CN116601286A - 突变葡萄糖脱氢酶 - Google Patents

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Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
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Abstract

本发明提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。包含在序列号1所示的氨基酸序列中第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列的多肽和该多肽的不同体呈现提高的葡萄糖脱氢酶活性。

Description

突变葡萄糖脱氢酶
技术领域
本发明涉及一种突变葡萄糖脱氢酶。更具体而言，本发明涉及一种提高了葡萄糖脱氢酶比活性的多肽、编码该多肽的DNA、重组载体、转化体、酶制剂、以及该多肽的用途。
背景技术
糖尿病患者逐年增加，糖尿病患者、特别是胰岛素依赖性的患者为了控制血糖值，需要日常地监视血糖值。近年来，使用能够使用酶简便且准确地测定的电化学生物传感器的自我血糖测定仪(葡萄糖传感器)被广泛使用。
作为葡萄糖传感器中使用的酶，利用以葡萄糖为底物的葡萄糖氧化酶(以下，也记载为“GO”)或葡萄糖脱氢酶(以下，也记载为“GDH”)。
GO具有对葡萄糖的特异性高、热稳定性优异的优点，另一方面，被指出在使用其的测定中，容易受到测定样品中的溶解氧的影响，溶解氧对测定结果造成影响的问题。为了解决该问题，开发了FAD依赖性的GDH(以下，为FAD-GDH)。但是，已知FAD-GDH对木糖反应，因此，鉴于在糖尿病判定检查时，不仅实施经口葡萄糖负荷试验，还实施经口木糖负荷试验、经静脉木糖负荷试验，在使用FAD-GDH的情况下，在上述负荷试验时对血糖值造成影响成为问题。
因此，作为弥补GO和GDH的两个缺点的酶，在专利文献1中报告取得了使GO突变为GDH的FAD-GDH。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2011/068050号
发明内容
发明所要解决的技术问题
使GO突变的FAD-GDH虽然弥补了GO和GDH的两个缺点，是底物特异性优异的酶，但其比活性有改善的余地。
因此，本发明的目的在于提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人进行了使GO突变的FAD-GDH(序列号1)的X射线晶体结构分析，结果着眼于第538位组氨酸受到空间位阻的可能性，以消除该部位的空间位阻为目的，研究了对附近的第578位蛋氨酸的突变导入。其结果发现，通过导入规定的突变，能够提高比活性。本发明是基于该见解完成的。即，本发明提供以下记载的方式的发明。
项1.如以下(1)～(3)的任一项所示的多肽：
(1)包含在序列号1所示的氨基酸序列中第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基而成的氨基酸序列的多肽，
(2)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，除了导入所述替换的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高，以及
(3)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的除了导入所述替换的氨基酸残基以外的序列一致性为70％以上的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高。
项2.一种DNA，其编码项1所述的多肽。
项3.一种表达盒或重组载体，其包含项2所述的DNA。
项4.一种转化体，其通过项3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。
项5.一种项1所述的多肽的制造方法，其包括培养项4所述的转化体的工序。
项6.一种酶制剂，其包含项1所述的多肽。
项7.一种葡萄糖测定用试剂，其包含项1所述的多肽。
项8.一种葡萄糖测定方法，其包括使用项1所述的多肽测定试样中的葡萄糖的工序。
项9.一种葡萄糖测定用试剂盒，其包含项7所述的葡萄糖测定用试剂。
项10.一种葡萄糖传感器，其包含不溶性支撑体和固定于所述不溶性支撑体的项1所述的多肽。
项11.一种葡萄糖减少剂，其包含项1所述的多肽。
项12.一种葡萄糖减少的组合物的制造方法，其包括以下工序：使用项1所述的多肽，减少选自由食品组合物、化妆品组合物和医药组合物组成的组中的组合物中的葡萄糖。
发明效果
根据本发明，提供一种提高了比活性的葡萄糖脱氢酶。
附图说明
图1表示包含序列号1所示的氨基酸序列的GDH的第578位突变体的酶活性。
具体实施方式
以下，对本发明详细进行说明。应予说明，在序列表以外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时用单字符缩写来表述。即，甘氨酸(Gly)为G，丙氨酸(Ala)为A，缬氨酸(Val)为V，亮氨酸(Leu)为L，异亮氨酸(Ile)为I，苯丙氨酸(Phe)为F，酪氨酸(Tyr)为Y，色氨酸(Trp)为W，丝氨酸(Ser)为S，苏氨酸(Thr)为T，半胱氨酸(Cys)为C，蛋氨酸(Met)为M，天冬氨酸(Asp)为D，谷氨酸(Glu)为E，天冬酰胺(Asn)为N，谷氨酰胺(Gln)为Q，赖氨酸(Lys)为K，精氨酸(Arg)为R，组氨酸(His)为H，脯氨酸(Pro)为P。
本说明书中，所示的氨基酸序列左端为N末端、右端为C末端。
本说明书中的“A120G”等表述为氨基酸替换的表示方法。例如，“A120G”表示特定的氨基酸序列中的从N末端侧起第120位的氨基酸A被替换为氨基酸G。
在本说明书中，“非极性氨基酸”包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。“非电荷氨基酸”包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。“酸性氨基酸”包含天冬氨酸和谷氨酸。“碱性氨基酸”包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
本说明书中，“替换”不仅包括人为地导入氨基酸残基替换的情况，还包括自然地导入氨基酸残基替换的情况，即还包含原本氨基酸残基就不同的情况。本说明书中，氨基酸残基的替换可以为人为的替换，也可以为自然的替换，优选人为的替换。
1.多肽
本发明的多肽为下述(1)～(3)的任一项所示的多肽。
(1)一种多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中，第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列，
(2)一种多肽，其是在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，导入所述替换的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成的，与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高，以及
(3)一种多肽，其在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的除了导入所述替换的氨基酸残基以外的序列一致性为90％以上，与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高。
所述(1)～(3)所示的多肽具有比序列号1的多肽提高的葡萄糖脱氢酶活性。
序列号1的多肽是来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(GO)的D446H和V582P双重突变体(以下，与上述的第578位的氨基酸替换突变不同，将D446H和V582P也记载为“双重突变”)。
前述(1)～(3)的多肽不仅包括人为地进行替换而得到的多肽，还包括原本就具有这样的氨基酸序列的多肽。
以下，在上述(2)和(3)的多肽中，有时将序列号1的第578位的氨基酸残基以外标记为“任意不同部位”。本说明书中，术语“任意不同部位”为只要对多肽的特性没有明显影响，则允许不同的部位。另外，在本说明书中，将虽然与上述(1)的多肽相比，在任意不同部位，氨基酸序列有不同，但与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比提高了葡萄糖脱氢酶活性的多肽称为上述(1)的多肽的不同体。上述(2)和(3)的多肽是上述(1)的多肽的不同体。另外，上述多肽的不同体虽然与上述(1)的多肽相比，在任意不同部位氨基酸序列有不同，但该多肽的特性实质上相同。应予说明，多肽的特性实质上相同是指葡萄糖脱氢酶活性相同，具体而言，是指葡萄糖脱氢酶活性显示为上述(1)的多肽的葡萄糖脱氢酶活性的0.8～1.2倍左右、优选为0.9～1.1倍左右、更优选为0.95～1.05倍左右。
