WO2021210614A1 - ケトン体測定用酵素剤、ケトン体測定用センサ及び試料中のケトン体を測定する方法 - Google Patents

ケトン体測定用酵素剤、ケトン体測定用センサ及び試料中のケトン体を測定する方法 Download PDF

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WO2021210614A1
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polypeptide
measuring
hbdh
sample
ketone bodies
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PCT/JP2021/015467
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Inventor
杉浦　敏行
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天野エンザイム株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/64—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving ketones

Definitions

  • the present invention relates to a novel 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase for measuring ketone bodies, and more specifically, to an enzyme agent for measuring ketone bodies, a sensor for measuring ketone bodies, and a method for measuring ketone bodies in a sample.
  • HBDH is an industrially important enzyme reagent for the measurement of ketone bodies.
  • HBDH is isolated from various microorganisms.
  • Patent Document 1 discloses HBDH derived from Rhodobacter sphaeroides.
  • HBDH derived from Paracoccus denitrificans (optimal pH of oxidation reaction is 8.5) in Non-Patent Document 1
  • HBDH derived from Ralstonia pickettii T1 (optimum pH of oxidation reaction is 8.5) in Non-Patent Document 2.
  • Non-Patent Document 3 HBDH derived from Mycobacterium phlei ATCC354 (optimal pH of oxidation reaction is 8.4)
  • Non-Patent Document 4 HBDH derived from Staphylococcus xylosus (optimum pH of oxidation reaction is 8.6).
  • Non-Patent Document 5 contains HBDH derived from Pseudomonas fragi (optimal pH of oxidation reaction is 8.5), and Non-Patent Document 6 contains HBDH derived from Alcaligenes faecalis (optimum pH of oxidation reaction is 8.5).
  • Document 7 contains HBDH derived from Acidovorax sp. Strain SA1 (optimal pH of oxidation reaction is 8.5), and Non-Patent Document 8 contains HBDH derived from Bacillus cereus T (optimum pH of oxidation reaction is 8), non-patented.
  • Document 9 discloses HBDH derived from Zoogloea ramigera I-16-M (the optimum pH of the oxidation reaction is 8).
  • Patent Documents 2 and 3 disclose HBDH derived from Alcaligenes faecalis and HBDH derived from Pseudomonas species, respectively, as HBDH having excellent thermal stability that is stable even at 37 ° C.
  • HBDH of Patent Documents 1 to 3 has been put on the market and is now the standard for enzymes for measuring ketone bodies.
  • Patent Document 4 discloses that the triple mutant of HBDH derived from Alcaligenes faecalis was stable up to 87 ° C.
  • Patent Document 5 discloses that the 6-fold mutant of HBDH derived from Lord Bacter sphaeroides was stable up to 54 ° C.
  • HBDH is recognized for its industrial importance for measuring ketone bodies, it still exists only slightly as a commercial product. All of the HBDHs found so far, including commercially available products, have room for improvement in their usefulness.
  • an object of the present invention is to provide a new HBDH having usefulness as an enzyme for measuring ketone bodies.
  • the present inventor happens to have a special HBDH having an optimum pH in the neutral region, which has an optimum pH characteristic different from that of the previously known 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase. I found.
  • HBDH is highly useful in that it has an optimum pH that overlaps with the pH range of many ketone body measurement samples. That is, the present invention provides the inventions of the following aspects.
  • Item 3 a polypeptide having a sequence identity of 60% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity and thermal stability.
  • Item 3. The enzyme preparation for measuring ketone bodies according to Item 1 or 2, which does not contain a pH adjuster.
  • Item 4. A sensor for measuring ketone bodies, which comprises a polypeptide having 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity and having an optimum pH of the oxidation reaction of the activity of 6.5 or more and less than 8.0.
  • Item 5. The sensor for measuring ketone bodies according to Item 4, wherein the polypeptide is the polypeptide shown in any of the following (1) to (3).
  • Item 8. A ketone body measurement kit comprising the ketone body measurement enzyme agent according to any one of Items 1 to 3 or the ketone body measurement sensor according to any one of Items 4 to 7.
  • Item 9. 3-Hydroxybutyric acid dehydrogenase A sample to be measured for a ketone body under active conditions, an enzyme agent for measuring a ketone body according to any one of Items 1 to 3, or an enzyme agent for measuring a ketone body according to any one of Items 4 to 7.
  • a method of measuring ketone bodies in a sample which comprises the step of contacting with a sensor.
  • Item 10. Item 9.
  • Item 9 which does not use a pH adjuster.
  • Item 11 Item 9. The method according to Item 9 or 10, wherein the sample is a blood sample.
  • Item 12. Item 9. The method according to any one of Items 9 to 11, wherein the sample is a sample derived from a diabetic ketoacidosis patient.
  • a new enzyme agent for measuring ketone bodies using HBDH which has usefulness as an enzyme for measuring ketone bodies, a sensor for measuring ketone bodies, a kit for measuring ketone bodies, and the enzyme for measuring ketone bodies.
  • a method for measuring a ketone body in a sample using an agent or a sensor for measuring a ketone body is provided.
  • glycine G
  • alanine A
  • valine Val
  • Leu L
  • isoleucine I
  • Phe phenylalanine
  • Tyr tyrosine
  • Trp Tryptophan
  • Serin Serin
  • Seronin Thr
  • Cysteine Cysteine
  • Met Methionin
  • Met Methionin
  • Glutamic acid Glu
  • Aspartic acid Aspartic acid (Asn) is N
  • glutamine Gln
  • lysine Lys
  • arginine Arg
  • Histidine Histidine
  • Pro proline
  • amino acid sequence to be displayed has the N-terminal at the left end and the C-terminal at the right end.
  • non-polar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • Acid amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine, and histidine.
  • the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention contains a polypeptide having 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity and an optimum pH of the oxidation reaction of the activity of 6.5 or more and less than 8.0 as an active ingredient (HBDH). include.
  • the optimum pH range for the oxidation reaction of the activity of the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention is 6.7 to 7.8, more preferably 7 to 7.5.
  • the HBDH contained in the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention preferably includes the polypeptide shown in any of the following (1) to (3).
  • the polypeptide of (1) is 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (HBDH) derived from Paraburkholderia NBRC102489.
  • HBDH 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase
  • This HBDH has significantly higher thermal stability as well as 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity.
  • thermal stability of wild-type HBDH obtained from microorganisms has an essential limit, and it is genetically modified in order to improve the thermal stability.
  • it is extremely characteristic that the polypeptide of (1) exhibits remarkably high thermostability despite being a wild type.
  • the bacterium from which the polypeptide of (1) is derived is a room temperature bacterium that is not heat resistant, despite the fact that the polypeptide of (1) is a wild type. It can be said that it is a surprising feature that it exhibits remarkably high thermal stability.
  • polypeptide of (1) does not react with 2-hydroxybutyrate, lactic acid, and malic acid.
  • the modification of the amino acid introduced into the polypeptide of (2) may include only one type of modification (for example, substitution) from substitutions, additions, insertions, and deletions, and two or more types. Modifications (eg, substitution and insertion) may be included.
  • the number of amino acids substituted, added, inserted or deleted may be one, more than one, or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 8, 1 to 1. Examples thereof include 6, 1 to 5, or 1 to 4, more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 or 2 or 1.
  • sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90. % Or more. More preferably, the sequence identity is preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more. Can be mentioned.
  • sequence identity is defined as BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2sex The values of amino acid sequence identity obtained by Microbiol. Lett., Vol. 174, p247-250, 1999) are shown. The parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • the 22nd position (I), the 160th position (Y), the 164th position (K), the 190th position (P), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are present.
  • the amino acids at positions 193 (V) and 195 (T) are considered to contribute to the binding of NAD, and are considered to contribute to the binding of NAD at positions 98 (Q), 147 (S), 149 (H), and 149 (H).
  • the amino acids at positions 157 (K) and 160 (Y) are thought to contribute to substrate binding, and both are thought to contribute to 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity, and thus these sites. It is desirable not to introduce substitutions or deletions into the.
  • "having 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity” means having an activity sufficient to exert a function as 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase. Specifically, it means that the activity can be confirmed by the following measurement method, and the specific value of the specific activity is not limited, but usually, the specific activity of HBDH calculated by the following measurement method is 50 U / It means that it is mg or more, preferably 100 to 1200 U / mg.
  • HBDH activity measurement method 0.1 mol / L Tris- containing 145 mmol / L (final concentration) of 3-hydroxybutyric acid, 5.8 mmol / L (final concentration) of hydrazine sulfate, and 0.1 g / dL (final concentration) of TritonX-100.
