JP6504390B2 - 改変型ピラノース酸化酵素 - Google Patents

Description

本発明は、改変型ピラノース酸化酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いたピラノースの測定方法、測定試薬組成物及びバイオセンサに関する。

ピラノース酸化酵素は、グルコースや他のピラノースを酸化し、酸素に電子を供与して過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である（特許文献１及び特許文献２）。該酵素は、糖尿病のマーカーである１，５−アンヒドログルシトール（１，５−ＡＧ）を基質とするため、糖尿病の診断薬に利用されている。

１，５−ＡＧは、食事等による影響を受けにくい糖尿病診断マーカーとして重要であり、更に、糖尿病予備軍である食後高血糖の診断マーカーとしても注目されている。１，５−ＡＧの測定法の中には、基質の電子を酵素がメディエータへ供与する工程を含む、メディエータが介在した測定法がある。ピラノース酸化酵素は、メディエータだけでなく、酸素へも電子を供与してしまうため、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があった。このため、血中の溶存酸素の影響を受けにくい酵素が求められていた。

ピラノース酸化酵素は種々の由来酵素が知られており、アミノ酸配列も開示されている（特許文献３及び非特許文献１〜５）。

特開平０２−４２９８０号公報 特開２００７−３００８１８号公報 ＵＳ６１４６８６５号公報

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ ９：５７（２０１０） Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５７９４―５８００（２００４） Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６７：６５４―６６３（２００５） Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２：１１―２０（１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３１、１２２３―１２２８（２００９）

本発明は、酸素の影響を受けにくい改変型ピラノース酸化酵素及びその製造方法を提供する。更に、該酵素によるピラノースの測定方法、測定試薬組成物及びセンサを提供することを目的とする。

本発明は、ピラノース酸化酵素（ＰＯＤ）のアミノ酸を置換することで、酸素の影響を受けにくいという優れた特性を有する改変型ピラノース酸化酵素を取得できることを見出した。更に、該酵素をコードするポリヌクレオチドを用いて該酵素を効率的に製造できるということ、及び該酵素を用いて酸素の影響を受けにくいピラノース測定が可能なことを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］に関する。
［態様１］
ピラノース酸化酵素のアミノ酸配列において、
配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含み、
改変前のピラノース酸化酵素に比べて、蛋白量あたりのピラノース脱水素酵素活性（ＰＤＨ比活性）と蛋白量あたりのピラノース酸化酵素活性（ＰＯＤ比活性）との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）が大きくなっている、改変型ピラノース酸化酵素。
［態様２］
ピラノース酸化酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であって、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列において、
配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含む、
態様１記載の改変型ピラノース酸化酵素。
［態様３］
Ｐ１４７に対応する位置のアミノ酸がプロリンであり、Ｌ２１４に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、Ｌ２１６に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、Ｑ４２１に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、Ｈ４２３に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、及びＦ４４７に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、態様１又は２記載の改変型ピラノース酸化酵素。
［態様４］
Ｐ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンに置換された、態様１〜３の何れか１項に記載の改変型ピラノース酸化酵素。
［態様５］
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素のＰＤＨ／ＰＯＤを１倍とした場合に、ＰＤＨ／ＰＯＤが少なくとも２倍である、態様１〜４の何れか１項に記載の改変型ピラノース酸化酵素。
［態様６］
態様１〜５の何れか１項に記載の改変型ピラノース酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
［態様７］
態様６記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［態様８］
態様７記載のベクターで形質転換された形質転換細胞。
［態様９］
態様８の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型ピラノース酸化酵素を採取することを特徴とする、改変型ピラノース酸化酵素の製造方法。
［態様１０］
態様１〜５の何れか１項に記載の改変型ピラノース酸化酵素を使用するピラノース測定方法。
［態様１１］
態様１〜５の何れかに１項記載の改変型ピラノース酸化酵素を含むピラノース測定試薬組成物。
［態様１２］
態様１〜５の何れかに１項記載の改変型ピラノース酸化酵素を含むピラノース測定用バイオセンサ。

