French press to crush stones, and uncrushed cells were removed by centrifugation (10000Xg, 15 minutes, 4 ° C).
  • the supernatant was subjected to ultracentrifugation (160500 X g (40000 rpm), 90 minutes, 4 ° C) to obtain a water-soluble fraction. This was used as a crude enzyme preparation in the following Examples.
  • each modified PQQGD H obtained in Example 2 was holoenzyme least 1 hour in 1 2 presence I mM C a C. This was dispensed in 187 1 portions, and 3 ⁇ l of the active reagent (6 mM D CIP 481, 600 mM PMS 8 ⁇ I, 10 mM phosphate buffer ⁇ ⁇ 7.016 zl) and each Dark 10 ⁇ l of D-glucose solution was added, and the enzyme activity was measured.
  • Enzyme activity was measured at room temperature, and PMS (phenazine methosulfate) -DC IP (2,6-dichlorophenol) was added in 10 mM MOPS-NaOH buffer (pH 7.0).
  • the change in absorbance of DC IP at 600 nm was tracked using a spectrophotometer, and the rate of decrease in absorbance was taken as the reaction rate of the enzyme.
  • the enzyme activity that reduces 1 ⁇ 1 of DC IP per minute was defined as 1 unit.
  • the molar extinction coefficient of DC IP at pH 7.0 was set to 16.3 mM- 1 .
  • Substrate specificity was examined for a crude enzyme preparation of each modified enzyme. Resulting et wild-type Contact Yopi the modified PQQGDH of the crude enzyme preparation were respectively 1 MPQQ, 1 mM holoenzyme least 1 hour at C a C 1 2 presence in Example 2. This was dispensed at 187 ⁇ l each, and 31 active reagents (including 6 mM DC IP, 60 OmM PMS, 10 mM phosphate buffer pH 7.0) and a substrate were added. As a substrate, 400 mM glucose or other sugar was added to a final concentration of 2 OmM or 10 OmM, respectively, and incubated at room temperature for 30 minutes, and the enzyme activity was measured in the same manner as in Example 3. Specified. The value was expressed as a relative activity with respect to the activity when glucose was used as a substrate and the activity was 100%. The results are shown in Table 3-6.
  • Table 7-8 shows the results of measuring the enzyme activity using the modified enzyme of the present invention having a double mutation. All of the modified enzymes of the present invention showed a higher level of reaction with glucose and a higher reaction duration than the reactivity with maltose. Table 7
  • the dependence of the activity of the modified PQQGDH of the present invention on the substrate concentration was examined.
  • the method was based on the method for measuring the enzyme activity described in Example 3, and the change in the absorbance of DC IP at 600 ⁇ m was used as an index.
  • the results are shown in Figure 3.
  • the modified PQQGD H of the present invention saturates at a higher glucose concentration than the wild type. In each case, no substrate inhibition was observed up to a glucose concentration of 20 OmM, and the Ksi was reduced at 20 OmM or more.
  • Example 6 Packing power for cation-exchange cuff chromatography in which wild-type and Glnl92Asp crude purified enzymes obtained in Example 2 were equilibrated with 10 mM phosphate buffer, pH 7.0, respectively.
  • the plate was treated with (pH 7.0) at room temperature for 20 minutes to block daltaldehyde.
  • This electrode was equilibrated in a 10 mM MOPS buffer (pH 7.0) at room temperature for 1 hour or more.
  • the electrodes were stored at 4 ° C.
  • the concentration of dalcose was measured.
  • glucose was quantified in the range of 0.1 mM to 5 mM.
  • modified water-soluble PQQGDH of the present invention has poor selectivity for glucose, it is useful as an element of a sensor for measuring blood glucose.