  • HCl buffer pH 8.5
  • the HBDH activity (U / mg polypeptide) is calculated based on the following enzyme activity calculation formula.
  • 6.22 is the mmol reduction coefficient of NADH at 340 nm.
  • the dilution ratio for example, when 40 ⁇ L of water is added to 10 ⁇ L of the polypeptide solution to prepare a 50 ⁇ L sample solution, the dilution ratio is 5.
  • the residual activity at 50 ° C. obtained by the following measurement method is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably. It means that it is 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, even more preferably 99% or more, and particularly preferably 99.5% or more.
  • a polypeptide solution was prepared by dissolving the polypeptide in 100 mmol / L phosphate buffer (pH 7.0) so as to be 0.1 mg / mL, and the HBDH activity of the prepared polypeptide solution was adjusted to the above-mentioned HBDH activity. Calculated based on the measurement method.
  • the polypeptide solution is heat-treated at 50 ° C. for 20 minutes, and the HBDH activity of the polypeptide solution after the heat treatment is calculated based on the above-mentioned HBDH activity measurement method.
  • the relative value (residual activity at 50 ° C.) of the polypeptide solution after the heat treatment is calculated based on the following formula.
  • polypeptides of (2) and (3) are preferably those that do not react with 2-hydroxybutyrate, lactic acid, and malic acid, similarly to the polypeptide of (1). ..
  • the polypeptides (2) and (3) may be wild-type like the polypeptide of (1), or may be variants of the polypeptide of (1).
  • the polypeptide used in the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention exhibits excellent heat resistance even if it is a wild type derived from Parabark honova phangolam like the polypeptide of (1). From this point of view, a preferable example of the polypeptides of (2) and (3) used in the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention is wild-type HBDH.
  • the above-mentioned polypeptide may contain one kind alone or a plurality of kinds in combination.
  • the above-mentioned polypeptides (1) to (3) can be used as a host using, for example, a recombinant vector obtained by introducing a DNA encoding the polypeptide into an expression vector. It can be produced by transforming and culturing the resulting transformant.
  • the above-mentioned polypeptides (1) to (3) are produced by culturing the producing bacteria (in the case of the polypeptide of (1), Parabark hogradea phangolam) for wild-type ones. You can also do it.
  • the DNA encoding the polypeptide can be obtained by obtaining the region encoding the polypeptide by PCR or the like, or by artificial synthesis using a gene synthesis method or the like.
  • a mutation introduction method is known, and for example, a site-specific mutation introduction method of DNA can be used.
  • the base sequence of DNA in which a mutation has been introduced into the base sequence can be confirmed using a DNA sequencer. Once the base sequence is determined, DNA encoding the above polypeptide is obtained by chemical synthesis, PCR using a cloned probe as a template, or hybridization using a DNA fragment having the base sequence as a probe. be able to.
  • a person skilled in the art can appropriately design the base sequence of the DNA encoding the above-mentioned polypeptide according to the amino acid sequence of the above-mentioned polypeptide.
  • SEQ ID NO: 2 is a specific example of the DNA encoding the polypeptide of (1) above.
  • “Stringent conditions” are 0.5% SDS, 5x Denhartz [Denhartz's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% ficol 400] and Conditions for keeping warm at 50 ° C. to 65 ° C. for 4 hours to overnight in 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0) containing 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA. To say.
  • the "homology" of DNA is defined as BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2sequ. The values of identity obtained by Lett., Vol. 174, 247-250, 1999) are shown. The parameters may be set to Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • the above DNA is preferably one in which the codon utilization frequency is optimized for the host.
  • DNA whose codon utilization frequency is optimized for Escherichia coli is suitable.
  • the recombinant vector contains a regulator such as a promoter operably linked to the above DNA.
  • a promoter is typically used as a regulator, but if necessary, a transcription element such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, or an SPI site may be included.
  • operably linked means that various regulatory factors such as promoters and enhancers that regulate the DNA of the present invention are linked to the above-mentioned DNA in a state in which they can operate in a host cell.
  • the expression vector a vector constructed from phages, plasmids, or viruses that can grow autonomously in the host for gene recombination is preferable.
  • Such expression vectors are known, and for example, commercially available expression vectors include pQE-based vector (Qiagen Co., Ltd.), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), and pET-based vector (Merck). Co., Ltd.) etc.
  • the expression vector may be used by selecting an appropriate combination with the host cell.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as the host cell, a combination of a pET vector and a BL21 (DE3) Escherichia coli strain, or a pDR540 vector and JM109 Escherichia coli. A combination of strains and the like is preferable.
  • the host used for producing the transformant is not particularly limited as long as the gene can be introduced, autonomously proliferates, and the trait of the gene of the present invention can be expressed.
  • Escherichia coli Bacteria belonging to the genus Escherichia such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida and the like; Pseudomonas putta; yeast etc.; filamentous fungi and the like are preferable examples. However, it may also be animal cells, insect cells, plants, or the like. Of these, Escherichia coli is particularly preferable. Further, the host may be a bacterium derived from the above-mentioned polypeptide.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the above-mentioned DNA or the above-mentioned recombinant vector of the present invention into a host.
  • the method for introducing the DNA of the present invention or the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as the gene of interest can be introduced into the host. Further, the place where the DNA is introduced is not particularly limited as long as the gene of interest can be expressed, and may be on a plasmid or on the genome. Specific methods for introducing the DNA of the present invention or the recombinant vector of the present invention include, for example, a recombinant vector method and a genome editing method.
  • the conditions for introducing the above DNA or recombinant vector into the host may be appropriately set according to the introduction method, the type of host, and the like.
  • the host is a bacterium, for example, a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • yeast for example, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like can be mentioned.
  • the host is an animal cell, for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method and the like can be mentioned.
  • the host is an insect cell, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method and the like can be mentioned.
  • the host is a plant, for example, an electroporation method, an Agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method and the like can be mentioned.
  • the culture conditions of the transformant may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, but liquid culture is preferable. Further, in the case of industrial production, aeration stirring culture is preferable.
  • the culture supernatant or bacterial cells can be collected by a method such as centrifugation of the culture solution. If the above polypeptide is accumulated in the cells, the cells are treated with a mechanical method such as ultrasonic waves or French press or a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, an enzyme such as protease or the like is used. It can be solubilized by using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) to obtain a water-soluble fraction containing the target polypeptide.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the expressed target polypeptide can be secreted into the culture medium.
  • the culture solution or water-soluble fraction containing the polypeptide obtained as described above may be subjected to the purification treatment as it is, but after the polypeptide in the culture solution or the water-soluble fraction is concentrated, it is subjected to the purification treatment. May be served.
  • Concentration can be performed by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment, fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent (for example, methanol, ethanol and acetone), or the like.
  • a hydrophilic organic solvent for example, methanol, ethanol and acetone
  • the purification treatment of the polypeptide can be performed, for example, by appropriately combining methods such as gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the polypeptide thus purified may be pulverized by freeze-drying, vacuum-drying, spray-drying or the like, if necessary.
  • the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention may contain other ingredients depending on the type of active ingredient, the form of the drug, and the like.
  • the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention comprises a group consisting of excipients, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, pH adjusters, buffer solutions, and physiological saline in addition to the above active ingredients. It can contain the additive of choice.
  • excipient include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like.
  • the stabilizer include propylene glycol, ascorbic acid and the like.
  • Examples of the preservative include sodium chloride, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben and the like.
  • Examples of the preservative include sodium chloride, ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like.
  • Examples of the pH adjusting agent include acid adjusting agents such as citric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid; and alkaline adjusting agents such as sodium hydroxide, sodium carbonate and potassium hydroxide.
  • Examples of the buffer solution include acetate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, citrate phosphate buffer solution, borate buffer solution, tartrate buffer solution, Tris buffer solution, phosphate buffered physiological saline and the like.
  • an enzyme agent having a neutral optimum pH for an oxidation reaction such as the polypeptide of (1) above, can be used.
  • a reaction system can be constructed without using a pH adjuster.
  • the pH adjuster can be excluded from other components contained in the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention. That is, a preferable example of the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention is one that does not contain a pH adjuster.
