JP2000245454A - トリコスポロン属由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フルクトシルバリン（ＦＶ）酸化分解能に優
れる新規フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯ
Ｄ）を提供する。 【解決手段】 トリコスポロン属（Trichosporon）の菌
体、好ましくは図１１に示すトリコスポロン ムコイデ
ス ＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoidesKDK4001）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）を培養して、得られた菌
体から菌体破砕によりタンパク質を抽出し、精製を行う
ことにより、単一のＦＡＯＤを得ることができる。この
トリコスポロン ムコイデス ＫＤＫ４００１（Tricho
sporonmucoides KDK4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３
４）由来のＦＡＯＤは、例えば、他の菌体由来のＦＡＯ
Ｄに比べ、ＦＶに対する比活性が高く、ＦＶの酸化分解
能に優れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規フルクトシル
アミノ酸オキシダーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】血液中の糖化タンパク質、例えば、糖化
アルブミンや、赤血球中の糖化ヘモグロビン（以下、
「ＨｂＡ１ｃ」という）等は、生体内血糖値の過去の履
歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における
重要な指標とされている。

【０００３】このような糖化タンパク質の測定方法とし
ては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）法、ミニカラム法、免疫法、酵素法等があげられ
る。この中でも、特にフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法は、他の測定方法に比
べ、正確かつ迅速に糖化タンパク質を測定できる方法で
ある。

【０００４】このＦＡＯＤを用いた測定方法は、例え
ば、以下に示すようにして行うことができる。まず、Ｆ
ＡＯＤが糖化タンパク質に作用し易いように、糖化タン
パク質をプロテアーゼで分解する。そして、この分解物
をＦＡＯＤで処理し、ＦＡＯＤの酸化還元反応により生
成する過酸化水素量または消費される酸素量を測定する
ことによって、前記糖化タンパク質の量を測定する。

【０００５】しかしながら、従来のＦＡＯＤは、ＨｂＡ
１ｃに対しての作用に問題があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、ＨｂＡ１ｃに対して良く作用する新規ＦＡＯＤの提
供である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ＨｂＡ１ｃの糖化部分
は、そのＮ末端のバリン残基である。そこで、本発明者
らは、ヘモグロビンを単一炭素源及び窒素源として生育
し、かつフルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」という）
を単一窒素源として生育することを条件として、自然界
の様々な菌体を分離培養し、それらが産生する酵素につ
いて、ＦＶに対する酸化分解能等を調べた。その結果、
下記式（１）で示される反応を触媒する新規ＦＡＯＤを
産生する菌体を分離することに成功し、本発明に至っ
た。なお、本発明のＦＡＯＤは、下記式（１）で示すよ
うに、ＦＶに限らず、α−アミノ基が糖化された他のア
ミノ酸に対して活性が極めて高い。また、本発明のＦＡ
ＯＤは、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質に対して、
下記式（１）と同様の触媒機能を発揮してもよく、さら
にその他の触媒機能を有していてもよい。本発明のＦＡ
ＯＤを使用することにより、ＨｂＡ１ｃの測定を高精度
かつ迅速に行うことが可能となる。また、本発明のＦＡ
ＯＤは、ＨｂＡ１ｃの測定以外にも、他の糖化タンパク
質、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の測定や、その他
の用途に使用できる。

【０００８】

【化１】 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨＲ²−ＣＯＯＨ ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ →Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ₂−ＣＨＲ²−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ …（１） ［前記式中、Ｒ¹は糖残基を示し、Ｒ²はアミノ酸側鎖基
を示す。］

【０００９】前記式（１）において、糖残基（Ｒ¹）
は、糖化反応前の糖に由来する残基を意味し、反応前の
糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前
の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、
反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位によ
り、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場
合、糖残基（Ｒ¹）は、グルコース残基（アルドース残
基）となる。また、この糖残基（Ｒ¹）は、例えば、−
[ＣＨ（ＯＨ）]_n−ＣＨ₂ＯＨで示すことができる。な
お、ｎは、０〜６の整数である。

【００１０】また、前記式（１）において、アミノ酸側
鎖基を示すＲ²は、例えば、アミノ酸が、グリシン、ア
ラニン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン酸、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニ
ン、チロシン、バリン、アルギニン、メチオニン、スレ
オニン、ヒスチジン等の場合、それぞれ−Ｈ（グリシン
の場合）、アラニン側鎖基、セリン側鎖基、アスパラギ
ン側鎖基、アスパラギン酸側鎖基、グルタミン酸側鎖
基、イソロイシン側鎖基、ロイシン側鎖基、フェニルア
ラニン側鎖基、チロシン側鎖基、バリン側鎖基、アルギ
ニン側鎖基、メチオニン側鎖基、スレオニン側鎖基、ヒ
スチジン側鎖基等を示す。

