WO2022138668A1 - 変異グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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WO2022138668A1
WO2022138668A1 PCT/JP2021/047411 JP2021047411W WO2022138668A1 WO 2022138668 A1 WO2022138668 A1 WO 2022138668A1 JP 2021047411 W JP2021047411 W JP 2021047411W WO 2022138668 A1 WO2022138668 A1 WO 2022138668A1
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amino acid
polypeptide
glucose
seq
acid sequence
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PCT/JP2021/047411
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French (fr)
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亨一 西尾
若子 津川
広司 早出
Original Assignee
天野エンザイム株式会社
国立大学法人東京農工大学
ユニバーシティー オブ ノースキャロライナ アット チャペル ヒル
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01047—Glucose 1-dehydrogenase (1.1.1.47)

Definitions

  • the present invention relates to a mutant glucose dehydrogenase. More specifically, the present invention relates to a polypeptide having an improved specific glucose dehydrogenase activity, a DNA encoding the polypeptide, a recombinant vector, a transformant, an enzymatic agent, and a use of the polypeptide.
  • the number of diabetic patients is increasing year by year, and diabetic patients, especially insulin-dependent patients, need to monitor their blood glucose levels on a daily basis in order to control their blood glucose levels.
  • a self-glucose meter (glucose sensor) using an electrochemical biosensor that can easily and accurately measure using an enzyme has been widely used.
  • glucose oxidase hereinafter, also referred to as “GO”
  • GDH glucose dehydrogenase
  • FAD-GDH FAD-dependent GDH
  • FAD-GDH FAD-dependent GDH
  • Patent Document 1 FAD-GDH obtained by mutating GO to GDH was obtained as an enzyme that compensates for both the drawbacks of GO and GDH.
  • FAD-GDH mutated GO is an enzyme with excellent substrate specificity by compensating for both the drawbacks of GO and GDH, but there is room for improvement in its specific activity.
  • an object of the present invention is to provide a glucose dehydrogenase having improved specific activity.
  • polypeptide shown in any of the following (1) to (3) (1) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acid residue at position 578 is replaced with a valine residue or a phenylalanine residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. (2) In the amino acid sequence in which the amino acid residue at position 578 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with a valine residue or a phenylalanine residue, one or a number other than the amino acid residue into which the substitution has been introduced.
  • Item 3. An expression cassette or recombinant vector containing the DNA according to Item 2.
  • Item 4. A transformant obtained by transforming a host with the expression cassette or recombinant vector according to Item 3.
  • Item 2. The method for producing a polypeptide according to Item 1, which comprises a step of culturing the transformant according to Item 4.
  • Item 7. A reagent for measuring glucose containing the polypeptide according to Item 1.
  • Item 8. A glucose measuring method comprising a step of measuring glucose in a sample using the polypeptide according to Item 1.
  • Item 9. A glucose measurement kit containing the glucose measurement reagent according to Item 7.
  • Item 10 A glucose sensor comprising an insoluble support and the polypeptide according to Item 1 immobilized on the insoluble support.
  • Item 11. A glucose reducing agent containing the polypeptide according to Item 1.
  • Item 12. A glucose-reduced composition comprising the step of reducing glucose in a composition selected from the group consisting of food compositions, cosmetic compositions, and pharmaceutical compositions using the polypeptide according to Item 1. Manufacturing method.
  • glucose dehydrogenase having improved specific activity is provided.
  • glycine G
  • alanine A
  • valine Val
  • Leu L
  • isoleucine I
  • Phe phenylalanine
  • Tyr tyrosine
  • Trp Tryptophan
  • Serin Serin
  • Seronin Thr
  • Cystein Cystein
  • Met Methionin
  • Met Methionin
  • Glu Glutamic acid
  • Asparagine Asparagine (Asn) is N
  • glutamine Gln
  • lysine Lys
  • arginine Arg
  • Histidine Histidine
  • Pro proline
  • amino acid sequence to be displayed has the N-terminal at the left end and the C-terminal at the right end.
  • A120G in the present specification are notations for amino acid substitutions.
  • A120G means that the 120th amino acid A from the N-terminal side in a specific amino acid sequence is replaced with the amino acid G.
  • non-polar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acid amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • substitution means not only when an amino acid residue substitution is artificially introduced, but also when an amino acid residue substitution is naturally introduced, that is, the amino acid residue is originally different. Is also included.
  • the substitution of the amino acid residue may be an artificial substitution or a natural substitution, but an artificial substitution is preferable.
  • polypeptide of the present invention is a polypeptide shown in any of the following (1) to (3).
  • polypeptides shown in (1) to (3) above have improved glucose dehydrogenase activity as compared with the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is a D446H and V582P double mutant of glucose oxidase (GO) derived from Aspergillus niger (hereinafter, D446H and V582P are the amino acid substitution mutations at position 578 above. Separately, it is also described as "double mutation").
  • D446H and V582P are the amino acid substitution mutations at position 578 above. Separately, it is also described as "double mutation").
  • polypeptides (1) to (3) above include not only polypeptides obtained by artificially substituting but also polypeptides originally having such an amino acid sequence.
  • arbitrary difference site is a site where a difference is allowed as long as it does not significantly affect the properties of the polypeptide.
  • glucose dehydrogenase activity is higher than that of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide in which is improved is referred to as a variant of the polypeptide of (1) above.
  • the polypeptides (2) and (3) are variants of the polypeptide of (1). Further, the difference in the polypeptide has a difference in amino acid sequence at an arbitrary difference site as compared with the polypeptide in (1), but the characteristics of the polypeptide are substantially the same. preferable. In addition, the fact that the characteristics of the polypeptide are substantially the same means that the glucose dehydrogenase activity is equivalent, and specifically, the glucose dehydrogenase activity is 0.8 of the glucose dehydrogenase activity of the polypeptide of the above (1). It means that it exhibits about 1.2 times, preferably about 0.9 to 1.1 times, and more preferably about 0.95 to 1.05 times.
  • the difference in amino acids in the polypeptide of (2) may include only one type of difference (for example, substitution) among substitutions, additions, insertions, and deletions, and two or more types of differences (for example, substitutions). , Substitution and insertion) may be included.
  • the number of amino acid differences at arbitrary differences may be 1 or several, for example, 1 to 60 or 1 to 50, preferably 1 to 20, 1 to 1. Examples thereof include 10, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2 or 1. .
  • the sequence identity of each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 excluding the site where the amino acid is substituted is 70% or more, 80% or more, 85% or more or 90% or more. However, it is preferably 92% or more or 94% or more, more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, or 98% or more, more preferably 99% or more, still more preferably 99.5. % Or more, particularly preferably 99.8% or more.
  • sequence identity excluding the site where the amino acid substitution is made for each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 means the arbitrary difference site from each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is a sequence identity calculated by extracting only and comparing only the arbitrary difference sites.
  • sequence identity is defined as BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2sexoM. The value of the identity of the amino acid sequence obtained by Lett., Vol. 174, p247-250, 1999) is shown. The parameters may be set to Gap insulation Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • amino acid substitution is introduced at an arbitrary difference site of the polypeptides of (2) and (3)
  • conservative substitution can be mentioned as an example of the aspect of amino acid substitution. That is, as the amino acid substitution introduced to the arbitrary difference site in the polypeptides of (2) and (3), for example, if the amino acid before the substitution is a non-polar amino acid, the substitution or substitution with another non-polar amino acid If the previous amino acid is an uncharged amino acid, it is replaced with another uncharged amino acid, if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, it is replaced with another acidic amino acid, and if the amino acid before substitution is a basic amino acid. For example, substitution with other basic amino acids.