  • Does not contain a pH adjuster means that it does not contain a substance used for the purpose of adjusting the pH
  • adjusting the pH corresponds to at least the optimum pH of conventional HBDH. That is, adjusting the pH to a range outside the pH range of a general sample for measuring ketone bodies (specifically, pH 8 or higher). Therefore, in the preferred embodiment of the present invention, the optimum pH (6.5 or more and 8.0 or more) of the active ingredient HBDH used in the present invention is not contained even when the pH adjusting agent used for adjusting the pH to 8 or more is not contained. It is permissible to include less than, preferably 6.7 to 7.8, more preferably 7 to 7.5) of substances used for the purpose of adjusting the pH.
  • the pH used for adjusting the pH to 8 or higher can be excluded.
  • the content of the active ingredient in the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention is appropriately set within the range in which the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity of the active ingredient is exhibited.
  • the formulation form of the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquids, powders, and granules.
  • the enzyme preparation for measuring ketone bodies of the present invention can be prepared by a generally known method.
  • the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention is used for the purpose of measuring ketone bodies.
  • the ketone body to be measured is 3-hydroxybutyric acid (R-3-hydroxybutyric acid).
  • the specific method of using the enzyme agent for measuring ketone bodies of the present invention will be described in detail in "4. Method for measuring ketone bodies in a sample” described later.
  • the sensor for measuring ketone bodies of the present invention has 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity, and the optimum pH of the oxidation reaction of the activity is 6.5 or more and less than 8.0 (preferably 6.7 to 6.7 to 6.7). It contains a polypeptide of 7.8, more preferably 7 to 7.5) as an active ingredient (HBDH).
  • the HBDH contained in is preferably a polypeptide shown in any of the following (1) to (3).
  • the sensor for measuring ketone bodies of the present invention contains the above-mentioned polypeptide, and 3-hydroxybutyric acid (R-3-hydroxybutyric acid) and NAD + (nicotinamide adenine dinucleotide) and / or a derivative thereof according to the above-mentioned polypeptide. It can be configured as an object that converts a change based on the reaction with and its amount into a readable signal.
  • Examples of the electrochemical signal include those in which a chemical state (for example, the presence of 3-hydroxybutyric acid) is converted into an electric signal (for example, an electric current).
  • the optical signal, NAD + and / or a derivative redox state e.g., NAD + and / or a derivative thereof, and / or the presence of NADH and / or a derivative thereof
  • NAD + and / or a derivative thereof include absorption and / or emission based .
  • the above polypeptide is immobilized on an insoluble support.
  • the fixation mode of the polypeptide is not particularly limited, and examples thereof include physical fixation by adhesion, adsorption, absorption, swelling, etc., chemical or biochemical fixation by specific non-covalent bond, and chemical fixation by covalent bond. ..
  • polypeptide may be immobilized on the insoluble support in the form of a single polypeptide, or the polypeptide may be immobilized on the insoluble support in the form of a composition together with other components.
  • Specific embodiments when the polypeptide is immobilized on the insoluble support in the form of a composition include an embodiment in which the composition is physically immobilized (preferably immobilized by adhesion) on the insoluble support. ..
  • the point that the composition preferably does not contain a pH adjuster is as described in "1-3. Other components" above.
  • the insoluble support is composed of a solid or solid material whose surface at least is insoluble in the reaction system of the above-mentioned polypeptide and 3-hydroxybutyric acid and can fix the above-mentioned polypeptide.
  • the material constituting at least the surface of the insoluble support include a swellable material (for example, gelatin), a porous base material (for example, cellulose, filter paper, etc.), a resin, glass, and a redox polymer (that is, a redox mediator). Polymer), metal, carbon and the like.
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate shape, a flaky shape, a stick shape, and a bead shape.
  • a preferable example of the above-mentioned insoluble carrier is an electrode whose surface is made of the above-mentioned material.
  • the polypeptide is preferably physically fixed to such an electrode, and more preferably, the composition containing the polypeptide is physically fixed (preferably fixed by adhesion).
  • a specific embodiment of the ketone body measurement sensor of the present invention may be any form adopted as a biosensor, and examples thereof include a sensor chip, a microtiter plate, a test strip, an electrochemical flow cell, and the like. Be done.
  • Ketone body measurement kit of the present invention is the ketone body measurement enzyme agent described in the above “1. Ketone body measurement enzyme agent” or the ketone body described in the above “2. Ketone body measurement sensor”. Includes body measurement sensors.
  • the ketone body measurement kit of the present invention may further include a ketone body measurement enzyme agent or a ketone body measurement sensor, as well as other suitable items used for measurement and / or sample collection.
  • NAD + nicotinamide adenin dinucleotide
  • NAD + derivatives eg, nicotinamide adenin dinucleotide phosphate, thionicotinamide-NAD, pyridinealdehyde-NAD, acetylpyridine-NAD, etc. Carba-NAD, etc.
  • Redox mediator Redox mediator
  • fluorescent probe deproteinized solution
  • buffer solution for example, acetate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, citrate phosphate buffer solution, borate buffer solution, tartrate buffer solution
  • Tris buffer phosphate buffer physiological saline, etc.
  • lancet device and the like.
  • the kit for measuring ketone bodies of the present invention may contain one kind alone or a plurality of kinds in combination as these other items.
  • the method for measuring ketone bodies in samples of the present invention is a sample for which ketone bodies should be measured under 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase active conditions, and the above-mentioned "1.
  • the step includes contacting the enzyme agent for measuring ketone bodies described in "Enzyme agent” or the sensor for measuring ketone bodies described in "3. Sensor for measuring ketone bodies” above.
  • the method for measuring a ketone body in a sample of the present invention is carried out based on the following reaction catalyzed by the enzyme agent for measuring ketone bodies or the active ingredient (HBDH) described in the sensor for measuring ketone bodies.
  • the method for measuring a ketone body in a sample of the present invention is to use (a) a sample containing 3-hydroxybutyric acid with the above-mentioned enzyme agent for measuring ketone bodies or the above-mentioned sensor for measuring ketone bodies. Steps of contacting; (b) 3-hydroxybutyric acid in the sample and NAD + (nicotinamide adenine dinucleotide) and / by the active ingredient (HBDH) in the ketone body measurement enzyme agent or the ketone body measurement sensor.
  • NAD + nicotinamide adenine dinucleotide
  • the sample is not particularly limited as long as it is a sample for which a ketone body should be measured, and examples thereof include a biological sample derived from a target for which a ketone body should be measured. Mammals such as humans can be mentioned as targets for which ketone bodies should be measured.
  • Biological samples include body fluids, excreta and tissues, and specifically include blood samples (whole blood, serum, plasma), urine, semen, prostatic fluid, tears, saliva, sweat, ascites, cerebrospinal fluid, etc. Examples include plasma, lymph, and tissue extraction samples. Since the optimum pH of the oxidation reaction of the active ingredient HBDH used in the present invention is less than 8, the biological sample preferably has a pH within the optimum pH range, and a blood sample is particularly preferable.
  • the pH of blood is 7.35 to 7.5 in healthy subjects, but decreases as the blood ketone body concentration increases, and in severe diabetic ketoacidosis, the pH can be 7.0 or less, for example, about 6.7. .. Therefore, the pH of the blood sample for which the ketone body should be measured includes pH 6.7 to 7.8.
  • the lower limit of the pH range of the blood sample may be 6.8 or more, or 6.9 or more, and the upper limit of the pH range of the blood sample is 7.5 or less, 7.3 or less, or 7.0. It may be as follows.
  • the contact between the sample and the enzyme agent for measuring ketone bodies can be performed by preparing a mixed solution of the sample and the enzyme agent for measuring ketone bodies. Further, the contact between the sample and the ketone body measurement sensor causes the sample to be dropped, placed, flowed, or absorbed on an insoluble support to which the active ingredient (HBDH) is fixed in the ketone body measurement sensor. Or by immersing the insoluble support in the sample.
  • HBDH active ingredient
  • the temperature and pH conditions that cause the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity of the active ingredient (HBDH) are appropriately selected by those skilled in the art.
  • the reaction temperature is specifically 20 to 40 ° C, preferably 23 to 30 ° C, and more preferably 25 to 27 ° C.
  • the reaction pH can be based on the optimum pH of the active ingredient (HBDH), and specific examples thereof include less than 8, preferably 6.5 to 7.5, and more preferably 7 to 7.5.
  • the reaction time is not particularly limited, and examples thereof include 5 seconds to 3 hours, preferably 10 seconds to 10 minutes.
  • the pH of the reaction system in step (b) is preferably less than pH 8. Further, as a preferable example of the pH of the reaction system in the step (b), pH 6.7 to 7.8 can be mentioned.
  • the lower limit of the pH range may be 6.8 or more, or 6.9 or more, and the upper limit of the pH range may be 7.5 or less, 7.3 or less, or 7.0 or less. ..
