KR101923241B1 - 가역적인 이온 및 분자 감지 또는 이동을 위한 나노세공 장치 - Google Patents

Abstract

전기화학적 감지 회로에서 사용하기 위해 적합한 나노피펫 (nanopipette)을 사용하는, 이온 이동 및 결합의 검출을 위한 방법 및 장치를 개시한다. 나노피펫은 금속 이온, 또는 글루코스에 결합하고 이를 감지하기 위한 보론산과 같은 다른 특이적 결합 분자에 결합하고 이를 감지하기 위해 그의 내부 구멍 상에서 금속 킬레이터로 관능화될 수 있다. 그러한 관능화된 나노피펫은 나노피펫이 이온 또는 소분자에 선택적으로 및 가역적으로 결합할 때를 검출하는 전기 센서에 포함된다. 전압-유도 이온 이동에 의한 수용액 내의 침전을 제어하기 위한, 나노피펫을 포함하는 나노반응기를 또한 개시하고, 여기서 이온은 구멍 내의 전하를 밀어냄으로써 내부 구멍 밖으로 유도될 수 있다.

Description

가역적인 이온 및 분자 감지 또는 이동을 위한 나노세공 장치 {NANOPORE DEVICE FOR REVERSIBLE ION AND MOLECULE SENSING OR MIGRATION}

발명자: 나덜 포울만드, 보아즈 빌로즈니, 파올로 액티스, 알. 아담 시거 및 바크탄 신가람

관련 출원에 대한 교차-참조

본원은 2011년 3월 4일 출원된 U.S. 특허 가출원 61/449,379를 기초로 한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

정부 지원의 언급

본 발명은 미국 항공 우주국 (National Aeronautics and Space Administration) (NASA)에 의해 제시된 계약 번호 (Contract Number) NCC9-165 및 NNX08BA47A, 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 제시된 계약 번호 P01-HG000205, NASA에 의해 제시된 계약 번호 NNX09AQ44A 및 미국 국립 암 연구소에 의해 제시된 계약 번호 U54CA143803 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

서열 목록, 컴퓨터 프로그램 또는 컴팩트 디스크에 대한 참조

없음.

발명의 배경

발명의 분야

본 발명은 나노물질 분야, 구체적으로 나노세공 장치 및 센서에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 나노 규모의 이온 전류 측정치를 사용한 이온 및 탄수화물의 감지 및 조작에 관한 것이다

본 발명의 특정 측면은 상세한 설명에서 언급되지만 반드시 상세하게 설명되지는 않는 기술적 특징에 관련될 수 있기 때문에 이에 대한 배경 정보를 아래에 제시한다. 즉, 본 발명에서 사용되는 개별적인 부품 또는 방법은 아래에서 논의되는 물질에서 보다 상세하게 설명될 수 있고, 상기 물질은 특허청구되는 본 발명의 특정 측면을 만들거나 사용하기 위한 추가의 지침을 당업자에게 제공할 수 있다. 아래 논의는 본원의 임의의 청구항에 대한 정보의 관련성 또는 설명된 물질의 선행 기술의 효과에 대한 승인으로서 고려되지 않아야 한다.

나노세공 이온 전류 조정제

고체 상태 나노세공은 나노입자의 크기-선택적 합성을 위한 생물학적 채널을 모방하기 위해 사용될 수 있는 안정한 구조로서 또는 나노 규모 센서로서 특히 관심을 끌고 있다. 원뿔형, 또는 비대칭적 나노세공은, 전압 개폐 (voltage-gated) 이온 전류를 보이고 나노유체 다이오드 (nanofluidic diode)로서 거동할 수 있는 나노채널의 별개의 범주이고, 즉, 이들은 이온 전류 정류 (rectification)를 보인다. 몇몇 그룹에서 비대칭적 나노세공을 함유하는 막을 가로지른 이온 전류 측정을 이용하는 전기 센서를 개발하였다 (문헌 [Harrell, C. C. et al., Resistive-pulse DNA detection with a conical nanopore sensor. Langmuir 22, 10837-10843, doi:10.1021/1a061234k (2006)]; [Kececi, K., et al. Resistive-pulse detection of short dsDNAs using a chemically functionalized conical nanopore sensor. Nanomedicine 3, 787-796, doi:10.2217/17435889.3.6.787 (2008)]; [Sexton, et al., Developing synthetic conical nanopore for biosensing applications. Mol. Bia Syst. 3, 667-685, doi:10.1039/b708725j (2007)]; [Au, M., et al. Biosensing with functionalized Single Asymmetric Polymer Nanochannels, Macromol. BioscL 10, 28-32, doi:10.1002/mabL200900198 (2010)]). 상기 장치는 일반적으로 트랙-에칭 (track-etching) 방법에 의해 제조된다. 석영 모세관으로 제조된 석영 기재 나노세공은 많은 동일한 전기 특성을 보이지만, 레이저 풀러 (puller)를 사용하여 신속하게 제조된다. 나노피펫 (nanopipette)으로도 불리는 석영 원뿔형 나노세공은 다른 비대칭적 나노채널의 많은 특성을 보이고, 세공은 세포를 나노 규모로 영상화하기 위해 사용되는 특성인 고 공간 해상도로 조작될 수 있다는 점에서 유리하다.

원뿔형 나노세공을 사용한 조사는 벌크 (bulk) 물질에 대한 기존의 생각에 도전하는 새로운 화학적 및 전기적 현상을 제시하였다. 최근에, 이온 전류 진동 (oscillation)은 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 필름 내의 정류성 원뿔형 나노세공 (2 내지 8 nm 직경)에서 관찰되었고, 약가용성 염의 전압-유도 농도에 의해 야기되는 세공 내의 동적 침전에 의해 발생하였다. 질화규소 또는 보로실리케이트 유리의 훨씬 큰 세공 내의 전류 진동은 용해도가 상이한 유기 분자를 사용하여 두 용매의 계면에서 생성될 수 있다. 상기 현상은 비평형 이벤트, 예컨대 침전을 실시간으로 및 나노 규모로 전기적으로 모니터링하기 위한 새로운 방법을 제시한다.

나노세공 센서

안정성 및 생물학적 채널을 모방하는 능력 때문에 나노세공-기반 플랫폼은 (생체) 분자 상호작용을 연구하기 위한 후보가 된다. 고체 상태 나노세공은 안정하고, 그의 직경은 제조 과정을 통해 제어될 수 있고, 장치 및 어레이 내에 통합될 수 있다. 또한, 그의 표면 특성은 화학적 관능화에 의해 쉽게 조정될 수 있고, 따라서 화학적 및 생화학적 반응성 나노세공의 개발이 가능하다. 나노세공-기반 센서는 단백질, DNA, 앱타머 (aptamer), 리간드, 및 작은 생체분자를 비롯한 수용체를 포함하고, 따라서 다양한 분석물의 표적화가 가능하다. 많은 고체 상태 나노세공 센서의 감수성에 필수적인 것은 이온 전류 정류 (ICR)의 특성이고, 이것은 용액 내의 이온과 하전된, 비대칭적 형상의 나노채널, 또는 원뿔형 나노세공의 표면 사이의 선택적 상호작용에 의해 발생한다. ICR을 보이고 센서로서 사용되는 나노물질은 중합체 막 및 석영 나노피펫 내의 트랙-에칭된 나노세공을 포함한다. 어느 경우든, 핵심적인 문제는 적절한 수용체에 의한 표면 변형이다.

또한, 원뿔형 석영 나노세공은 감지 용도를 위해 관능화되었다 (예를 들어, 문헌 [Sa, N., Fu, V. & Baker, I.A. "Reversible Cobalt Ion Binding to Imidazole-Modifled Nanopipettes." Anal Chem., 82, 9663-9666, doi:10.1021/ac102619j (2010)]; [Fu, Y., Tokuhisa, H. & Baker, I.A. "Nanopore DNA sensors based on dendrimer-modified nanopipettes." Chem Commun (Comb), 4877-4879, doi:10.1039Jb910511e (2009)]; [Umehara, S., Karhanek, M., Davis, R. W. & Pourmand, N. "Label-free biosensing with functionalized nanopipette probes." Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 4611-4616, doi:10.1073/pnas.0900306106 (2009)]; [Actis, P., Mak, A. & Pourmand, N. "Functionalized nanopipettes: toward label-free, single cell biosensors." Bioanalytical Reviews 1,177-185, doi:10.1007/s12566-010-0013-y (2010)]; [Actis, P., Jejelowo, 0. & Pourmand, N. "Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors." Biosensor and Bioelectronics 26, 333-337 (2010)] 참조).