上述(2)的多肽中的氨基酸的不同可以仅包括替换、添加、插入和缺失中的1种不同(例如替换)，也可以包括2种以上的不同(例如替换和插入)。在上述(2)的多肽中，任意不同部位的氨基酸的不同的数量只要为1个或数个即可，例如可举出1～60个或1～50个，优选为1～20个、1～10个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、或1～4个，进一步优选为1～3个，特别优选为1或2个或者1个。
另外，在上述(3)的多肽中，只要相对于序列号1所示的各氨基酸序列的除了进行了上述氨基酸替换的部位以外的序列一致性为70％以上、80％以上、85％以上或90％以上即可，但优选为92％以上或94％以上，进一步优选为95％以上、96％以上、97％以上、或98％以上，更进一步优选为99％以上，更进一步优选为99.5％以上，特别优选为99.8％以上。
在此，在上述(3)的多肽中，相对于序列号1所示的各氨基酸序列的除了进行了上述氨基酸替换的部位以外的序列一致性为：从序列号1所示的各氨基酸序列中仅抽取上述任意不同部位并且仅对该任意不同部位进行比较而计算出的序列一致性。另外，“序列一致性”表示基于BLASTPACKAGE[sgi32 bit edition，Version 2.0.12；available fromNational Center for Biotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(TatianaA.Tatsusova，Thomas L.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247-250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extensionCost value：1即可。
在上述(2)和(3)的多肽的任意不同部位导入氨基酸替换的情况下，作为氨基酸替换的方式的一例，可举出保守性替换。即，作为在(2)和(3)的多肽中对任意不同部位导入的氨基酸替换，例如可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则向其他的非极性氨基酸的替换；如果替换前的氨基酸为非带电性氨基酸，则向其他的非带电性氨基酸的替换；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则向其他的酸性氨基酸的替换；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则向其他的碱性氨基酸的替换。
另外，作为在上述(2)和(3)多肽的任意不同部位导入氨基酸替换的情况下的氨基酸替换的方式的其它例子，可举出以下的其他规定的替换。即，可以认为，序列号1所示的氨基酸序列中的选自由第115位(L)、第131位(G)、第132位(T)、第193位(V)、第353位(T)、第436位(F)、第444位(S)、第472位(Y)、第511位(I)、第535位(P)、第537位(Y)和第583位(M)组成的组中的1个或2个以上的氨基酸的替换、以及第582位(P)向S、R或L的替换(以下，将它们记载为“其他规定的替换”)有助于葡萄糖脱氢酶活性的表达、或该活性的表达和对木糖的反应性的抑制，因此，可以在上述(2)和(3)多肽的任意不同部位导入该其他的替换。作为该其他规定的替换的优选例，可举出第446位(H)和第582位(P)向S、R、或L的替换；以及第444位(S)向R、Q、或E的替换。
在上述(2)和(3)的多肽不包含上述其他规定的替换的情况下，认为序列号1所示的氨基酸序列中的第446位(H)和第582位(P)有助于葡萄糖脱氢酶活性的表达和对木糖的反应性的抑制，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。
在上述(2)和(3)的多肽包含上述其他规定的替换的情况下，认为该其他规定的替换有助于葡萄糖脱氢酶活性的表达、或该活性的表达和对木糖的反应性的抑制，因此可以在序列号1所示的氨基酸序列中的第446位(H)和第582位(P)中的任一者或两者中导入替换或缺失。作为具有上述该其他规定的替换且在第446位(H)和第582位(P)中的任一者或两者导入有替换或缺失的情况下的上述(2)和(3)的多肽的具体例，可举出以下的[a]和[b]的多肽。
[a]一种多肽，其包含以下特征：在序列号1中，第446位(H)未被替换；第582位(P)被替换为S、R或L；且第578位(M)被替换为V或P
[b]一种多肽，其包含以下特征：在序列号1中，第444位(S)被替换为R、Q、或E；第446位(H)被替换为其他的氨基酸(例如D)；第582位(P)未被替换；且第578位(M)被替换为V或F
在上述(2)和(3)的多肽中，作为“与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高的多肽”的葡萄糖脱氢酶活性的程度，只要比包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的葡萄糖脱氢酶活性高，则没有特别限定，可举出包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的葡萄糖脱氢酶活性的1.10倍以上，优选为1.15倍以上，更优选为1.20倍以上。作为上述(2)和(3)的多肽的葡萄糖脱氢酶活性的程度的上限，没有特别限定，例如可举出包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的葡萄糖脱氢酶活性的1.40倍以下、1.35倍以下、或1.30倍以下。
本发明的多肽催化在电子受体存在下将葡萄糖的羟基氧化而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应。本发明的多肽的“葡萄糖脱氢酶活性”利用该作用原理，例如可以使用使用了吩嗪硫酸甲酯(PMS)和2,6-二氯吲哚酚(DCIP)作为电子受体的以下的体系进行测定。
[数1]
(反应1)D-葡萄糖+PMS(氧化型)→D-葡萄糖酸-δ-内酯+PMS(还原型)
(反应2)PMS(还原型)+DCIP(氧化型)→PMS(氧化型)+DCIP(还原型)
在上述反应1中，伴随葡萄糖的氧化，生成PMS(还原型)。通过继续进行的上述反应2，伴随PMS(还原型)的氧化，DCIP被还原。检测该“DCIP(氧化型)”的消失程度作为波长600nm下的吸光度的变化量，基于该变化量，能够求出葡萄糖脱氢酶活性。
具体而言，混合50mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)2.05mL、1mol/L的葡萄糖溶液0.60mL、15mmol/L的PMS溶液0.10mL、以及2mmol/L的DCIP溶液0.15mL，在37℃保温5分钟后，添加0.1mL用包含0.1％BSA的50mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)稀释的酶溶液，开始反应。求出伴随酶反应进行的600nm下的吸光度的每1分钟的减少量(ΔA600)，按照下式算出GDH活性。此时，GDH活性将在D-葡萄糖存在下1分钟内还原1μmol的DCIP的酶量定义为1U。
[数2]
应予说明，式中的Vt表示反应试剂溶液与酶溶液的总液量(mL)，16.3表示本活性测定条件下的还原型DCIP的每1μmol的吸光系数(cm2/μmol)，0.1表示酶溶液的液量(mL)，1.0表示池的光路长度(cm)，ΔA600空白表示在添加用于酶的稀释的缓冲液代替酶溶液而开始反应的情况下的600nm下的吸光度的每1分钟的减少量，df表示稀释倍数。
2.DNA
编码本发明的多肽的DNA(以下有时也表述为“本发明的DNA”)只要是本领域技术人员，就可以按照本发明的多肽的氨基酸序列进行适当设计。本发明的DNA例如可以通过在编码包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的DNA中导入与上述氨基酸突变对应的突变而得到，也可以通过在编码来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(GO)即序列号1的氨基酸序列中未导入上述双重突变的方式的多肽的DNA中导入与上述双重突变和上述氨基酸突变对应的突变而得到，也可以通过基于基因的全合成法的人工合成而得到。
关于编码包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽的DNA，例如已知为序列号2所示的碱基序列，例如，可以通过使用PCR的常规方法从组装有该碱基序列的质粒等核酸构建物中取得该碱基序列部分。另外，编码来源于A.niger的葡萄糖氧化酶(GO)的DNA也是公知的，可以通过使用PCR的常规方法从A.niger的基因组DNA分离。
向碱基序列的特定部位导入特定突变的方法是公知的，例如，可以利用DNA的部位特异性突变导入法等。作为对DNA中的碱基进行转换的具体方法，例如可举出市售的试剂盒(QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit：Stratagene制、KOD-Plus-Mutagenesis kit：东洋纺制等)的利用等。