  • the following other predetermined substitution can be mentioned. That is, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the 115th position (L), the 131st position (G), the 132nd position (T), the 193rd position (V), the 353rd position (T), and the 436th position ( F), 444th (S), 472th (Y), 511th (I), 535th (P), 537th (Y), and 583th (M).
  • substitutions of one or more amino acids, as well as substitutions at position 582 (P) with S, R, or L (hereinafter referred to as "other predetermined substitutions"). Since it is considered that it contributes to the expression of glucose dehydrogenase activity or the expression of the activity and the suppression of the reactivity to xylose, the above-mentioned (2) and (3) polypeptides are optionally substituted with the other substitution sites. May be introduced. Preferred examples of such other predetermined substitutions are the substitution of positions 446 (H) and 582 (P) with S, R, or L; and R of position 444 (S), Substitution with Q or E can be mentioned.
  • the 446th position (H) and the 582nd position (P) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are glucose dehydrogenase activity. It is desirable not to introduce substitutions or deletions at these sites, as they are thought to contribute to the suppression of expression and reactivity to xylose.
  • the other predetermined substitution expresses glucose dehydrogenase activity or suppresses the expression of the activity and the reactivity to xylose.
  • a substitution or deletion may be introduced into either or both of the 446th position (H) and the 582nd position (P) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Specific examples of the polypeptide include the following polypeptides [a] and [b].
  • position 446 (H) is not substituted; position 582 (P) is substituted with S, R, or L; and position 578 (M) is V or P.
  • the degree of glucose dehydrogenase activity of the "polypeptide having improved glucose dehydrogenase activity as compared with the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1" is the sequence.
  • the activity is not particularly limited as long as it is higher than the glucose dehydrogenase activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but is 1.10 times or more, preferably 1.15 times or more the glucose dehydrogenase activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is more than doubled, more preferably 1.20 times or more.
  • the upper limit of the degree of glucose dehydrogenase activity of the polypeptides of (2) and (3) is not particularly limited, but for example, 1. of the glucose dehydrogenase activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. 40 times or less, 1.35 times or less, or 1.30 times or less can be mentioned.
  • the polypeptide of the present invention catalyzes the reaction of oxidizing the hydroxyl group of glucose in the presence of an electron acceptor to produce glucono- ⁇ -lactone.
  • the "glucose dehydrogenase activity" of the polypeptide of the present invention utilizes this principle of action, for example, the following system using phenazinemethsulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. Can be measured using.
  • Vt is the total liquid volume (mL) of the reaction reagent solution and the enzyme solution
  • 16.3 is the absorbance coefficient (cm 2 / ⁇ mol) per 1 ⁇ mol of the reduced DCIP under the present activity measurement conditions, 0.1.
  • 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • ⁇ A600blank is the absorbance at 600 nm when the buffer used for diluting the enzyme was added instead of the enzyme solution and the reaction was started.
  • the amount of decrease per minute, df represents a dilution factor.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention (hereinafter, also referred to as “DNA of the present invention”) can be appropriately designed by those skilled in the art according to the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be obtained, for example, by introducing a mutation corresponding to the amino acid mutation into a DNA encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or Aspergillus.
  • Niger Niger -derived glucose oxidase that is, the DNA encoding the polypeptide in a form in which the double mutation is not introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the double mutation and the amino acid mutation It may be obtained by introducing the mutation corresponding to the above, or it may be obtained by artificial synthesis based on the total synthesis method of the gene.
  • the DNA encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is known as, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and for example, a nucleic acid construct such as a plasmid in which the base sequence is integrated.
  • the base sequence portion can be obtained from the above by a conventional method using PCR.
  • A. DNA encoding glucose oxidase (GO) derived from niger is also known. It can be isolated from niger's genomic DNA by a conventional method using PCR.
  • a method for introducing a specific mutation into a specific site of a base sequence is known, and for example, a site-specific mutation introduction method for DNA can be used.
  • Specific methods for converting a base in DNA include, for example, the use of a commercially available kit (QuickChange Lightning Site-Directed Mutagenesis kit: manufactured by Stratagene, KOD-Plus-Mutagenesis kit: manufactured by Toyobo, etc.).
  • the base sequence of DNA in which a mutation has been introduced into the base sequence can be confirmed using a DNA sequencer. Once the base sequence is determined, the DNA encoding the polypeptide is obtained by chemical synthesis, PCR using a cloned probe as a template, or hybridization using a DNA fragment having the base sequence as a probe. be able to.
  • a mutant type of DNA encoding the peptide having the same function as before the mutation by a site-specific mutagenesis method or the like.
  • Introducing a mutation into the DNA encoding the peptide can be carried out by a known method such as the Kunkel method, the Gapped doublex method, or the megaprimer PCR method.
  • the DNA of the present invention is preferably one in which the codon utilization frequency is optimized for the host, and more preferably the DNA in which the codon utilization frequency is optimized for the Aspergillus microorganism.
  • the total of the host optimum codon usage frequency of each codon may be adopted.
  • the optimal codon is defined as the most frequently used codon among the codons corresponding to the same amino acid.
  • the frequency of codon utilization is not particularly limited as long as it is optimized for the host.
  • Examples of the DNA of the present invention include DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 encodes a polypeptide in which the 578th position of the polypeptide of (1) is replaced with a valine residue or a phenylalanine residue, respectively.
  • the DNA of the present invention encodes a polypeptide having improved glucose dehydrogenase activity as compared with the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprises the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Examples thereof include DNA containing a base sequence complementary to DNA and DNA that hybridizes under stringent conditions.
  • stringent conditions are 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% ficol. 400] and 6 ⁇ SSC containing 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA (1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0) at 50 ° C. to 65 ° C. for 4 hours to overnight. The condition to keep warm.
  • BSA bovine serum albumin
  • polyvinylpyrrolidone 0.1% ficol. 400
  • Hybridization under stringent conditions is specifically performed by the following method. That is, a nylon membrane on which a DNA library or cDNA library was immobilized was prepared, and in a prehybridization solution containing 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardz, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, at 65 ° C. Block the nylon membrane. Then add each probe labeled at 32 P and insulate at 65 ° C. overnight. This nylon film was placed in 6 ⁇ SSC at room temperature for 10 minutes, in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS, at room temperature for 10 minutes, in 0.2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS, at 45 ° C. for 30 minutes. After washing, autoradiography can be taken to detect DNA that specifically hybridizes to the probe.
  • a polypeptide having improved glucose dehydrogenase activity as compared with the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is encoded, and from the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • Examples of the DNA include DNA having 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more homology. The homology is preferably 92% or more or 94% or more, more preferably 95% or more, 96% or more, or 97% or more, still more preferably 98% or more or 99% or more, and more preferably 99.5%. As mentioned above, 99.8% or more is particularly preferable.
  • the "homology" of DNA is calculated using publicly available or commercially available software having an algorithm for comparing a reference sequence as a query sequence.
  • BLAST, FASTA, GENETYX manufactured by Software Development Co., Ltd.
  • these may be set to default parameters and used.
  • An expression cassette or recombinant vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention (hereinafter, also referred to as "expression cassette of the present invention” or “recombinant vector of the present invention”) is the present invention. It can be obtained by linking a promoter and a terminator to the DNA of the above, or by inserting the expression cassette of the present invention or the DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention may contain a promoter, a terminator, and, if necessary, a transcription element such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, and an SPI site as control factors. These regulators need only be operably linked to the DNA of the present invention. Operable ligation means that various regulators that regulate the DNA of the present invention and the DNA of the present invention are ligated in a state in which they can operate in a host cell.
  • a vector constructed from phages, plasmids, or viruses capable of autonomous growth in a host for gene recombination is suitable.