  • steps (a) and (b) may be performed in this order or may be performed at the same time.
  • the active ingredient (HBDH) that catalyzes the above reaction in the method for measuring ketone bodies in the sample of the present invention the optimum pH of the oxidation reaction is neutral, such as the polypeptide of (1) above. Can be used.
  • the pH adjuster is used in both steps (a) and (b).
  • the reaction system can be constructed without using. That is, a preferred example of the method for measuring ketone bodies in the sample of the present invention is an embodiment in which a pH adjuster is not used.
  • the Derivatives of NAD +, a NAD + as a basic skeleton, like the NAD + results in simultaneous reduction when the active ingredient (HBDH) 3-hydroxybutyric acid is converted to acetoacetic acid material
  • the present invention is not particularly limited, and examples thereof include nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, thionicotinamide-NAD, pyridinealdehyde-NAD, acetylpyridine-NAD, and carba-NAD.
  • the amount of NADH and / or a derivative thereof produced and the amount of NAD + and / or a derivative thereof consumed correlate with the amount of 3-hydroxybutyric acid present in the sample. Based on this, the amount of NADH and / or its derivatives produced; the amount of consumed NAD + and / or its derivatives; and / or the ratio of those amounts shall be measured as the amount of change based on the above reaction. Can be done. Those skilled in the art can appropriately determine the method for calculating these amounts and ratios.
  • Test Example 1 Screening of active ingredient (HBDH)
  • a strain having HBDH activity was selected from the culture medium of a preserved strain (7606 strain) of Amano Enzyme Co., Ltd., and the temperature stability was confirmed.
  • the medium composition used for the culture is as follows. 1g / dL Urea 1g / dL Monosodium glutamate 0.4g / dL Yeast extract 1.0g / dL Potassium phosphate pH 5.5 (Autoclaved at 121 ° C for 20 minutes.)
  • the HBDH active fraction obtained thereby was derived from Paraburkholderia fungorum NBRC102489.
  • HBDH activity measurement method 0 containing 3-hydroxybutyric acid at 145 mmol / L (final concentration), hydrazine sulfate at 5.8 mmol / L (final concentration), and TritonX-100 at 0.1 g / dL (final concentration).
  • concentration decreases at 340 nm per minute. Dilution was measured.
  • the HBDH activity (U / mL) was calculated based on the following enzyme activity calculation formula. In the enzyme activity calculation formula, 6.22 is the mmol reduction coefficient of NADH at 340 nm.
  • the HBDH active fraction was developed by SDS-PAGE, and it was confirmed that almost a single enzyme component was contained.
  • the molecular weight (derived from the molecular weight marker) of the enzyme component contained in the HBDH active fraction obtained from the Paraburkholderia fungorum NBRC102489 was about 28,000.
  • Example 1 Optimal pH
  • the HBDH of Example 1 was dissolved in Britton-Robinson buffer whose pH was adjusted to 4 to 9 (in 0.5 increments) at the same concentration, and the HBDH activity was measured according to the method (3) above to obtain the maximum activity (1).
  • the relative value (%) of HBDH at each pH was derived when the HBDH activity at pH 7.5) was set to 100. The results are shown in FIG.
  • the optimum pH of the oxidation reaction of HBDH in Example 1 was 7 to 7.5.
  • the pH of the oxidation reaction of commercially available HBDH is any of HBDH of Comparative Example 1, HBDH of Comparative Example 2, HBDH derived from Pseudomonas species (manufactured by Toyobo), and HBDH derived from Lord Bacter sphaeroides (manufactured by Roche).
  • the pH of the known HBDH oxidation reaction is 8 to 8.6
  • the HBDH of Example 1 has a special optimum pH in the neutral range. It turned out that.
  • the HBDH of Example 1 maintains high HBDH activity in the vicinity of pH 7 (for example, about pH 6.7) even when the pH is less than 7, and therefore, diabetes that can be lower than pH 7.
  • a measurement system with high HBDH activity can be constructed without using a pH adjuster.
  • Test Example 2 Various characteristics of the active ingredient (HBDH) In this Test Example, various characteristics of HBDH obtained in Test Example 1 were confirmed.
  • Example 1 in Table 1 is one of the HBDHs acquired and confirmed in the procedures (1) to (3) above, and Comparative Example 1 (manufactured by Amano Enzyme) and Comparative Example 2 (manufactured by Asahi Kasei) , HBDH has high thermal stability among commercially available products. The results of the thermal stability test are shown in FIG.
  • the HBDH of Example 1 showed remarkably high thermal stability despite being a wild type.
  • the thermal stability (residual rate after 20-minute treatment) when the treatment temperature was 50 ° C. was as shown in Table 1 below.
  • Test Example 3 Identification of the active ingredient (HBDH) In this test example, the sequence of HBDH of Example 1 was identified.
  • Genomic DNA was prepared using 2 (manufactured by Kaneka Corporation).
  • the above-acquired gene was inserted into the multicloning site of the Escherichia coli expression vector pTrc99A according to a conventional method.
  • the vector into which the HBDH gene was introduced was introduced into Escherichia coli DH5 ⁇ by the competent cell method.
  • the obtained transgenic Escherichia coli was cultured in LB medium for 17 hours, collected by centrifugation, and then the intracellular enzyme was extracted by crushing beads.