在碱基序列中导入突变得到的DNA可使用DNA测序仪确认碱基序列。一旦确定碱基序列，之后通过以化学合成、克隆的探针作为模板的PCR、或以具有该碱基序列的DNA片段作为探针的杂交，可以得到编码上述多肽的DNA。
另外，也可以通过部位特异性突变诱发法等合成作为编码上述肽的DNA的突变型的、与突变前具有同等功能的DNA。应予说明，为了对编码上述肽的DNA导入突变，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法、Mega-primer PCR法等公知的方法进行。
本发明的DNA优选为将密码子利用频率在宿主内最优化的DNA，更优选为将密码子利用频率在曲霉属微生物中最优化的DNA。
作为表示密码子利用频率的指标，选择各密码子的宿主最适密码子利用频率的总计即可。最适密码子可定义为对应于同一氨基酸的密码子中利用频率最高的密码子。密码子利用频率只要是在宿主中最优化的频率即可，没有特别限定。
作为本发明的DNA的例子，可举出包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA。包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA分别编码上述(1)的多肽的第578位被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的多肽。
作为本发明的DNA的其他例子，可举出：编码与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比提高了葡萄糖脱氢酶活性的多肽并包含与含有序列号3或4所示的碱基序列的DNA互补的碱基序列的DNA、以及在严格条件下杂交的DNA。
在此，“严格条件”是指，在包含0.5％SDS、5×Denhartz’s〔Denhartz’s、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％聚蔗糖400〕以及100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，在50℃～65℃下保温4小时～一晚的条件。
在严格的条件下的杂交，具体而言，通过以下方法进行。即，制成将DNA文库或cDNA文库固定化而成的尼龙膜，在包含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhartz’s、100μg/ml鲑鱼精子DNA的预杂交溶液中，在65℃下封闭尼龙膜。然后，加入用32P标记的各探针，在65℃下保温一夜。将该尼龙膜在6×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的2×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的0.2×SSC中、45℃下清洗30分钟后，采取放射自显影术，能够检测出与探针特异性杂交的DNA。
作为本发明的DNA的进一步的例子，可举出：编码与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，提高了葡萄糖脱氢酶活性的多肽，且与包含序列号3或4所示的碱基序列的DNA具有70％以上、80％以上、85％以上或90％以上的同源性的DNA。作为该同源性，可举出优选为92％以上或94％以上，进一步优选为95％以上、96％以上或97％以上，进一步优选为98％以上或99％以上，更优选为99.5％以上，特别优选为99.8％以上。
在此，DNA的“同源性”可以使用具有将基准序列作为查询序列进行比较的算法的公开或市售的软件来计算。具体而言，可以使用BLAST、FASTA、或GENETYX(软件开发株式会社制)等，将它们设定为默认参数使用即可。
3.表达盒或重组载体
包含编码本发明的多肽的DNA的表达盒或重组载体(以下也表述为“本发明的表达盒”或“本发明的重组载体”)可以通过在本发明的DNA上连接启动子和终止子、或通过在表达载体中插入本发明的表达盒或本发明的DNA而得到。
在本发明的表达盒或重组载体中，作为控制因子，除了启动子和终止子以外，还可以根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。这些控制因子只要可工作地连接于本发明的DNA即可。可工作地连接是指，调节本发明的DNA的各种控制因子和本发明的DNA以能够在宿主细胞中工作的状态连接。
关于本发明的重组载体，作为表达载体，优选从能够在宿主内自主增殖的噬菌体、质粒或病毒构建用于基因重组的表达载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为能够在商业上获得的表达载体，可举出pUC系载体(Takara Bio株式会社)pQE系载体(株式会社Qiagen)、pDR540、pRIT2T(GE Healthcare Bio-Science株式会社)、pET系载体(Merck株式会社)等。表达载体只要选择与宿主细胞的适当组合使用即可。
4.转化体
通过使用本发明的表达盒或重组载体转化宿主，可以得到转化体(以下有时也表述为“本发明的转化体”)。
作为转化体的制造中使用的宿主，只要能够导入基因、表达盒或重组载体稳定、且能够自主增殖，能够表达包含本发明的DNA的基因的性状，就没有特别限制，例如可举出属于米曲霉(Aspergillus oryzae)等曲霉属、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属等的微生物；酵母等作为优选的例子，但除此之外，也可以是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。其中，特别优选曲霉属微生物。
本发明的转化体可以通过在宿主中导入本发明的重组载体而得到。导入本发明的DNA的部位只要能够表达目标基因，就没有特别限定，可以在质粒上，也可以在基因组上。作为导入本发明的表达盒或本发明的重组载体的具体方法，例如可举出重组载体法、基因组编辑法。向宿主导入表达盒或重组载体的条件根据宿主的种类等适当设定即可。在宿主为微生物的情况下，例如可举出使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法、电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法等。如果是宿主为动物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等。如果是宿主为昆虫细胞的情况，则例如可举出磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法等。如果是宿主为植物细胞的情况，则例如可举出电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、以及PEG法等。
本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的确认可以通过PCR法、Southern杂交法、以及Northern杂交法等进行。
在通过PCR法确认本发明的表达盒或本发明的重组载体是否引入到宿主的情况下，例如，从转化体中分离、纯化基因组DNA或表达盒或重组载体即可。
表达盒或重组载体的分离、纯化例如在宿主为细菌的情况下，基于将细菌裂解而得到的溶菌物进行。作为裂解方法，例如可利用溶菌酶等溶菌酶来实施处理，可根据需要并用蛋白酶及其它酶、以及十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。
进而，还可以组合冻融及弗氏压碎处理这样的物理破碎方法。从溶菌物中分离、纯化DNA例如可以通过将利用苯酚处理以及蛋白酶处理等的除蛋白处理、核酸酶处理、醇沉淀处理以及市售的试剂盒适宜组合来进行。
DNA的切断可以按照常规方法，例如可以使用限制酶处理来进行。作为限制酶，例如使用作用于特定的核酸序列的II型限制酶。DNA与表达盒或表达载体的结合，例如使用DNA连接酶进行。
然后，将分离·纯化的DNA作为模板，在本发明的DNA上设计特异性引物，进行PCR。对通过PCR得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等，利用溴化乙锭和SYBR Green液等进行染色，然后将扩增产物作为条带进行检测，由此能够确认转化。
另外，也可以使用预先利用荧光色素等标记的引物进行PCR来检测扩增产物。进而，也可以采用使扩增产物结合于微孔板等固相并通过荧光和酶反应等确认扩增产物的方法。
5.多肽的制备方法
本发明的多肽可以通过包含培养本发明的转化体的工序的制造方法得到。
转化体的培养条件只要考虑宿主的营养生理性质适宜设定即可，优选举出液体培养。另外，如果是进行工业制造的情况，则优选通气搅拌培养。
作为培养基的营养源，可使用转化体的生长所必需的营养源。作为碳源，只要为可同化的碳化合物即可，例如可举出葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、丙酮酸等。