  • Such expression vectors are known, and for example, commercially available expression vectors include pUC-based vectors (Takara Bio Co., Ltd.), pQE-based vectors (Kiagen Co., Ltd.), pDR540, and pRIT2T (GE Healthcare Bioscience). Co., Ltd.), pET-based vector (Merck Co., Ltd.) and the like.
  • the expression vector may be used by selecting an appropriate combination with the host cell.
  • transformant of the present invention By transforming a host with the expression cassette or recombinant vector of the present invention, a transformant (hereinafter, also referred to as “transformant of the present invention”) can be obtained.
  • a gene can be introduced, an expression cassette or a recombinant vector is stable, autonomous proliferation is possible, and the trait of a gene containing the DNA of the present invention can be expressed.
  • the present invention is not particularly limited, but for example, the genus Aspergillus such as Aspergillus oryzae, the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, and the genus Pseudomonas A microorganism belonging to the genus Pseudomonas and the like; yeast and the like are preferable examples, but animal cells, insect cells, plant cells and the like may also be used. Among these, Aspergillus microorganisms are particularly preferable.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host.
  • the place where the DNA of the present invention is introduced is not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention include, for example, a recombinant vector method and a genome editing method.
  • the conditions for introducing the expression cassette or the recombinant vector into the host may be appropriately set according to the type of the host and the like.
  • the host is a microorganism, for example, a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like can be mentioned.
  • an animal cell for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method and the like can be mentioned.
  • an insect cell for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method and the like can be mentioned.
  • the host is a plant cell, for example, an electroporation method, an Agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method and the like can be mentioned.
  • the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention has been incorporated into the host can be confirmed by the PCR method, the Southern hybridization method, the Northern hybridization method, or the like.
  • genomic DNA or the expression cassette or the recombinant vector may be separated and purified from the transformant. ..
  • Separation / purification of the expression cassette or recombinant vector is performed, for example, based on a lysate obtained by lysing the bacterium when the host is a bacterium.
  • a lytic enzyme such as lysozyme
  • a protease and other enzymes and a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) are used in combination.
  • Separation and purification of DNA from the lysate can be performed, for example, by appropriately combining a phenol treatment, a protein removal treatment by a protease treatment, a ribonuclease treatment, an alcohol precipitation treatment, and a commercially available kit.
  • DNA can be cleaved according to a conventional method, for example, using restriction enzyme treatment.
  • restriction enzyme for example, a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence is used.
  • Binding of DNA to an expression cassette or expression vector is performed using, for example, DNA ligase.
  • a primer specific to the DNA of the present invention is designed and PCR is performed.
  • the amplified product obtained by PCR is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc., stained with ethidium bromide, SYBR Green solution, etc., and the amplified product is detected as a band. You can confirm that it has been converted.
  • amplification product it is also possible to detect the amplification product by performing PCR using a primer labeled in advance with a fluorescent dye or the like. Further, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and confirming the amplification product by fluorescence, an enzymatic reaction or the like may also be adopted.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by a production method including a step of culturing the transformant of the present invention.
  • the culture conditions of the transformant may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, but liquid culture is preferable. Further, in the case of industrial production, aeration stirring culture is preferable.
  • the carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid.
  • the nitrogen source may be any assimilating nitrogen compound, and examples thereof include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese and zinc, specific amino acids and specific vitamins, etc. are used as needed. You may.
  • the culture temperature can be appropriately set as long as the transformant of the present invention can grow and the transformant of the present invention produces the polypeptide of the present invention, but is preferably about 15 to 37 ° C.
  • the culturing may be completed at an appropriate time in anticipation of the time when the polypeptide of the present invention reaches the maximum yield, and the culturing time is usually about 12 to 48 hours.
  • the transformant of the present invention is cultured, the culture solution is collected by a method such as centrifugation, and the cells are treated by a mechanical method such as ultrasound and French press or a lytic enzyme such as lysozyme. Then, if necessary, solubilization can be obtained by using an enzyme such as protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) to obtain a water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention.
  • an enzyme such as protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS)
  • the expressed polypeptide of the present invention can be secreted into the culture medium.
  • the water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention obtained as described above may be subjected to the purification treatment as it is, but the polypeptide of the present invention in the water-soluble fraction is concentrated and then subjected to the purification treatment. You may provide it.
  • Concentration can be performed by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment, fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent (for example, methanol, ethanol and acetone), or the like.
  • a hydrophilic organic solvent for example, methanol, ethanol and acetone
  • the purification treatment of the polypeptide of the present invention can be performed, for example, by appropriately combining methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the purification process is already known and can be proceeded by referring to appropriate documents, magazines, textbooks, etc.
  • the polypeptide of the present invention purified in this manner can be powdered by freeze-drying, vacuum-drying, spray-drying or the like and distributed on the market, if necessary.
  • the polypeptides of the invention can be provided in the form of enzymatic agents. Therefore, the present invention also provides an enzyme preparation containing the above-mentioned polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • the content of the polypeptide of the present invention in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set as long as the glucose dehydrogenase activity of the active ingredient is exhibited.
  • the enzyme preparation of the present invention may contain other components other than the above-mentioned polypeptide of the present invention to the extent that the effect of the present invention is not affected.
  • other components include enzymes other than the polypeptide of the present invention, additives, culture residues produced by the above production method, and the like.
  • the other enzyme can be appropriately determined depending on the use of the above-mentioned polypeptide of the present invention, and for example, amylase ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidase ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase).
  • Glucocsidase ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase
  • Protease acidic protease, neutral protease, alkaline protease
  • peptidase leucine peptidase, aminopeptidase
  • lipase esterase
  • cellulase phosphatase (acidic phosphatase, alkaline phosphatase)
  • Examples thereof include nucleases, deamylases, oxidases, dehydrogenases (other than the above active ingredients), glutaminases, pectinases, catalases, dextranases, transglutaminases, protein deamylases, and pluranase.
  • These other enzymes may be contained alone or in combination of a plurality of types.
  • the additive may be appropriately determined according to the use of the polypeptide of the present invention and the formulation form of the enzyme agent, and may be an excipient, a buffer, a suspending agent, a stabilizer, a preservative, a preservative, etc.
  • examples include physiological saline.
  • examples of the excipient include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like.
  • the buffer include phosphates, citrates, acetates and the like.
  • the stabilizer include propylene glycol, ascorbic acid and the like.
  • preservative examples include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like.
  • preservative examples include ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like.
  • Examples of the culture residue include culture medium-derived components, contaminating proteins, bacterial cell components, and the like.
  • the pharmaceutical form of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquid and solid (powder, granule, etc.).
  • the enzyme preparations in these pharmaceutical forms can be prepared by generally known methods.
  • enzyme preparation of the present invention examples include a glucose measuring reagent and a glucose reducing agent described later.
  • the polypeptide of the invention can be applied to applications that utilize glucose dehydrogenase activity. Such applications include applications for the purpose of measuring glucose in the target sample and applications for the purpose of reducing glucose in the target composition.
  • the polypeptide of the present invention when the polypeptide of the present invention is applied to an application for the purpose of measuring glucose in a target sample, more specifically, the polypeptide of the present invention can be used as an active ingredient of a glucose measuring reagent or a glucose sensor. It can be used as a recognition element. Further, when the polypeptide of the present invention is applied to an application for the purpose of reducing glucose in a target composition, the polypeptide of the present invention can be used as an active ingredient of a glucose reducing agent.
  • the present invention also provides a reagent for measuring glucose, a glucose sensor, and a glucose reducing agent containing the above-mentioned polypeptide of the present invention.