【００１１】また、本発明のＦＡＯＤとしては、前記式
（１）で示される反応触媒機能を有していれば、配列番
号１〜６に記載のいずれかのアミノ酸配列において、一
個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されていても
よい。

【００１２】本発明のＦＡＯＤ産生菌体として、本発明
者らにより単離された菌体としては、トリコスポロン属
（Trichosporon）の菌体があり、その種類としては、新
菌体であるトリコスポロン ムコイデス ＫＤＫ４００
１（Trichosporon mucoidesKDK4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−
１７１３４）があげられる。なお、本発明のＦＡＯＤ
は、これらの菌体由来には制限されず、例えば、前述の
ようなアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝
子を組み込んだ組換え体由来等であってもよい。

【００１３】本発明のＦＡＯＤにおいて、α―アミノ基
が糖化されたアミノ酸（以下、「α―ＧＡ」という）を基
質としたときの比活性が、α―アミノ基以外のアミノ基
が糖化されたアミノ酸を基質としたときの比活性よりも
高いことが好ましい。また、前述のように、ＨｂＡ１ｃ
は、そのＮ末端バリン残基が糖化されていることから、
前記α―ＧＡが、α−アミノ基が糖化されたバリン（以
下、「α―ＧＶ」という）であることが好ましく、特に
好ましくはＦＶである。また、前記α―アミノ基以外の
アミノ基が糖化されたアミノ酸が、ε−アミノ基が糖化
されたリジンであることが好ましく、特に好ましくはε
−アミノ基が糖化されたフルクトシルリジン（以下、
「ε−ＦＬ」という）である。

【００１４】つぎに、本発明のＦＡＯＤの理化学的性質
の一例を以下に示す。この理化学的性質は、本発明のＦ
ＡＯＤを産生する菌体であるトリコスポロン ムコイデ
スＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoides KDK4001）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）を後述する方法により培
養し、精製することによって得られたＦＡＯＤ単一標品
を用いて、以下に示す方法により明らかにされたもので
ある。

【００１５】（１）力価の測定方法 酵素反応により生成する過酸化水素量の測定を用いる方
法と、酵素反応により消費する酸素量の測定を用いる方
法がある。

【００１６】Ａ．過酸化水素量の測定 （Ａ−１：速度法）以下に示すＦＡＯＤ反応液組成にな
るように、各試薬を混合して、前記ＦＡＯＤの添加によ
り反応を開始する。そして、４−アミノアンチピリンの
酸化生成物であるキノン色素の波長５０５ｎｍにおける
吸収（吸光度）を、ＳｈｉｍａｄｚｕＵＶ−２２００Ａ
分光光度計（島津製作所社製）を用いて、経時的に測定
する。生成されたキノン色素の分子吸光係数（ε＝５．
１６×１０³）と吸光度とから、反応温度３０℃で、１
分間に生成する過酸化水素量（μｍｏｌ）を算出し、こ
の値をＦＡＯＤ活性とする（単位：Ｕ）。

【００１７】 （ＦＡＯＤ反応液組成） トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５） １００μｍｏｌ ４−アミノアンチピリン ４．５μｍｏｌ フェノール ６．０μｍｏｌ ＦＡＯＤ基質（ＦＶ） ５．０μｍｏｌ ＰＯＤ ６．０Ｕ ＦＡＯＤ 適当量（約０．０１〜１．０Ｕ） （全体積：３ｍｌ）

【００１８】（Ａ−２：終末法）前記速度法（Ａ−１）
と同様にして反応を開始し、反応液の一定時間（通常、
１０分間）における吸光度の増加を測定する。そして、
予め、標準過酸化水素を用いて作成した検量線から、反
応温度３０℃で、１分間に生成した過酸化水素量（μｍ
ｏｌ）を算出し、この値をＦＡＯＤ活性（Ｕ）とする。

【００１９】Ｂ．酸素量の測定 ０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌと
前記ＦＡＯＤ溶液５０μｌ（約０．０１〜１．０Ｕ）と
を測定容器内で混合し、これに蒸留水を加え全量を２．
９ｍｌにする。この混合液中に酸素電極（ランクブラザ
ース社製）のセルを入れ、３０℃で攪拌し、前記混合液
中の溶存酸素および前記混合液の温度を平衡化する。そ
して、前記混合液に５０ｍＭ ＦＶ１００μｌを添加
し、消費された酸素量を記録計で連続的に計測し、初速
度を求める。そして、予め、測定容器内の酸素濃度とそ
の記録値とから標準曲線を作成し、この標準曲線から、
反応温度３０℃で、１分間に消費された酸素量（μｍｏ
ｌ）を求め、これを酵素単位（Ｕ）とする。