作为氮源，只要为可同化的氮化合物即可，例如可举出蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、大豆粕碱提取物。
除了碳源和氮源以外，可根据需要使用例如磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰以及锌等盐类、特定的氨基酸以及特定的维生素等。
培养温度可在本发明的转化体能够生长且本发明的转化体能够产生本发明的多肽的范围内适当设定，优选为15～37℃左右。培养只要预估本发明的多肽达到最高产量的时期而在适当时期完成即可，通常培养时间为12～48小时左右。
培养本发明的转化体，利用对培养液进行离心分离等方法回收培养上清或菌体，对菌体利用超声波和弗氏压碎之类的机械方法或利用溶菌酶等溶菌酶实施处理，根据需要使用蛋白酶等酶、十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂进行增溶，可得到包含本发明的多肽的水溶性级分。
另外，还可通过选择适当的表达载体和宿主使表达的本发明的多肽分泌到培养液中。
如上得到的包含本发明的多肽的水溶性级分可以直接供于纯化处理，也可以将该水溶性级分中的本发明的多肽浓缩后供于纯化处理。
浓缩例如可通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、基于亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇和丙酮)的分别沉淀法等而进行。
本发明的多肽的纯化处理例如可以通过将凝胶过滤、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等方法适宜组合来进行。
上述纯化处理已经是公知的，可以参照适当的文献、杂志及教科书等来进行。这样纯化而得到的本发明的多肽可以根据需要通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等粉末化后在市场中流通。
6.酶制剂
本发明的多肽可以以酶制剂的方式提供。因此，本发明还提供包含上述本发明的多肽作为有效成分的酶制剂。
作为本发明的酶制剂中的本发明的多肽的含量，没有特别限定，可以在发挥有效成分的葡萄糖脱氢酶活性的范围内适当设定。
本发明的酶制剂除了上述本发明的多肽以外，也可以在不影响本发明的效果的程度包含其他成分。作为其他成分，可举出上述本发明的多肽以外的其他酶、添加剂、在上述制造方法中产生的培养残渣等。
作为其他酶，可以根据上述本发明的多肽的用途适当确定，例如可举出淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶(除上述有效成分以外)、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质脱酰胺酶、普鲁兰酶等。这些其他酶可以单独包含1种，也可以以多种的组合包含。
作为添加剂，可以根据上述本发明的多肽的用途和酶制剂的制剂形态适当确定，可举出赋形剂、缓冲剂、悬浊剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可举出淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可举出磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可举出丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可举出苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以举出乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。这些添加剂可以单独含有1种，也可以以多种的组合包含。
作为培养残渣，可举出来源于培养基的成分、夹杂蛋白质、菌体成分等。
作为本发明的酶制剂的制剂形态，没有特别限定，例如可举出液状、固体状(粉末、颗粒等)等。这些制剂形态的酶制剂通常可以通过公知的方法来制备。
作为本发明的酶制剂的具体例，可举出后述的葡萄糖测定用试剂和葡萄糖减少剂。
7.用途
本发明的多肽可适用于利用葡萄糖脱氢酶活性的用途。作为这样的用途，可举出以测定对象试样中的葡萄糖为目的的用途、以减少对象组合物中的葡萄糖为目的的用途。
在将本发明的多肽应用于以测定对象试样中的葡萄糖为目的的用途的情况下，更具体而言，本发明的多肽可以作为葡萄糖测定用试剂的有效成分或作为葡萄糖传感器的识别元件使用。另外，在将本发明的多肽应用于以减少对象组合物中的葡萄糖为目的的用途的情况下，本发明的多肽可以作为葡萄糖减少剂的有效成分使用。
即，本发明还提供包含上述本发明的多肽的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖传感器以及葡萄糖减少剂。其中，关于葡萄糖测定用试剂和葡萄糖减少剂，关于除有效成分以外可包含的其他成分和制剂形态，与上述本发明的酶制剂中所述的内容相同，关于其具体的使用方法在后述“8.葡萄糖测定方法”中详述。另外，关于葡萄糖传感器及其具体的使用方法在后述“10.葡萄糖传感器”中详述。
8.葡萄糖测定方法
如上所述，本发明的多肽可以作为葡萄糖测定用试剂使用。因此，本发明还提供一种葡萄糖测定方法，其包括使用上述本发明的多肽测定试样中的葡萄糖的工序。
作为试样的例子，可举出应测定血糖值的试样(具体而言为血液试样)、应测定食品中的葡萄糖量的试样(具体而言为调味料、饮料等)、发酵食品(具体而言为食醋、酒等)的制造过程中应该测定发酵度的试样等。
在本发明的葡萄糖测定方法中，可以利用基于上述本发明的多肽的氧化还原反应来测定试样中的葡萄糖量。具体而言，可以使包含葡萄糖的试样与本发明的多肽接触进行酶反应，基于监测酶反应的信号变化，测定反应后的葡萄糖量。
更具体而言，可以使本发明的多肽与电子受体(2,6-二氯靛酚(DCPIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)等)、以及根据需要使用的反应促进剂(例如N-(2-乙酰胺)亚胺二乙酸(ADA)、双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(Bis-Tris)、碳酸钠、咪唑等)、pH缓冲剂、和/或显色试剂一起与包含葡萄糖的试样接触，使其反应一定时间。在此期间，能够监测基于由电子受体的还原变化或从电子受体接受电子产生的色素的聚合生成的信号变化(例如，吸光度变化)等。根据试样中的葡萄糖全部被氧化的时刻为止的信号变化，能够以预先使用标准浓度的葡萄糖溶液制作的校准曲线为基础，算出试样中的葡萄糖浓度。
上述酶反应中的条件可以根据本发明的多肽的最适温度和最适pH等适当确定。
9.葡萄糖测定用试剂盒
本发明还提供一种用于进行上述葡萄糖测定方法的葡萄糖测定用试剂盒。本发明的葡萄糖测定用试剂盒包含上述“7.用途”中所述的葡萄糖测定用试剂。
本发明的葡萄糖测定用试剂盒可以包含检测所需的缓冲剂、电子受体、反应促进剂和/或显色试剂等试剂、以及用于制作校准曲线的葡萄糖标准溶液等作为葡萄糖测定用试剂以外的其他项。关于这些其他项的具体例和使用方法，如上述“8.葡萄糖测定方法”中所述。本发明的葡萄糖测定用试剂盒可以单独包含1种这些其他项，也可以组合包含多种。
10.葡萄糖传感器
如上所述，本发明的多肽可以作为葡萄糖传感器的识别元件使用。因此，本发明还提供一种葡萄糖传感器，其包含不溶性支撑体和固定于上述不溶性支撑体的上述本发明的多肽。
作为多肽的固定方式，没有特别限定，可举出基于附着、吸附、吸收、封入、溶胀等的物理固定，基于特异性非共价键的化学或生化学固定，以及基于共价键的化学固定。
另外，多肽可以以单独的方式固定于不溶性支撑体，也可以将多肽与其他成分一起以组合物的方式固定于不溶性支撑体。作为多肽以组合物的方式固定于不溶性支撑体的情况的具体的方式，可举出该组合物物理固定于不溶性支撑体的方式。
不溶性支撑体至少其表面由在上述本发明的多肽与葡萄糖的反应体系中不溶解且能够固定上述多肽的固体物质或固体材料构成。作为构成不溶性支撑体的至少表面的材料的具体例，可举出溶胀性材料(例如明胶等高分子基质等)、多孔性基材(例如纤维素等多孔质体、滤纸等无纺片材)、树脂、玻璃、氧化还原聚合物(即，使氧化还原介体结合而成的聚合物)、金属、碳等。
作为不溶性载体的形状，没有特别限定，例如可举出基板状、薄片状、棒状、珠状等。
作为上述不溶性载体的优选例，可举出其表面由上述材料构成的电极(例如金电极、铂电极、碳电极等)。另外，在这样的电极中，优选的是多肽被物理固定，更优选的是，多肽以同时包含其他成分(例如二茂铁、铁氰化物等的介体、吩嗪硫酸甲酯等)的组合物的方式被物理固定。
作为本发明的葡萄糖传感器的具体的方式，可以是作为生物传感器采用的任意的方式，例如，可举出传感器芯片、微量滴定板、试纸条、电化学流通池等。
这样的具体方式中的葡萄糖的感测可以通过基于上述“8.葡萄糖测定方法”中所述的方法的方法、特别是利用以下的方法进行。在恒温池中加入缓冲液，维持在一定温度。作为工作电极，使用将上述本发明的多肽固定化的电极，使用对电极(例如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)。对电极施加一定的电压，电流稳定后，使包含葡萄糖的试样(优选为血液试样，更优选为自身血液)接触，测定电流的增加。根据由标准浓度的葡萄糖溶液制成的校准曲线，能够计算出试样中的葡萄糖浓度。