현재까지, 분석물과 나노세공 센서의 가역적인 결합은 어려운 것으로 증명되었다. 그러나, 이것은 상기 장치가 하나의 센서를 사용한 연속 모니터링 또는 반복된 측정과 같은 용도를 위해 사용되어야 한다면 중요한 문제이다. 또한, 단일 센서의 다수 사용은 문헌에 보고된 많은 센서에 대한 정량적 측정을 제한하는, 동일한 크기의 세공을 재현가능하게 생산할 때의 문제를 극복할 것이다. 상기 용도를 위해, 나노피펫은 센서 팁 (tip)이 샘플 사이에서, 또는 단일 샘플 내에서 나노 규모 정확도로 정밀하고 신속하게 조작될 수 있기 때문에 유망한 플랫폼이다. 현재까지, pH에 대해 반응성인 관능화된 나노세공은 신속하게 가역적인 및 선택적 거동의 측면에서 최상의 특성을 보여주었다. 이미다졸로 관능화되고 코발트 이온에 반응하는 나노피펫은 낮은 pH의 용액에 침지하고, 리간드에 양성자를 다시 부감함으로써 재생될 수 있다 (문헌 [Sa, N.; Fu, V.; Baker, L.A., Reversible Cobalt Ion Binding to Imidazole-Modified Nanopipettes. Anal. Chem. 2010, 82 (24), 9963-9966]).

나노세공을 통한 수송은 전압 및 압력을 포함하는 다양한 외부 자극에 의해 변형될 수 있다 (문헌 [Lan, W.-J.; Holden, D. A.; White, H. S., Pressure-Dependent Ion Current Rectification in Conical-Shaped Glass Nanopores. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133 (34), 13300-13303] 참조). 나노세공에 걸친 염 구배를 간단히 변경함으로써 수송에 영향을 줄 수 있고, 이러한 효과는 DNA를 저항-펄스 (resistive-pulse) 측정을 위해 집중하기 위해 사용되었다 (문헌 [Wanunu, M.; Morrison, W.; Rabin, Y.; Grosberg, A. Y.; Meller, A., Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat Nano 2010, 5 (2), 160-165] 참조). 또한, 나노세공은 자극, 예컨대 용매 극성에 반응하도록 조작될 수 있다. 이것은 나노세공이 중합체로 장식된 소위 "털모양 (hairy) 나노세공"을 사용하여 달성될 수 있다 (문헌 [Peleg, O.; Tagliazucchi, M.; Kroeger, M.; Rabin, Y.; Szleifer, I., Morphology Control of Hairy Nanopores. ACS Nano 2011, 5 (6), 4737-4747] 참조). 몇몇의 인공적인 나노세공은 표면 변형을 사용하여 pH-감수성을 위해 조작되었다. 원뿔형 나노세공은 마찬가지로 전류 정류를 조정하는 다른 하전된 종에 대한 결합을 위해 수용체로 변형되었다. 표적은 핵산, 금속 이온, 단백질, 및 소분자를 포함하였다. 큰 생체분자, 예컨대 핵산 및 단백질의 경우에, 세공의 물리적 차단은 표면 전하의 조정 이외의 추가의 역할을 수행할 것 같다. 지금까지, 작은 비하전된 종을 사용한 전류 정류의 조정은 어려운 것으로 입증되었다. 그러나, 상기 시스템은 약물, 펩티드, 및 탄수화물을 포함하기 위해 반응성 나노세공에 대한 자극을 확대할 것이다.

글루코스 / 디올 감지

탄수화물 인식은 혈당 모니터링에 필수적이다 (문헌 [Kondepati, et al. Anal. Bioanal. Chem. 388, 545-563 (2007)]). 또한, 탄수화물의 검출 및 정량은 생체과정 모니터링에서 및 대사성 당류, 뉴클레오티드, 또는 당단백질을 기초로 한 의학적 진단을 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Timmer, et al. Curr. Op. Chem. Biol. 11, 59-65 (2007)]). 글루코스를 측정하기 위한 대부분의 전기화학적 방법은 레독스 (redox) 효소, 예컨대 글루코스 옥시다제에 의존한다 (문헌 [Oliver, et al. Diabetic Med. 26, 197-210 (2009)]). 가장 통상적인 인공적인 수용체는 보론산을 이용하고, 이것은 광 프로브에 주로 사용되어왔다 (문헌 [Mader & Wolfbeis, Microchimica Acta 162, 1-34 (2008)]). 또한, 글루코스의 전기화학적 측정을 위한 비효소적 방법도 개발되었고, 이것은 주로 글루코스의 산화에 의존한다 (문헌 [Park, et al. Anal. Chim. Acta 556, 46-57 (2006)]; [E.T Chen, Nanopore structured electrochemical biosensors, US 2008/0237063]).

현재까지, 탄수화물에 반응하는 나노유체 세공은 문헌에서 거의 보고되지 않았다. 나노세공 분석은 저항-펄스 방법을 사용하여 소분자를 검출하기 위해 사용되지만, 이 기술은 일반적으로 단백질 및 다른 거대분자에 더 적합하다. MW이 약 500 내지 10,000인 올리고당류가 알파-헤몰리신 세공을 이용한 저항-펄스 기술을 사용하여 판별되었다.

수용체-변형된 나노세공의 일례는 추후 HRP 분자 상의 만노스 단위와 상호작용하는 당류-결합 단백질인 Con A에 초거대분자 상태로 (supramolecularly) 접합되는, 공유 부착된 HRP 효소를 이용한다 (문헌 [Ali, et al. nanoscale 3, 1894-1903 (2011)]). 단당류 (갈락토스 및 글루코스)의 부가는 Con A와 경쟁하여, 세공을 통한 이온 전류를 변경한다. 최근의 두 가지 예는 화학적 수용체로서 보론산을 이용하고, 여기서 수용체는 인공적인 나노세공의 벽에 공유 부착된다 (문헌 [Sun, Z.; Han, C; Wen, L.; Tian, D.; Li, H.; Jiang, L., pH gated glucose responsive biomimetic single nanochannels. Chem. Commun. (Cambridge, U. K.) 2012]; [Nguyen, Q. H.; Ali, M.; Neumann, R.; Ensinger, W., Saccharide/glycoprotein recognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid. Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 162 (1), 216-222]). 전자의 경우에, 산성 용액이 당류 결합을 역전시키고 신호를 회복시키기 위해 필요하였다. 후자의 경우에는, 가역적인 결합이 입증되지 않았다.

나노세공 제조 및 표면 화학에 대한 최근의 많은 발전에도 불구하고, 상기 언급된 연구는 외부 자극으로서 탄수화물을 사용하여 이온 전류를 조정하기 위한 새로운 방식에 대한 필요성을 보여준다. 상기 문제는 나노세공과 연결될 수 있는 새로운 기능성 물질을 사용하여 해결될 수 있다.

구체적인 특허 및 간행물

2010년 3월 25일 공개된 US 특허 출원 공개 2010/0072080 (Karhanek et al.)에는 펩티드 및 단백질을 포함하는 생체분자 검출을 위한 펩티드 리간드를 그 위에 갖는 나노피펫을 포함하는 방법 및 장치가 개시되어 있다.

2010년 5월 4일 등록된 US 특허 7,708,871 (Siwy et al.)에는 전해질 내의 하전된 입자의 유동을 제어하기 위한 나노소자를 갖는 장치가 개시되어 있다. 상기 장치는 전해질 내의 하전된 입자의 유동을 제어하기 위해 중합체 막 포일에 의해 분할된 전해조 용기를 포함한다.

문헌 [Sa et al. in Analytical Chemistry 2010, 82 (24), pp 9963-9966]에는 이미다졸-종결 실란으로 변형된 석영 나노피펫이 용액 내의 금속 이온 (Co²⁺)에 반응한다고 개시되어 있다. 나노피펫의 반응은 이온 전류 정류 비의 조사를 통해 평가되었다. 나노피펫이 상이한 pH의 용액 사이에서 순환될 때, 흡착된 Co^{2 +}는 나노피펫의 결합 부위를 재생하기 위해 나노피펫 표면으로부터 방출되었다.

문헌 [Umehara et al. in Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 106, pages 4611-4616, March 24, 2009]에는 관능화된 나노피펫 전극을 사용한 무표지, 실시간 단백질 검정이 개시되어 있다. 나노피펫 팁 표면 상의 정전기, 비오틴-스트렙타비딘, 및 항체-항원 상호작용은 50 nm 세공을 통한 이온 전류 유동에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다.