  • a reagent for measuring glucose and the glucose reducing agent other components and the formulation form that may be contained other than the active ingredient are the same as those described in the above-mentioned enzyme agent of the present invention, and the specific method of use thereof. Will be described in detail in “8. Glucose measurement method” described later. Further, the glucose sensor and its specific usage method will be described in detail in "10. Glucose sensor” described later.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a reagent for glucose measurement. Therefore, the present invention also provides a glucose measuring method including a step of measuring glucose in a sample using the above-mentioned polypeptide of the present invention.
  • samples include samples for which blood glucose levels should be measured (specifically, blood samples), samples for which glucose content in foods should be measured (specifically, seasonings, beverages, etc.), and fermented foods (specifically, fermented foods). Specific examples thereof include samples whose degree of fermentation should be measured in the manufacturing process of glucose, liquor, etc.).
  • the amount of glucose in the sample can be measured by utilizing the redox reaction by the polypeptide of the present invention. Specifically, a sample containing glucose and the polypeptide of the present invention are brought into contact with each other to carry out an enzymatic reaction, and the amount of reacted glucose can be measured based on a signal change for monitoring the enzymatic reaction.
  • the polypeptide of the present invention is used as an electron acceptor (2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP), phenazinemethsulfate (PMS), etc.), and a reaction promoter used as needed (for example,).
  • DCPIP 2,6-dichlorophenolindophenol
  • PMS phenazinemethsulfate
  • a reaction promoter used as needed (for example,).
  • pH buffer pH buffer
  • color-developing reagent a color-developing reagent
  • the glucose concentration in the sample can be calculated from the signal change up to the time when all the glucose in the sample is oxidized, based on the calibration curve prepared in advance using the glucose solution of the standard concentration.
  • the conditions for the above enzymatic reaction are appropriately determined based on the optimum temperature, optimum pH, etc. of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention also provides a glucose measurement kit used for performing the above-mentioned glucose measurement method.
  • the glucose measurement kit of the present invention contains the glucose measurement reagent described in "7. Uses" above.
  • the glucose measurement kit of the present invention includes reagents such as buffers, electron acceptors, reaction promoters, and / or color-developing reagents necessary for the assay, as well as reagents other than the glucose measurement reagent, and calibration curve preparation.
  • reagents such as buffers, electron acceptors, reaction promoters, and / or color-developing reagents necessary for the assay, as well as reagents other than the glucose measurement reagent, and calibration curve preparation.
  • Glucose standard solution for the purpose can be contained. Specific examples and usage methods of these other items are as described in "8. Glucose measurement method" above.
  • the glucose measurement kit of the present invention may contain these other items individually or in combination of a plurality of types.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a recognition element for a glucose sensor. Therefore, the present invention also provides a glucose sensor containing the insoluble support and the polypeptide of the present invention immobilized on the insoluble support.
  • the fixation mode of the polypeptide is not particularly limited, and physical fixation by attachment, adsorption, absorption, encapsulation, swelling, etc., chemical or biochemical fixation by specific non-covalent bond, and chemical fixation by covalent bond are used. Can be mentioned.
  • the polypeptide may be fixed to the insoluble support in the form of a single substance, or the polypeptide may be fixed to the insoluble support in the form of a composition together with other components.
  • Specific embodiments in which the polypeptide is immobilized on the insoluble support in the form of a composition include embodiments in which the composition is physically immobilized on the insoluble support.
  • the insoluble support is composed of a solid substance or a solid material whose surface is at least insoluble in the reaction system between the polypeptide of the present invention and glucose and which can fix the polypeptide.
  • the material constituting at least the surface of the insoluble support include a swellable material (for example, a polymer matrix such as gelatin) and a porous base material (for example, a porous body such as cellulose and a non-woven sheet such as filter paper). , Resin, glass, redox polymer (that is, a polymer to which a redox mediator is bonded), metal, carbon and the like.
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate shape, a flaky shape, a stick shape, and a bead shape.
  • a preferable example of the above-mentioned insoluble carrier is an electrode whose surface is made of the above-mentioned material (for example, a gold electrode, a platinum electrode, a carbon electrode, etc.).
  • the polypeptide is preferably physically immobilized on such an electrode, and more preferably, the polypeptide is accompanied by other components (for example, mediators such as ferrocene and ferricyanide, phenazinemethsulfate, etc.). It is physically fixed in the form of a composition comprising.
  • glucose sensor of the present invention may be any form adopted as a biosensor, and examples thereof include a sensor chip, a microtiter plate, a test strip, an electrochemical flow cell, and the like.
  • Glucose sensing in such a specific embodiment can be performed by a method based on the method described in the above "8. Glucose measurement method", particularly by the following method.
  • the working electrode the electrode on which the polypeptide of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, Ag / AgCl electrode) are used.
  • a constant voltage is applied to the electrodes, and after the current becomes steady, a sample containing glucose (preferably a blood sample, more preferably autologous blood) is brought into contact with the electrode to measure the increase in the current.
  • the glucose concentration in the sample can be calculated according to the calibration curve prepared with the standard concentration glucose solution.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a glucose-reducing agent. Accordingly, the present invention comprises the step of using the above-mentioned polypeptide of the present invention to reduce glucose in a composition selected from the group consisting of food compositions, cosmetic compositions, and pharmaceutical compositions. Also provided are methods of making reduced compositions.
  • glucose in the above composition is glucono? ⁇ ?
  • the amount of glucose can be reduced.
  • the above composition containing glucose may be brought into contact with the polypeptide of the present invention to carry out an enzymatic reaction.
  • the conditions for the enzymatic reaction are appropriately determined based on the optimum temperature, optimum pH, etc. of the polypeptide of the present invention.
  • the glucose-reduced food composition, cosmetic composition, and pharmaceutical composition obtained by the production method of the present invention can suppress coloring due to the Maillard reaction.
  • Test Example 1 X-ray crystal structure analysis of glucose dehydrogenase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (D446H and V582P double mutants of glucose oxidase derived from Aspergillus niger; hereinafter also referred to as "GDH1") was performed.
  • GDH1 glucose oxidase derived from Aspergillus niger
  • the following mutation primers were designed based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Primer for M578A mutation 1 ACGCAAGCCTCGTCCCATCCTATGACG (SEQ ID NO: 5) Primer for M578A mutation 2: GGACGAGGCTTGCGTAGGGGGAATAGA (SEQ ID NO: 6) Primer for M578N mutation 1: ACGCAAAACTCGTCCCATCCTATGACG (SEQ ID NO: 7) Primer for M578N mutation 2: GGACGAGTTTTGCGTAGGGGGAATAGA (SEQ ID NO: 8) Primer for M578V mutation 1: ACGCAAGTGTCGTCCCATCCTATGACG (SEQ ID NO: 9) Primer for M578V mutation 2: GGACGACACTTGCGTAGGGGGAATAGA (SEQ ID NO: 10) Primer for M578L mutation 1: TACGCAACTGTCGTCCCATCCTATG (SEQ ID NO: 11) Primer for M578L mutation 2: GACGACAGTTGCGTAGGGGGAATAG (SEQ ID NO: 12) Primer for
  • PCR was performed using the above-designed primer and DNA Polymerase to obtain an amplified DNA fragment.
  • the amplified product after PCR was treated with the restriction enzyme DpnI, the unmutated plasmid was digested, and then ligation was performed to obtain the mutated plasmid.
  • plasmid extraction was performed to prepare a mutated plasmid.
  • the obtained mutated-introduced plasmid was transformed into Saccharomyces cerevisiae.
  • the obtained transformant was subjected to liquid culture, and the GDH activity of the resulting enzyme solution was examined by the following method.