11.葡萄糖减少的组合物的制造方法
如上所述，本发明的多肽可以作为葡萄糖减少剂使用。因此，本发明还提供一种葡萄糖减少的组合物的制造方法，其包括使用上述本发明的多肽减少选自由食品组合物、化妆品组合物和医药组合物组成的组中的组合物中的葡萄糖的工序。
在本发明的制造方法中，利用基于上述本发明的多肽的氧化还原反应，将上述组合物中的葡萄糖转换为葡萄糖酸-δ-内酯，由此能够减少葡萄糖量。具体而言，只要使包含葡萄糖的上述组合物与本发明的多肽接触而进行酶反应即可。酶反应中的条件可以根据本发明的多肽的最适温度和最适pH等适当确定。
通过本发明的制造方法得到的葡萄糖减少的食品组合物、化妆品组合物以及医药组合物能够抑制由美拉德反应引起的着色。
实施例
以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明不被解释为限定于以下实施例。
试验例1
着眼于进行包含序列号1的氨基酸序列的葡萄糖脱氢酶(来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶的D446H和V582P双重突变体；以下也记载为“GDH1”)的X射线晶体结构分析的结果，伴随向第582位氨基酸的突变导入，第538位的组氨酸受到空间位阻的可能性。以消除该空间位阻为目的，研究了向第538位的组氨酸附近的第578位蛋氨酸的突变导入。
以编码序列号1的氨基酸序列的序列号2所示的碱基序列为基础，设计以下的突变用引物。
M578A突变用引物1：ACGCAAGCCTCGTCCCATCCTATGACG(序列号5)
M578A突变用引物2：GGACGAGGCTTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号6)
M578N突变用引物1：ACGCAAAACTCGTCCCATCCTATGACG(序列号7)
M578N突变用引物2：GGACGAGTTTTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号8)
M578V突变用引物1：ACGCAAGTGTCGTCCCATCCTATGACG(序列号9)
M578V突变用引物2：GGACGACACTTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号10)
M578L突变用引物1：TACGCAACTGTCGTCCCATCCTATG(序列号11)
M578L突变用引物2：GACGACAGTTGCGTAGGGGGAATAG(序列号12)
M578K突变用引物1：ACGCAAAAGTCGTCCCATCCTATGACG(序列号13)
M578K突变用引物2：GGACGACTTTTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号14)
M578D突变用引物1：ACGCAAGATTCGTCCCATCCTATGACG(序列号15)
M578D突变用引物2：GGACGAATCTTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号16)
M578F突变用引物1：ACGCAATTCTCGTCCCATCCTATGACG(序列号17)
M578F突变用引物2：GGACGAGAATTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号18)
M578W突变用引物1：ACGCAATGGTCGTCCCATCCTATGACG(序列号19)
M578W突变用引物2：GGACGACCATTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号20)
M578Y突变用引物1：ACGCAATACTCGTCCCATCCTATGACG(序列号21)
M578Y突变用引物2：GGACGAGTATTGCGTAGGGGGAATAGA(序列号22)
将插入到包含序列号2的碱基序列的DNA中的质粒作为模板，使用设计的上述引物和DNA聚合酶进行PCR，得到扩增的DNA片段。
用限制性酶Dpn I处理PCR后的扩增产物，消化未突变的质粒后，进行连接，取得突变导入的质粒。将突变导入后的质粒转化为大肠杆菌DH5α后，进行质粒提取，制作突变导入的质粒。将所得到的突变导入的质粒转化为酿酒酵母。对得到的转化株进行液体培养，通过以下的方法对由此得到的酶溶液调查GDH活性。
GDH活性评价方法
混合50mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)2.05mL、1mol/L的葡萄糖溶液0.60mL、15mmol/L的PMS溶液0.10mL、以及2mmol/L的DCIP溶液0.15mL，在37℃保温5分钟后，添加0.1mL用包含0.1％BSA的50mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.5)稀释的酶溶液，开始反应。求出伴随酶反应的进行的600nm下的吸光度的每1分钟的减少量(ΔA600)，按照下式算出GDH活性。此时，GDH活性将在D-葡萄糖存在下将1分钟内还原1μmol的DCIP的酶量定义为1U。
[数3]
应予说明，式中的Vt表示反应试剂溶液与酶溶液的总液量(mL)，16.3表示本活性测定条件下的还原型DCIP的每1μmol的吸光系数(cm2/μmol)，0.1表示酶溶液的液量(mL)，1.0表示池的光路长度(cm)，ΔA600空白表示在添加用于酶的稀释的缓冲液代替酶溶液而开始反应的情况下的600nm下的吸光度的每1分钟的减少量，df表示稀释倍数。
将突变导入前的酶GDH1的GDH活性设为100％，算出各突变酶的GDH活性的相对量(％)。将结果示于图1。如图1所示，在M578V和M578F中确认到活性的提高。应予说明，各酶的表达量用SDS-PAGE进行评价，确认到为同等水平的表达量。因此，确认到在M578V和M578F中提高了比活性。
试验例2
从导入有M578V的突变的GDH1质粒中，通过PCR扩增GDH基因部分，将扩增的DNA片段连接于高峰淀粉酶修饰CS3启动子和来源于米曲霉的FAD依赖性葡萄糖脱氢酶的终止子基因之间，构建表达盒。
将构建的表达盒和来源于米曲霉的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因(pyrG基因)插入pUC19中，构建表达质粒。使用构建的表达质粒，转化米曲霉RIB40的pyrG基因缺损株，利用尿苷要求性取得转化株。将得到的转化株在液体培养中培养，取得包含M578V的粗酶液。将得到的粗酶液使用盐析、疏水结合色谱、离子交换色谱纯化，进行冷冻干燥，得到M578V的纯化酶粉末。
与试验例1同样地测定得到的M578V的纯化酶粉末和GDH1的纯化酶粉末的每单位重量的GDH活性值(U/mg)，算出M578V的GDH活性的相对量(相对活性)，导出将GDH1的活性值设为100％时的M578V的相对活性。将结果示于表1。
[表1]
相对活性
GDH1 100％
M578V 122％
如表1所示，M578V与GDH1相比，显示约2成的比活性提高。
另外，求出针对葡萄糖的动力学参数(Km[mmol/L]和Vmax[U/mg])，导出将GDH1的Km和Vmax分别设为100％时的M578V的相对Km和相对Vmax相对活性。将结果示于表2。
[表2]
相对Km 相对Vmax
GDH1 100％ 100％
M578V 103％ 127％
如表2所示，M578V与GDH1相比，相对于葡萄糖的Km几乎不变，但Vmax显示约2成的提高。即，M578V与GDH1相比，对于葡萄糖底物的酶亲和力几乎不变，但确认到酶反应的效率提高。
序列表自由文本
序列号1是来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶的D446H和V582P双重突变体。
序列号2是编码来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶的D446H和V582P双重突变体的DNA。
序列号3是编码序列号1所示的双重突变体的M578V突变体的DNA。
序列号4是编码序列号1所示的双重突变体的M578F突变体的DNA。
序列号5～22为突变导入用引物。
序列表
<110> 天野酶株式会社
国立大学法人东京农工大学
北卡罗来纳大学教堂山分校
<120> 突变葡萄糖脱氢酶
<130> 21108WO
<150> JP2020-211550
<151> 2020-12-21
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶的双重突变体（D446H，V582P）
<400> 1
Met Ser Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
20 25 30
Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