문헌 [Umehara et al. "Current Rectification with Poly-L-lysine Coated Quartz nanopipettes," Nano Lett. 6(11):2486-2492 (2006)]에는 조 용액에서 나노피펫을 사용한, 비코팅된 및 폴리-l-라이신 코팅된 나노피펫의 전류 반응이 개시되어 있다.

문헌 [Karhanek M., Kemp J.T., Pourmand N., Davis R.W. and Webb CD, "Single DNA molecule detection using nanopipettes and nanoparticles," Nano Lett. 2005 Feb;5(2):403-7]에는 나노입자로 표지된 단일 DNA 분자가 잡아당겨진 유리 모세관에 의해 형성된 나노피펫 팁을 통해 이동되기 때문에 이온 전류의 차단에 의해 검출될 수 있음이 개시되어 있다. 개시된 설정은 나노입자-DNA 전류 차단을 검출하기 위해 조 내에 단일 검출 전극을 이용한 전압 클램프 (clamp) 회로를 사용한다.

문헌 [Ying, Liming in Biochemical Society Transactions, vol 37, pages 702-706, 2009]은 나노피펫 및 이온, 분자 (생체분자 포함) 및 세포의 나노감지 (nanosensing) 및 나노조작에 있어서 그의 용도를 검토하였다.

2006년 1월 5일 공개된 WO 2006/000064 (Borghs, Gustaaf, et al.)에는 막을 통해 연장되는 나노세공을 통한 하전된 담체의 유동의 제어를 위한 나노유체 장치가 개시되어 있다.

2005년 11월 24일 공개된 US 특허 출원 공개 2005/0260119 (Sunkara, et al.)에는 마이크로파 플라즈마 보조 화학적 기상 증착 방법을 사용하여 나노피펫으로 명명된 점점 가늘어지는 위스커 (tapered whisker) 형태의 관형 타소 나노구조를 합성하는 방법이 개시되어 있다.

2008년 10월 2일 공개된 US 20080237063 (Chen) (명칭: "Nanopore structured electrochemical biosensors")에는 글루코스의 직접 측정을 위해 나노세공 구조의 촉매 활성 시클로덱스트린이 부착된 바이오센서가 개시되어 있다.

문헌 [Choi et al., "Biosensing with conically shaped nanopores and nanotubes," Phys. Chem. Chem. Phys. 8:4976-4988 (2006)]에서는 트랙-에치 공정을 사용한 합성된 원뿔형 나노세공의 제조 및 특성결정을 논의하고 있다. 또한, 인가된 막횡단 전위 하에 상기 세공을 통해 유동하는 이온 전류를 정류할 수 있는 원뿔형 나노세공의 설계 및 기능이 개시되어 있다.

문헌 [Li et al., "Development of boronic acid grafted random copolymer sensing fluid for continuous glucose monitoring," Biomacromolecules 10(1):113-118 (2009)]에는 점도 기반 글루코스 감지를 위한 생체적합성 공중합체 폴리(아크릴아미드-ran-3-아크릴아미도페닐보론산) (PAA-ran-PAAPBA)이 개시되어 있다.

문헌 [Sun, Z.; Han, C; Wen, L.; Tian, D.; Li, H.; Jiang, L., pH gated glucose responsive biomimetic single nanochannels. Chem. Commun. (Cambridge, U.K.) (2012)]에는 페닐보론산 수용체로 공유 변형된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 내의 트랙-에칭된 원뿔형 나노채널이 기재되어 있다.

문헌 [Nguyen, Q.H.; Ali, M.; Neumann, R.; Ensinger, W., Saccharide/glycoprotein recognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid. Sensors and Actuators B: Chemical 2012, 162 (1), 216-222]에는 페닐보론산 수용체로 공유 변형된 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 내의 트랙-에칭된 원뿔형 나노채널이 기재되어 있다. 채널은 단당류 및 당단백질에 반응한다.

다음 간단한 요약은 본 발명의 모든 특징 및 측면을 포함하고 의도하지 않고, 또한 본 발명이 요약에서 논의되는 모든 특징 및 측면을 포함하여야 함을 의미하지 않는다.

본 발명은 특정 측면에서 샘플 내의 분석물을 검출하는 장치에서 사용하기 위한 나노피펫에 관한 것이고, 이것은 나노세공 개구부 (opening)로 이어지는 나노피펫의 내부 구멍 (bore)을 규정하는 모세관 부분; 내부에 전극을 함유하기에 적합하고 상기 나노세공을 통해 외부 용액과 소통하는 내부 용액을 함유하기에 적합한 상기 내부 구멍 (전극 입체형태에 대해서는, 예를 들어 구멍이 신장되고 개구부로 갈수록 가늘어지는 도 1을 참조한다); 및 상기 나노세공의 내부 표면 (일반적으로 석영)에 직접 결합되는 (즉, 접촉하는) 고분자 전해질을 포함하는, 상기 나노세공의 내부 표면 상의 코팅물; 및 이온 또는 소분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 분석물에 대한 결합에 특이적인, 상기 고분자 전해질에 연결되는 결합 분자를 포함한다.

본 발명의 특정 측면에서, 고분자 전해질에 연결되는 결합 분자는 글루코스 감지를 위한 보론산일 수 있고/있거나, 고분자 전해질은 다가양이온 (이에 의해 코팅물의 전하가 변경됨)일 수 있고/있거나, 고분자 전해질은 폴리알킬 피리딘 또는 폴리아민일 수 있다.

본 발명의 특정 측면에서, 고분자 전해질/감지 분자는 연장되고 나노세공을 부분적으로 차단하여 보다 많은 감지 분자를 샘플에 노출시키기 위해 나노세공에 적용된다.

본 발명의 특정 측면에서, 결합 분자는 중합체 또는 고분자 전해질 코팅물에 연결되는 킬레이팅제이다. 중합체 코팅물은 피펫 구멍과 이온 결합 중합체 사이에 고분자 전해질 층을 추가로 포함할 수 있다. 층은 코팅물의 형태일 수 있고, 바람직하게는 연속되어, 노출된 (bare) 석영을 덮는다. 몇몇 실시양태에서, 킬레이팅제는 다당류, 예를 들어 키토산, 선형 다당류인 이온 결합 중합체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 킬레이팅제는 폴리펩티드일 수 있다. 몇몇의 다른 실시양태에서, 코팅물은 당류 결합 분자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당류 결합 분자는 단백질, 예컨대 렉틴일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당류 결합 분자는 보론산 또는 보론산 에스테르를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 탄수화물 분자, 특히 시스-디올기를 갖는 탄수화물, 보다 특히, 글루코스를 감지하기 위한 나노피펫 장치를 포함한다. 이 장치는 나노세공을 보유하는 불활성 기판을 포함할 수 있고, 여기서 나노세공은 채널을 포함한다. 특정 측면에서, 채널은 석영 나노채널이다. 몇몇 측면에서, 불활성 기판은 채널을 통해 접근되는 내부 부분 및 샘플과 접촉하기 위한 외부 부분을 규정한다. 몇몇 측면에서, 나노세공은 채널 내에 중합체 코팅물을 추가로 포함하고, 상기 중합체은 탄수화물-결합 분자 ("CBM", 예컨대 보론산)에 연결된다. 몇몇 측면에서, 나노세공은 상기 CBM에 연결된 중합체를 추가로 포함하고, 여기서 CBM은 채널 내에 반투과성 매트릭스를 형성하기 위해서 중합체 내에 함침된다.

장치는 나노세공에서의 이온 조건에 의한 이온 전류 정류가 글루코스 분석물의 결합에 의해 조정되는 측정 회로를 사용하여 작동된다. 바람직한 실시양태에서, 당류의 중합체-연결된 보론산에 대한 결합은 이온 정류의 역전 (reversal)을 야기한다. 따라서, 장치는 채널을 통한 전류를 생성하고 채널을 통한 전류 유동의 변화를 측정하기 위한 전자 회로를 포함할 수 있고, 여기서 상기 샘플 내의 탄수화물 분자는 상기 CBM에 결합하여, 샘플 내의 탄수화물 존재를 나타내는 전류 유동의 측정된 변화를 유발한다.