本発明により、酸素の影響を受けにくいという優れた特性を有する改変型ピラノース酸化酵素を利用することが可能になった。更に、本発明の改変型ピラノース酸化酵素を効率的に製造できるようになり、酸素が存在する試料においても、該酵素を用いてより正確なピラノース測定が可能になった。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素の評価結果を示す図である。各酵素のＰＯＤ比活性（蛋白量あたりのＰＯＤ活性）を白い棒、各酵素のＰＤＨ比活性（蛋白量あたりのＰＤＨ活性）をストライプの棒で示した。三角及び数値は、ＷＴの改変率（倍）を１倍としたときの、各改変型酵素の改変率（倍）を示した。 本発明の改変型ピラノース酸化酵素による１，５−ＡＧの測定結果を示す図である。 本発明の改変型ピラノース酸化酵素によるグルコースの測定結果を示す図である。 配列番号２、９、１０、１１、１２、１３及び１４をＵｎｉＰｒｏｔのＡｌｉｇｎで、Ｒｕｎ Ａｌｉｇｎした結果に、改変位置を四角で囲んで示した図である。

本明細書の“改変型酵素”とは、ピラノース酸化酵素を構成する一部のアミノ酸を別のアミノ酸に置換した酵素である。
本明細書の“酸素への電子供与能”とは、酵素が、基質であるピラノースから受け取った電子を酸素に供与する能力である。本発明では、後述のピラノース酸化酵素活性測定法により測定した。
本明細書の“メディエータへの電子供与能”とは、酵素が、基質であるピラノースから受け取った電子をメディエータに供与する能力である。本発明では、後述のピラノース脱水素酵素活性測定法により測定した。
本発明の“改変率（倍）”とは、各酵素の蛋白量あたりのピラノース脱水素酵素活性（ＰＤＨ比活性）と蛋白量あたりのピラノース酸化酵素活性（ＰＯＤ比活性）との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）を算出し、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素（ＷＴ）のＰＤＨ／ＰＯＤを１倍とした場合の、各改変型酵素のＰＤＨ／ＰＯＤの倍率である。尚、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素（ＷＴ）のＰＤＨ／ＰＯＤは、０．６３である。

本明細書ではアミノ酸残基を１文字表記で表現することがあり、アラニンはＡ、ロイシンはＬ、イソロイシンはＩ、フェニルアラニンはＦ、グルタミンはＱ、ヒスチジンはＨ、プロリンはＰで表す。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、
ピラノース酸化酵素のアミノ酸配列において、
配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含む。尚、該改変型ピラノース酸化酵素は改変前のピラノース酸化酵素に比べて、ＰＤＨ／ＰＯＤが大きくなっている。

改変前のピラノース酸化酵素のアミノ酸配列は、ピラノース酸化酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であれば特に限定されず、公知のピラノース酸化酵素配列を利用できる。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔのＰ５９０９７、Ｑ７５ＺＰ８、Ｑ６ＱＷＲ１、Ｑ６ＵＧ０２、Ｐ７９０７６及びＢ９Ｖ８Ｍ９の配列が例示できる。好ましくは、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列であり、該配列と相同性を有する配列でも良い。更に、該配列を有するタンパク質は、ピラノース酸化酵素活性を有する。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、
（ａ）配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号２、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。尚、改変前のタンパク質である、前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、何れもピラノース酸化酵素活性を有する。

相同性を有するとは、類似性が好ましくは少なくとも９０％、又は９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列である。又は同一性が好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％又は９５％のアミノ酸配列である。

類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス製）のアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙの値に基づく。
同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス製）の塩基配列同士又はアミノ酸配列同士のホモロジー解析により算出されたｉｄｅｎｔｉｔｙの値に基づく。

１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたとは、好ましくは多くとも６０個、より好ましくは多くとも５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１０個又は５個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加である。

ピラノース酸化酵素のアミノ酸配列において「配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置」という表現は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の開始アミノ酸であるメチオニン（Ｍ）を１番目とした場合の１４７番目のプロリン、２１４番目のロイシン、２１６番目のロイシン、４２１番目のグルタミン、４２３番目のヒスチジン又は４４７番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸を意味し、配列番号２との配列アライメントにより特定できる。例えば図４に示したように対応する位置を特定できる。