  • SEQ ID Nos: 3 and 4 are primers.

Abstract

本発明の目的は、ケトン体測定用酵素としての有用性を有する新たなＨＢＤＨを提供することである。３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを含む、ケトン体測定用酵素剤。

Description

ケトン体測定用酵素剤、ケトン体測定用センサ及び試料中のケトン体を測定する方法
　本発明は、ケトン体を測定するための新たな３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼに関し、より具体的には、ケトン体測定用酵素剤、ケトン体測定用センサ及び試料中のケトン体を測定する方法に関する。
　Ｄ－３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤＨ：ＥＣ１．１．１．３０）は、短鎖型脱水素酵素／還元酵素（ＳＤＲ）ファミリーに属し、ＮＡＤ+を補酵素として３－ヒドロキシ酪酸のアセト酢酸への酸化反応を可逆的に触媒する、当該酸化反応の至適ｐＨを８以上のアルカリ側に持つ酵素である。ヒドロキシ酪酸は、アセト酢酸及びアセトンと共にケトン体と呼ばれる。
　血中ケトン体濃度の急激な上昇は、１型糖尿病の重度の合併症であるケトアシドーシス（ＤＫＡ）を引き起こす原因となるため、治療に際しケトン体量をモニターして予防することが推奨される。ＨＢＤＨは、ケトン体測定のための産業上重要な酵素試薬である。
　ＨＢＤＨは様々な微生物から単離されている。例えば、特許文献１にはRhodobacter sphaeroides由来のＨＢＤＨが開示されている。また、非特許文献１にはParacoccus denitrificans由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．５）、非特許文献２にはRalstonia pickettii T1由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．５）、非特許文献３にはMycobacterium phlei ATCC354由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．４）、非特許文献４にはStaphylococcus xylosus由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．６）、非特許文献５にはPseudomonas fragi由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．５）、非特許文献６にはAlcaligenes faecalis由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．５）、非特許文献７にはAcidovorax sp. strain SA1由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８．５）、非特許文献８にはBacillus cereus T由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８）、非特許文献９にはZoogloea ramigera I-16-M由来のＨＢＤＨ（酸化反応の至適ｐＨは８）が開示されている。
　一方で、特許文献２及び特許文献３に記載されるように、微生物由来のＨＢＤＨは熱に対して不安定であるため、熱安定性に優れたＨＢＤＨが望まれる。この点に鑑み、特許文献２及び特許文献３では、３７℃でも安定な熱安定性に優れたＨＢＤＨとして、それぞれ、アルカリゲネス・ファエカリス由来のＨＢＤＨ、及びシュードモナス種由来のＨＢＤＨが開示されている。特許文献１～３のＨＢＤＨは上市されており、今やケトン体測定用酵素のスタンダードとなっている。
　微生物から単離される野生型のＨＢＤＨは、熱安定性に優れたものであっても、その安定性はせいぜい３７℃近辺であり、野生型のＨＢＤＨの熱安定性には本質的な限界がある。このため、ＨＢＤＨを改変することで熱安定性を高める試みもなされている。例えば、特許文献４には、アルカリゲネス・ファエカリス由来のＨＢＤＨの３重変異体が、８７℃まで安定であったことが開示されている。また、特許文献５には、ロードバクター・スファエロイデス由来のＨＢＤＨの６重変異体が、５４℃まで安定であったことが開示されている。
特開平１１－３１８４３８号公報 特開平８－７０８５６号公報 特開２００３－３３９３８５号公報 特開２０１９－５０５１９３号公報 特開２０１９－５１１２４５号公報
Biochim. Biophys. Acta 871, 302-309 (1986) J. Biosci. Bioeng. 101, 501-507 (2006) J. Gen. Microbiol. 104, 123-126 (1978) Acta Microbiol. Pol. 43, 33-45 (1994) J. Mol. Biol. 355, 722-733 (2006) Acta Crystallogr. Sect. F 65, 331-335 (2009) J. Biosci. Bioeng. 97, 78-81 (2004) Can. J. Microbiol. 19, 673-677 (1973) J. Biochem. 89, 625-635 (1981)
　ＨＢＤＨはケトン体測定に利用される産業上の重要性が認識されていながらも、未だ市販品としてはわずかに存在するのみである。そして、市販品を含めこれまで見出されているＨＢＤＨはいずれも、その有用性に改善の余地がある。
　そこで本発明は、ケトン体測定用酵素としての有用性を有する新たなＨＢＤＨを提供することを目的とする。
　本発明者は、７６０６株の微生物をスクリーニングした結果、偶然にも、これまで知られていた３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼとは異なる至適ｐＨ特性の、中性領域に至適ｐＨを持つ特殊なＨＢＤＨを見出した。このようなＨＢＤＨは、多くのケトン体測定用試料のｐＨ域と重複した至適ｐＨを有する点で有用性が高い。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを含む、ケトン体測定用酵素剤。
項２．　下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドを含む、項１に記載のケトン体測定用酵素剤：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
項３．　ｐＨ調整剤を含まない、項１又は２に記載のケトン体測定用酵素剤。
項４．　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを含む、ケトン体測定用センサ。
項５．　前記ポリペプチドが、下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドである、項４に記載のケトン体測定用センサ：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
項６．　前記ポリペプチドが不溶性支持体に固定されている、項４又は５に記載のケトン体測定用センサ。
項７．　前記前記ポリペプチドが、ｐＨ調整剤を含まない組成物に含まれた形態である、項４～６のいずれかに記載のケトン体測定用センサ。
項８．　項１～３のいずれかに記載のケトン体測定用酵素剤又は項４～７のいずれかに記載のケトン体測定用センサを含む、ケトン体測定用キット。
項９．　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性条件下で、ケトン体を測定すべき試料と、項１～３のいずれかに記載のケトン体測定用酵素剤又は項４～７のいずれかに記載のケトン体測定用センサとを接触させる工程を含む、試料中のケトン体を測定する方法。
項１０．　ｐＨ調整剤を用いない、項９に記載の方法。
項１１．　前記試料が血液試料である、項９又は１０に記載の方法。
項１２．　前記試料が、糖尿病性ケトアシドーシス患者由来の試料である、項９～１１のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、ケトン体測定用酵素としての有用性を有する新たなＨＢＤＨを用いたケトン体測定用酵素剤、ケトン体測定用センサ及びケトン体測定用キット、並びに、当該ケトン体測定用酵素剤又はケトン体測定用センサを用いた試料中のケトン体を測定する方法が提供される。
本発明のＨＢＤＨのｐＨ特性の試験結果である。 本発明のＨＢＤＨの熱安定性試験結果である。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　また、本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
１．ケトン体測定用酵素剤
１－１．有効成分（ＨＢＤＨ）
　本発明のケトン体測定用酵素剤は、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを有効成分（ＨＢＤＨ）として含む。
　本発明のケトン体測定用酵素剤の前記活性の酸化反応の至適ｐＨの好ましい範囲としては、６．７～７．８、より好ましくは７～７．５が挙げられる。
　本発明のケトン体測定用酵素剤に含まれるＨＢＤＨとしては、好ましくは、下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドが挙げられる。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
　（１）のポリペプチドは、パラバークホリデリア・ファンゴラム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１０２４８９由来の３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＢＤＨ）である。このＨＢＤＨは、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性と共に、顕著に高い熱安定性を有する。従来、微生物から得られる野生型のＨＢＤＨの熱安定性には本質的な限界があるというのが長年における当業者の技術常識であり、熱安定性を向上させるためには遺伝子工学的に改変する手段しかないことに鑑みると、（１）のポリペプチドが野生型であるにも関わらず顕著に高い熱安定性を奏することは極めて特徴的である。更に、（１）のポリペプチドの由来菌であるパラバークホリデリア・ファンゴラムが耐熱性ではない常温菌であることに鑑みても、（１）のポリペプチドが野生型であるにも関わらず顕著に高い熱安定性を奏することは驚くべき特徴であるといえる。
　さらに、（１）のポリペプチドは、２－ヒドロキシブチレート（2-hydroxy butyrate）、乳酸、及びリンゴ酸に反応しない。
　前記（２）のポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記（２）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１０個、好ましくは１～８個、１～６個、１～５個、又は１～４個、更に好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
　また、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、６０％以上であればよいが、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上が挙げられる。さらに好ましい上記配列同一性としては、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、一層好ましくは９７％以上、より一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