  • GDH activity evaluation method 2.05 mL of 50 mmol / L phosphate buffer (pH 6.5), 0.60 mL of 1 mol / L glucose solution, 0.10 mL of 15 mmol / L PMS solution, and 2 mmol / L DCIP solution 0. After mixing 15 mL and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 0.1 mL of an enzyme solution diluted with 50 mmol / L phosphate buffer (pH 6.5) containing 0.1% BSA was added to initiate the reaction. The amount of decrease in absorbance at 600 nm per minute ( ⁇ A600) with the progress of the enzymatic reaction was determined, and the GDH activity was calculated according to the following formula. At this time, for GDH activity, the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of D-glucose was defined as 1U.
  • Vt is the total liquid volume (mL) of the reaction reagent solution and the enzyme solution
  • 16.3 is the absorption coefficient (cm 2 / ⁇ mol) per 1 ⁇ mol of the reduced DCIP under the present activity measurement conditions, 0.1.
  • 1.0 is the optical path length of the cell (cm)
  • ⁇ A600blank is the absorbance at 600 nm when the buffer used for diluting the enzyme was added instead of the enzyme solution and the reaction was started.
  • the amount of decrease per minute, df represents the dilution factor.
  • the GDH activity of the enzyme GDH1 before the introduction of the mutation was set to 100%, and the relative amount (%) of the GDH activity of each mutant enzyme was calculated. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, improvement in activity was observed at M578V and M578F.
  • the expression level of each enzyme was evaluated by SDS-PAGE, and it was confirmed that the expression level was at the same level. Therefore, it was confirmed that the specific activity was improved at M578V and M578F.
  • Test Example 2 From the GDH1 plasmid into which the M578V mutation was introduced, the GDH gene portion was amplified by PCR, and the amplified DNA fragment was ligated between the Takaamylase-modified CS3 promoter and the terminator gene of FAD-dependent glucose dehydrogenase derived from Aspergillus oryzae. An expression cassette was constructed.
  • the constructed expression cassette and the Aspergillus oryzae-derived orotidine 5' -phosphate decarboxylase gene were inserted into pUC19 to construct an expression plasmid.
  • the constructed expression plasmid was used to transform a pyrG gene-deficient strain of Aspergillus oryzae RIB40, and a transformed strain was obtained using uridine requirement.
  • the obtained transformant was cultured in a liquid culture to obtain a crude enzyme solution containing M578V.
  • the obtained crude enzyme solution was purified by salting out, hydrophobic bond chromatography, and ion exchange chromatography, and freeze-dried to obtain a purified enzyme powder of M578V.
  • the GDH activity value (U / mg) per unit weight of the obtained purified enzyme powder of M578V and GDH1 was measured in the same manner as in Test Example 1, and the relative amount (relative activity) of the GDH activity of M578V was calculated. Then, the relative activity of M578V was derived when the activity value of GDH1 was 100%. The results are shown in Table 1.
  • M578V showed an improvement in specific activity of about 20% as compared with GDH1.
  • M578V showed almost the same Km for glucose as compared with GDH1, but Vmax showed an improvement of about 20%. That is, it was confirmed that M578V had almost the same enzyme affinity for the glucose substrate as that of GDH1, but the efficiency of the enzyme reaction was improved.
  • SEQ ID NO: 1 is a D446H and V582P double mutant of glucose oxidase from Aspergillus niger.
  • SEQ ID NO: 2 is the DNA encoding the D446H and V582P double mutants of glucose oxidase from Aspergillus niger.
  • SEQ ID NO: 3 is the DNA encoding the M578V mutant of the double mutant shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 4 is the DNA encoding the M578F mutant of the double mutant shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NOs: 5 to 22 are primers for introducing mutations.

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Abstract

本発明は、比活性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼを提供する。配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び当該ポリペプチドの相違体は、向上したグルコースデヒドロゲナーゼ活性を呈する。

Description

変異グルコースデヒドロゲナーゼ
　本発明は、変異グルコースデヒドロゲナーゼに関する。より具体的には、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ比活性が向上したポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、酵素剤、及び当該ポリペプチドの用途に関する。
　糖尿病患者は年々増加しており、糖尿病患者、特にインスリン依存性の患者は、血糖値のコントロールのため、血糖値を日常的に監視する必要がある。近年、酵素を用いて簡便にかつ正確に測定できる電気化学的バイオセンサを用いた自己血糖測定器（グルコースセンサ）が広く用いられている。
　グルコースセンサに用いられる酵素として、グルコースを基質とするグルコースオキシダーゼ（以下、「ＧＯ」とも記載する。）又はグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」とも記載する。）が利用されている。
　ＧＯはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点がある一方で、それを用いた測定においては測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。この問題を解決すべく、ＦＡＤ依存性のＧＤＨ（以下、ＦＡＤ－ＧＤＨ）が開発された。しかしながら、ＦＡＤ－ＧＤＨはキシロースへ反応することが知られているため、糖尿病判定検査時に、経口グルコース負荷試験だけでなく、経口キシロース負荷試験、経静脈キシロース負荷試験が実施されることに鑑みると、ＦＡＤ－ＧＤＨを用いた場合には、上記負荷試験時に血糖値へ影響することが問題となっている。
　そこで、ＧＯ及びＧＤＨの両欠点を補う酵素として、特許文献１に、ＧＯをＧＤＨへ変異させたＦＡＤ－ＧＤＨを取得したことが報告されている。
国際公開第２０１１／０６８０５０号
　ＧＯを変異させたＦＡＤ－ＧＤＨは、ＧＯ及びＧＤＨの両欠点が補われ、基質特異性に優れた酵素ではあるが、その比活性には改善の余地がある。
　そこで本発明は、比活性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼを提供することを目的とする。
　本発明者は、ＧＯを変異させたＦＡＤ－ＧＤＨ（配列番号１）のＸ線結晶構造解析を行った結果、第５３８位ヒスチジンが立体障害を受けている可能性に着眼し、当該部位における立体障害の解消を目的として、近傍の第５７８位メチオニンへの変異導入を検討した。その結果、所定の変異を導入することで、比活性を向上できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド：
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が７０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
項２．　項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項３．　項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
項４．　項３に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項５．　項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１に記載のポリペプチドの製造方法。
項６．　項１に記載のポリペプチドを含む酵素剤。
項７．　項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース測定用試薬。
項８．　項１に記載のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法。
項９．　項７に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
項１０．　不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された項１に記載のポリペプチドとを含む、グルコースセンサ。
項１１．　項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース低減剤。
項１２．　項１に記載のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法。