対応する位置のアミノ酸は、Ｐ１４７に対応するのはプロリンであることが好ましく、Ｌ２１４に対応するのはロイシンであることが好ましく、Ｌ２１６に対応するのはロイシン又はイソロイシンであることが好ましく、ロイシンであることがより好ましく、Ｑ４２１に対応するのはグルタミンであることが好ましく、Ｈ４２３に対応するのはヒスチジンであることが好ましく、Ｆ４４７に対応するのはフェニルアラニンであることが好ましい。

また、置換するアミノ酸について、アラニンであることが好ましい。つまり、Ｐ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンに置換されることが好ましい。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、ピラノース脱水素酵素（ＰＤＨ）比活性とピラノース酸化酵素（ＰＯＤ）比活性との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）が改変前のピラノース酸化酵素より大きく、好ましくは少なくとも１．０であり、より好ましくは少なくとも１．２、１．５又は２．０であって、改変前のピラノース酸化酵素に比べ、酸素の影響を受けにくい。更に、本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素のＰＯＤ比活性を１００％とした場合に、ＰＯＤ比活性が好ましくは多くとも９０％、８０％、７０％又は６０％である。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素のＰＤＨ比活性とＰＯＤ比活性との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）を１倍とした場合に、ＰＤＨ／ＰＯＤが好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍、３倍、４倍又は５倍である。つまり、改変率（倍）が好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも２．５倍、３倍、４倍又は５倍である。

本発明のポリヌクレオチドは、態様１〜５の何れかに記載の改変型ピラノース酸化酵素をコードするポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドは、イントロンを含む配列であっても良く、ｃＤＮＡでも良い。例えば、配列番号２、９、１０、１１、１２、１３又は１４で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが例示できる。

本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法で容易に調製することができる。例えば、前記の本発明のポリヌクレオチドを鋳型とし、適切なプライマーセットを用いた公知の各種ＰＣＲ法を利用して、変異を導入することにより調製することができる。又は、人工的に合成しても良い。形質転換細胞に応じてコドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドでも良い。

鋳型となるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の配列を合成しても良い。又は、配列番号２記載のアミノ酸配列を用いて、公開配列に対して例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ）等のホモロジー検索を行って、ヒットした類似性及び／又は同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列も利用できる。公開配列からプライマーをデザインし、該遺伝子配列の由来株のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲにより増幅して得ることができる。公開配列の由来株と同種又は同属の株からも得ることができる。又は、公開配列情報から人工的に合成できる。類似性は、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９８％である。同一性は、好ましくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％又は９５％である。尚、配列番号１に記載の配列は野生型のピラノース酸化酵素のアミノ酸配列である配列番号２の配列をコードする塩基配列である。

本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、ベクターは適宜選択し、インサートとして本発明のポリヌクレオチドを含む。インサートは、宿主が真核細胞の場合、イントロンを含んでいても良い。発現ベクターとしては、原核細胞発現用ベクター又は真核細胞発現用ベクターの何れでも良く、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システム等が例示できるが、タンパク質の大量発現が可能なベクターが好ましい。尚、必要に応じて、シャペロンやリゾチーム等の発現に寄与するポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同一及び／又は別のベクターに導入することも可能である。

本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属等の子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができ、本発明のベクターで形質転換させて得ることができる。

本発明の形質転換細胞を培養して得られた培養物から改変型ピラノース酸化酵素を採取することによって、組換え改変型ピラノース酸化酵素を製造することができる。

本発明で使用される改変型ピラノース酸化酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸等のアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。ビタミン類としては、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン（ニコチン酸）、チアミン等が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等が使用できる。更に、タンパク質の発現の調整に必要な化合物を適宜添加しても良い。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法により行うのが良い。改変型ピラノース酸化酵素生産菌の特性を踏まえて、改変型ピラノース酸化酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は１０℃から４５℃、且つｐＨ４からｐＨ１０の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は回分培養であれば、１日から６日の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。