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Abstract

ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、Acinetobacter calcoaceticus由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの第１８６残基から第２０６残基の領域または他の種における同等の領域において１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素が開示される。本発明はまた、上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。

Description

明細書
グルコース脱水素酵素 技術分野
本発明はピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素 （PQQ GDH) の製造、 およびグルコースの定量におけるその使用に関する。 背景技術
血中グルコース濃度は、 糖尿病の重要なマーカーである。 また、 微生物を用い る発酵生産においては、 プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定 量する。 従来、 ダルコースはダルコ一スォキシダーゼ (GOD) あるいはダルコ ース 6リン酸脱水素酵素 （G6PDH) を用いる酵素法により定量されていた。 し力、し、 GODを用いる方法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化 水素を定量するためカタラーゼあるいはパーォキシダーゼをアツセィ系に添加す る必要があった。 G 6 PDHは分光学的手法に基づくグルコース定量に用いられ てきたが、 反応系にネ唐酵素である NAD (P) を添加しなければならない。
そこで、 これまでのグルコース酵素定量方法に用いられてきた酵素にかわる新 たな酵素として P QQGDHの応用が注目されている。 P QQGDHは、 ピロ口 キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、 グルコースを酸ィ匕 してダルコノラク トンを生成する反応を触媒する。
P QQGDHには、 膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。 膜 結合性 P Q Q G D Hは、 分子量約 87 kDaのシンダルべプチド蛋白質であり、 種々のグラム陰†生菌において広く見いだされている。 例えば、 AM.Cleton- Jansen et al" J. Bacteriol. (1990) 172, 6308-6315を参照されたい。 一方、 水溶 性 P QQGDHは Acinetobacter calcoaceticus のいくつかの株においてその存 在が確認されており （Biosci. Biotech. Biochem.(1995),59(8)，1548-1555) 、 そ の構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている （Mol. Gen. Genet.(l989),217:430-436) 。 A. calcoaceticus由来水溶性 P QQGDHは、 分子量約 50 kD aのホモダイマーである。 他の PQQ酵素とは蛋白質の一次構 造上でのホモロジ一がほとんどない。
最近、 Acinetobacter calcoaceticus由来の水溶性 P Q Q GDHの X線結晶構 造解析の結果が報告され、 活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかと なつた。 （A.Oubrie et al., J. Mol. Biol., 289， 319-333(1999);A. Oubrie et al.， The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999); A. Oubrie et al. PNAS, 96(21), 11787-11791 (1999)) 0 これらの論文によれば、 水溶性 P Q Q GD Hは 6つの w—モチーフから構成される eプロペラ蛋白質であることが明かとなった。
P Q Q GD Hはグルコースに対して高レ、酸化活性を有していること、 および P Q Q GDHは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としな いことから、 グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、 アツセィ分野への 応用が期待されている。 しかしながら P Q Q G D Hはグルコースに対する選択性 が低いことが問題であった。
したがって本発明.は、 グルコースに対する選択性が高い改変型水溶性 P Q Q G D Hを提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者は水溶性 P Q Q GDHを遺伝子工学的に改良してそのグルコースに対 する選択性を高め、 臨床検査や食品分析などに応用できる改変型 P Q Q GD Hを 開発すべく鋭意研究を行なった結果、 水溶性 P Q Q GDHの特定の領域において アミノ酸変異を導入することにより、 グルコースに対する選択性が高い酵素を得 ることに成功した。
すなわち、 本発明は、 ピロ口キノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース 脱水素酵素において、 天然の水溶性グルコース脱水素酵素の 1またはそれ以上の ァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されており、 かつ前記天然の水溶性グル コース脱水素酵素と比較してグルコースに対する高！/、選択性を有する改変型ダル コース脱水素酵素を提供する。 本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、 天然の 水溶性ダルコース脱水素酵素と比較してグルコースに対して高レ、選択性を有する。 好ましくは本発明の改変型 P Q Q GD Hは、 グルコースに対する反応性と比べて、 ラクトースあるいはマル 1、一スに対する反応性が野生型より低下している。 より 好ましくは、 グルコースに対する反応性を 100 %とした場合、 ラクトースある いはマルトースに対する活性が 50 %以下であり、 より好ましくは 40 %以下で あり、 さらに好ましくは 30%以下である。
本発明の 1つの態様においては、 本発明の改変型グルコース脱水素酵素におい て、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q GDHの第 186残基から 第 206残基の領域または他の種における同等の領域において 1またはそれ以上 のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基 （すなわち天然に存在する PQQグルコース 脱水素酵素中の対応するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基） で置換されてい る。 なお、 本明細書においては、 アミノ酸の位置は、 開始メチォニンを 1として 番号付けする。