【００２０】（２）至適ｐＨ 以下に示す各種緩衝液を用いた以外は、前記速度法（Ａ
−１）と同様に活性測定を行い、各条件における相対活
性（％）を求めた。前記緩衝液としては、０．１Ｍ リ
ン酸カリウム緩衝液（以下、「ＫＰＢ」という）（ｐＨ
５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ
７．５、ｐＨ８．０）、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０）
および０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．
５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．０、ｐＨ１
０．５）を使用した。この結果を、図１のグラフに示
す。同図において、はＫＰＢ、●はトリス（Ｔｒｉｓ）
−ＨＣｌ緩衝液、□はグリシン（Ｇｌｙ）−ＮａＯＨ緩
衝液をそれぞれ示す。図示のように、至適ｐＨは、ｐＨ
６．５〜９．０の範囲であり、ｐＨ７．５〜８．０の場
合に優れた活性を示した。

【００２１】（３）ｐＨ安定性 以下に示す各種緩衝液を使用し、反応前に前記ＦＡＯＤ
を前記各種緩衝液と混合し、３０℃で１０分間インキュ
ベートした以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様に活性
測定を行い、各条件における残存活性（％）を求めた。
前記緩衝液は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、ｐＨ
４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５）および前記至適ｐＨ
の検討に使用した３種類の緩衝液である。この結果を、
図２のグラフに示す。同図において、▲は酢酸緩衝液、
□はＫＰＢ、●はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、△はＧｌｙ
−ＮａＯＨ緩衝液をそれぞれ示す。図示のように、ｐＨ
４．５〜９．５の範囲で安定であり、ｐＨ４．０以下お
よびｐＨ１０．５以上で処理した場合に、その残存活性
は１０％以下であった。

【００２２】（４）至適温度 各温度（２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４
５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃）で反応を行っ
た以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様に活性測定を行
い、各条件における相対活性（％）を求めた。この結果
を図３のグラフに示す。図示のように、至適温度は、３
０〜５５℃の範囲であり、４５℃の場合に優れた活性を
示した。

【００２３】（５）熱安定性 前記ＦＡＯＤをトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と
混合し、反応前に各温度（２５℃、３０℃、３５℃、４
０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃）で１０分間イ
ンキュベートした以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様
に活性測定を行い、各条件における残存活性（％）を求
めた。この結果を図４のグラフに示す。図示のように、
本発明のＦＡＯＤは、２５〜５０℃の範囲で安定である
が、５５℃で処理した場合、約９０％失活した（残存活
性約１０％）。

【００２４】（６）基質に対する比活性 基質としてＦＶを用いた場合の比活性を前記速度法（Ａ
−１）により測定した。また、前記ＦＶの代わりにε−
ＦＬを使用した以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様に
して、ε−ＦＬを用いた場合の比活性を測定した。その
結果、ＦＶを用いた場合の比活性が、７９．５Ｕ／ｍｇ
であり、ε−ＦＬを用いた場合の比活性（４１．４Ｕ／
ｍｇ）よりも高かった。

【００２５】（７）基質特異性 各種基質を用いた以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様
に活性測定を行い、各基質に対する相対活性（％）を求
めた。これらの結果を下記表１に示す。前記相対活性
は、基質としてＦＶを用いた場合の比活性を１００％と
して表した。

【００２６】

【表１】 基質 相対活性 （％） フルクトシルアラニン ８３．７ フルクトシルイソロイシン ９２．６ フルクトシルロイシン ５５．１ フルクトシルフェニルアラニン ５０．７ フルクトシルセリン ７６．１ ＦＶ １００

【００２７】前記表１に示すように、ＦＶに対する活性
が最も高かった。また、上記の糖化アミノ酸以外の糖化
アミノ酸（α−アミノ基が糖化されたもの）に対して
も、活性が確認された。なお、Ｄ−バリンが糖化したも
の（フルクトシル−Ｄ−バリン）については、活性はみ
られなかった。

【００２８】（８）ミカエリス定数（Ｋｍ値） 前記速度法（Ａ−１）により活性測定を行い、基質ＦＶ
に対するミカエリス定数を求めた。また、基質ε−ＦＬ
に対するミカエリス定数は、基質ＦＶの代わりにε−Ｆ
Ｌを用いた以外は、前記速度法（Ａ−１）と同様に活性
測定を行って、求めた。この結果を図５および図６に示
す。図５は、ＦＶについてのラインウェーバー−バーク
の逆数プロットを示すグラフであり、図６は、ε−ＦＬ
についてのラインウェーバー−バークの逆数プロットを
示すグラフである。