몇몇 측면에서, 본 발명은 내부 전극을 갖는 나노피펫, 내부 용액을 보유하기 위한 구멍, 외부 용액에 대한 용기, 및 외부 용액과 접촉하기 적합하고 접촉하도록 위치하는, 내부 전극과 외부 전극 사이의 측정 회로를 포함하는 나노피펫 측정 회로를 포함하고, 여기서 측정 회로는 외부 전극에 대한 상기 내부 전극의 가역적인 전압 차이를 전달하기 위한 증폭기를 포함하고, 구멍과 외부 용액 사이의 전류를 측정하기 위한 검출기를 추가로 포함한다.

본 발명의 특정 측면은 나노피펫의 내부와 외부 용액 사이에 나노세공을 갖는 나노피펫의 내부의 용액에, 전하를 갖는 적어도 하나의 제1 이온을 제공하는 단계; 외부 용액에 제2 이온 종을 제공하는 단계; 및 나노피펫의 내부의 용액 내의 전하를 갖는 하나의 이온에, 반대 전하의 나노세공을 가로질러 전압을 인가하고, 상기 전압은 상기 이온 종이 나노세공으로 이동하여 상기 제2 이온과 반응하여 상기 이온성 화합물을 형성하기에 충분한 것인 단계를 포함하는, 용액, 즉 나노 규모 반응기에서 2개의 상이한 이온을 조합함으로써 이온성 화합물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 이온성 화합물의 형성을 나타내는 전류의 변화는 진동일 수 있다.

특정 측면에서, 본 방법은 나노세공을 통한 이온 전류를 측정하는 단계 및 이온성 화합물의 형성을 나타내는 전류의 변화를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 이온성 화합물은 불용성이다. 방법은 침전물이 형성된 후에 전압을 역전시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

제1 또는 제2 이온은 음이온과 반응하여 이온성 화합물을 형성하는 금속 이온일 수 있다. 금속은 전이 금속일 수 있다. 금속 이온은 Mg^{2 +}, Ca^{2 +}, Mn^{2 +}, Zn²⁺, Cu²⁺, Fe^{2 +}, Fe^{3 +}, Cr^{3 +}, Cr^{6 +}, Cd^{2 +}, Mo^{2 +}, Co^{3 +}, Co^{2 +}, Hg^{2 +}, Ni^{2 +}, Al^{3 +}, Al^{2 +}, Ar^{3 +}, Ar^{3 -} 및 Pb^{2 +}로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 음이온은 포스페이트, 클로라이드, 술페이트, 모노포스페이트, 피로포스페이트, 메타포스페이트, 트리폴리포스페이트, 테트라메타포스페이트, 및 오르토포스페이트로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 음이온은 글루코네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 말로네이트, 말레이트, 락테이트, 시트레이트, EDTA, 시트라코네이트, 시트라말레이트, 스테아레이트, 올레에이트, 라우레이트, 옥토에이트 아스코르베이트, 피콜리네이트, 및 오로테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 유기 카르복실산 음이온으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 몇몇의 다른 실시양태에서, 음이온은 단백질일 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명은 나노피펫의 내부와 외부 용액 사이에 나노세공을 갖는 나노피펫의 내부의 용액에, 전하를 갖는 적어도 하나의 제1 이온을 제공하는 단계; 및 반대 전하의 나노세공을 가로질러 전압을 상기 제1 이온에 인가하고, 상기 전압은 나노세공을 가로지른 이온의 이동을 유발하기에 충분한 것인 단계를 포함하는, 나노피펫 내부로부터 이온을 외부 용액 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 전기화학적 배치 및 팁 근처의 나노피펫의 내부 부근의 구리 이온에 특이적으로 결합하기 위해 관능화된 센서 상의 구리 이온의 가역적인 결합의 개략도이다.
도 2는 나노세공에서 침전물의 형성이 이온 전류의 측정가능한 차단을 야기하는, 도 1에서의 전기화학적 구성의 개략도이다.
도 3은 조 내의 2 마이크로몰 염화아연 및 -350 mV의 전위를 사용하여 침전 측정에 사용된 나노피펫 배치에서 전류 진동을 보여주는 그래프. 삽입도: 개방 상태 중의 하나의 확대도.
도 4는 도 1에서 (108)에 제시된 바와 같이 적용되는 이온-결합 표면 변형 (칼모듈린/PAA/PLL)으로부터 얻은 데이타를 보여주는 IV 도표이고, 나노피펫 바이오센서의 이온 감수성을 보여준다. 실선-노출된 피펫; 파선-PAA2; 삼각형-CaM.
도 5a는 센서 CaM-1의 표면에 대한 정류 계수를 보여주는 그래프이다.
도 5b는 도 5a의 센서의 전류 트레이스 (current trace)이다.
도 6은 노출된 나노피펫 (삼각형) 및 키토산/PAA 개선된 나노피펫 센서 (원)의 pH 반응을 보여주는 그래프이다.
도 7은 정류 계수의 변동 vs pH 3 및 7에서 침적된 키토산/PAA 층의 수를 보여주는 그래프이다.
도 8은 노출된 나노피펫 (삼각형) 및 키토산/PAA 센서 (원)의 pH 반응을 보여주는 그래프이다.
도 9는 0.1 M KCl, 10 mM 포스페이트 완충제 용액 내에서 키토산을 사용한 센서의 관능화의 효과를 나타내는, 상이한 조건 하에서 이온 전류를 보여주는 그래프이다.
도 10은 센서의 재활용 후에 정류 계수의 변동을 보여주는 그래프이다. Cu²⁺ 농도: 100 μM. 센서는 센서를 pH3 용액에 60초 동안 침지함으로써 재생하였다.
도 11은 0.1 M KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7 내의 다양한 농도의 Cu^{2 +}에 대한 센서의 반응을 보여주는 트레이스이다. 1/I_n과 l/C_구리 사이의 선형 피트 (fit) (제시되지 않음)를 계산하였다 (R=0.997). 이온 전류는 나노피펫 배럴 (barrel) 내의 전극에 인가된 -500 mV의 전위에서 결정하였다.
도 12는 구리 이온과 나노피펫의 상호작용에 대한 전기영동의 역할을 보여주는 그림이다.
도 13은 출력 전류를 보여주는 트레이스이고, 화살표는 Cu^{2 +} 이온 (150 μM의 용액 최종 농도)의 첨가를 나타낸다. 양 전압 인가 동안에는 어떠한 변화도 검출되지 않지만, 음 전위로 전환시에 즉각적인 반응이 발생하여 다음 양 전압 단계에서 변동을 야기한다.
도 14는 나노피펫의 팁에서 나노세공으로부터 침전물의 제거에 의한 이온 전류의 진동을 보여주는 그림이다.
도 15a는 포스페이트 완충제 (pH 7)로 충전되고 2 마이크로몰 염화아연이 존재하는 Tris-HCl 완충제 (pH 7)의 존에 침지된 피펫에 음 전위를 인가할 때의 진동 그래프이다.
도 15b는 고 및 저 전도도의 상태에서 도 15a로부터의 이벤트를 보여주는 막대그래프이다.
도 16은 나노피펫의 변형을 위한 양이온성 고분자 전해질의 합성을 보여주는 그림이다. 다가양이온은 알킬 골격 상에 피리딜 단위를 반복함으로써 제시된다.
도 17은 보론산을 사용한 석영 표면 (172)의 직접적 2 단계 관능화를 보여주는 개략도이다.
도 18a, 18b 및 18c는 나노세공의 단면도를 보여주고 수용체를 나노세공에 고정하기 위한 3가지 방법을 보여주는 일련의 도면이다. 도 18a는 수용체의 나노세공 벽에 대한 직접 공유 부착을 보여준다. 도 18b는 기능적 중합체의 세공 벽에 대한 흡착을 보여주고, 여기서 수용체는 중합체에 연결된다. 도 18c는 세공 내의 3차원 기능적 매트릭스의 고정을 보여주고, 여기서 중합체 상의 수용체는 나노세공을 가로질러 그물-유사 망상 구조를 형성하고, 즉, 코팅물은 상기 나노세공 내로 연장되고 이를 부분적으로 차단한다.
도 19a, 19b 및 19c는 대조군 및 pH 7 포스페이트 완충제 내의 글루코스 (3 mM)로 관능화된 피펫의 반응을 보여주는 그래프이다. 피펫은 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 이어서 m-브로모메틸페닐보론산으로 관능화되었다. 삽입도: +500 및 -500 mV에서 이온 전류로부터 계산된 정류 계수. 도 19a는 비변형된 피펫의 이온 전류 반응을 보여주는 그래프이고; 도 19b는 보론산-변형된 피펫의 이온 전류 반응을 보여주는 그래프이고, 도 19c는 도 19a 및 b에 제시된 피펫 시스템의 정류를 보여주는 그래프이다.
도 20은 단당류의 존재 하에 PVP-BA의 침전을 보여주는 막대 그래프이다. pH 2의 메탄올/물 내의 PVP-BA의 교반 용액을 침전이 일어날 때까지 수산화나트륨으로 적정하였다. 오차 막대는 3개의 별개의 실험으로부터의 표준 편차를 보여준다.
도 21은 1 마이크로몰 중합체 농도의 중합체 PVP-BA 및 PVP-Bn의 존재 하에 ARS의 흡광도 변화를 보여주는 그래프이다. 염료 용액은 1:1 메탄올/물 내의 0.25 mM이다.
도 22는 ARS의 존재 하에 이온 투과성의 조정을 보여주는 IV 도표이다. 중합체 PVP-BA로 함침된 나노피펫을 0, 60, 또는 360 μM ARS를 함유하는 pH 9.5 카르보네이트 완충제 내에 침지하였다. 오차 막대는 반복된 전압 램프 (ramp) (N=5)로부터의 표준 편차를 보여준다.
도 23은 프룩토스를 사용한 이온 전류 정류의 반전 (inversion)을 보여주는 그래프이다. 10 mM 프룩토스를 사용하지 않거나 사용하면서 pH 9.5에서 PVP-BA-함침된 나노채널에 대한 전류-전압 곡선.
도 24는 프룩토스를 사용하거나 사용하지 않으면서 -0.5 V에서 측정된 이온 전류 조정의 순차적인 사이클을 보여주는 그래프이다. 오차 막대는 반복된 전압 스캔 (N=5)으로부터의 표준 편차를 보여준다. 평형 시간은 각각의 조건에서 5분이었다.
도 25는 3개의 별개의 나노피펫 센서에 대한 가역적인 이온 전류 정류 값을 보여주는 그래프이다. 센서를 프룩토스 (10 mM)를 사용하거나 사용하지 않으면서 카르보네이트 완충제 (pH 9.5) 내에 침지하였다. 완충제 내의 센서 S1에 대한 양의 정류는 (254)에 제시된다. 프룩토스 내의 센서 S1에 대한 음의 정류는 (252)에 제시된다.
도 26은 용액-상 형광 검정에서 PVP-BA를 사용한 프룩토스에 대한 결합 등온선을 보여주는 선 그래프이다.
도 27은 변형된 원뿔형 나노채널을 사용한 전기화학적 방법을 사용하여 도 26에 제시된 데이타의 그래프이다. 도 26 및 27은 25% 메탄올과 함께 pH 9.5 카르보네이트 완충제 내에 PVP-BA (0.003% w/v) 및 HPTS (1.5 μM)를 함유하는 프로브 용액 내로의 프룩토스의 적정에 의해 생성하였다. 오차 막대는 3개의 별개의 적정으로부터의 표준 편차를 보여준다. 그래프 B는 카르보네이트 완충제 내의 프룩토스의 농도를 증가시키면서 PVP-BA로 함침된 원뿔형 나노채널에 대한 전위 -500 mV에서의 이온 전류를 보여준다. 오차 막대는 5회의 순차적인 전압 스캔으로부터의 표준 편차를 보여준다. 데이타 점은 실험 섹션에서 설명되는 바와 같이 결합 등온선에 피팅되었다.