本明細書においてァミノ酸残基の位置または領域に関して用いる場合、 「同等 の」 との用語は、 構造上類似するが同一ではない 2以上の蛋白質において、 ある ァミノ酸残基または領域が等価の生物学的または生化学的機能を有することを表 す。 例えば、 Acinetobacter calcoaceticus 以外の生物に由来する水溶十生 P Q Q GDHにおいて、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q GDHの第 1
86残基から 206残基の領域とアミノ酸配列類似性の高い領域が存在し、 かつ 蛋白質の二次構造から見て該領域がその蛋白質において同じ役割を果たしている と合理的に考えられる場合、 該領域は 「Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶 性 PQQGDHの第 186残基から 206残基の領域と同等の領域」 と言われる。 さらに、 該領域の第 7番目のアミノ酸残基は 「Acinetobacter calcoaceticus 由 来水溶性 PQQGDHの第 192残基と同等の位置のァミノ酸残基」 と言われる。 好ましくは、 本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 PQQGDHの 192番目のグルタミン残基もしくは 193番目のロイシン残基、 または他の種における同等の位置のアミノ酸残基が 他のアミノ酸残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、 ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするグノレコー ス脱水素酵素にぉレ、て、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 192番目のダル タミン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が 提供される。 好ましくは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 192番目のグ ルタミン残基は、 ァラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残 基、 フエエルァラニン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換され ている。
本発明の別の態様においては、 ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするグ^^コ一 ス脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 2番目のグル タミン残基と 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が同時に他のアミノ酸残基で置換 されている改変型グルコース脱水素酵素が提供される。 好ましくは、 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基は、 ァラニン残基、 ダリ シン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエ二ルァラニン残基、 セリン残 基、 またはァスパラギン酸残基で置換されている。 また好ましくは、 配列番号 1 で表されるァミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基がグルタミン酸残基 で置換されており、 かつ 1 9 2番目のグルタミン残基がァラニン残基、 グリシン 残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエ二ルァラニン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、 ピロ口キノリンキノンを補酵素とするダルコ一 ス脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァス パラギン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパ ラギン残基が他のァミノ酸残基で置換されているグルコース脱水素酵素が提供さ れる。 好ましくは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラ ギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されている。 また好ましくは、 配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基がグルタミン酸残基 で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基がトレオニン残基で置換 されている。
本発明の別の態様においては、 ピロロキノリンキノンを補酵素とするダルコ一 ス脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のダル タミン残基が他のアミノ酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギ ン残基が他のァミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提供 される。 好ましくは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタ ミン残基がァラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フ ェニルァラニン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている。 また 好ましくは、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基 がァラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエニルァ ラニン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている。
本発明の別の態様においては、 ピロ口キノリンキノンを補酵素とするダルコ一 ス脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 3番目のロイ シン残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース脱水素酵素が提 供される。 好ましくは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 3番目のロイ シン残基がァラニン残基、 グリシン残基、 メチォニン残基、 トリブトファン残基 あるいはリジン残基で置換されている。
また別の観点においては、 本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、 配列： Gly-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(式中、 Xaal、 Xaa2、 は任意の天然アミノ酸残基である、 ただし、 Xaalが Ginであるとき Xaa2は Leuではない） を含む。 好ましくは Xaalは Ala、 Gly、 Glu、 Leu, Phe、 Serまたは Aspであり、 Xaa2は Alaまたは Glyである。