35 40 45
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
50 55 60
Asp Ile Thr Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
65 70 75 80
Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
85 90 95
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
100 105 110
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
115 120 125
Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp
130 135 140
Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile
165 170 175
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr
180 185 190
Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val
195 200 205
Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys
210 215 220
Asp Leu Gly Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr
225 230 235 240
Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
245 250 255
Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Arg Tyr Val
260 265 270
Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly
275 280 285
Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys
290 295 300
His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu
305 310 315 320
Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile
325 330 335
Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr
340 345 350
Thr Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly
355 360 365
Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala
370 375 380
Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu
385 390 395 400
Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile
405 410 415
Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe His Val Trp
435 440 445
Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp
450 455 460
Pro Tyr Leu Arg His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu
465 470 475 480
Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile
485 490 495
Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro
500 505 510
Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr
515 520 525
Ile Pro Tyr Asn Phe Arg Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser
530 535 540
Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val
545 550 555 560
Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr
565 570 575
Gln Met Ser Ser His Pro Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
580 585 590
Val Ala Asp Ala Ile Leu Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
595 600 605
<210> 2
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶的双重突变体(D446H, V582P) 的DNA
<400> 2
atgtctactc tccttgtgag ctcgcttgtg gtctccctcg ctgcggccct cccacactac 60
atcaggagca atggcatcga agccagcctc ctgactgacc ccaaggaggt tgccggccgc 120
actgtcgact acatcatcgc tggtggaggt ctgactggac tcaccactgc tgcccgtctg 180
acggagaacc ccgatatcac tgtgcttgtc atcgaaagtg gctcctacga gtctgacaga 240
ggtcctatca ttgaggacct gaacgcttac ggtgacattt ttggcagcag tgtggaccac 300
gcctacgaga ctgtcgagct cgccaccaac aatcagactg cgctgatccg ctccggaaat 360
ggtctcggtg gctctaccct cgtcaacggt ggcacctgga ctcgccccca caaggcacaa 420
gttgactcat gggagaccgt cttcggaaat gagggctgga actgggacag cgtggccgcc 480
tactccctcc aggctgagcg tgctcgcgca ccaaatgcca aacagattgc tgctggccac 540
tactttaatg catcctgcca tggtatcaat ggtactgtcc acgccggacc ccgcgatacc 600
ggtgatgact actcccccat cgtcaaggct ctcatgagcg ctgtcgaaga caggggcgtt 660
cccaccaaga aggacttggg atgcggtgac ccccatggtg tgtccatgtt ccccaacacc 720
ttgcacgaag accaagtgcg ctctgatgcc gctcgtgaat ggctcctccc caactaccag 780
cgtcccaacc tgcaagtcct cactggacgg tatgttggaa aggtcctgct cagccagaac 840
gctaccacac ctcgtgccgt tggcgtggaa ttcggcaccc acaagggcaa cacccacaac 900
gtctacgcta agcacgaggt cctcctggcc gctggatccg ctgtctctcc caccatcctc 960
gaatattccg gtatcggaat gaagtccatt ctagagcctc ttggaattga caccgtcgtt 1020
gacctgcccg ttggtctcaa ccttcaggac cagaccacct ctaccgtccg ctcacgcatt 1080
acctccgccg gtgccggaca gggacaggcc gcttggttcg ctaccttcaa cgagaccttt 1140
ggcgactacg ccgaaaaggc tcacgagctg ctcaacacca agctggagca gtgggccgaa 1200
gaggccgtcg cccgtggcgg attccacaac accaccgctt tgctcatcca gtacgagaac 1260