개요

본 발명은 전기화학적 센서에 포함되는 나노세공 장치, 즉, 나노피펫에 관한 것이다. 장치는 제1 전극을 함유하는 내부 영역을 포함하고 또 다른 전극을 포함하는 외부 용액과 접촉하도록 설정된다. 이들 전극은 나노세공에서 발생하는 현상이 검출 및 측정될 수 있는 감지 회로에 연결된다. 바람직한 실시양태에서, 나노세공은 예를 들어 동일한 양수인의 상기 언급된 US 2010/0072080에 설명된 나노피펫의 일부이다. 용어 "나노"는 구멍, 및 수반 부품, 예컨대 내부 전극 (직경이 약 <200 nm임) 내의 치수를 나타낸다. 이 치수는 아래에서 상세하게 설명되는 전기화학적 거동의 생성에 중요하다.

본 발명은 추가로 작은 이온, 예컨대 H⁺ 및 금속 양이온, 및 디올 (아래에서 논의됨)에 결합하고 결합을 검출할 수 있는 가역적인 이온 센서에 관한 것이다. 가역적인 센서는 센서 공동 (cavity) (즉, 나노피펫 구멍) 내의 극성의 역전의 측면에서, 및 중요하게는 이온이 가역적인 방식으로 나노세공에 결합한다는 점에서 가역적이다. 본 발명의 장치는 센서 내의 이온을 센서 나노세공 밖으로 이동하도록 유도하기 위해 사용될 수 있고, 센서는 바람직하게는 나노피펫의 형태이다. 피펫 내의 이온의 결합은 결합된 이온이 없는 용액에 피펫 팁을 침지함으로써 역전될 수 있다. 또한, 작은 이온의 결합은 상태, 예컨대 용액 내의 pH를 변경함으로써 해제될 수 있다. 본 발명은 또한 나노피펫을 기반으로 한 가역적인 이온 이동 장치에 관한 것이다. 상기 이온 이동은 외부 용액에 비해 나노피펫 내의 전압 전위의 변화에 의해 유도될 수 있다. 이온 이동은 외부 용액 내의 과량의 이온을 생성하기 위해 나노피펫 구멍으로부터 이온의 이동에 의해 야기되는 침전을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 침전은 나노피펫의 나노세공 팁 근처에서 발생하고, 팁에서 나노세공을 통한 전류 진동의 변화에 의해 초기에 검출될 수 있다. 침전은 내부 용액과 외부 용액 사이의 인가된 전압 전위에 의해 유도된 나노세공 팁을 통한 이온 전류의 변화를 야기한다. 작은 이온 농도 및 작은 침전물 크기에서 검출되는 침전은 다양한 시스템에 적용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 결정 형성은 소량의 단백질을 사용하여 검출될 수 있다.

본 센서 기술은 관능화된 나노피펫의 팁에서 결합 이벤트를 무표지 방식으로 변환할 수 있는 간단한 전기화학적 판독을 기초로 한다. 나노피펫 팁의 고 임피던스는 장치의 감수성을 제한하여, 팁 오리피스 (orifice)의 치수 및 구조를 센서 성능에 중요하게 만든다. 또한, 본 센서 기술은 고 공간 해상도를 갖는 센서를 제조하기 위해 압전작동기 (piezoactuator)와 쉽게 통합될 수 있다. 나노피펫이 표면에 접근하면서, 피펫을 통한 이온 전류는 주사 이온 전도도 현미경 검사 (SICM)에서 매우 유용하게 이용되는 잘 공지된 효과인 "전류 스퀴징 (current squeezing)" 때문에 감소할 것이다. 감지 이외에, 나노피펫 기반 플랫폼은 단일 세포 내의 분자의 제어된 전달에 대해 단일-분자 생물물리학을 조사하고, 나노 규모에서 세포를 영상화하기 위해 사용되어 왔다.