培養物中から改変型ピラノース酸化酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初に改変型ピラノース酸化酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれる改変型ピラノース酸化酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等の精製操作を組み合わせることによって精製できる。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素を用いて、ピラノースを測定することができる。本発明のピラノース測定方法は、ピラノースを含む被検試料と本発明の改変型ピラノース酸化酵素とを接触させる工程を備えることにより、被検試料中のピラノースを定量できる。測定対象は、本発明の酵素が作用するピラノースであれば特に限定されない。例えば、グルコース測定用、キシロース測定用、ガラクトース測定用又は１，５−ＡＧ測定用として有用である。本発明の酵素は酸素の影響を受けにくいため、溶存酸素の影響を受ける測定系であっても、本発明の酵素を用いることで正確な測定値が得られる。本発明の測定対象は特に限定されないが、例えば生体試料が例示でき、具体例として血液試料が例示できる。更に、本発明の測定法は、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質を消去、分離又は除去するステップと組み合わせることができる。例えば、１，５−ＡＧを測定対象とする場合は、グルコースを消去、分離又は除去する工程と組み合わせることができる。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素を用いて、ピラノース測定試薬組成物を製造することができ、該酵素を含むピラノース測定試薬組成物を簡便に製造することが可能となった。本発明の試薬組成物は、酵素として本発明の改変型ピラノース酸化酵素を含む試薬組成物であれば良い。該組成物中の酵素量は、測定対象を測定できれば特に限定されないが、０．０００１から５０Ｕ程度が好ましく、０．００１から２０Ｕ程度がより好ましい。更に、任意のメディエータ（電子受容体）を含ませることができ、例えば、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等が例示できる。また、該組成物は、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等が例示できる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を、該測定試薬に含ませることができる。

本発明の改変型ピラノース酸化酵素を使用したバイオセンサを製造できる。本発明のバイオセンサは、酵素として本発明の改変型ピラノース酸化酵素を反応層に含むセンサであれば良い。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着等の方法を利用して電極系を形成し、更に該酵素とメディエータとを備えることによって作製される。この他に、発色強度又はｐＨ変化等を検知する方式のバイオセンサも構築可能である。酸素の影響を受けにくい、グルコースセンサ、キシロースセンサ、ガラクトースセンサ又は１，５−ＡＧセンサ等を作製することができる。

更に本発明の改変型ピラノース酸化酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及び改変型ピラノース酸化酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。

以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。

［実施例１］
（変異導入遺伝子の取得）
変異導入用プライマーを用いてＰＣＲにより変異導入を行った。具体的には、テンプレートのアンチセンス鎖に、５’側をリン酸化させたプライマーをアニールさせ、ポリメラーゼで伸長させた。伸長したＤＮＡ断片を同反応液中でＤＮＡリガーゼを用いてつなぎ、変異導入された部分以外が鋳型と相補的なものを得るという手法で行った。

（１）変異導入用プライマー
ピラノース酸化酵素（ＰＯＤ）遺伝子に部位特異的変異を導入するために、下記のようなプライマーをデザインし、合成した。
配列番号２のアミノ酸配列の１４７番目のプロリン（Ｐ）をアラニン（Ａ）に置換させる（Ｐ１４７Ａ）ためのプライマーをPROD-P147A（配列番号３）とした。同様に、その他のアミノ酸置換用のプライマーを、PROD-L214A、PROD-L216A、PROD-Q421A、PROD-H423A及びPROD-F447A（配列番号４〜８）とした。
PROD-P147A：5’TGGACCTGCGCTACAGCGGAGTTCTTCAAGGAA 3’（配列番号３）
PROD-L214A：5’CGCGGTATCAAACCTGCCCCGCTCGCATGTCAT 3’（配列番号４）
PROD-L216A：5’ATCAAACCTCTCCCGGCCGCATGTCATCGTCTT 3’（配列番号５）
PROD-Q421A：5’TTCCCTTGGCACGCAGCGATTCATCGCGACGCG 3’（配列番号６）
PROD-H423A：5’TGGCACGCACAGATTGCTCGCGACGCGTTCAGC 3’（配列番号７）
PROD-F447A：5’GTCGACCTAAGGTTCGCTGCTCGTCAGGCCAGA 3’（配列番号８）