本発明はまた、 上述の改変型グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、 該遺 伝子を含むべクターおょぴ該遺伝子を含む形質転換体、 ならびに本発明の改変型 グルコース脱水素酵素を含むダルコースアツセィキットおよびグルコースセンサ 一を提供する。
本発明の改変型グルコース脱水素酵素の酵素蛋白質はグルコースに対して高い 選択性を示し、 かつグルコースに対して高い酸ィヒ活性を有していることから、 グ ルコースの高選択的かつ高感度の測定に応用することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の改変型 P Q Q GD Hをコードする突然変異遺伝子を作成する ために用いたプラスミド p G B 2の構造を示す。
図 2は、 本発明の改変型 P Q Q GD Hをコードする突然変異遺伝子を作成する 方法を示す。
図 3は、 本発明の改変型 P QQGDHの活性の基質濃度依存性を示すグラフで める。 発明の詳細な説明
改変型 PQQGDHの構造
本発明の好ましい改変型グルコース脱水素酵素においては、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P QQGDHの第 186残基から第 206残基の領域 または他の種における同等の領域において 1またはそれ以上のアミノ酸残基が他 のアミノ酸残基で置換されている。 好ましくは、 本発明の改変型 PQQGDHは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 192番目のグルタミン残基がァラエン残 基またはグリシン残基で置換されている力 \ または 193番目のロイシン残基が ァラニン残基、 グリシン残基、 メチォニン残基、 トリプトファン残基、 またはリ ジン残基で置換されている。
また別の態様においては、 本発明の改変型 PQQGDHは、 上述の置換に加え て、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 167番目のァスパラギン酸残基が同 時に他のアミノ酸残基で、 特に好ましくはグルタミン酸残基で置換されている。 また好ましくは、 本発明の改変型 PQQGDHは、 上述の置換に加えて、 452 番目のァスパラギン残基が他のアミノ酸残基で、 特に好ましくはトレオニン残基 で置換されている。 167番目のァスパラギン酸残基および 452番目のァスパ ラギン残基が PQQGDHによる基質の認識および結合に関与することは、 それ ぞれ特開 2001-346587およぴ牿開 2001-197888に記載されている。 し力 し、 一 般的には、 異なるドメインに存在するアミノ酸残基に同時に変異を導入すること により、 基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、 全く予測 することができない。 場合によっては、 酵素活性が全く失われることもある。 し たがって、 本発明において、 これらの変異を同時に導入することによりダルコ一 スの選択性の向上が得られたことは、 驚くべき発見であった。
また別の観点においては、 本発明の改変型グルコース脱水素酵素は、 配列： Glv-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu (式中、 Xaal、 Xaa2、 は任意の天然アミノ酸残基である、 ただし、 Xaalが Ginであるとき Xaa2は Leuではない） を含む。 好ましくは Xaalは Ala、 Gly、 Glu、 Leu、 Phe、 Serまたは Asnであり、 Xaa2は Alaまたは Glyである。 改変型 P Q Q G D Hの製造方法
Acinetobacter calcoaceticus 由来の天然の水溶性 PQQGDHをコードする 遺伝子の配列は配列番号 2で規定される。 本発明の改変型 P QQGDHをコード する遺伝子は、 天然の水溶性 PQQGDHをコードする遺伝子において、 置換す べきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、 所望のアミノ酸残基をコードする塩 基配列に置換することにより構築することができる。 このような部位特異的塩基 配列置換のための種々の方法が、 当該技術分野において知られており、 例えば、 Sambrookら， Molecular Cloning,' A Laboratory Manual"， 2 fe, 1989, Cold. Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに 己载さ; てレヽる。
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター （例えばプラスミ ド） に挿入し、 これを適当な宿主 （例えば大腸菌） に形質転換する。 外来性蛋白 質を発現させるための多くのベクター ·宿主系が当該技術分野において知られて おり、 宿主としては例えば、 細菌、 酵母、 培養細胞などの種々のものを用いるこ とができる。
本発明の改変型 PQQGDHにおいては、 所望のグルコースデヒドロゲナーゼ 活性を有する限り、 さらに他のァミノ酸残基の一部が欠失または置換されていて もよく、 また他のアミノ酸残基が付カ卩されていてもよい。 このような部位特異的 塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。 さらに、 当業者は、 他の細菌に由来する水溶性 PQQGDHについても、 蛋白 質の一次構造を並列して比較すること、 あるいは当該酵素の一次構造をもとに予 測された二次構造を比較することにより、 Acinetobacter calcoaceticus由来の水 溶个生 PQQGDHの第 186残基から第 206残基の領域と同等の領域を容易に 認識することができ、 本発明にしたがって、 この領域中のアミノ酸残基を他のァ ミノ酸残基で置換することにより、 グルコース選択性の向上した改変型ダルコ一 ス脱水素酵素を得ることができる。 これらの改変型グルコース脱水素酵素も本発 明の範囲内である。
上述のようにして得られた、 改変型 PQQGDHを発現する形質転換体を培養 し、 培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、 菌体をフレンチプレスなどで 破砕するか、 またはォスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に 放出させる。 これを超遠心分離し、 PQQGDHを含む水溶性画分を得ることが できる。 あるいは、 適当な宿主ベクター系を用いることにより、 発現した PQQ GDHを培養液中に分泌させることもできる。 得られた水溶性画分を、 イオン交 換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 HPLCなどによ り精製することにより、 本発明の改変型 PQQGDHを調製する。 酵素活性の測定方法 .
本発明の PQQGDHは、 PQQを補酵素として、 グルコースを酸化してダル コノラタトンを生成する反応を触媒する作用を有する。 酵素活性の測定は、 PQ QGDHによるグルコースの酸化にともなつて還元される P Q Qの量を酸化還元 色素の呈色反応により定量することができる。 呈色試薬としては、 例えば、 PM S (フエナジンメトサルフェート） 一 DC I P (2, 6—ジクロロフエノールイ ンドフエノ ル） 、 フェリシアン化カリウム、 フエ口センなどを用いることがで きる。 グルコースに対する選択性