특정 실시양태에서, 본 장치는 고체 상태 나노세공에서 침전을 사용하여 전류 진동을 유도 및/또는 측정하기 위한 새로운 메카니즘을 제공한다. 이 기술은 나노피펫의 팁에서 두 용액의 계면으로 이온 이동을 능동적으로 유도하기 위해 사용될 수 있다. 세공은 역치 전위에서만 차단되기 때문에, 반응은 일시적으로 및 공간적으로 제어될 수 있다. 상기 침전은 다양한 이온을 사용하여 수행될 수 있다. 염 침전의 운동학을 나노 규모로 제어하고 측정하는 상기 능력 때문에, 동역학적 과정, 예컨대 생물 무기화 (biomineralization) 및 용해 연구를 위한 새로운 기술을 실시할 수 있다. 전압 진동에 의한 나노반응기 (nanoreactor) 내의 침전물의 포획은 나노입자의 크기 및 표면 전하 연구를 위한 추가의 도구이다. 또한, 불용성 염의 제어된 나노침전은 선택적 및 감수성 이온 센서 개발에 유용하다. 아래에서 설명되는 반응은 2 마이크로몰의 매우 낮은 농도의 염을 검출할 수 있고, 다른 양이온의 존재에 의해 영향받지 않았다. 예를 들어, 낮은 농도 (2 μM 이하)의 황산아연 염이 검출되었고, 다른 양이온, 예컨대 칼륨 또는 마그네슘의 존재에 의해 영향받지 않았다. 또한, 침전에 의해 차단된 나노세공이 진동하는 전위를 통해 개방되는 능력은 나노세공을 사용한 감지의 응용범위를 확장할 수 있다. 예를 들어, 일정한 전압은 나노침전물을 검출하기 위해 사용될 수 있는 반면에, 진동하는 전위는 다른 감지 용도를 위해 이온 전류를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 다양한 단백질 결정 형성 방법에 사용될 수 있다. 상이한 결정 형성 방법은 보통 단백질 용해도의 점진적인 감소를 통해 단백질 용액을 과포화 상태로 만들기 위해 사용될 수 있다. 단백질 결정 형성에서 단백질 용해도를 감소시키기 위한 가장 통사적인 방법은 침전제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 및 황산암모늄의 첨가에 의한 것이다. 침전제는 예를 들어 증기 확산 방법을 사용하여 그의 농도가 증가될 때 물에 결합한다. 그 결과, 단백질에 이용가능한 용매의 양은 감소하고, 이것은 본질적으로 단백질의 농도가 증가함을 의미한다. 특정 유효 단백질 농도에서, 단백질은 침전하기 시작하여, 조건이 적정할 경우 결정을 생성할 것이다. 맞는 pH, 이온 강도, 온도, 단백질 농도, 다양한 염, 리간드 또는 첨가제의 존재, 침전제의 종류 및 실제 결정 형성 방법 (현적 (hanging drop), 시팅 드롭 (sitting drop), 투석 등)의 조합을 포함하는 적정한 결정 형성 조건은 실질적으로 미리 예측하는 것이 불가능하고; 따라서, 상이한 조건을 사용한 결정 형성 스크리닝이 개발되었다. 본 장치는 상이한 단백질 결정화 조건의 효과를 시험하기 위해서 많은 병렬 실험에서 사용될 수 있다.

본 방법의 또 다른 용도는 분석적 이온 감지 분야이다. 처음인 것으로 생각되는, 화학적으로 관능화된 고체 상태 나노세공의 분석 용도가 이온 감지에 대해 제시된다. 인가된 전압의 주파수 및 파형은 신호-대-노이즈 비를 최대화하도록 조정될 수 있음이 밝혀졌고, 이것은 인가된 전압이 센서에 대한 Cu^{2 +} 결합을 촉발할 수 있음을 보여준다. 일시적으로 및 공간적으로 분자의 결합을 유도하는 능력은 분석물-수용체 상호작용의 열역학적 및 운동학적 특성을 연구할 수 있는 정밀한 생물감지 장치의 개발을 허용한다.

본원에 개시된 바이오센서는 정류성 나노세공에서 선택적 및 가역적인 결합을 보여준다. 상기 종류의 가역적인 센서는 ICR-기반 센서에 통일된 세공 구조의 나노세공에 제조와 연관된 문제를 극복한다. 고분자 전해질 층 증착의 모니터링은 ICR이 가장 감수성인 세공에 추가의 화학적 변형이 위치함을 효과적으로 보장한다. 고분자 전해질이 얼마나 멀리 세공 내로 침투하는지 결정하고 벌크 용액과 외부 나노피펫 세공의 계면에서의 상호작용을 추가로 조사하기 위해, 추가의 실험 및 이론적 모델링, 및 나노세공 표면의 특성 결정을 위한 발전된 방법이 필요할 것이다. 상기 분야의 발전은 나노세공 센서의 분석 도구로서의 사용을 촉진할 것이다. 본원에서 설명되는 바와 같은 가역적인 나노피펫 센서는 수질, 나노 규모의 이온 농도의 공간 해상도 (기능적 맵핑 (functional mapping)) 또는 특정 분석물의 연속적인 세포내 측정을 모니터링을 위해 사용될 수 있다.

본 장치는 당뇨병 위험이 있는 대상체가 필요로 할 수 있는 글루코스 감지를 위해 변형된다. 이 장치는 글루코스 모니터링을 필요로 하는 대상체로부터의 전혈 또는 심지어 상기 대상체 내의 전혈에 적용될 수 있는 휴대용 장치로서 제조될 수 있다. 즉, 예를 들어 석영 나노피펫 팁은 진피 근처의 체액 내의 글루코스와 접촉하기 위해 피부를 투과할 수 있다.

본 글루코스-감지 장치는 바람직하게는 팁 (나노세공)에서 또는 그 근처에서 나노피펫의 내부 표면에 적용된 수용체, 예컨대 보론산 (당류에 대한 수용체) 및 혼합물에 결합된 중합체를 사용한다. 당류-결합 중합체 혼합물은 가장 바람직하게는 다음 특성을 갖는다: 1) 중합체는 음하전된 세공 벽과의 상호작용을 증가시키기 위해 양하전된다. 2) 중합체는 각각의 양 전하에 대해 약 하나의 보론산을 가져서, 보로네이트 형태로의 전환에 대한 중합체의 중화를 야기할 것이다. 3) 중합체는 유기 용매 내에서 가용성이지만, 수성 매질 내에서는 불용성이어서, 중합체는 나노피펫의 팁에 포획될 수 있다. 4) 중합체에 의해 형성된 불용성 매트릭스는 물, 이온, 및 분석물에 투과성이다. 5) 센서에서 신호 조정을 역전시키기 위해 용매 또는 매질의 변화는 요구되지 않아야 한다.

투과성 매트릭스 방법은 단지 세공 벽보다는 나노세공의 전체 부피가 수용체를 함유하기 때문에 다른 나노세공 관능화 방법보다 우수한 것으로 생각된다. 중합체-결합 수용체 (예를 들어 보론산)는 나노세공을 통해 이동하는 이온과 보다 큰 상호작용을 갖고, 따라서 분석물의 존재 하에 보다 높은 신호 조정을 제시할 것이다. 또한, 많은 중합체는 분석물 결합시에 입체형태의 변화를 겪고, 이것은 이온 전류 조정을 보다 향상시킬 수 있다. 마지막으로, 분석물은 전기장에 의해 세공을 통해 이동할 필요는 없고, 오히려 중합체 매트릭스를 통한 분석물의 수동 확산이 전기 신호를 조정할 것임에 유의하는 것이 중요하다. 상기 특징은 고정된 중합체 망상 구조를 수용체의 공유 부착 또는 관능화된 중합체의 층-대-층 증착으로부터 구별한다. 폴리-(4-비닐피리딘) (PVP)을 기재로 한 시스템은 아래에서 설명되는 바와 같이 선택되었다.

아래에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 기능적 다가양이온 함유 보론산 글루코스 수용체가 석영 나노채널에 함침된 나노피펫 장치를 제조하였다. 보론산을 사용하여 나노채널의 벽 (즉, 나노세공)을 직접 변형하기 위한 이전의 노력은 당류에 대한 크지 않은 반응을 유발하였지만, 이온 전류에 대한 훨씬 더 큰 제어를 제공하여야 하는 보론산-기반 수용체의 몇몇 측면이 존재한다. 먼저, 보론산의 탄수화물에 대한 결합은 완전히 가역적이고, 나노채널에도 그러하다는 증거는 존재하지 않는다. 보다 중요하게는, 보론산은 중성 탄수화물의 존재 하에 정전하의 변화를 겪지 않을 수 있고 - 이 변화는 나노세공 내의 전류 정류에 극적인 영향을 주어야 한다. 가공된 나노채널에 대해 상기 특성을 이용하기 위해서, 폴리(4-비닐피리딘)을 기재로 한 양이온성 중합체가 보론산 수용체 매트릭스로서 선택되었다 (도 26). 중합체의 알킬화는 모든 양 전하에 대해 정확히 하나의 보론산을 생성한다. 양이온성 중합체는 정전기 상호작용을 기초로 하여 석영 나노피펫에 고정될 수 있고, 상기 상호작용은 전류 정류를 기초로 하여 모니터링할 수 있다.