【００２９】図５および図６からＶｍａｘおよびＫｍ値
を求めた結果、基質がＦＶの場合、Ｖｍａｘ＝１１０μ
ｍｏｌ・ｍｉｎ^-1・ｍｇ^-1、Ｋｍ＝０．８６ｍＭであ
り、基質がε−ＦＬの場合、Ｖｍａｘ＝４９．３μｍｏ
ｌ・ｍｉｎ^-1・ｍｇ^-1、Ｋｍ＝０．５０ｍＭであった。

【００３０】（９）金属の影響 予め、前記ＦＡＯＤに、金属イオンが終濃度１ｍＭにな
るようにその金属塩を添加して、３０℃で５分間インキ
ュベートした後、前記速度法（Ａ−１）により活性測定
を行い、これらの相対活性（％）を求めた。これらの結
果を下記表２に示す。なお、相対活性は、金属塩無添加
の場合の比活性を１００％として表した。

【００３１】

【表２】

【００３２】前記表２に示すように、本発明ＦＡＯＤ
は、Ｃｕイオン、Ａｇイオン、Ｈｇイオンによりほぼ完
全に阻害され、Ｃｏイオンにより若干阻害されることが
わかった。

【００３３】（１０）阻害剤による影響 予め、前記ＦＡＯＤ溶液に、終濃度１ｍＭになるように
各種阻害剤を添加して、３０℃で１０分間インキューベ
ートを行った後、前記速度法（Ａ−１）により活性測定
を行い、これらの残存活性（％）を求めた。この結果
を、下記表３に示す。前記残存活性は、前記ＦＡＯＤが
阻害剤未処理の場合の比活性を１００％として表した。
下記表３において、ＰＣＭＢはｐ−クロロメルクリ安息
香酸、ＤＴＮＢは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安
息香酸）、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を示す。

【００３４】

【表３】

【００３５】前記表３に示すように、前記ＦＡＯＤは、
チオール（ＳＨ）基阻害剤であるＰＣＭＢによりほぼ完
全に阻害されたが、その他のＳＨ基阻害剤による阻害は
見られなかった。また、フェニルヒドラジンにより阻害
がみられたが、同じくカルボニル基に作用するヒドラジ
ンおよびヒドロキルアミンによる阻害は見られなかっ
た。

【００３６】（１１）分子量 分子量の決定は、ゲルろ過法、およびドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）法により行った。

【００３７】Ａ．ゲルろ過法 カラムは、スーパーデックス２００ｐｇ（Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ２００ｐｇ）（ファルマシア社製）カラム（カラム
サイズ：１６／６０）、溶出溶媒は、０．１ＭＮａＣｌ
含有の０．１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ８．５）、分子量の標準
タンパク質は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（分子量
２９０，０００）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（分子
量１４０，０００）、エノラーゼ（分子量６７，００
０）、ミオキナーゼ（分子量３２，０００）およびシト
クロームｃ（分子量１２，４００）をそれぞれ用いた。
前記カラムにより前記ＦＡＯＤおよび前記標準タンパク
質の分画をそれぞれ行い、これらの溶出体積から、前記
ＦＡＯＤの分子量を求めた。この結果を図７のグラフに
示す。このグラフは、各種タンパク質の溶出体積と分子
量の対数との関係を示す。このグラフから、ゲルろ過法
によるＦＡＯＤの分子量は、約４６，０００（４６ｋＤ
ａ）であることがわかった。

【００３８】Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法 まず、デービスの方法に従い、１０％ゲル（ｐＨ８．
８）を用いて、２０ｍＡで２時間電気泳動した後、クー
マシーブリリアントブルーＧ−２５０（和光純薬工業社
製）によりタンパク染色を行った。なお、分子量の標準
タンパクとして、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０
００）、オボアルブミン（分子量４３，０００）、カル
ボニックアンヒドラーゼ（分子量３０，０００）、トリ
プシンインヒビター（分子量２０，１００）およびリゾ
チーム（分子量１４，３００）についても同様に電気泳
動を行った。この結果を図８および図９に示す。図８
は、各種タンパク質の泳動パターンを表し、図９は、前
記泳動パターンをもとに、各種タンパク質の移動度（Ｒ
ｆ値）と、分子量の対数との関係を示したグラフであ
る。この結果から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による前記ＦＡ
ＯＤの分子量は、約５０，０００（５０ｋＤａ）である
ことがわかった。

【００３９】（１２）サブユニット構造 前記ゲルろ過法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量
の結果からモノマー構造であることが推測された。