　本発明によれば、比活性が向上したグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＧＤＨの第５７８位変異体の酵素活性を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　本明細書における「Ａ１２０Ｇ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば、「Ａ１２０Ｇ」とは、特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１２０番目のアミノ酸Ａが、アミノ酸Ｇに置換されていることを意味する。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
　本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
１．ポリペプチド
　本発明のポリペプチドは、下記（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドである。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が９０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
　前記（１）～（３）に示すポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドよりも向上したグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。
　配列番号１のポリペプチドは、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）のＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体である（以下において、Ｄ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐを、上記の第５７８位におけるアミノ酸置換変異とは別に、「二重変異」とも記載する）。
　前記（１）～（３）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を元々有するポリペプチドも含まれる。
　以下、前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１の第５７８位のアミノ酸残基以外を「任意相違部位」と表記することもある。本明細書において、用語「任意相違部位」とは、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、相違が許容される部位である。また、本明細書において、前記（１）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドを、前記（１）のポリペプチドの相違体という。前記（２）及び（３）のポリペプチドは、前記（１）のポリペプチドの相違体である。また、前記ポリペプチドの相違体は、前記（１）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、当該ポリペプチドの特性が実質的に同一であることがより好ましい。なお、ポリペプチドの特性が実質的に同一とは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が同等であることをいい、具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が、前記（１）のポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の０．８～１．２倍程度、好ましくは０．９～１．１倍程度、より好ましくは０．９５～１．０５倍程度を示すことを意味する。
　前記（２）のポリペプチドにおけるアミノ酸の相違は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の相違（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の相違（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。前記（２）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよく、例えば１～６０個又は１～５０個、好ましくは１～２０個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
　また、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性は、７０％以上、８０％以上、８５％以上又は９０％以上であればよいが、好ましくは９２％以上又は９４％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、一層好ましくは９９％以上、より一層好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
　ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換がされた部位を除いた配列同一性とは、配列番号１に示す各アミノ酸配列から前記任意相違部位のみを抜き出して、当該任意相違部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドの任意相違部位にアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様の一例として、保存的置換が挙げられる。即ち、（２）及び（３）のポリペプチドにおいて任意相違部位に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　また、前記（２）及び（３）ポリペプチドの任意相違部位にアミノ酸置換が導入される場合の、アミノ酸置換の態様の他の例として、以下の他の所定の置換が挙げられる。即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列における、第１１５位（Ｌ）、第１３１位（Ｇ）、第１３２位（Ｔ）、第１９３位（Ｖ）、第３５３位（Ｔ）、第４３６位（Ｆ）、第４４４位（Ｓ）、第４７２位（Ｙ）、第５１１位（Ｉ）、第５３５位（Ｐ）、第５３７位（Ｙ）、及び第５８３位（Ｍ）からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸の置換、並びに、第５８２位（Ｐ）の、Ｓ、Ｒ、又はＬへの置換（以下において、これらを「他の所定の置換」と記載する。）は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現、若しくは当該活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられるため、前記（２）及び（３）ポリペプチドの任意相違部位には、当該他の置換が導入されていてもよい。当該他の所定の置換の好ましい例としては、第４４６位（Ｈ）と、第５８２位（Ｐ）の、Ｓ、Ｒ、又はＬへの置換；及び、第４４４位（Ｓ）の、Ｒ、Ｑ、又はＥへの置換が挙げられる。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドが上記他の所定の置換を含まない場合は、配列番号１に示すアミノ酸配列における第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）が、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドが上記他の所定の置換を含む場合は、当該他の所定の置換が、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の発現、若しくは当該活性の発現及びキシロースへの反応性の抑制に寄与していると考えられるため、配列番号１に示すアミノ酸配列における第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）のいずれか又は両方に置換又は欠失が導入されていてもよい。上記当該他の所定の置換を有し且つ第４４６位（Ｈ）及び第５８２位（Ｐ）のいずれか又は両方に置換又は欠失が導入されている場合の前記（２）及び（３）のポリペプチドの具体例としては、以下の［ａ］及び［ｂ］のポリペプチドが挙げられる。
　［ａ］配列番号１において、第４４６位（Ｈ）は置換されず；第５８２位（Ｐ）が、Ｓ、Ｒ、又はＬへ置換され；且つ、第５７８位（Ｍ）が、Ｖ又はＰへ置換されている特徴を含むポリペプチド
　［ｂ］配列番号１において、第４４４位（Ｓ）が、Ｒ、Ｑ、又はＥへ置換され；第４４６位（Ｈ）が他のアミノ酸（例えばＤ）へ置換され；第５８２位（Ｐ）は置換されず；且つ、第５７８位（Ｍ）がＶ又はＦへ置換されている特徴を含むポリペプチド
　前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド」のグルコースデヒドロゲナーゼ活性の程度としては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性よりも高ければ特に限定されないが、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の１．１０倍以上、好ましくは１．１５倍以上、より好ましくは１．２０倍以上が挙げられる。前記（２）及び（３）のポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の程度の上限としては特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのグルコースデヒドロゲナーゼ活性の１．４０倍以下、１．３５倍以下、又は１．３０倍以下が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。本発明のポリペプチドの「グルコースデヒドロゲナーゼ活性」は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の系を用いて測定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記反応１においては、グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する上記反応２により、ＰＭＳ（還元型）の酸化に伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合いを波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を求めることができる。
　具体的には、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２．０５ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌのグルコース溶液０．６０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳ溶液０．１０ｍＬ、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＤＣＩＰ溶液０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素溶液を０．１ｍＬ添加し、反応を開始する。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、Ｄ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　なお、式中のＶｔは反応試薬溶液と酵素溶液との総液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件における還元型ＤＣＩＰの１μｍｏｌ当たりの吸光係数（ｃｍ2／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
２．ＤＮＡ
　本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、当業者であれば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡに前記のアミノ酸変異に対応する変異を導入することにより得てもよいし、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）つまり配列番号１のアミノ酸配列に前記の二重変異が導入されていない形態のポリペプチドをコードしているＤＮＡに、前記の二重変異と前記のアミノ酸変異とに対応する変異を導入することにより得てもよいし、遺伝子の全合成法に基づく人工合成により得てもよい。
　配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡについては、例えば、配列番号２に示される塩基配列として知られており、例えば、当該塩基配列が組み込まれたプラスミド等の核酸構築物からＰＣＲを用いた常法により当該塩基配列部分を取得することができる。また、Ａ．ｎｉｇｅｒ由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）をコードしているＤＮＡも公知であり、Ａ．ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
　塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用等が挙げられる。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
　本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドン利用頻度をアスペルギルス属微生物に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
　コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されない。
　本発明のＤＮＡの例として、配列番号３又は４に示す塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。配列番号３又は４に示される塩基配列からなるＤＮＡは、それぞれ、前記（１）のポリペプチドの第５７８位がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されたポリペプチドをコードしている。