본원에서 사용되는 보론산은 당류에 결합하는 그의 능력이 인정된 간단한 인공적인 수용체이다. 센서 및 작동기 제조에 이용될 수 있는 보론산의 몇몇의 특성이 존재한다. 1,2-디올 (예를 들어 1,2 디히드록시 벤젠, 에틸렌 글리콜)에 결합시에, 보론산의 루이스 (Lewis) 산도가 증가한다. 예를 들어, 페닐보론산은 음하전된 보론 종과 평형시에 카테콜 (1,2 벤젠디올)과 복합체를 형성한다 (문헌 [Artificial Receptors for Chemical Sensors, edited by Vladimir M. Mirsky, Anatoly Yatsimirsky, Wiley-CH, Chapter 6 (2011)] 참조). 따라서, pK_a가 완충 매질의 pH보다 더 낮은 값으로 이동하면, 탄수화물의 결합은 보론산을 음이온성 보로네이트 에스테르로 전환한다. 보론산을 사용하는 현재까지 보고된 많은 프로브 및 센서는 형광-기반이다. 그러나, 보론산의 다능성 (versatility) 때문에, 상기 수용체도 탄수화물 분리, 중합성 물질의 팽윤을 기초로 한 광 센서, 및 전기화학적 센서에 사용되어 왔다. 중성 당류에 대한 결합이 보론산의 전하 변화를 초래할 수 있다는 사실 때문에, 상기 수용체는 반응성 나노유체 다이오드의 가공을 위한 우수한 후보가 되었다.

나노채널 내의 변형된 나노세공은 중합체의 양이온성 전하로부터 발생한 강한 전류 정류를 보였고, 상기 정류는 중성 탄수화물의 존재 하에 반전될 수 있다. 나노채널은 밀리몰 농도의 프룩토스 사용시에 가역적인 거동을 보였다. 용액 내에서 중합체의 특성 결정 능력은 보론산과 1,2-디올의 상호작용, 및 정전하 둘 모두에 의존적인 결합 방식을 보여주었다. 변형된 나노채널은 특히 음이온성 카테콜-함유 염료인 알리자린-레드 술포네이트 (ARS)에 대한 높은 감수성을 보였고, 단지 60 μM 염료의 사용시에 전류 정류가 취소되었다. 중요한 사실은, 이온 투과성의 조정이 이온 전도도의 차단에 의존하는 것이 아니라, 정전하의 결과로서 전류 정류의 극성의 변화에 의존한다는 점이다. 본원에 따르면, 나노채널을 통한 이온 유동의 조정을 위한, 전압과 무관한 새로운 기술을 실시할 수 있다.

정의

달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명되는 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 바람직한 방법 및 물질이 설명된다. 일반적으로, 세포 및 분자 생물학 및 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 구체적으로 규정되지 않은 특정 실험 기술은 일반적으로 당업계에 공지되고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에서 설명되는 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행된다. 명료함을 위해, 다음 용어를 아래에서 규정한다.

용어 "이온"은 전자의 총수가 양성자의 총수와 동일하지 않아서 순 양 또는 음 전하를 제시하는 원자 또는 분자를 의미한다. 이 용어는 구체적으로 이온이 단일 원자로 이루어진 원자성 또는 단원자 이온, 및 소분자의 다원자 이온을 의미한다.

용어 "소분자"는 분자량이 약 1,000 원자 질량 단위, 또는, 몇몇 실시양태에서 200 amu 미만인 화합물을 의미한다. 소분자는 크기 범위를 초과하는 다중 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하지 않지만, 일반적으로 세포에서 발견되는 다른 소분자를 포함한다. 예를 들어, 아데닌은 약 135 amu이고; 글루코스는 약 180 amu이고; 우레아는 약 60 amu이고; 크레아티닌은 약 113 amu이다.

용어 "나노피펫"은 나노 규모의 원뿔형 팁 개구부, 즉, 0.05 nm 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 (+ 또는 -20%) 50 nm 또는 약 80 nm 또는 약 100 nm의 팁 개구부를 갖는 나노세공을 갖는 중공의 (hollow) 자가지지성, 불활성, 비-생물학적 구조를 의미한다. 중공 구조는 예를 들어 유리 또는 석영이고, 팁 개구부를 통과하는 유체를 그 내부에 보유하기에 적합하다. 나노피펫의 내부는 분석물의 비특이적 결합을 최소화하도록 선택되거나 변형된다. 나노피펫의 내부는 일반적으로 석영 또는 다른 생물학적 불활성 물질의 단일 층의 균일한 벽 두께를 갖는 연장된 원뿔의 형태이고, 나노피펫 내의 용액과 접촉하는 전극의 삽입을 허용하는 크기이다. 본원에서 사용되는 나노피펫은 일반적으로 하나의 구멍을 갖지만, 이중 구멍 모세관을 잡아당김으로써 다수의 동심 구멍을 갖는 나노피펫이 제조될 수 있다. 외경은 일반적으로 팁 영역에서 약 1 ㎛ 미만이다.

용어 "나노세공"은 전기적 절연 막 내의 작은 구멍, 바람직하게는 설명된 바와 같은 나노피펫의 팁을 의미한다. 나노세공은 나노세공에 인접한 나노피펫 구멍의 마지막 수 mm인 팁 영역에 존재할 것이다. 아래에서 설명되는 바와 같은 나노세공은 소분자 복합체가 이온 및 분자의 나노세공을 통한 이동에 영향을 주도록 하는 크기이다. 나노세공은 전압이 막을 가로질러 인가될 때 나노세공을 통과하는 이온 전류를 모니터링하는 장치에서 기능하도록 설계된다. 나노세공은 나노피펫 본체에 의해 형성되는 채널 영역을 가질 것이고, 바람직하게는 점점 가늘어지는, 예를 들어 원뿔대형 (frusto-conical) 입체형태일 것이다. 아래에서 설명되는 바와 같이 석영 모세관을 잡아당김으로써, 재현가능하고 규정된 나노세공 형태를 얻을 수 있다.

용어 "전류 정류"는 하전된 나노세공이 비대칭적 전류 출력을 갖는 대칭적 입력 전압에 반응할 때의 효과를 의미한다. 확산 전기 이중층 두께가 세공 크기와 대등할 때, 나노세공 표면 상의 고정된 하전된 종과 용액 내의 이온 종 사이의 정전기 상호작용은 나노피펫 투과선택성 (permselectivity)을 변경한다. 정류 계수 (r)는 특정 양 전압에서 측정된 전류와, 동일하지만 반대 극성을 갖는 전압에서 측정된 전류 사이의 비의 대수, 즉, r=Log₁₀ I+/I-로서 규정된다.

상기 계수는 나노피펫의 정류 특성 및 따라서 센서 표면 상의 고정된 전하의 유용한 표시자이다. 음하전된 석영 나노세공은 음성 전류 정류 (r < 0)를 보인다. 정류는 하전된 기능성 층, 예컨대 폴리-L-라이신, 덴드리머, 아미노실란 및 키토산으로 나노세공 표면을 변형시킴으로써 반전될 수 있다 (r > 0).

용어 "나노피펫 장치"는 전류 검출 회로에 작동가능하게 연결되고 나노피펫 및 임의의 참조 전극과 접촉하는 샘플 유체의 수용에 적합한 나노피펫을 의미한다.

용어 "전류 검출 회로"는 전류 및/또는 전압을 검출하고, 이를 예컨대 본원에서 설명되는 나노피펫 및 참조 전극에 연결된 회로에 적용하기 위한 장치를 의미한다. 회로는 10-10000 피코암페어의 기준선 전류를 기초로 하여 약 1-100, 10-100 또는 1-10 피코암페어의 전류의 변화를 검출하기 위한 임의의 감수성 장치를 포함할 수 있다. 이 용어는 시간 반응성이고 상대적으로 온도 독립적이거나 또는 온도 변화의 보상을 허용하는 회로를 추가로 의미한다. 이것은 기지 전압이 공급되는 입력부를 회로에 가져야 한다. 감수성 검출 회로는 알려져 있고, 전압 클램프 증폭기 및 트랜스임피던스 (transimpedance) 증폭기를 포함한다. 용어 "전압 클램프"는 본원에서 가변 커맨드 (command) 전압에 연결된 한 입력부, 측정된 전압에 연결된 또 다른 입력부, 및 피드백 (feedback) 회로를 갖는 차동 증폭기를 이용하는 회로를 의미한다. 전압 클램프는 커맨드 전압에서 시스템을 유지하기 위해 음성 피드백, 이 경우에 예정된 교번 (alternating) 신호, 예컨대 신호 생성기로부터의 교번 전압 신호를 이용한다. 출력 전류는 입력 전압의 변화를 따르고, 전류의 작은 변화가 검추될 수 있다.