【００４０】（１３）補酵素の関与 前記ＦＡＯＤ溶液および１０ｍＭ ＦＶを含有するＦＡ
ＯＤ溶液のそれぞれの吸収スペクトルを、Ｓｈｉｍａｄ
ｚｕＵＶ−２２００Ａ分光光度計（島津製作所社製）を
用いて測定した。その結果を図１０に示す。同図におい
て、実線はＦＡＯＤ溶液のスペクトル、破線はＦＶを含
有するＦＡＯＤ溶液の吸収スペクトルをそれぞれ示す。
図示のように、ＦＶを添加することにより、波長４５０
ｎｍの吸収ピークが消失した。これによりＦＡＯＤには
補酵素フラビンが関与していることが推測された。

【００４１】（１４）アミノ酸配列 前記ＦＡＯＤの単一標品を用いて、常法のエドマン分解
法によりアミノ酸配列の決定を行った。その結果、配列
番号１〜６に記載のアミノ酸配列を有することが確認で
きた。

【００４２】（１５）既知のＦＡＯＤとの理化学的性質
の比較 下記表４に既存のＦＡＯＤおよび前記トリコスポロン
ムコイデス ＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoides
KDK4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）由来ＦＡＯＤ
の諸性質を示す。

【００４３】なお、下記表４において、各種菌体由来の
ＦＡＯＤの諸性質についての出典は、アスペルギルス
テレウスＧＰ−１（Aspergillus terreus GP-1)（ＦＥ
ＲＭＢＰ−５６８４）は、国際公開公報ＷＯ９７／２０
０３９号、ペニシリウムジャンシネルムＳ−３４１３
（Penicilium janthinellumＳ−３４１３）（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４７５）は、特開平８−３３６３８６号公
報、ギベレラ フジクロイＩＦＯ６３５６（Gibberella
fujikuroi ＩＦＯ６３５６）は、特開平７−２８９２
５３号公報、フサリウム オキスポルムＳ−１Ｆ４（Fu
sarium oxyspor um S-1F4）（ＦＥＲＭ ＢＰ−５０１
０）は、特開平７−２８９２５３号公報である。

【００４４】

【表４】

【００４５】前記表４に示すようにトリコスポロン ム
コイデス ＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoides KD
K4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）由来のＦＡＯＤ
は、他のＦＡＯＤに比べ、ＦＶに対する比活性が優れて
おり、かつε−アミノ基が糖化されているε−ＦＬより
もＦＶに対する比活性が高い点で他のＦＡＯＤとは異な
っていた。

【００４６】つぎに、本発明のＦＡＯＤを産生する新規
菌体について説明する。この菌体としては、例えば、前
述のように、トリコスポロン属（Trichosporon）の菌体
があり、この中でも特に好ましくは、トリコスポロン
ムコイデス ＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoides
KDK4001）である。

【００４７】このトリコスポロン ムコイデス ＫＤＫ
４００１（Trichosporon mucoidesKDK4001）は、本発明
者らが、土壌中より新規に単離した菌体であり、工業技
術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１７１３４（寄託日：平成１１年１月１１日）で、寄
託されている。本菌体の形態を表す顕微鏡写真（１００
０倍）を図１１に示す。なお、本菌体の菌学的特性は、
下記に示すとおりである。

【００４８】（形態学的性質） ピンクコロニー − 出芽細胞（Budding cells） ＋ レモン型細胞(Lemon-shaped cells) − 出芽突起(Buds on stalks) − 分裂細胞(Splitting cells) − 糸状（Filamentous） ＋ 偽分節菌(Pseudohyphae) ＋ 分節分生子(Arthroconidia) ＋ 出芽分生子(Ballistoconidia) − 対象型出芽分生子(Symmetric ballostconidia) −

【００４９】（発酵学的性質） Ｄ−グルコース − マルトース − ラクトース − Ｄ−ガラクトース − スクロース − ラフィノース −

【００５０】（生育学的性質） Ｄ−グルコース ＋ マルトース ＋ グリセロール ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ α，α−トレハロース ＋ エリトリトール ＋ Ｌ−ソルボース ＋ メチル−α−Ｄ−グルコシド ＋ Ｄ−グルシトール ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ セロビオース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−リボース ＋ メリビオース ＋ ｍｙｏ−イノシトール ＋ Ｄ−キシロース ＋ ラクトース ＋ ２−ケト−Ｄ−グルコン酸 ＋ Ｌ−アラビノース − ラフィノース ＋ Ｄ−グルコン酸 ＋ Ｌ−ラムノース ＋ メレチトース ＋ Ｄ−グルクロン酸 ＋ スクロース ＋ ガラクチトール ＋ グルコノ−δ−ラクトン ＋ 硝酸 − エチルアミン ＋ Ｌ−リジン ＋ カダベリン ＋ クレアチン − クレアチニン − ０．０１％シクロヘキサミド ＋ 酢酸生成物 −