（２）プライマーの５'リン酸化
１００μM プライマー ２μl、１０× Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ５μl、０．１M ＡＴＰ １．０μl、滅菌水 ４１μl及び１０Ｕ／μｌ Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ １μlを混合し、３７℃で６０分間インキュベートした。これにより、５’側リン酸化プライマーを調製した。

（３）変異導入用ＰＣＲ
未変異のＰＯＤ遺伝子をプラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）のマルチクローニングサイトにあるＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した、プラスミドｐＥＴ２１ａ（＋）／ＰＯＤを変異導入ＰＣＲのテンプレートとした。尚、該ＰＯＤ遺伝子配列は、配列番号１に記載の塩基配列である。

５’リン酸化プライマー ４μl、テンプレート(ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＰＯＤ) １００ｎｇ、１０× ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μl、１０× ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ２．５μl、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ １μl、２．５Ｕ／μl ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｐｆｕ） １μl及び４０Ｕ／μl Ｔａｑ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ ０．５μlに滅菌水を加え、５０μｌのＰＣＲ反応液とした。各プライマーについてＰＣＲ反応液を調製し、下記反応条件でＰＣＲを行った。

（反応条件）
１）６５℃ ５分
２）９５℃ ２分
３）９５℃ ３０秒
４）５０℃ ３０秒
５）６５℃ １０分
上記の３）〜５）を３０サイクル繰り返す
６）７５℃ １０分

（４）ＤｐｎＩ処理
各ＰＣＲ産物にＤｐｎＩを１μl加えて３７℃で１時間インキュベートすることで、テンプレートプラスミドを分解した。

（５）変異導入遺伝子の取得
ＤｐｎＩ処理後の各サンプルで、各大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。培養した各大腸菌からプラスミド抽出を行った。抽出した各プラスミドベクターの挿入部分の塩基配列を解析した結果、挿入部分のＰＯＤ遺伝子には何れも目的の変異が導入されていたことが確認できた。変異導入遺伝子を含む各プラスミドベクターを、ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｐ１４７Ａ、ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｌ２１４Ａ、ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｌ２１６Ａ、ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｑ４２１Ａ、ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｈ４２３Ａ及びｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｆ４４７Ａとした。

［実施例２］
（改変型酵素の活性評価）
（１）変異株の取得
実施例１で得られた変異導入遺伝子を含む各プラスミドベクターで、各大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。変異導入遺伝子を含む各形質転換大腸菌を、変異株とした。各変異株を、液体培地で培養後、遠心分離により集菌した。尚、液体培地は、アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭ含む。

（２）改変型酵素の取得
集菌した各変異株を、ＤＮａｓｅＩを終濃度２．５μｇ／ｍＬ、リゾチームを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加した５０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．５）に懸濁した。該懸濁液を、各々９６ディープウェルに０．４ｍＬずつ分注し、３７℃で１５分インキュベートした。次に、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、和光純薬製）を終濃度１％になるように添加し、３７℃で１５分インキュベートした。更に、該液を−８０℃で凍結させ、３７℃で融解させた。続いて、遠心分離して各々沈殿を除去し、上清（ＣＦＥ）を回収した。回収した各ＣＦＥを、改変型酵素液とした。各改変型酵素を、Ｐ１４７Ａ、Ｌ２１４Ａ、Ｌ２１６Ａ、Ｑ４２１Ａ、Ｈ４２３Ａ及びＦ４４７Ａとした。