　本発明のＤＮＡの他の例として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドをコードし、配列番号３又は４に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。
　ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
　本発明のＤＮＡの更なる例として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチドをコードし、且つ配列番号３又は４に示す塩基配列からなるＤＮＡに７０％以上、８０％以上、８５％以上又は９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。当該相同性としては、好ましくは９２％以上又は９４％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、又は９７％以上、一層好ましくは９８％以上又は９９％以上、より好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．８％以上が挙げられる。
　ここで、ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
３．発現カセット又は組換えベクター
　本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター（以下、「本発明の発現カセット」又は「本発明の組換えベクター」とも表記する）は、本発明のＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、又は、発現ベクターに本発明の発現カセット若しくは本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の発現カセット又は組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本発明の組換えベクターについて、発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ株式会社）ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよい。
４．形質転換体
　本発明の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって、形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で本発明のＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）等のアスペルギルス属、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する微生物；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等であってもよい。これらの中でもアスペルギルス属微生物が特に好ましい。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が微生物の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、及びＰＥＧ法等が挙げられる。
　本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、及びノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　ＰＣＲ法よって本発明の発現カセット又は本発明の組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ又は発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。
　発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。
　更に、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ＤＮＡと発現カセット又は発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
　その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。
　また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
５．ポリペプチドの製造方法
　本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養する工程を含む製造方法によって得ることができる。
　形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
　培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。
　窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。
　炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
　培養温度は、本発明の形質転換体が生育可能であり、且つ本発明の形質転換体が本発明のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定し得るが、好ましくは１５～３７℃程度である。培養は、本発明のポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２～４８時間程度である。
　本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
　また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
　濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　前記精製処理は既に公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして精製された本発明のポリペプチドは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化して市場に流通させることができる。
６．酵素剤
　本発明のポリペプチドは、酵素剤の形態で提供されることができる。したがって、本発明は、上記本発明のポリペプチドを有効成分として含む酵素剤も提供する。
　本発明の酵素剤における本発明のポリペプチドの含有量としては特に限定されず、有効成分のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が発揮される範囲で適宜設定することができる。
　本発明の酵素剤は、上記本発明のポリペプチド以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、上記本発明のポリペプチド以外の他の酵素、添加剤、上記製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
　他の酵素としては、上記本発明のポリペプチドの用途に応じて適宜決定することができるが、例えば、アミラーゼ（α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ（上記有効成分以外）、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素、プルラナーゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　添加剤としては、上記本発明のポリペプチドの用途及び酵素剤の製剤形態に応じて適宜決定することができるが、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分等が挙げられる。
　本発明の酵素剤の製剤形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。これらの製剤形態の酵素剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
　本発明の酵素剤の具体的な例としては、後述のグルコース測定用試薬及びグルコース低減剤が挙げられる。
７．用途
　本発明のポリペプチドは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を利用する用途に適用することができる。このような用途としては、対象試料中のグルコースの測定を目的とした用途、対象組成物中のグルコースの低減を目的とした用途が挙げられる。
　本発明のポリペプチドを、対象試料中のグルコースの測定を目的とした用途に適用する場合、より具体的には、本発明のポリペプチドは、グルコース測定用試薬の有効成分として、又はグルコースセンサの認識素子として、用いることができる。また、本発明のポリペプチドを、対象組成物中のグルコースの低減を目的とした用途に適用する場合、本発明のポリペプチドは、グルコース低減剤の有効成分として用いることができる。
　つまり、本発明は、上記本発明のポリペプチドを含むグルコース測定用試薬、グルコースセンサ、及びグルコース低減剤も提供する。このうち、グルコース測定用試薬及びグルコース低減剤について、有効成分以外に含まれ得る他の成分及び製剤形態については、上記本発明の酵素剤で述べた内容と同じであり、その具体的な使用方法については後述「８．グルコース測定法」に詳述する。また、グルコースセンサ及びその具体的な使用方法については後述「１０．グルコースセンサ」に詳述する。
８．グルコース測定法
　上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコース測定用試薬として用いることができる。従って、本発明は、上記本発明のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法も提供する。
　試料の例としては、血糖値を測定すべき試料（具体的には血液試料）、食料品中のグルコース量を測定すべき試料（具体的には、調味料、飲料等）、発酵食料品（具体的には、食酢、酒等）の製造過程において発酵度を測定すべき試料等が挙げられる。
　本発明のグルコース測定法においては、上記本発明のポリペプチドによる酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定することができる。具体的には、グルコースを含む試料と、本発明のポリペプチドとを接触させて酵素反応を行い、酵素反応をモニターするシグナル変化に基づいて、反応したグルコース量を測定することができる。
　より具体的には、本発明のポリペプチドを、電子受容体（２，６－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）等）、並びに必要に応じて用いられる反応促進剤（例えば、Ｎ－（２－アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウム、イミダゾール等）、ｐＨ緩衝剤、及び／又は発色試薬とともに、グルコースを含む試料と接触させ、一定時間反応させることができる。この間、電子受容体の還元変化又は電子受容体から電子を受け取ることによる色素の重合生成に基づくシグナル変化（例えば、吸光度変化）等をモニタリングすることができる。試料中のグルコースがすべて酸化された時点までのシグナル変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
　上記の酵素反応における条件は、本発明のポリペプチドの至適温度及び至適ｐＨ等に基づいて適宜決定される。
９．グルコース測定用キット
　本発明は、上記のグルコース測定法を行うために用いられるグルコース測定用キットも提供する。本発明のグルコース測定用キットは、上記「７．用途」で述べたグルコース測定用試薬を含む。
　本発明のグルコース測定用キットは、グルコース測定用試薬以外の他のアイテムとして、アッセイに必要な緩衝剤、電子受容体、反応促進剤、及び／又は発色試薬等の試薬、並びにキャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液等を含むことができる。これら他のアイテムの具体例及び使用方法については、上記「８．グルコース測定法」で述べた通りである。本発明のグルコース測定用キットは、これらの他のアイテムを、１種を単独で含んでいてもよいし、複数種を組み合わせて含んでいてもよい。
１０．グルコースセンサ
　上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコースセンサの認識素子として用いることができる。従って、本発明は、不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された上記本発明のポリペプチドとを含むグルコースセンサも提供する。
　ポリペプチドの固定態様としては特に限定されず、付着、吸着、吸収、封入、膨潤等による物理的固定、特異的非共有的結合による化学的又は生化学的固定、及び共有結合による化学的固定が挙げられる。
　また、ポリペプチドは、ポリペプチドが単独の形態で不溶性支持体に固定されていてもよいし、ポリペプチドが他の成分とともに組成物の形態で不溶性支持体に固定されていてもよい。ポリペプチドが組成物の形態で不溶性支持体に固定されている場合の具体的な態様としては、当該組成物が不溶性支持体に物理的固定している態様が挙げられる。
　不溶性支持体は、少なくともその表面が、上記本発明のポリペプチドとグルコースとの反応系中に溶解せず且つ上記のポリペプチドを固定できる固体物質又は固形材料で構成されている。不溶性支持体の少なくとも表面を構成する材料の具体例としては、膨潤性材料（例えばゼラチン等の高分子マトリックス等）、多孔性基材（例えばセルロース等の多孔質体、ろ紙等の不織シート）、樹脂、ガラス、レドックスポリマー（つまり、レドックスメディエータを結合させたポリマー）、金属、カーボン等が挙げられる。
　不溶性担体の形状としては特に限定されず、例えば、基板状、薄片状、スティック状、ビーズ状等が挙げられる。
　上記の不溶性担体の好ましい例としては、その表面が上記の材料で構成された電極（例えば、金電極、白金電極、カーボン電極等）が挙げられる。また、このような電極には、好ましくはポリペプチドが物理的固定されており、より好ましくは、ポリペプチドが他の成分（例えば、フェロセン、フェリシアン化物等のメディエータ、フェナジンメトサルフェート等）をともに含む組成物の態様で物理的固定されている。