【００５１】（生育）酵母ＭＹ培地における生育は、２
５〜３５℃で生育良好であり、３７℃では生育が弱く、
４０℃では生育しない。

【００５２】（生育ｐＨ）生育ｐＨは、ｐＨ７．０が最
適である。

【００５３】本発明のＦＡＯＤを用いれば、糖化アミノ
酸と前記ＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測
定することにより、前記糖化アミノ酸の量を測定するこ
とができる。また、糖化タンパク質または糖化ペプチド
の量を測定する場合は、これらをプロテアーゼで分解し
た後、この分解物と前記ＦＡＯＤとを反応させ、この酸
化還元反応を測定することが好ましい。

【００５４】

【発明の実施の形態】本発明のＦＡＯＤは、例えば、本
発明のＦＡＯＤを産生する菌体であるトリコスポロン属
（Trichosporon）の菌体を培養することによって製造で
きるが、その最適条件は菌体ごとに異なる。以下に、ト
リコスポロン ムコイデス ＫＤＫ４００１（Trichosp
oron mucoides KDK4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３
４）の培養条件を示す。

【００５５】培養に使用する液体培地としては、例え
ば、炭素源、窒素源、無機塩、その他栄養素等を適宜含
有する培地が使用できる。前記炭素源としては、通常、
グルコース、フルクトース、キシロース、グリセリン
等、前記窒素源としては、ペプトン、カゼイン消化物、
大豆粉等のタンパク質またはその消化物、あるいは酵母
エキス等の窒素性有機物等がそれぞれ使用できる。ま
た、前記無機物としては、ナトリウム、カリウム、カル
シウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルト等の塩
類が使用できる。

【００５６】前記培地組成は、特に制限されないが、本
発明のＦＡＯＤ収率が良いことから、糖およびアミノ酸
を含有することが好ましい。前記糖としては、例えば、
グルコースが好ましく、アミノ酸としてはロイシンが好
ましい。前記培地中における糖の含量は、０．５〜１．
０重量％の範囲が好ましく、前記アミノ酸の含量は、
０．５〜１．０重量％の範囲が好ましい。このような培
地の特に好ましい一例として、グルコース−ロイシン褐
変化培地を以下に示す。なお、このグルコース−ロイシ
ン褐変化培地は、グルコースとロイシンとを高温高圧条
件下で褐変反応（メイラード反応）させた培地である。

【００５７】 （グルコース−ロイシン褐変化培地：ｐＨ６．０） グルコース ２．０重量％ ロイシン １．５重量％ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．１重量％ ＮａＨ₂ＰＯ₄ ０．１重量％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５重量％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．０１重量％ 酵母エキス ０．２重量％ 水 残分

【００５８】培養時間は、特に制限されない。ただし、
本発明のＦＡＯＤは、通常、菌体中に存在する菌体内酵
素であるが、培養を長く行うと菌体外に放出されるおそ
れがあるため、例えば、後述のように培養後の菌体中か
らＦＡＯＤを回収する場合は、１５〜２４時間の範囲で
培養することが、特に好ましい。

【００５９】培養温度は２５〜３０℃の範囲が好まし
く、特に好ましくは２８℃、ｐＨはｐＨ５．５〜６．０
の範囲が好ましく、特に好ましくはｐＨ６．０であり、
好気条件下で培養することが好ましい。

【００６０】なお、前述のように培養条件は、培養する
菌体により適宜決定されるため、前述の条件には制限さ
れない。

【００６１】つぎに、前記培養により得られた培養液か
ら、本発明のＦＡＯＤを常法により分離精製することに
より、前記ＦＡＯＤの単一標品を得ることができる。

【００６２】分離精製を行うにあたって、前述のよう
に、本発明のＦＡＯＤは菌体内酵素であるため、まず、
菌体を破砕して、酵素を抽出する。前記菌体破砕の方法
としては、摩砕用アルミナ等を用いた摩砕法、フレンチ
プレス等による高圧法、超音波処理法、酵素処理法、凍
結融解法等があげられる。例えば、前記フレンチプレス
を用いる場合、菌体を緩衝液に懸濁し、この懸濁液に、
２０，０００〜３０，０００ｐｓｉの圧力をかけ、瞬間
的に常圧にまで減圧することにより前記菌体を破砕でき
る。