taccgcgact ggatcgtcaa ggacaatgtc gcatactcgg aactcttcct cgacacggcc 1320
ggagtggcca gtttccatgt gtgggatctt ctgcccttca ctagaggata cgtacacatc 1380
ctcgacaagg acccctacct ccgccatttc gcatacgacc ctcagtactt tctcaacgag 1440
cttgacctgc tcggccaggc tgccgccact cagctggccc gcaacatctc caactccggt 1500
gccatgcaaa cttatttcgc tggagagact attcccggtg acaacctcgc gtatgatgcc 1560
gacttgagcg cctgggttga gtatatcccg tacaacttcc gccctaacta ccatggtgtg 1620
ggtacttgct ccatgatgcc gaaggagatg ggcggtgttg tcgacaatgc tgcccgtgtg 1680
tatggtgtgc agggactgcg agtcatcgat ggttctattc cccctacgca aatgtcgtcc 1740
catcctatga cggtctttta tgccatggcc ttgaaggttg cggatgccat cttggcggat 1800
tatgcttcca tgcagtga 1818
<210> 3
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码序列号1所示的双重突变体的突变体 (M578V) 的DNA
<400> 3
atgtctactc tccttgtgag ctcgcttgtg gtctccctcg ctgcggccct cccacactac 60
atcaggagca atggcatcga agccagcctc ctgactgacc ccaaggaggt tgccggccgc 120
actgtcgact acatcatcgc tggtggaggt ctgactggac tcaccactgc tgcccgtctg 180
acggagaacc ccgatatcac tgtgcttgtc atcgaaagtg gctcctacga gtctgacaga 240
ggtcctatca ttgaggacct gaacgcttac ggtgacattt ttggcagcag tgtggaccac 300
gcctacgaga ctgtcgagct cgccaccaac aatcagactg cgctgatccg ctccggaaat 360
ggtctcggtg gctctaccct cgtcaacggt ggcacctgga ctcgccccca caaggcacaa 420
gttgactcat gggagaccgt cttcggaaat gagggctgga actgggacag cgtggccgcc 480
tactccctcc aggctgagcg tgctcgcgca ccaaatgcca aacagattgc tgctggccac 540
tactttaatg catcctgcca tggtatcaat ggtactgtcc acgccggacc ccgcgatacc 600
ggtgatgact actcccccat cgtcaaggct ctcatgagcg ctgtcgaaga caggggcgtt 660
cccaccaaga aggacttggg atgcggtgac ccccatggtg tgtccatgtt ccccaacacc 720
ttgcacgaag accaagtgcg ctctgatgcc gctcgtgaat ggctcctccc caactaccag 780
cgtcccaacc tgcaagtcct cactggacgg tatgttggaa aggtcctgct cagccagaac 840
gctaccacac ctcgtgccgt tggcgtggaa ttcggcaccc acaagggcaa cacccacaac 900
gtctacgcta agcacgaggt cctcctggcc gctggatccg ctgtctctcc caccatcctc 960
gaatattccg gtatcggaat gaagtccatt ctagagcctc ttggaattga caccgtcgtt 1020
gacctgcccg ttggtctcaa ccttcaggac cagaccacct ctaccgtccg ctcacgcatt 1080
acctccgccg gtgccggaca gggacaggcc gcttggttcg ctaccttcaa cgagaccttt 1140
ggcgactacg ccgaaaaggc tcacgagctg ctcaacacca agctggagca gtgggccgaa 1200
gaggccgtcg cccgtggcgg attccacaac accaccgctt tgctcatcca gtacgagaac 1260
taccgcgact ggatcgtcaa ggacaatgtc gcatactcgg aactcttcct cgacacggcc 1320
ggagtggcca gtttccatgt gtgggatctt ctgcccttca ctagaggata cgtacacatc 1380
ctcgacaagg acccctacct ccgccatttc gcatacgacc ctcagtactt tctcaacgag 1440
cttgacctgc tcggccaggc tgccgccact cagctggccc gcaacatctc caactccggt 1500
gccatgcaaa cttatttcgc tggagagact attcccggtg acaacctcgc gtatgatgcc 1560
gacttgagcg cctgggttga gtatatcccg tacaacttcc gccctaacta ccatggtgtg 1620
ggtacttgct ccatgatgcc gaaggagatg ggcggtgttg tcgacaatgc tgcccgtgtg 1680
tatggtgtgc agggactgcg agtcatcgat ggttctattc cccctacgca agtgtcgtcc 1740
catcctatga cggtctttta tgccatggcc ttgaaggttg cggatgccat cttggcggat 1800
tatgcttcca tgcagtga 1818
<210> 4
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码序列号1所示的双重突变体的突变体 (M578F) 的DNA
<400> 4
atgtctactc tccttgtgag ctcgcttgtg gtctccctcg ctgcggccct cccacactac 60
atcaggagca atggcatcga agccagcctc ctgactgacc ccaaggaggt tgccggccgc 120
actgtcgact acatcatcgc tggtggaggt ctgactggac tcaccactgc tgcccgtctg 180
acggagaacc ccgatatcac tgtgcttgtc atcgaaagtg gctcctacga gtctgacaga 240
ggtcctatca ttgaggacct gaacgcttac ggtgacattt ttggcagcag tgtggaccac 300
gcctacgaga ctgtcgagct cgccaccaac aatcagactg cgctgatccg ctccggaaat 360
ggtctcggtg gctctaccct cgtcaacggt ggcacctgga ctcgccccca caaggcacaa 420
gttgactcat gggagaccgt cttcggaaat gagggctgga actgggacag cgtggccgcc 480
tactccctcc aggctgagcg tgctcgcgca ccaaatgcca aacagattgc tgctggccac 540
tactttaatg catcctgcca tggtatcaat ggtactgtcc acgccggacc ccgcgatacc 600
ggtgatgact actcccccat cgtcaaggct ctcatgagcg ctgtcgaaga caggggcgtt 660
cccaccaaga aggacttggg atgcggtgac ccccatggtg tgtccatgtt ccccaacacc 720
ttgcacgaag accaagtgcg ctctgatgcc gctcgtgaat ggctcctccc caactaccag 780
cgtcccaacc tgcaagtcct cactggacgg tatgttggaa aggtcctgct cagccagaac 840
gctaccacac ctcgtgccgt tggcgtggaa ttcggcaccc acaagggcaa cacccacaac 900