　本発明のグルコースセンサの具体的な態様としては、バイオセンサとして採用されている任意の形態であってよく、例えば、センサチップ、マイクロタイタープレート、テストストリップ、電気化学的フローセル等が挙げられる。
　このような具体的態様におけるグルコースのセンシングは、上記「８．グルコース測定法」で述べた方法に準拠した方法、特に以下の方法で行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として上記本発明のポリペプチドを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料（好ましくは血液試料、より好ましくは自己血液）を接触させて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
１１．グルコースが低減された組成物の製造方法
　上述の通り、本発明のポリペプチドは、グルコース低減剤として用いることができる。従って、本発明は、上記本発明のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法も提供する。
　本発明の製造方法においては、上記本発明のポリペプチドによる酸化還元反応を利用して上記組成物中のグルコースをグルコノ？δ？ラクトンに変換することで、グルコース量を低減することができる。具体的には、グルコースを含む上記組成物と、本発明のポリペプチドとを接触させて酵素反応を行えばよい。酵素反応における条件は、本発明のポリペプチドの至適温度及び至適ｐＨ等に基づいて適宜決定される。
　本発明の製造方法によって得られる、グルコースが低減された、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物は、メイラード反応による着色を抑制することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１
　配列番号１のアミノ酸配列からなるグルコースデヒドロゲナーゼ（アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体；以下において、「ＧＤＨ１」とも記載する。）のＸ線結晶構造解析を行った結果、第５８２位アミノ酸への変異導入に伴い、第５３８位のヒスチジンが立体障害を受けている可能性に着眼した。この立体障害の解消を目的として、第５３８位のヒスチジン近傍の第５７８位メチオニンへの変異導入を検討した。
　配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２に示される塩基配列をもとに、以下の変異用プライマーを設計した。
　　Ｍ５７８Ａ変異用プライマー1：ACGCAAGCCTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号５）
　　Ｍ５７８Ａ変異用プライマー2：GGACGAGGCTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号６）
　　Ｍ５７８Ｎ変異用プライマー1：ACGCAAAACTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号７）
　　Ｍ５７８Ｎ変異用プライマー2：GGACGAGTTTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号８）
　　Ｍ５７８Ｖ変異用プライマー1：ACGCAAGTGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号９）
　　Ｍ５７８Ｖ変異用プライマー2：GGACGACACTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１０）
　　Ｍ５７８Ｌ変異用プライマー1：TACGCAACTGTCGTCCCATCCTATG（配列番号１１）
　　Ｍ５７８Ｌ変異用プライマー2：GACGACAGTTGCGTAGGGGGAATAG（配列番号１２）
　　Ｍ５７８Ｋ変異用プライマー1：ACGCAAAAGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１３）
　　Ｍ５７８Ｋ変異用プライマー2：GGACGACTTTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１４）
　　Ｍ５７８Ｄ変異用プライマー1：ACGCAAGATTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１５）
　　Ｍ５７８Ｄ変異用プライマー2：GGACGAATCTTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１６）
　　Ｍ５７８Ｆ変異用プライマー1：ACGCAATTCTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１７）
　　Ｍ５７８Ｆ変異用プライマー2：GGACGAGAATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号１８）
　　Ｍ５７８Ｗ変異用プライマー1：ACGCAATGGTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号１９）
　　Ｍ５７８Ｗ変異用プライマー2：GGACGACCATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号２０）
　　Ｍ５７８Ｙ変異用プライマー1：ACGCAATACTCGTCCCATCCTATGACG（配列番号２１）
　　Ｍ５７８Ｙ変異用プライマー2：GGACGAGTATTGCGTAGGGGGAATAGA（配列番号２２）
　配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡに挿入されたプラスミドを鋳型として、設計した上記のプライマーとＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片を得た。
　ＰＣＲ後の増幅産物を制限酵素Ｄｐｎ　Ｉで処理し、未変異のプラスミドを消化後、ライゲーションを行い、変異導入されたプラスミドを取得した。変異導入後のプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、プラスミド抽出を行い、変異導入されたプラスミドを作製した。得られた変異導入されたプラスミドをサッカロマイセス・セレビシエに形質転換した。得られた形質転換株について液体培養を行い、これにより得られた酵素溶液について以下の手法でＧＤＨ活性を調べた。
ＧＤＨ活性評価方法
　５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２．０５ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌのグルコース溶液０．６０ｍＬ、１５ｍｍｏｌ／ＬのＰＭＳ溶液０．１０ｍＬ、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＤＣＩＰ溶液０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素溶液を０．１ｍＬ添加し、反応を開始した。酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出した。この際、ＧＤＨ活性は、Ｄ－グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　なお、式中のＶｔは反応試薬溶液と酵素溶液との総液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件における還元型ＤＣＩＰの１μｍｏｌ当たりの吸光係数（ｃｍ2／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
　変異導入前の酵素ＧＤＨ１のＧＤＨ活性を１００％とし、各変異酵素のＧＤＨ活性の相対量（％）を算出した。結果を図１に示す。図１に示す通り、Ｍ５７８Ｖ及びＭ５７８Ｆで活性の向上が認められた。なお、各酵素の発現量はＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、同等レベルの発現量であることを確認した。従って、Ｍ５７８Ｖ及びＭ５７８Ｆで比活性が向上したことが認められた。
試験例２
　Ｍ５７８Ｖの変異が導入されたＧＤＨ１プラスミドから、ＧＤＨ遺伝子部分をＰＣＲにて増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をタカアミラーゼ改変ＣＳ３プロモーターとアスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのターミネーター遺伝子の間につなぎ、発現カセットを構築した。
　構築された発現カセットと、アスペルギルス・オリゼ由来オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ遺伝子）とを、ｐＵＣ１９に挿入し、発現プラスミドを構築した。構築された発現プラスミドを用いて、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のｐｙｒＧ遺伝子欠損株を形質転換し、ウリジン要求性を利用して形質転換株を取得した。得られた形質転換株を液体培養で培養し、Ｍ５７８Ｖを含む粗酵素液を取得した。得られた粗酵素液を塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマトを用いて精製し、凍結乾燥を行い、Ｍ５７８Ｖの精製酵素粉末を得た。
　得られたＭ５７８Ｖの精製酵素粉末及びＧＤＨ１の精製酵素粉末の単位重量あたりのＧＤＨ活性値（Ｕ／ｍｇ）を試験例１と同様に測定し、Ｍ５７８ＶのＧＤＨ活性の相対量（相対活性）を算出し、ＧＤＨ１の活性値を１００％とした場合のＭ５７８Ｖの相対活性を導出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１に示すとおり、Ｍ５７８Ｖは、ＧＤＨ１と比較して約２割の比活性向上を示した。
　また、グルコースに対するカイネティックパラメータ（Ｋｍ［ｍｍｏｌ／Ｌ］及びＶｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）を求め、ＧＤＨ１のＫｍ及びＶｍａｘをそれぞれ１００％とした場合のＭ５７８Ｖの相対Ｋｍ及び相対Ｖｍａｘ相対活性を導出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表２に示す通り、Ｍ５７８ＶはＧＤＨ１と比較してグルコースに対するＫｍはほとんど変わらないが、Ｖｍａｘは約２割の向上を示した。つまり、Ｍ５７８ＶはＧＤＨ１と比較してグルコース基質に対する酵素親和力はほとんど変わらないが、酵素反応の効率が向上していることが認められた。
配列番号１は、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体である。
配列番号２は、アスペルギルス・ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコースオキシダーゼのＤ４４６Ｈ及びＶ５８２Ｐ二重変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号３は、配列番号１に示す二重変異体のＭ５７８Ｖ変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号４は、配列番号１に示す二重変異体のＭ５７８Ｆ変異体をコードするＤＮＡである。
配列番号５～２２は、変異導入用プライマーである。

Claims (12)

  1. 　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド：
    （１）配列番号１に示すアミノ酸配列において、第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、前記置換が導入されたアミノ酸残基以外の１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド、及び
    （３）配列番号１に示すアミノ酸配列における第５７８位のアミノ酸残基がバリン残基又はフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記置換が導入されたアミノ酸残基を除いた配列同一性が７０％以上であり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してグルコースデヒドロゲナーゼ活性が向上しているポリペプチド。
  2. 　請求項１に記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
  3. 　請求項２に記載のＤＮＡを含む発現カセット又は組換えベクター。
  4. 　請求項３に記載の発現カセット又は組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  5. 　請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
  6. 　請求項１に記載のポリペプチドを含む酵素剤。
  7. 　請求項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース測定用試薬。
  8. 　請求項１に記載のポリペプチドを用いて試料中のグルコースを測定する工程を含む、グルコース測定法。
  9. 　請求項７に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
  10. 　不溶性支持体と、前記不溶性支持体に固定された請求項１に記載のポリペプチドとを含む、グルコースセンサ。
  11. 　請求項１に記載のポリペプチドを含む、グルコース低減剤。
  12. 　請求項１に記載のポリペプチドを用いて、食品組成物、化粧料組成物、及び医薬組成物からなる群より選択される組成物中のグルコースを低減する工程を含む、グルコースが低減された組成物の製造方法。
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