　ここで、前記（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における第２２位（I）、第１６０位（Ｙ）、第１６４位（Ｋ）、第１９０位（Ｐ）、第１９３位（Ｖ）、第１９５位（Ｔ）のアミノ酸は、ＮＡＤの結合に寄与していると考えられ、第９８位（Ｑ）、第１４７位（Ｓ）、第１４９位（Ｈ）、第１５７位（Ｋ）、第１６０位（Ｙ）のアミノ酸は、基質の結合に寄与していると考えられ、いずれも３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して導入されるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼとしての機能を発揮できる程度の活性を有していることを意味する。具体的には、次の測定法によって活性を確認できることをいい、具体的な比活性の値は限定されるものではないが、通常、次の測定法によって計算されるＨＢＤＨの比活性が５０Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１００～１２００Ｕ／ｍｇであることをいう。
（ＨＢＤＨ活性測定法）
　３－ヒドロキシ酪酸を１４５ｍｍｏｌ／Ｌ（終濃度）、ヒドラジン硫酸塩を５．８ｍｍｏｌ／Ｌ（終濃度）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を０．１ｇ／ｄＬ（終濃度）を含む０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に対し、２５℃で、１ｍｇ／ｍＬポリペプチド溶液を所定倍率（希釈倍率）で希釈したサンプル液５０μＬを添加した後、１分間当たりに減少する３４０ｎｍの吸光度を測定する。以下の酵素活性計算式に基づいて、ＨＢＤＨ活性（Ｕ／ｍｇポリペプチド）を算出する。なお、酵素活性計算式において、６．２２は、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨのミリモル減少係数である。また、希釈倍率については、例えばポリペプチド溶液１０μＬに水４０μＬ加えて５０μＬのサンプル液を調製した場合、希釈倍率は５となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　また、前記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「熱安定性を有する」とは、次の測定法によって得られる５０℃残存活性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、一層好ましくは９７％以上、より一層好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上であることをいう。
（熱安定性測定方法）
　ポリペプチドを１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中０．１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解することでポリペプチド溶液を調製し、調製したポリペプチド溶液のＨＢＤＨ活性を、上記のＨＢＤＨ活性測定法に基づいて算出する。当該ポリペプチド溶液を５０℃で２０分間熱処理し、熱処理後におけるポリペプチド液のＨＢＤＨ活性を、上記のＨＢＤＨ活性測定法に基づいて算出する。熱処理後におけるポリペプチド液の残存活性の相対値（５０℃残存活性）を、以下の式に基づいて算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　さらに、（２）及び（３）のポリペプチドは、（１）のポリペプチドと同様に、２－ヒドロキシブチレート（2-hydroxy butyrate）、乳酸、及びリンゴ酸に反応しないものであることが好ましい。
　（２）及び（３）のポリペプチドは、（１）のポリペプチドと同様に野生型であってもよいし、（１）のポリペプチドの改変体であってもよい。本発明のケトン体測定用酵素剤に用いられるポリペプチドは、（１）のポリペプチドのようにパラバークホリデリア・ファンゴラム由来の野生型であっても優れた耐熱性を奏する。このような観点から、本発明のケトン体測定用酵素剤に用いられる（２）及び（３）のポリペプチドの好適な例としては、野生型のＨＢＤＨが挙げられる。
　本発明のケトン体測定用酵素剤において、上記のポリペプチドは、１種を単独で含んでいてもよいし、複数種が組み合わされて含んでいてもよい。
１－２．有効成分（ＨＢＤＨ）の製造方法
　上記の（１）～（３）のポリペプチドは、例えば、当該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを発現ベクターに導入して得られる組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、それによって得られた形質転換体を培養することによって製造することができる。また、上記の（１）～（３）のポリペプチドは、野生型のものについては、産生菌（（１）のポリペプチドの場合はパラバークホリデリア・ファンゴラム）を培養することで製造することもできる。
　上記ポリペプチドをコードしているＤＮＡは、上記ポリペプチドをコードしている領域をＰＣＲ等による取得、又は、遺伝子合成法を用いた人工合成等により得ることができる。
　また、塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する場合、変異導入方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードしているＤＮＡの塩基配列については、当業者であれば、上記ポリペプチドのアミノ酸配列に従って適宜設計可能である。
　上記ポリペプチドをコードしているＤＮＡの具体例としては、以下が挙げられる。
（i）上記（１）～（３）のポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ii）上記（１）～（３）のポリペプチドをコードするＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び
（iii）上記（１）～（３）のポリペプチドをコードするＤＮＡに対して６０％以上（好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の相同性を有するＤＮＡ。
　上記（１）のポリペプチドをコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号２が挙げられる。
　「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．　Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７－２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　上記のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
　組換えベクターには、上記のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と上記のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせなどが好ましく挙げられる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本発明の遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；放線菌等；酵母等；糸状菌等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。また、宿主としては、上記ポリペプチドの由来菌であってもよい。
　本発明の形質転換体は、宿主に上記のＤＮＡ又は上記の本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する方法は、目的の遺伝子が宿主に導入できる限り特に限定されない。また、ＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。
　宿主に上記のＤＮＡ又は組換えベクターを導入する条件は、導入方法及び宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
　形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
　形質転換体を培養した後は、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収することができる。上記のポリペプチドが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、目的のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
　また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した目的のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られたポリペプチドを含む培養液又は水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液又は水溶性画分中のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
　濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　ポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　このようにして精製されたポリペプチドは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
１－３．他の成分
　本発明のケトン体測定用酵素剤は、上記ポリペプチド（有効成分）の他に、有効成分の種類、製剤形態等に応じて他の成分を含んでいてよい。
　例えば、本発明のケトン体測定用酵素剤は、上記有効成分の他、賦形剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、緩衝液、生理食塩水からなる群より選択される添加剤を含有することができる。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては塩化ナトリウム、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては塩化ナトリウム、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、クエン酸、塩酸、リン酸、硫酸等の酸性調整剤；水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性調整剤が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。
　本発明のケトン体測定用酵素剤は、有効成分として、上記（１）のポリペプチド等のように、酸化反応の至適ｐＨが中性のものを用いることができる。このような場合、酵素の至適ｐＨ領域と試料（特に、血液試料等の体液試料）のｐＨ領域とが重複するため、ｐＨ調整剤を用いることなく、反応系を構築することができることから、本発明のケトン体測定用酵素剤に含まれる他の成分からｐＨ調整剤を除外することができる。つまり、本発明のケトン体測定用酵素剤の好適な例として、ｐＨ調整剤を含まないものが挙げられる。
　「ｐＨ調整剤を含まない」とは、ｐＨを調整することを目的に用いられる物質を含まないことをいい、当該「ｐＨを調整する」とは、少なくとも、従来のＨＢＤＨの至適ｐＨに該当する範囲、つまり、ケトン体測定用の一般的な試料のｐＨ範囲から外れた範囲（具体的にはｐＨ８以上）にｐＨを調整することをいう。従って、本発明の好ましい形態において、ｐＨ８以上に調整するために用いられるｐＨ調整剤を含まない場合であっても、本発明で用いられる有効成分ＨＢＤＨの至適ｐＨ（６．５以上８．０未満、好ましくは６．７～７．８、より好ましくは７～７．５）にｐＨを調整する目的に用いられる物質を含むことは許容する。しかしながら上述のとおり、酵素の至適ｐＨ領域と試料（特に、血液試料等の体液試料）のｐＨ領域とが重複するため、本発明の最も好ましい形態においては、ｐＨ８以上に調整するために用いるｐＨ調整剤に限らず、いかなるｐＨ調整剤の使用も不含とすることができる。
　本発明のケトン体測定用酵素剤における有効成分の含有量としては、有効成分の３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性が発揮される範囲で適宜設定される。