本発明の PQQGDHのグノレコースに対する選択性は、 基質として、 2—デォ キシー D—グノレコース、 マンノース、 ァロース、 3— o—メチノレ一 D—グノレコー ス、 ガラクトース、 キシロース、 ラクトースぉよびマノレトース等の各種の糖を用 いて上述のように酵素活性を測定し、 グルコースを基質としたときの活性に対す る相対活性を調べることにより評価することができる。
本発明の改変型 PQQGDHは野生型酵素と比較して、 グルコースに対する選 択性が向上しており、 特にマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対 する反応性が高い。 したがって、 本改変型酵素を用いて作成されたアツセィキッ トあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、 種々の糖が存 在する試料においても高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。 グノレコースアツセィキット
本発明はまた、 本発明に従う改変型 PQQGDHを含むグルコースアツセィキ ットを特徴とする。 本発明のグルコースアツセィキットは、 本発明に従う改変型 PQQGDHを少なくとも 1回のアツセィに十分な量で含む。 典型的には、 キッ トは、 本発明の改変型 PQQGDHに加えて、 アツセィに必要な緩衝液、 メディ エーター、 キヤリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、 ならび に使用の指針を含む。 本発明に従う改変型 PQQGDHは種々の形態で、 例えば、 凍結乾燥された試薬として、 または適切な保存溶液中の溶液として提供すること ができる。 好ましくは本発明の改変型 P QQGDHはホロ化した形態で提供され るが、 アポ酵素の形態で提供し、 使用時にホロ化することもできる。 ダルコ r "ス サニ
本発明はまた、 本発明に従う改変型 PQQGDHを用いるグルコースセンサー を特徵とする。 電極としては、 カーボン電極、 金電極、 白金電極などを用い、 こ の電極上に本発明の酵素を固定化する。 固定化方法としては、 架橋試薬を用いる 方法、 高分子マトリックス中に封入する方法、 透析膜で被覆する方法、 光架橋性 ポリマー、 導電十生ポリマー、 酸化還元ポリマーなどがあり、 あるいはフヱロセン あるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定 あるいは電極上に吸着固定してもよく、 またこれらを組み合わせて用いてもよい。 好ましくは本発明の改変型 P QQGDHはホロ化した形態で電極上に固定化する 力 アポ酵素の形態で固定化し、 P Q Qを別の層としてまたは溶液中で提供する こともできる。 典型的には、 グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型 PQQ GDHをカーボン電極上に固定ィ匕した後、 アミン基を有する試薬で処理してダル タルアルデヒドをブ口ッキングする。
グルコース濃度の測定は、 以下のようにして行うことができる。 恒温セルに緩 衝液を入れ、 PQQおよび C a C 12、 およびメディエーターを加えて一定温度 に維持する。 メディエーターとしては、 フェリシアン化カリウム、 フエナジンメ トサルフェートなどを用いることができる。 作用電極として本発明の改変型 PQ QGDHを固定化した電極を用い、 対極 （例えば白金電極） および参照電極 （例 えば AgZAg C l電極） を用いる。 カーボン電極に一定の電圧を印加して、 電 流が定常になった後、 グルコースを含む試料を加えて電流の增加を測定する。 標 準濃度のグルコース溶液により作製したキヤリブレーションカーブに従い、 試料 中のグルコース濃度を計算することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また、 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2003-71760ならびに 2002-196 1 77号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引 用する。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されることはない。 実施例 1
改変型酵素 P Q Q G D H遺伝子の構築
配列番号 2に示される Acinetobacter calcoaceticus由来 PQQGDHの構造 遺伝子をもとに、 変異の導入を行った。 プラスミド pGB2は、 ベクター pTr c 99 A (ファノレマシア社製） のマノレチクローニング部位に、 Acinetobacter calcoaceticus由来 PQQGDHをコードする構造遺伝子を揷入したものである (図 1 ) 。 常法に従って部位特異的変異法により 192番目のグルタミン残基ま たは 193番目のロイシン残基をコードする塩基配列を、 それぞれァラニン残基、 グリシン残基、 メチォニン残基、 トリブトファン残基、 またはリジン残基をコー ドする塩基配列に置換した。 さらに、 167番目のァスパラギン酸残基または 4 52番目のァスパラギン残基をコードする塩基配列を、 それぞれグルタミン酸残 基またはグリシン残基をコードする塩基配列に置換した。 部位特異的変異はブラ スミ ド pGB2を用いて、 図 2に示す方法により行った。 変異に用いた合成オリ ゴヌクレオチドターゲットプライマーの配列を表 1に示す。 2力所の変異を有す る変異体を作成するためには、 2種類のオリゴヌクレオチドターゲットプライマ 一を同時に用いて上記と同様に変異を導入した 表 1
Figure imgf000013_0001
ベクタープラスミド p KF l 8 k (宝酒造 （株） ） に Acinetobacter ' calcoaceticus 由来 P Q Q GDHをコードする遺伝子の一部を含む Kpn I-Hind III断片を組み込み、 これをテンプレートとした。 このテンプレート 5 0 f mo 1と宝酒造 （株） 製 Mu t a n (登録商標） 一E x p r e s s Kmキットに付 属のセレクションプライマ一 5 pmo 1、 リン酸化したターゲットプライマー 5 0 p mo 1を全体 (20 μ 1 ) の 1/1 0量の同キットのァニーリングバッファ 一とともに混合し、 1 0 0°C、 3分間の熱処理でプラスミドを変性させ、 1本鎖 にした。 セレクションプライマーは p KF 1 8 kのカナマイシン耐性遺伝子上に ある二重のァンパー変異を復帰させるためのものである。 これを 5分間氷上に置 き、 プライマーをァエーリングさせた。 これに 3 μ 1の同キットェタステンショ ンバッファー、 1 1の丁4 DNAリガーゼ、 1 1の丁4 DNAポリメラ ーゼおよび 5 μ 1の滅菌水を加えて相補鎖を合成した。 これを DN Αのミスマツ チ修復能欠損株である E.coli BMH 7 1 - 1 8 mutSに形質転換し、 ー晚振と う培養を行ってプラスミドを増幅させた。
次に、 ここから抽出したプラスミドを E.coli MV 1 1 84に形質転換し、 そ のコロニーからプラスミドを抽出した。 そしてこれらのプラスミドについてシー クエンスを行い、 目的とした変異の導入を確認した。 この断片を、 プラスミド p GB 2上の野生型 PQQGDHをコードする遺伝子の Kpn I-Hind III断片と入 れ替え、 改変型 PQQGDHの遺伝子を構築した。 実施例 2