【００６３】そして、菌体破砕後、遠心分離等によって
ＦＡＯＤを含有する上清を回収し、前記上清中のＦＡＯ
Ｄを分離精製する。この精製は、既知の方法である、硫
安等による塩析法、等電点沈殿法、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ等の組み合わせにより行うことができる。これらの
組み合わせとしては、特に制限されないが、例えば、
（１）交換基がジエチルアミノエチル（以下、「ＤＥＡ
Ｅ」という）基である陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、（２）硫安分画、（３）交換基がフェニル基である
疎水性クロマトグラフィー、（４）交換基がブチル基で
ある疎水性クロマトグラフィー、（５）交換基が４級ア
ンモニウム（以下、「Ｑ」という）基である強陰イオン
クロマトグラフィー、（６）分画分子量が１０，０００
〜２００，０００の範囲であるゲルクロマトグラフィー
の組み合わせ等が採用でき、これにより単一標品が得ら
れる。

【００６４】

【実施例】（実施例１）トリコスポロン ムコイデス
ＫＤＫ４００１（Trichosporon mucoides KDK4001）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）を培養してＦＡＯＤを製
造し、前記ＦＡＯＤの精製を行った。

【００６５】（１）培養方法 前々培養として、下記ＹＥＰＤ培地５ｍｌに、トリコス
ポロン ムコイデスＫＤＫ４００１（Trichosporon muc
oides KDK4001）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１３４）を一白
金耳植菌して、２８℃で、２４時間培養した後、前培養
として、前記グルコース−ロイシン褐変化培地１００ｍ
ｌに前記培養液を植菌して、２８℃で４８時間培養し
た。そして、本培養として、新たな前記グルコース−ロ
イシン褐変化培地１０リットル（１５リットルジャー）
に、前培養の培養液を植菌して、２８℃、１２時間、攪
拌速度５００ｒｐｍ、通気量５リットル／分の条件で培
養した。

【００６６】 （ＹＥＰＤ培地：ｐＨ６．０） 酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製） １．０重量％ バクトペプトン（ＤＩＦＣＯ社製） ２．０重量％ デキストロース（ＤＩＦＣＯ社製） ２．０重量％ 水 残分

【００６７】（２）精製方法 前記培養液から遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍ
ｉｎ、４℃）により菌体を回収し（湿重量５０ｇ）、１
ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）
（以下、「緩衝液Ａ」という）に懸濁して、菌体をフレ
ンチプレスにより破砕した。菌体破砕後、遠心分離（４
℃、１５，０００ｇ、２０分間）して上清を回収し、こ
れを無細胞抽出液とした。

【００６８】前記無細胞抽出液を、前記緩衝液Ａで一晩
透析した後、予め前記緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−
セファセル（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、こ
のカラムを前記緩衝液Ａで洗浄した後、０−０．５Ｍ塩
化カリウム濃度勾配により吸着タンパク質を溶出させ
た。そして、溶出後の活性画分を回収し、硫安分画を行
った。まず、前記活性画分溶液に４０％飽和になるよう
に硫安を添加し、充分に攪拌した後、遠心分離（４℃、
１２，０００ｒｐｍ、１０分、以下同じ）して上清を回
収し、前記上清に５０％飽和になるように硫安を添加
し、攪拌した後、遠心分離により沈殿を回収した。この
沈殿を前記緩衝液Ａに懸濁して、この懸濁液を前記緩衝
液Ａで一晩透析した。

【００６９】前記透析物に４０％飽和になるように硫安
を添加し、予め４０％硫安飽和の前記緩衝液Ａで平衡化
したフェニル−セファロース（ファルマシア社製）カラ
ムに吸着させ、このカラムを４０％硫安飽和の前記緩衝
液Ａで洗浄した後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度
勾配により吸着タンパク質を溶出させた。そして、溶出
後の活性画分を回収し、これを前記緩衝液Ａで一晩透析
した。

【００７０】前記透析物に４０％飽和になるように硫安
を添加し、これを予め４０％硫安飽和の前記緩衝液Ａで
平衡化したブチル−トヨパール（東ソー社製）カラムに
吸着させ、このカラムを４０％硫安飽和の前記緩衝液Ａ
で洗浄した後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度勾配
により吸着タンパク質を溶出させた。そして、溶出後の
活性画分を回収し、前記緩衝液Ａで一晩透析を行った。

【００７１】前記透析物を、予め前記緩衝液Ａで平衡化
したＱ−セファロース（ファルマシア社製）カラムに吸
着させ、このカラムを前記緩衝液Ａで洗浄した後、０−
１．０Ｍ ＫＣｌの直線濃度勾配により吸着タンパク質
を溶出させた。そして、溶出後の活性画分を回収した。

【００７２】前記活性画分を、予め０．１Ｍ ＮａＣｌ
含有の０．１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ８．５）で平衡化したス
ーパーデックス２００ｐｇ（ファルマシア社製）カラム
にアプライして、タンパク質を溶出させた。そして、溶
出後の活性画分を回収し、単一の精製酵素を得た。