１－４．製剤形態
　本発明のケトン体測定用酵素剤の製剤形態としては、特に限定されないが、例えば、液体、粉末、顆粒等が挙げられる。本発明のケトン体測定用酵素剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
１－５．用途
　本発明のケトン体測定用酵素剤は、ケトン体測定の目的で用いられる。測定目的となるケトン体は、３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ヒドロキシ酪酸）である。本発明のケトン体測定用酵素剤の具体的な使用方法については、後述「４．試料中のケトン体を測定する方法」で詳述する。
２．ケトン体測定用センサ
　本発明のケトン体測定用センサは、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満（好ましくは６．７～７．８、より好ましくは７～７．５）であるポリペプチドを有効成分（ＨＢＤＨ）として含む。
　に含まれるＨＢＤＨとしては、好ましくは、下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドが挙げられる。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
　上記ポリペプチドの詳細、ポリペプチドの製造方法、ポリペプチドと共に用いられうる他の成分、ポリペプチドの製剤形態、及び用途については、上記「１．ケトン体測定用酵素剤」で述べた通りである。
　本発明のケトン体測定用センサは、上記のポリペプチドを含むとともに、上記のポリペプチドによる３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ヒドロキシ酪酸）とＮＡＤ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はその誘導体との反応に基づく変化及びその量を読み取り可能な信号に変換する物体として構成することができる。
　上記のポリペプチドによる３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ヒドロキシ酪酸）とＮＡＤ+及び／又はその誘導体との反応に基づく変化としては、具体的には、３－ヒドロキシ酪酸の消費、ＮＡＤ+及び／又はその誘導体の酸化還元状態の変化が挙げられる。
　上記のポリペプチドによる３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ヒドロキシ酪酸）とＮＡＤ+及び／又はその誘導体との反応に基づく変化及びその量を読み取り可能な信号としては、電気化学的信号及び光学的信号が挙げられる。
　電気化学的信号としては、化学的な状態（例えば、３－ヒドロキシ酪酸の存在等）が電気的な信号（例えば、電流等）に変換されたものが挙げられる。光学的信号としては、ＮＡＤ+及び／又はその誘導体酸化還元状態（例えば、ＮＡＤ+及び／又はその誘導体、並びに／若しくは、ＮＡＤＨ及び／又はその誘導体の存在）に基づく吸光及び／又は発光が挙げられる。
　本発明のケトン体測定用センサにおいて、上記のポリペプチドは、不溶性支持体に固定されていることが好ましい。ポリペプチドの固定態様としては特に限定されず、付着、吸着、吸収、膨潤等による物理的固定、特異的非共有的結合による化学的又は生化学的固定、及び共有結合による化学的固定が挙げられる。
　また、ポリペプチドは、ポリペプチドが単独の形態で不溶性支持体に固定されていてもよいし、ポリペプチドが他の成分とともに組成物の形態で不溶性支持体に固定されていてもよい。ポリペプチドが組成物の形態で不溶性支持体に固定されている場合の具体的な態様としては、当該組成物が不溶性支持体に物理的固定（好ましくは付着により固定）している態様が挙げられる。なお、当該組成物がｐＨ調整剤を含まないことが好ましい点については、上記「１－３．他の成分」において述べた通りである。
　不溶性支持体は、少なくともその表面が、上記のポリペプチドと３－ヒドロキシ酪酸との反応系中に溶解せず且つ上記のポリペプチドを固定できる固体又は固形の材料で構成されている。不溶性支持体の少なくとも表面を構成する材料の具体例としては、膨潤性材料（例えばゼラチン等）、多孔性基材（例えばセルロース、ろ紙等）、樹脂、ガラス、レドックスポリマー（つまり、レドックスメディエータを結合させたポリマー）、金属、カーボン等が挙げられる。
　不溶性担体の形状としては特に限定されず、例えば、基板状、薄片状、スティック状、ビーズ状等が挙げられる。
　上記の不溶性担体の好ましい例としては、その表面が上記の材料で構成された電極が挙げられる。また、このような電極には、好ましくはポリペプチドが物理的固定されており、より好ましくは、ポリペプチドを含む組成物が物理的固定（好ましくは付着により固定）されている。
　本発明のケトン体測定用センサの具体的な態様としては、バイオセンサとして採用されている任意の形態であってよく、例えば、センサチップ、マイクロタイタープレート、テストストリップ、電気化学的フローセル等が挙げられる。
３．ケトン体測定用キット
　本発明のケトン体測定用キットは、上記「１．ケトン体測定用酵素剤」に記載のケトン体測定用酵素剤又は上記「２．ケトン体測定用センサ」に記載のケトン体測定用センサを含む。
　本発明のケトン体測定用キットは、ケトン体測定用酵素剤又はケトン体測定用センサの他、測定及び／又は試料の採取に用いられる適当な他のアイテムを更に含むことができる。
　このような他のアイテムの例としては、ＮＡＤ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤ+誘導体（例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、チオニコチンアミド－ＮＡＤ、ピリジンアルデヒド－ＮＡＤ、アセチルピリジン－ＮＡＤ、カルバ－ＮＡＤ等）、レドックスメディエータ、蛍光プローブ、除タンパク質液、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等）、ランセットデバイス等が挙げられる。本発明のケトン体測定用キットは、これらの他のアイテムとして、１種を単独で含んでいてもよいし、複数種を組み合わせて含んでいてもよい。
４．試料中のケトン体を測定する方法
　本発明の試料中のケトン体を測定する方法は、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性条件下で、ケトン体を測定すべき試料と、上記「１．ケトン体測定用酵素剤」に記載のケトン体測定用酵素剤又は上記「３．ケトン体測定用センサ」に記載のケトン体測定用センサとを接触させる工程を含む。
　本発明の試料中のケトン体を測定する方法は、上記ケトン体測定用酵素剤又は上記ケトン体測定用センサにおいて記載した有効成分（ＨＢＤＨ）が触媒する以下の反応に基づいて行われる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明の試料中のケトン体を測定する方法の具体的態様においては、試料中の３－ヒドロキシ酪酸を定量する。より具体的な態様においては、本発明の試料中のケトン体を測定する方法は、（ａ）３－ヒドロキシ酪酸を含む試料を、上記ケトン体測定用酵素剤又は上記ケトン体測定用センサとを接触させる工程；（ｂ）上記ケトン体測定用酵素剤又は上記ケトン体測定用センサにおける有効成分（ＨＢＤＨ）により、前記試料中の３－ヒドロキシ酪酸と、ＮＡＤ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はその誘導体とを反応させる工程；及び、（ｃ）３－ヒドロキシ酪酸（Ｒ－３－ヒドロキシ酪酸）とＮＡＤ+及び／又はその誘導体との反応に基づく変化を検出又は定量する工程、を含む。
　工程（ａ）において、試料としては、ケトン体を測定すべき試料であれば特に限定されないが、例えば、ケトン体を測定すべき対象由来の生体試料が挙げられる。ケトン体を測定すべき対象としては、ヒト等の哺乳動物が挙げられる。生体試料としては、体液，排泄物及び組織が挙げられ、具体的には、血液試料（全血、血清、血漿）、尿、精液、前立腺液、涙、唾液，汗、腹水、脳脊髄液、乳汁、リンパ液、組織抽出試料等が挙げられる。本発明で用いられる有効成分ＨＢＤＨの酸化反応の至適ｐＨが８未満であるため、生体試料としては、当該至適ｐＨの範囲内のｐＨを有するものが好ましく、特に血液試料が好ましい。
　血液のｐＨは、健常者ではｐＨ７．３５～７．５である一方、血中ケトン体濃度が上昇すると低下し、重度な糖尿病性ケトアシドーシスではｐＨ７．０以下、例えば６．７程度になりうる。従って、ケトン体を測定すべき血液試料のｐＨとしては、ｐＨ６．７～７．８が挙げられる。上記血液試料のｐＨ範囲の下限は、６．８以上、又は６．９以上であってもよく、上記血液試料のｐＨ範囲の上限は、７．５以下、７．３以下、又は７．０以下であってもよい。
　試料と上記ケトン体測定用酵素剤との接触は、試料と上記ケトン体測定用酵素剤との混合液を調製することで行うことができる。また、試料と上記ケトン体測定用センサとの接触は、上記ケトン体測定用センサにおいて有効成分（ＨＢＤＨ）が固定されている不溶性支持体に、試料を滴下する、載置する、流す、吸収させる等、又は、試料中に前記不溶性支持体を浸漬させる等によって行うことができる。
　工程（ｂ）において、反応条件は、有効成分（ＨＢＤＨ）の３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を生じさせる温度及びｐＨ条件が、当業者によって適宜選択される。例えば、反応温度としては、具体的には、２０～４０℃、好ましくは２３～３０℃、より好ましくは２５～２７℃が挙げられる。反応ｐＨとしては、有効成分（ＨＢＤＨ）の至適ｐＨに基づくことができ、具体的には、８未満、好ましくは６．５～７．５、より好ましくは７～７．５が挙げられる。反応時間としては特に限定されないが、例えば５秒～３時間、好ましくは１０秒～１０分が挙げられる。
　また、工程（ｂ）における反応系のｐＨとしては、好ましくはｐＨ８未満が挙げられる。また、工程（ｂ）における反応系のｐＨの好ましい例としては、ｐＨ６．７～７．８が挙げられる。上記ｐＨ範囲の下限は、６．８以上、又は６．９以上であってもよく、上記ｐＨ範囲の上限は、７．５以下、７．３以下、又は７．０以下であってもよい。
　なお、工程（ａ）と工程（ｂ）とはこの順に行われてもよいし、同時に行われてもよい。
　さらに、本発明の試料中のケトン体を測定する方法で上記反応を触媒する有効成分（ＨＢＤＨ）として、上記（１）のポリペプチド等のように、酸化反応の至適ｐＨが中性のものを用いることができる。このような場合においては、酵素の至適ｐＨ領域と試料（特に、血液試料等の体液試料）のｐＨ領域とが重複するため、工程（ａ）及び工程（ｂ）のいずれにおいてもｐＨ調整剤を用いることなく、反応系を構築することができる。つまり、本発明の試料中のケトン体を測定する方法の好適な例として、ｐＨ調整剤を用いない態様が挙げられる。
　工程（ｃ）において、ＮＡＤ+の誘導体としては、ＮＡＤ+を基本骨格とし、ＮＡＤ+と同様に、有効成分（ＨＢＤＨ）により３－ヒドロキシ酪酸がアセト酢酸に変換されると同時に還元型を生じる物質であれば特に限定されないが、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、チオニコチンアミド－ＮＡＤ、ピリジンアルデヒド－ＮＡＤ、アセチルピリジン－ＮＡＤ、カルバ－ＮＡＤ等が挙げられる。
　３－ヒドロキシ酪酸とＮＡＤ+及び／又はその誘導体との反応に基づく変化については、上記「２．ケトン体測定用センサ」で述べた通りである。３－ヒドロキシ酪酸とＮＡＤ+及び／又はその誘導体との反応に基づく変化は、試料に含まれていた３－ヒドロキシ酪酸の量と相関する。このため、当該反応に基づく変化を検出又は定量することにより、試料に含まれていた３－ヒドロキシ酪酸を検出又は定量することができる。
　好ましい態様においては、生成されたＮＡＤＨ及び／又はその誘導体の量と消費されたＮＡＤ+及び／又はその誘導体の量とが、試料中に存在していた３－ヒドロキシ酪酸の量と相関することに基づいて、生成されたＮＡＤＨ及び／又はその誘導体の量；消費されたＮＡＤ+及び／又はその誘導体の量；並びに／若しくは、それらの量の比率を、上記反応に基づく変化の量として測定することができる。これらの量及び比率の算出方法としては、当業者が適宜決定することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１：有効成分（ＨＢＤＨ）のスクリーニング