改変型酵素の調製
野生型または改変型 PQQGDHをコードする遺伝子を、 E. c o 1 i用の発 現ベクターである p T r c 9 9 A (フアルマシア社） のマルチクローニングサイ トに揷入し、 構築されたプラスミドを E.coli DH 5 ひ株に形質転換した。 これ を 4 5 Om 1の L培地 (アンピシリン 5 0 μ g/m 1、 クロラムフエ二コール 3 O i g/m l含有） で坂口フラスコを用いて 3 7°Cでー晚振とう培養し、 ImM C a C l 2、 5 0 0 ^MPQQを含む 7 1の L培地に植菌した。 培養開始後約 3 時間でィソプロピルチオガラクトシドを終濃度 0. 3 mMになるように添加し、 その後 1. 5時間培養した。 培養液から遠心分離 （5000X g、 1 0分、 4°C) で菌体を回収し、 この菌体を 0. 8 5 %N a C 1溶液で 2回洗浄した。 集菌した 菌体をフレンチプレスで破石 φし、 遠心分離 (10000X g 1 5分、 4°C) で未破 砕の菌体を除去した。 上清を超遠心分離 （160500 X g (40000r.p.m.)、 9 0分、 4°C) し、 水溶性画分を得た。 これを粗精製酵素標品として以下の実施例におい て用いた。 実施例 3
酵素活性の測定
実施例 2で得られた野生型およぴ各改変型 PQQGD Hの粗精製酵素標品をそ れぞれ l iMP QQ、 I mM C a C 1 2存在下で 1時間以上ホロ化した。 これ を 1 8 7 1ずつ分注し、 3 μ 1の活性試薬 ( 6 mMD C I P 4 8 1 , 60 0 mMPMS 8 μ I , 1 0 mMリン酸緩衝液 ρ Η 7. 0 1 6 z l ) および各濃 度の D—グルコース溶液 10 μ 1を加え、 酵素活性を測定した。
酵素活性の測定は、 室温にぉレ、て、 10 mM MO P S-Na OH緩衝液 ( p H7. 0) 中において PMS (フエナジンメ トサルフェート) -DC I P (2, 6—ジクロロフエノーノレインドフエノール） を用レヽ、 DC I Pの 600 nmの吸 光度変化を分光光度計を用いて追跡し、 その吸光度の減少速度を酵素の反応速度 とした。 このとき、 1分間に 1 μιηο 1の DC I Pが還元される酵素活性を 1ュ ニットとした。 また、 DC I Pの pH 7. 0におけるモル吸光係数は 16. 3m M一1とした。
基質濃度対酵素活性のプロットから、 Kmを求めた。 結果を表 2に示す。 表 2
Figure imgf000015_0001
実施例 4
基質特異性の評価
各改変型酵素の粗精製酵素標品について基質特異性を調べた。 実施例 2で得ら れた野生型およぴ各改変型 P Q Q G D Hの粗精製酵素標品をそれぞれ 1 M P Q Q、 1 mM C a C 12存在下で 1時間以上ホロ化した。 これを 187 μ 1ずつ 分注し、 3 1の活性試薬 （ 6 mM DC I P, 60 OmM PMS, 10 mM リン酸緩衝液 pH 7. 0を含む） および基質を加えた。 基質として、 それぞれ終 濃度 2 OmMまたは 10 OmMとなるように 400 mMのグルコースまたは他の 糖を加え、 室温で 30分間ィンキュベートして、 実施例 3と同様に酵素活性を測 定した。 値はグルコースを基質としたときの活性を 1 0 0 %とし、 .れに対する 相対活性で表した。 結果を表 3— 6に示す。
表 3
Figure imgf000016_0002
表 4
Figure imgf000016_0001
表 5 野生型 Glnl92Lsu Glnl92Phe Glnl92Ser Glnl92Asp 纖渡 20mM lOOmM 20mM lOOmM 20mM 20mM 20mM lOOm クレコース 100(%) 100(%) 100(%) 100(%) 100(%) 100(%) 100(%) 100(%
0 5 0 0 0 2 0 0 グンレコース
ンノース 7 9 0 0 2 5 0 0 ァロース 41 65 70 78 31 41 26 17
3O-m- 80 97 84 90 62 89 46 50 グンレコース
ガラクトース 8 6 23 20 61 19 1 2 キシロース 5 8 17 26 28 7 0 0 ラク卜ース 58 59 63 54 105 66 57 53 マルトース 67 55 55 36 31 35 8 1 セロビ;^ ~ス 85 44 90 55 148 82
表 6
Figure imgf000018_0001
また、 二重変異を有する本発明の改変型酵素を用いて、 酵素活性を測定した結 果を表 7—8に示す。 本発明の改変型酵素はいずれも、 マルトースに対する反応 性と比較してグルコースに対する高レ、反応十生を示した。 表 7
As l67Glu/ Glnl92Gly/
Asn452Thr Asn452Thr
20mM 20mM
グノレコース 100(%) 100(ο/ο)
ァロース 2 32
3-O-m-ダル 4 98
コ一ス
ガラクトース 2 14
マノレトース 2 46
ラクトース 12 21
表 8
Aspl67Glu Aspl67Glu/ Aspl67 Aspl67Glu A l£ul92Ala l£ul92G¾^ Glu/Gln Glnl92Ser
192l£u
纖濃ス 20mM lOQmM 20mM lOQmM 2QmM lOQmM lOQmM 20mM lOQmM 2Qm クレコース ιοο(%) ioo(%) ioo(%) ioo(%) ioo(%) ioo(%) 100(%) ioo(%) ioo(%) ioo( —ア^^ rン 0 5 0 0 0 0 (J 0 0 2 シノレ 人
7 9 1 0 0 0 U 0 0 2 ァロース 41 65 6 5 6 7 2 1 0 16
3 -m- 80 97 2 4 6 8 2 0 0 9 グンレコース
ガラクトース 8 6 5 7 1 4 21 3 0 10 キシ ス 5 8 0 1 0 0 5 0 0 3 ラクトース 58 59 58 61 50 43 57 61 43 49 マル卜ース 67 55 11 11 1 5 22 6 3 42 セロビ;^ ~ス 85 44 107 215 130 195 240 131
実施例 5
基質濃度依存性
本発明の改変型 P QQGDHの活性の基質濃度依存性を調べた。 各改変型酵素 を、 1 MPQQ、 ImM C a C 1 2存在下で 1時間以上ホロ化し、 各種濃度 のグルコースおよび 5 iMPQQ, 1 OmM C a C 1 2存在下で酵素活性を測 定した。 方法は実施例 3に記載の酵素活性の測定法に準じ、 DC I Pの 600 η mの吸光度の変化を指標とした。 結果を図 3に示す。 本発明の改変型 PQQGD Hは、 野生型と比較して高いグルコース濃度において飽和する。 また、 いずれも グルコース濃度 20 OmMまで基質阻害が見られず、 K s iは 20 OmM以上で めった。 実施例 6 実施例 2で得られた野生型および Glnl92Asp粗精製酵素をそれぞれ 10 mM リン酸緩衝液 p H 7. 0で平衡化した陽ィオン交換ク口マトグラフィ一用充填力 ラム TSKg e l CM— TOYOPEARL 650M (東ソ一株式会社） に 吸着させた。 このカラムを 1 OmMリン酸緩衝液 pH 7. 0、 75 Omlで洗浄 した後、 0— 0. 2M Na C 1を含む 1 OmMリン酸緩衝液 pH7. 0を用い、 酵素を溶出させた。 流速は 5m lZm i nで行った。 GDH活性を有する画分を 回収し、 10 mM MO PS-NaO H緩衝液 (pH 7. 0 ) でー晚透析した。 このようにして電気泳動的に均一な改変型 P QQGDH蛋白質を得た。 得られた 精製酵素標品について、 各基質に対する酵素活性を測定した。 結果を表 9— 10 に示す。 表 9 野生型 Glul92Asp