（３）ピラノース酸化酵素活性測定法
水２.１ｍＬ、１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）０．１ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ０．２ｍＬ、１２．４ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．２ｍＬ、２１０ｍＭ フェノール０．２ｍＬ及び１Ｍ Ｄ−グルコース０．１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、これに酵素試料０．１ｍＬを加えて、５００ｎｍにおけるΔＯＤ／ｍｉｎを測定し、初速度法により次式を用いて活性を算出した。
ピラノース酸化酵素（ＰＯＤ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ΔＯＤ／ｍiｎ×３．０（ｍL）×酵素の希釈倍率）／（１０．６６×１／２×１．０×酵素添加量（ｍL））
※１０．６６：５００ｎｍにおけるキノンイミン色素の分子吸光係数
※１．０ ：光路長（ｃｍ）
本法により、酸素への電子供与能を測定した。

（４）ピラノース脱水素酵素活性測定法
水０．６１ｍＬ、１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）１ｍＬ、３ｍＭ ＤＣＩＰ ０．１４ｍＬ、３ｍＭ １−ｍ−ＰＭＳ０．２ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース１ｍＬを混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、これに酵素試料０．０５ｍＬを加えて、６００ｎｍにおけるΔＯＤ／ｍｉｎを測定し、初速度法により次式を用いて活性を算出した。
ピラノース脱水素酵素（ＰＤＨ）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ΔＯＤ／ｍiｎ×３．０（ｍL）×酵素の希釈倍率）／（１６．３×１．０×酵素添加量（ｍL））
※１６．３：６００ｎｍにおけるＤＣＩＰの分子吸光係数
※１．０ ：光路長（ｃｍ）
本法により、メディエータへの電子供与能を測定した。

（５）蛋白濃度測定
蛋白濃度測定は、ＢＩＯ−ＲＡＤプロテインアッセイキットを用いたブラッドフォード法によって測定した。測定値は比活性の算出に使用した。

（６）各改変型酵素の評価
（２）で得た各改変型酵素について、前記の方法でＰＯＤ活性、ＰＤＨ活性及び蛋白濃度を測定した。尚、実施例１でＰＣＲのテンプレートに使用したＰＯＤ構造遺伝子を含む形質転換大腸菌を未変異株とした。改変型酵素液と同様に、未変異株からＣＦＥを調製し、未変異型酵素液（ＷＴ）とした。

各測定値から各サンプルのＰＯＤ比活性（Ｕ／ｍｇ）及びＰＤＨ比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。更に、ＷＴのＰＯＤ比活性を１００％として、各サンプルのＰＯＤ比活性の相対値（％）を算出した。表１に結果を示した。
全ての改変型酵素において、ＰＯＤ比活性が低下しており、アミノ酸置換Ｐ１４７Ａ、Ｌ２１４Ａ、Ｌ２１６Ａ、Ｑ４２１Ａ、Ｈ４２３Ａ又はＦ４４７Ａによって、ＷＴに比べて改変型酵素の酸素への電子供与能が６０％以下に低下したことが分かった。

更に、ＰＤＨ比活性とＰＯＤ比活性との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）を算出し、表１に示した。
ＷＴのＰＤＨ／ＰＯＤは０．６２９だった。これは、ＷＴが、メディエータへの電子供与能より、酸素への電子供与能の方が高いことを意味する。これに対し、得られた改変型酵素Ｐ１４７Ａ、Ｌ２１４Ａ、Ｌ２１６Ａ、Ｑ４２１Ａ、Ｈ４２３Ａ又はＦ４４７Ａは、ＰＤＨ／ＰＯＤが１．４６、４．３９、３．１４、５．３３、４４．４又は２３．１と、何れも改変前のピラノース酸化酵素（ＷＴ）に比べてＰＤＨ／ＰＯＤが大きくなっており、具体的には何れもＰＤＨ／ＰＯＤが１．０以上だった。

更に、ＷＴのＰＤＨ／ＰＯＤを１倍とした場合の各改変型酵素のＰＤＨ／ＰＯＤを、改変率（倍）として算出し、表１に示した。
得られた改変型酵素Ｐ１４７Ａ、Ｌ２１４Ａ、Ｌ２１６Ａ、Ｑ４２１Ａ、Ｈ４２３Ａ又はＦ４４７Ａは、改変率（倍）が２．３、７．０、５．０、８．５、７１又は３７と、何れも２倍以上だった。
このことから、本願で得られた改変型酵素は全て、酸素よりもメディエータへ電子を供与する能力が、ＷＴに比べて２倍以上高くなったことが分かった。