　本試験例では、天野エンザイム株式会社の保存株（７６０６株）の培養液より、ＨＢＤＨ活性を有する菌株を選択し、温度安定性を確認した。
（１）培地組成
　培養に用いた培地組成は以下の通りである。
　　１ｇ／ｄＬ　尿素
　　１ｇ／ｄＬ　グルタミン酸ナトリウム
　　０．４ｇ／ｄＬ　酵母エキス
　　１．０ｇ／ｄＬ　リン酸１カリウム
　　ｐＨ　５．５
　　（１２１℃で２０分オートクレーブした。）
（２）手順
　培養液の遠心分離により菌体を回収し、ビーズ破砕を行った後、菌体内酵素を抽出した。抽出した菌体内酵素のＨＢＤＨ活性を後述（３）の方法により測定し、ＨＢＤＨ活性が０．０５Ｕ／ｍＬ以上である酵素を、ＨＢＤＨ活性ありと判断した。ＨＢＤＨ活性ありと判断された酵素について、イオン交換クロマトグラフィーによりＨＢＤＨ活性画分を回収した。
　これによって得られたＨＢＤＨ活性画分は、パラバークホリデリア・ファンゴラム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１０２４８９に由来するものであった。
（３）ＨＢＤＨ活性測定法
　３－ヒドロキシ酪酸を１４５ｍｍｏｌ／Ｌ（終濃度）、ヒドラジン硫酸塩を５．８ｍｍｏｌ／Ｌ（終濃度）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を０．１ｇ／ｄＬ（終濃度）を含む０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に対し、２５℃で、測定対象試料を所定倍率（希釈倍率）で希釈したサンプル液５０μＬを添加した後、１分間当たりに減少する３４０ｎｍの吸光度を測定した。以下の酵素活性計算式に基づいて、ＨＢＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。なお、酵素活性計算式において、６．２２は、３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨのミリモル減少係数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（４）精製確認
　ＨＢＤＨ活性画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開し、ほぼ単一の酵素成分が含まれていることを確認した。パラバークホリデリア・ファンゴラム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１０２４８９から得られたＨＢＤＨ活性画分に含まれていた酵素成分の分子量（分子量マーカーから導出）は、約２８，０００であった。
（５）至適ｐＨ
　実施例１のＨＢＤＨを、ｐＨを４～９（０．５刻み）に調整したＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液にそれぞれ同濃度で溶解し、上記（３）の方法に従ってＨＢＤＨ活性を測定し、最大活性（ｐＨ７．５の場合のＨＢＤＨ活性）を１００とした場合の各ｐＨにおけるＨＢＤＨの相対値（％）を導出した。結果を図１に示す。
　図１に示されるように、実施例１のＨＢＤＨの酸化反応の至適ｐＨは７～７．５であった。なお、市販のＨＢＤＨの酸化反応のｐＨが、比較例１のＨＢＤＨ、比較例２のＨＢＤＨ、シュードモナス種由来のＨＢＤＨ（東洋紡製）、及びロードバクター・スファエロイデス由来のＨＢＤＨ（ロシュ製）のいずれも８．５であること、並びに、公知のＨＢＤＨの酸化反応のｐＨが８～８．６であることに鑑みると、実施例１のＨＢＤＨが、中性域の特殊な至適ｐＨを有していることが分かった。このため、実施例１のＨＢＤＨ用いて血液試料等の体液試料中のケトン体を測定する場合は、これら体液試料のｐＨが中性であることから、ｐＨ調整剤を用いずに測定系を構築することができ、さらには、測定に必要なＮＡＤを共存させる場合に、不安定なアルカリ性にする必要がない。加えて、図１に示される通り、実施例１のＨＢＤＨは、ｐＨが７未満の場合でも、ｐＨ７近傍（例えばｐＨ６．７程度）では高いＨＢＤＨ活性を維持しているため、ｐＨ７を下回りうる糖尿病性ケトアシドーシス患者由来の血液試料に対しても、ｐＨ調整剤を用いることなくＨＢＤＨ活性の高い測定系を構築することができる。
試験例２：有効成分（ＨＢＤＨ）の諸特性
　本試験例では、試験例１で得られたＨＢＤＨの諸特性を確認した。
（１）熱安定性
　下記表に示す各酵素について、酵素濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるように、１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、調製された酵素液について上記（３）の方法に従ってＨＢＤＨ活性を測定した。調製された酵素液を、４０℃、５０℃、５５℃、又は６０℃での、２０分間の処理に供し、熱処理液を得た。得られた熱処理液について試験例１の（３）の方法に従ってＨＢＤＨ活性を測定した。熱処理液の残存活性の相対値を、以下の式に基づいて算出した。なお、表１の実施例１は、上記（１）～（３）の手順で取得及び確認されたＨＢＤＨの１つであり、比較例１（天野エンザイム製）及び比較例２（旭化成製）は、ＨＢＤＨの市販品の中でも熱安定性が高いものである。熱安定性試験の結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　図２から明らかな通り、実施例１のＨＢＤＨは野生型であるにも関わらず顕著に高い熱安定性を示した。なお、処理温度５０℃である場合の熱安定性（２０分処理後の残存率）は、下記表１の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）基質特異性
　実施例１のＨＢＤＨについて、２－ヒドロキシブチレート（2-hydroxy butyrate）、乳酸、及びリンゴ酸それぞれとの反応性を調べたところ、これらのいずれとも反応しないことを確認した。
試験例３：有効成分（ＨＢＤＨ）の同定
本試験例では、実施例１のＨＢＤＨの配列を同定した。
　パラバークホリデリア・ファンゴラム（Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｆｕｎｇｏｒｕｍ）ＮＢＲＣ１０２４８９から、Ｅａｓｙ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（カネカ製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
　パラバークホリデリア・ファンゴラムの公知配列情報に基づき、共通配列から以下のプライマーを設計した。
　　　ATGTCGTCACTGAACACGAATC（配列番号３）
　　　TTATTGCATATACCAGCCGTG（配列番号４）
　ゲノムＤＮＡを鋳型に、設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅した遺伝子を取得した。常法に従いシーケンスを行った結果、遺伝子の配列は配列番号２の通り、当該遺伝子配列から翻訳したアミノ酸配列は配列番号１の通りであった。
　次に、大腸菌発現ベクター　ｐＴｒｃ９９Ａのマルチクローニング部位に、定法に従い上記取得した遺伝子を挿入した。ＨＢＤＨ遺伝子を導入したベクターを、大腸菌ＤＨ５αにコンピテントセル法で導入した。得られた遺伝子導入大腸菌をＬＢ培地で１７時間培養し、遠心分離により集菌した後、ビーズ破砕により菌体内酵素を抽出した。
　得られた抽出液のＨＢＤＨ活性を、試験例１の（３）の方法に基づいて測定により、ＨＢＤＨが発現していることを確認した。なお、ＨＢＤＨ遺伝子を導入していない大腸菌ではＨＢＤＨ活性を検出できないことも確認した。これらの結果から、配列番号２の遺伝子がＨＢＤＨ遺伝子であることが示された。
配列番号３及び４は、プライマーである。

Claims (12)

  1. 　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを含む、ケトン体測定用酵素剤。
  2. 　前記ポリペプチドが、下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドである、請求項１に記載のケトン体測定用酵素剤：
    （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
    （３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
  3. 　ｐＨ調整剤を含まない、請求項１又は２に記載のケトン体測定用酵素剤。
  4. 　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、前記活性の酸化反応の至適ｐＨが６．５以上８．０未満であるポリペプチドを含む、ケトン体測定用センサ。
  5. 　前記ポリペプチドが、下記（１）～（３）のいずれかに示すポリペプチドである、請求項４に記載のケトン体測定用センサ：
    （１）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド、及び
    （３）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であり、且つ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性及び熱安定性を有するポリペプチド。
  6. 　前記ポリペプチドが不溶性支持体に固定されている、請求項４又は５に記載のケトン体測定用センサ。
  7. 　前記ポリペプチドが、ｐＨ調整剤を含まない組成物に含まれた形態である、請求項４～６のいずれかに記載のケトン体測定用センサ。
  8. 　請求項１～３のいずれかに記載のケトン体測定用酵素剤又は請求項４～７のいずれかに記載のケトン体測定用センサを含む、ケトン体測定用キット。
  9. 　３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性条件下で、ケトン体を測定すべき試料と、請求項１～３のいずれかに記載のケトン体測定用酵素剤又は請求項４～７のいずれかに記載のケトン体測定用センサとを接触させる工程を含む、試料中のケトン体を測定する方法。
  10. 　ｐＨ調整剤を用いない、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記試料が血液試料である、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　前記試料が、糖尿病性ケトアシドーシス患者由来の試料である、請求項９～１１のいずれかに記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH11318438A (ja) * 1998-04-08 1999-11-24 Roche Diagnostics Gmbh 組換え微生物３―ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ―ゼ、その製造方法およびその使用
JP2003339385A (ja) * 2002-05-29 2003-12-02 Toyobo Co Ltd 新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法、ならびに、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いたケトン体の測定方法および測定用組成物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11318438A (ja) * 1998-04-08 1999-11-24 Roche Diagnostics Gmbh 組換え微生物３―ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ―ゼ、その製造方法およびその使用
JP2003339385A (ja) * 2002-05-29 2003-12-02 Toyobo Co Ltd 新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法、ならびに、新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いたケトン体の測定方法および測定用組成物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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