gtctacgcta agcacgaggt cctcctggcc gctggatccg ctgtctctcc caccatcctc 960
gaatattccg gtatcggaat gaagtccatt ctagagcctc ttggaattga caccgtcgtt 1020
gacctgcccg ttggtctcaa ccttcaggac cagaccacct ctaccgtccg ctcacgcatt 1080
acctccgccg gtgccggaca gggacaggcc gcttggttcg ctaccttcaa cgagaccttt 1140
ggcgactacg ccgaaaaggc tcacgagctg ctcaacacca agctggagca gtgggccgaa 1200
gaggccgtcg cccgtggcgg attccacaac accaccgctt tgctcatcca gtacgagaac 1260
taccgcgact ggatcgtcaa ggacaatgtc gcatactcgg aactcttcct cgacacggcc 1320
ggagtggcca gtttccatgt gtgggatctt ctgcccttca ctagaggata cgtacacatc 1380
ctcgacaagg acccctacct ccgccatttc gcatacgacc ctcagtactt tctcaacgag 1440
cttgacctgc tcggccaggc tgccgccact cagctggccc gcaacatctc caactccggt 1500
gccatgcaaa cttatttcgc tggagagact attcccggtg acaacctcgc gtatgatgcc 1560
gacttgagcg cctgggttga gtatatcccg tacaacttcc gccctaacta ccatggtgtg 1620
ggtacttgct ccatgatgcc gaaggagatg ggcggtgttg tcgacaatgc tgcccgtgtg 1680
tatggtgtgc agggactgcg agtcatcgat ggttctattc cccctacgca attctcgtcc 1740
catcctatga cggtctttta tgccatggcc ttgaaggttg cggatgccat cttggcggat 1800
tatgcttcca tgcagtga 1818
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578A突变体的引物
<400> 5
acgcaagcct cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578A突变体的引物
<400> 6
ggacgaggct tgcgtagggg gaataga 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578N突变体的引物
<400> 7
acgcaaaact cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578N突变体的引物
<400> 8
ggacgagttt tgcgtagggg gaataga 27
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578V突变体的引物
<400> 9
acgcaagtgt cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578V突变体的引物
<400> 10
ggacgacact tgcgtagggg gaataga 27
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578L突变体的引物
<400> 11
tacgcaactg tcgtcccatc ctatg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578L突变体的引物
<400> 12
gacgacagtt gcgtaggggg aatag 25
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578K突变体的引物
<400> 13
acgcaaaagt cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578K突变体的引物
<400> 14
ggacgacttt tgcgtagggg gaataga 27
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578D突变体的引物
<400> 15
acgcaagatt cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578D突变体的引物
<400> 16
ggacgaatct tgcgtagggg gaataga 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578F突变体的引物
<400> 17
acgcaattct cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578F突变体的引物
<400> 18
ggacgagaat tgcgtagggg gaataga 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578W突变体的引物
<400> 19
acgcaatggt cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578W突变体的引物
<400> 20
ggacgaccat tgcgtagggg gaataga 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578Y突变体的引物
<400> 21
acgcaatact cgtcccatcc tatgacg 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于获得M578Y突变体的引物
<400> 22
ggacgagtat tgcgtagggg gaataga 27

Claims (12)

1.如以下(1)～(3)的任一项所示的多肽：
(1)包含在序列号1所示的氨基酸序列中第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基而成的氨基酸序列的多肽，
(2)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，除了导入所述替换的氨基酸残基以外的1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入或缺失而成的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高，以及
(3)在序列号1所示的氨基酸序列中的第578位的氨基酸残基被替换为缬氨酸残基或苯丙氨酸残基的氨基酸序列中，相对于序列号1所示的氨基酸序列的除了导入所述替换的氨基酸残基以外的序列一致性为70％以上的多肽，且该多肽与包含序列号1所示的氨基酸序列的多肽相比，葡萄糖脱氢酶活性提高。
2.一种DNA，其特征在于，编码权利要求1所述的多肽。
3.一种表达盒或重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA。
4.一种转化体，其特征在于，通过权利要求3所述的表达盒或重组载体转化宿主而得到。
5.权利要求1所述的多肽的制造方法，其特征在于，包括培养权利要求4所述的转化体的工序。
6.一种酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。
7.一种葡萄糖测定用试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。
8.一种葡萄糖测定方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的多肽测定试样中的葡萄糖的工序。
9.一种葡萄糖测定用试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的葡萄糖测定用试剂。
10.一种葡萄糖传感器，其特征在于，包含不溶性支撑体和固定于所述不溶性支撑体的权利要求1所述的多肽。
11.一种葡萄糖减少剂，其特征在于，包含权利要求1所述的多肽。
12.一种葡萄糖减少的组合物的制造方法，其特征在于，包括以下工序：使用权利要求1所述的多肽，减少选自由食品组合物、化妆品组合物和医药组合物组成的组中的组合物中的葡萄糖。
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