【００７３】各精製工程における、各活性画分のＦＡＯ
Ｄ活性およびタンパク質量を測定した。その結果を下記
表５に示す。なお、活性は、基質としてＦＶを用いて前
述の速度法（Ａ−１）により測定し、タンパク質は、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
製）と、標準タンパク質であるウシ血清アルブミンとを
用いて、常法により定量した。

【００７４】

【表５】

【００７５】前記表５に示すように、最終的に７９．５
Ｕ／ｍｇの比活性である、単一精製されたＦＡＯＤが得
られた。

【００７６】

【発明の効果】以上のように、本発明の新規ＦＡＯＤ
は、糖化アミノ酸の中でもα―ＧＡに対して良く作用
し、特にＨｂＡ１ｃのＮ末端アミノ酸残基に対応するＦ
Ｖに対する比活性が高い。したがって、例えば、このＦ
ＡＯＤをＨｂＡ１ｃの測定に使用すれば、その測定を正
確かつ簡便に行うことができるようになり、ＨｂＡ１ｃ
の糖尿病診断の指標としての有用性をさらに高めること
に貢献できる。

【００７７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈１１０〉KYOTO DAIICHI KAGAKU CO.,LTD 〈１２０〉Novel Fructosyl Amino Acid Oxidase from Trichosporon genus. 〈１３０〉R2913 〈１６０〉6 〈２１０〉1 〈２１１〉19 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈２２０〉 〈２２１〉PEPTIDE 〈２２２〉（1）．．．（19） 〈２２３〉Xaa denotes an undecided amino acid residue. 〈４００〉1 Val Val Val Gly Gly Gly Gly Thr Leu Gly Ser Xaa Thr Ala Leu His 5 10 15 Leu Val Arg 〈２１０〉2 〈２１１〉10 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈２２０〉 〈２２１〉PEPTIDE 〈２２２〉（1）．．．（10） 〈２２３〉Xaa denotes an undecided amino acid residue. 〈４００〉2 Phe Gly Ala Asp Gly Gly Xaa Leu Ala Ala 5 10 〈２１０〉3 〈２１１〉19 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈４００〉3 Asn Lys Trp Leu Asp Ser Glu Asp Glu Ile Val Ala His Ala Pro Leu 5 10 15 Leu Asp Arg 〈２１０〉4 〈２１１〉8 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈４００〉4 Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu 5 〈２１０〉5 〈２１１〉17 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈２２０〉 〈２２１〉PEPTIDE 〈２２２〉（1）．．．（17） 〈２２３〉Xaa denotes an undecided amino acid residue. 〈４００〉5 His Gly Val Ile Lys Val Xaa Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Ala Phe 5 10 15 Lys 〈２１０〉6 〈２１１〉10 〈２１２〉PRT 〈２１３〉Trichosporon mucoides 〈４００〉6 Ala Ile Ala Thr Leu Leu Pro Arg Phe Lys 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例のＦＡＯＤの至適ｐＨを示す
グラフである。

【図２】前記ＦＡＯＤのｐＨ安定性を示すグラフであ
る。

【図３】前記ＦＡＯＤの至適温度を示すグラフである。

【図４】前記ＦＡＯＤの熱安定性を示すグラフである。

【図５】前記ＦＡＯＤのＦＶを基質としたときのライン
ウェバー−バークの逆数プロットを示すグラフである。

【図６】前記ＦＡＯＤのε−ＦＬを基質としたときのラ
インウェバー−バークの逆数プロットを示すグラフであ
る。

【図７】前記ＦＡＯＤのゲルろ過による溶出体積と分子
量との関係を示すグラフである。

【図８】前記ＦＡＯＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示
す図である。

【図９】前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質の移
動度と分子量との関係を示すグラフである。

【図１０】前記ＦＡＯＤおよび前記ＦＡＯＤとＦＶとの
混合液の吸収スペクトルを示すグラフである。

【図１１】本発明のＦＡＯＤを産生するトリコスポロン
属（Trichosporon）の菌体の一例の顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD03 FF04E FF05E FF09E FF11E FF12E LL01 LL03

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 トリコスポロン属（Trichosporon）が産
   生するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
2. 【請求項２】 配列番号１〜６に記載のいずれかのアミ
   ノ酸配列を有するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
3. 【請求項３】 トリコスポロン ムコイデス ＫＤＫ４
   ００１（Trichosporonmucoides KDK4001）（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１７１３４）由来の請求項１または２記載のフルク
   トシルアミノ酸オキシダーゼ。