Km Vmax kcat kcat/Km Km Vmax kcat ImMJ I T U T//—mg、 (sec ) m ΆiV IlV -Λ
丄 - · s〜ec一 -1、
丄 J I U/mg secり v ガ QQQ ン、ノ|レ o.U 4 )丄 (J do U 丄 t)4、上 UU% ου.υ 4/0 QUO ァ πζ· ~ス 35.5 2997 2509 71(46%) 57.2 226 189
3O-m- 28.7 3596 3011 105(68%) 64.4 310 260 グルコース
ガラクトース 5.3 277 232 44(29%) 118.9 137 115 ラクトース 18.9 1982 1659 88(57%) 75.0 390 327 マル卜ース 26.0 2305 1930 74(48%) 95.8 77 64
表 10
Figure imgf000022_0001
実施例 7
酵素センサ一の作製および評価
5ュニットの C¾nl92Ak改変型酵素にカーボンペースト 20 m gを加えて凍結 乾燥させた。 これをよく混合した後、 既にカーボンペース トが約 4 Omg充填さ れたカーボンペース ト電極の表面だけに充填し、 濾紙上で研磨した。 この電極を 1 %のグルタルアルデヒドを含む 10 mM MOPS緩衝液 （ p H 7. 0 ) 中で 室温で 30分間処理した後、 20 mMリジンを含む 10 mM MOPS緩衝液
( p H 7. 0 ) 中で室温で 20分間処理してダルタルアルデヒドをブ口ッキング した。 この電極を 10 mM MOPS緩衝液 (pH7. 0 ) 中で室温で 1時間以 上平衡化させた。 電極は 4 °Cで保存した。
作製した酵素センサーを用いてダルコース濃度の測定を行つた。 本発明の改変 型 PQQGDHを固定化した酵素センサーを用いて、 0. 1 mM— 5 mMの範囲 でグルコースの定量を行うことができた。 産業上の利用性
本発明の改変型水溶性 P Q Q G D Hは、 グルコースに対する選択性が髙レ、ため、 血中グルコース測定用センサーの素子として有用である。

Claims

請求の範囲
1 . ピロロキノリンキノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素にお いて、 天然の水溶性グルコース脱水素酵素の 1またはそれ以上のァミノ酸残基が 他のアミノ酸残基で置換されており、 かつ前記天然の水溶性ダルコース脱水素酵 素と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース脱水素酵 素。
2 . ピロ口キノリンキノンを捕酵素とするグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの第 1 8 6残基から第 2 0 6残基の領域または他の種における同等の領域において 1またはそれ以上のァ ミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改変型ダルコ ース脱水素酵素。
3 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶性 P Q Q G D Hの 1 9 2番目のグルタミ ン残基もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で 置換されている改変型ダルコース脱水素酵素。
4 . ピロロキノリンキノンをネ翁酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基が他のァミノ 酸残基で置換されてレ、る改変型グルコース脱水素酵素。
5 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基がァ ラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フヱニルァラ二 ン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されている、 請求項 4記 載の改変型ダルコース脱水素酵素。
6 . ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基と 1 6 7番目 のァスパラギン酸残基が同時に他のァミノ酸残基で置換されている改変型ダルコ ース脱水素酵素。
7 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基 が他のァミノ酸残基で置換されており、 かつ 1 9 2番目のグルタミン残基がァラ ニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエ二ルァラニン 残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されている、 請求項 6記載 の改変型グルコース脱水素酵素。
8. 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基 がグルタミン酸残基で置換されており、 かつ 1 9 2番目のグルタミン残基がァラ ニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエ二ルァラニン 残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されている、 請求項 6記載 の改変型ダルコース脱水素酵素。
• 9 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基が他のァ ミノ酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基が他のアミノ 酸残基で置換されている改変型ダルコース脱水素酵素。
1 0 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基 がグルタミン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基が他 のアミノ酸残基で置換されている、 請求項 9記載の改変型グルコース脱水素酵素。
1 1 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 6 7番目のァスパラギン酸残基 がグルタミン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基がト レオニン残基で置換されている、 請求項 9記載の改変型ダルコース脱水素酵素。
1 2 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基が他のァミノ 酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2番目のァスパラギン残基が他のァミノ酸残 基で置換されている改変型グノレコース脱水素酵素。
1 3 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基がァ ラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエ二ルァラ二 ン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2 番目のァスパラギン残基が他のアミノ酸残基で置換されている、 請求項 1 2記載 の改変型ダルコース脱水素酵素。