以上より、酸素の影響を受けにくい改変型ピラノース酸化酵素が得られたことが分かった。

［実施例３］
（改変型酵素の精製）
ｐＥＴ２１ａ（＋）／Ｈ４２３Ａで形質転換した変異株の培養菌体をリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。続いて、遠心分離して沈殿を除去し、上清（ＣＦＥ）を回収した。回収したＣＦＥを、熱処理した後、硫安分画処理した。処理後のサンプルを脱塩し、最終的に陰イオン交換樹脂（商品名：ＤＥＡＥセルロファインＡ５００ｍ、東ソー製）カラムで夾雑蛋白を除去し、精製酵素を得た。該精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、約７０ｋＤａの単一バンドを示すことを確認した。

［実施例４］
（改変型酵素を用いた１，５−ＡＧの測定）
実施例３で得た精製酵素を使用し、実施例２（４）のＰＤＨ活性測定法に基づき、分光光度計を用いて１，５−ＡＧの定量を行った。基質として、終濃度が０．０１、０．０５、０．１、１．０、１０、２０、５０ｍＭとなるように１，５−ＡＧを添加した。測定結果から酵素活性を算出し、１，５−ＡＧ濃度（０．０１、０．０５、０．１、１．０、１０、２０、５０ｍＭ）に対して相対値（％）でプロットした結果を、図２に示した。
図２に示したように、本発明の改変型ピラノース酸化酵素を用いて、少なくとも０．０１〜５０ｍＭの濃度範囲で１，５−ＡＧの定量が可能であることが分かった。

［実施例５］
（改変型酵素を用いたグルコースの測定）
実施例３で得た精製酵素を使用し、実施例２（４）のＰＤＨ活性測定法に基づき、分光光度計を用いてグルコースの定量を行った。基質として、終濃度が１．０、３．０、１０、２０、５５ｍＭとなるようにグルコースを添加した。測定結果から酵素活性を算出し、グルコース濃度（１．０、３．０、１０、２０、５５ｍＭ）に対して相対値（％）でプロットした結果を、図３に示した。
図３に示したように、本発明の改変型ピラノース酸化酵素を用いて、少なくとも１．０〜５５ｍＭの濃度範囲でグルコースの定量が可能であることが分かった。

Claims (9)

1. 配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列において、
   配列番号２で示されるアミノ酸配列のＰ１４７、Ｌ２１４、Ｌ２１６、Ｑ４２１、Ｈ４２３又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸残基がアラニンに置換され、
   蛋白量あたりのピラノース脱水素酵素活性（ＰＤＨ比活性）と蛋白量あたりのピラノース酸化酵素活性（ＰＯＤ比活性）との比（ＰＤＨ／ＰＯＤ）が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する酵素のＰＤＨ／ＰＯＤを１倍とした場合に、少なくとも２倍である、改変型ピラノース酸化酵素。
2. Ｐ１４７に対応する位置のアミノ酸がプロリンであり、Ｌ２１４に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、Ｌ２１６に対応する位置のアミノ酸がロイシンであり、Ｑ４２１に対応する位置のアミノ酸がグルタミンであり、Ｈ４２３に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、又はＦ４４７に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニンである、請求項１記載の改変型ピラノース酸化酵素。
3. 請求項１又は２に記載の改変型ピラノース酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項３記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
5. 請求項４記載のベクターで形質転換された形質転換細胞。
6. 請求項５の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型ピラノース酸化酵素を採取することを特徴とする、改変型ピラノース酸化酵素の製造方法。
7. 請求項１又は２に記載の改変型ピラノース酸化酵素を使用するピラノース測定方法。
8. 請求項１又は２に記載の改変型ピラノース酸化酵素を含むピラノース測定試薬組成物。
9. 請求項１又は２に記載の改変型ピラノース酸化酵素を含むピラノース測定用バイオセンサ。

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