1 4 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 2番目のグルタミン残基がァ ラニン残基、 グリシン残基、 グルタミン酸残基、 ロイシン残基、 フエエルァラニ ン残基、 セリン残基、 またはァスパラギン酸残基で置換されており、 かつ 4 5 2 番目のァスパラギン残基がトレオニン残基で置換されている、 請求項 1 2記載の 改変型ダルコース脱水素酵素。
1 5 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 Acinetobacter calcoaceticus 由来水溶'!"生 P Q Q G D Hの 1 9 3番目のロイシン 残基もしくは他の種における同等の位置のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基で置 換されている改変型グルコース脱水素酵素。
1 6 . ピロ口キノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 9 3番目のロイシン残基が他のアミノ酸 残基で置換されている改変型ダルコース脱水素酵素。
1 7 . 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の 1 9 3番目のロイシン残基が、 ァ ラニン残基、 グリシン残基、 メチォニン残基、 トリブトファン残基、 またはリジ ン残基で置換されている、 請求項 1 6記載の改変型グルコース脱水素酵素。 1 8 . ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素において、 配列
Gly-Arg-Asn-Xaal-Xaa2-Ala-Tyr-Leu
(式中、 Xaal、 Xaa2、 は任意の天然アミノ酸残基である、 ただし、 Xaalが Ginであるとき Xaa2は Leuではない）
を含むことを特徴とする改変型グルコース脱水素酵素。
1 9 . Xaal力 S Ala、 Gly、 Glu、 Leu、 Phe、 Serまたは Aspであり、 Xaa2力 S Alaまたは Glyである、 請求項 1 8記載の改変型ダルコース脱水素酵素。
2 0 . 請求項 1— 1 9のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素をコー ドする遺伝子。
2 1 . 請求項 2 0に記載の遺伝子を含むベクター。
2 2 . 請求項 2 0に記載の遺伝子を含む形質転換体。
2 3 . 請求項 2 0に記載の遺伝子が主染色体に組み込まれてレヽる、 請求項 2 2 記載の形質転換体。
2 4 . 請求項 1一 1 9のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含む グノレコースアツセィキット。
2 5 . 請求項 1— 1 9のいずれかに記載の改変型グルコース脱水素酵素を含む グノレコースセンサー。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1367120A2 (en) * 2002-05-27 2003-12-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
US7479383B2 (en) 2003-09-08 2009-01-20 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI224136B (en) * 1999-04-30 2004-11-21 Koji Sode Glucose dehydrogenase
JP5824205B2 (ja) * 2010-10-27 2015-11-25 アークレイ株式会社 変異グルコース脱水素酵素
CN105331590B (zh) * 2015-10-29 2020-02-28 英科隆生物技术（杭州）有限公司 葡萄糖特异性改善的可溶性吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶突变体、聚核苷酸及其应用
CN111073866B (zh) * 2015-10-29 2024-03-19 英科隆生物技术（杭州）有限公司 PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及其在葡萄糖检测中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001346587A (ja) * 2000-06-08 2001-12-18 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
EP1167519A1 (en) * 1999-04-08 2002-01-02 Koji Sode Glucose dehydrogenase
EP1176202A1 (en) * 1999-04-30 2002-01-30 Koji Sode Glucose dehydrogenase
WO2002034919A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Roche Diagnostics Gmbh Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1367120A3 (en) * 2002-05-27 2004-06-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1167519A1 (en) * 1999-04-08 2002-01-02 Koji Sode Glucose dehydrogenase
EP1176202A1 (en) * 1999-04-30 2002-01-30 Koji Sode Glucose dehydrogenase
JP2001346587A (ja) * 2000-06-08 2001-12-18 Koji Hayade 基質特異性に優れたグルコース脱水素酵素
WO2002034919A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-02 Roche Diagnostics Gmbh Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1544292A4 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1367120A2 (en) * 2002-05-27 2003-12-03 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
EP1367120A3 (en) * 2002-05-27 2004-06-02 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
US7476525B2 (en) 2002-05-27 2009-01-13 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability
US7479383B2 (en) 2003-09-08 2009-01-20 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity
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