용어 "석영"은 나노피펫 재질이 결정질 석영보다 덜 비싼 용융 실리카 또는 무정형 석영임을 의미한다. 그러나, 결정질 석영이 사용될 수 있다. 세라믹 및 유리 세라믹 및 보로실리케이트 유리도 사용될 수 있지만, 정확도는 석영만큼 좋지 않다. 용어 "석영"은 특수 물질 및 적용가능한 세라믹, 유리 세라믹 또는 보로실리케이트 유리를 포함하는 것으로 의도되고 규정된다. 다양한 종류의 유리 또는 석영이 본 나노피펫 제작에 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 1차적인 고려사항은 좁은 직경의 개구부로 길게 늘여지는 물질의 능력이다. 바람직한 나노피펫 물질은 본질적으로 다양한 종류의 유리 및 석영의 형태에 포함되는 이산화규소로 이루어진다. 용융 석영 및 용융 실리카는 주로 실리카를 무정형 (비-결정) 형태로 함유하는 유리의 종류이다.

용어 "전해질"은 전해질 고체, 즉, 유리 이온을 함유하는 물질을 의미한다. 전형적인 이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 클로라이드, 포스페이트 및 비카르보네이트를 포함한다. 다른 이온 종이 사용될 수 있다. 물질은 용액 내의 분석물을 함유하는 샘플 및 이온을 포함할 것이기 때문에 일반적으로 액체일 것이다. 샘플 자체가 전해질, 예컨대 인간 혈장 또는 다른 체액, 물 샘플 등일 수 있다. 전해질은 이온 전류를 보유하여야 하고; 약 10-100 mM, 바람직하게는 약 100 mM의 양성 및 음성 이온 종이 상기 기능에 필요한 것으로 생각된다. 본 발명의 장치는 나노피펫 내부 및 샘플 물질에 동일하거나 상이한 전해질을 사용할 수 있다.

용어 "고분자 전해질"은 그의 통상적인 의미, 즉, 그의 반복 단위가 전해질기를 보유하는 중합체로 본원에서 사용된다. 상기 기는 수용액 (물) 내에서 해리되어 중합체를 하전된 상태로 만들 것이다. 고분자 전해질 특성은 따라서 전해질 (염) 및 중합체 (고 분자량 화합물) 둘 모두와 유사하고, 때로 다중염으로 불린다. 염처럼, 그의 용액은 전기 전도성이다. 중합체처럼, 그의 용액은 종종 점성이다. 통상적으로 연질 물질 시스템에 존재하는 하전된 분자 사슬은 다양한 분자 회합체의 구조, 안정성 및 상호작용에서 근본적인 기능을 수행한다. 고분자 전해질은 하전된 관능기를 함유하는 생물학적 중합체 및 합성 중합체를 포함한다. 생물학적 기원의 고분자 전해질의 예는 올리고뉴클레오티드, 핵산, 단백질, 펩티드, 펙틴과 같은 다당류, 카라기난, 알기네이트, 및 키토산을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 합성 중합체의 예는 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리(나트륨 스티렌 술포네이트), 폴리아크릴산 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

고분자 전해질 상의 전하는 단량체 단위로부터 직접 유래될 수 있거나 또는 전구체 중합체에 대한 화학적 반응에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 폴리(디알릴디메틸염화암모늄) ("PDAD")은 양하전된 수용성 비닐 단량체인 디알릴디메틸염화암모늄의 중합에 의해 제조된다. 양하전된 공중합체 PDAD-코-PAC (즉, 폴리(디알릴디메틸염화암모늄) 및 폴리아크릴아미드 공중합체)는 디알릴디메틸염화암모늄 및 아크릴아미드 (중합체 내에서 중성으로 유지되는 중성 단량체)의 중합에 의해 제조된다. 폴리(스티렌술폰산)은 중성 폴리스티렌의 술폰화에 의해 제조될 수 있다. 또한, 폴리(스티렌술폰산)은 음하전된 스티렌 술포네이트 단량체의 중합에 의해 제조될 수 있다.

다가음이온을 포함하는 다양한 고분자 전해질가 본 발명에서 사용될 수 있다. 약한 다가음이온은 일반적으로 카르복실산 기를 포함하고, 강한 다가음이온은 일반적으로 술폰산 기, 포스폰산 기, 또는 술페이트 기를 포함한다. 음하전된 고분자 전해질의 예는 술포네이트 기 (-SO₃)를 포함하는 고분자 전해질, 예컨대 폴리(스티렌술폰산) ("PSS"), 폴리(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 술폰산) ("PAMPS"), 술폰화 폴리(에테르 에테르 케톤) ("SPEEK"), 술폰화 리그닌, 폴리(에틸렌술폰산), 폴리(메타크릴옥시에틸술폰산), 그의 염, 및 그의 공중합체; 폴리카르복실레이트, 예컨대 폴리(아크릴산) ("PAA") 및 폴리(메타크릴산); 및 술페이트, 예컨대 카라기닌을 포함한다. 다른 다가음이온은 HV-알긴산나트륨, 알긴산나트륨, 히알루론산나트륨, 헤파린 술페이트, 셀룰로스 술페이트, 카파 카라기난, 펜타나트륨 트리폴리포스페이트, 저에스테르화 펙틴 (폴리갈락투론산), 폴리글루탐산, 카르복시메틸셀룰로스, 콘드로이틴 술페이트-6, 콘드로이틴 술페이트-4, 및 콜라겐을 포함한다. 다가음이온의 분자량 및 전하 밀도는 화합물이 적합한 다가양이온과 고분자 전해질 복합체를 형성하도록 선택된다.

다가양이온인 다양한 고분자 전해질도 양이온성 중합체로서 사용될 수 있다. 예시적인 다가양이온은 폴리알킬렌 이민, 예컨대 폴리에틸렌 이민 ("PEI") 및 폴리프로필렌 이민을 포함한다. 다른 다가양이온은 폴리아민, 즉, 단량체 단위가 매달린 (pendant) 아민기를 갖는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 폴리아민, 폴리프로필렌 폴리아민, 폴리비닐아민, 폴리알릴아민, 폴리(비닐알콜/비닐아민), 키토산, 폴리라이신, 폴리믹신, 스페르민 염산염, 프로타민 술페이트, 폴리(메틸렌-코-구아니딘) 염산염, 폴리에틸렌이민-에톡실화된, 폴리에틸렌이민-에피클로르히드린 변형된, 4기화된 폴리아미드, 및 폴리디알릴디메틸 염화암모늄-코-아크릴아미드를 포함한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 키토산은 무작위로 분포된 β-(1-4)-연결된 D-글루코사민 (탈아세틸화된 단위) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (아세틸화된 단위)로 이루어진 선형 다당류이다.

양하전된 고분자 전해질의 다른 예는 4급 암모늄기, 예컨대 폴리(디알릴디메틸화암모늄) ("PDAD"), 폴리(비닐벤질트리메틸-암모늄) ("PVBTA"), 이오넨, 폴리(아크릴옥시에틸트리메틸 염화암모늄), 폴리(메타크릴옥시(2-히드록시)프로필트리메틸 염화암모늄), 및 그의 공중합체; 피리디늄 기를 포함하는 고분자 전해질, 예컨대, 폴리(N-메틸비닐피리딘) ("PMVP"), 다른 폴리(N-알킬비닐피리딘), 및 그의 공중합체; 및 양성자 부가된 폴리아민, 예컨대 폴리(알릴아민염산염) ("PAH")을 포함한다. 다가양이온의 분자량 및 전하 밀도는 화합물이 적합한 다가음이온과 고분자 전해질 복합체를 형성하도록 선택된다. 피리딜계 양이온성 중합체에 대한 추가의 설명은 예를 들어 US 4,384,075, "Cationic Alkenyl Azabenzenes and Rubber Modified Asphalts"에서 볼 수 있다. 아래에서 예시되는 폴리비닐피리미딘, 예컨대 폴리(4-비닐피리딘) (Mw ~60,000) 및 예를 들어 폴리(4-비닐피리딘-코-부틸 메타크릴레이트)도 양이온성 중합체로서 분명하게 규정된다. 임의의 몇몇 기가 피리딜계 중합체를 알킬화하고 다가양이온을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 기는 수용체, 예컨대 보론산, 비오틴, 및 킬레이팅 리간드를 함유할 수 있다. 따라서, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 본 고분자 전해질은 폴리알킬 피리딘, 즉, 매달린 피리딜 기를 갖는 알킬 골격을 갖는 중합체일 수 있다. 폴리알킬 피리딘은 도 16에 도시된 바와 같이, 일반적으로 분자량 (예를 들어 1,000-10,000)에 따라 "n" 반복 단위의 알킬 (예를 들어 비닐) 골격, 및 모든 단량체 단위는 아니지만 골격에 부착된, 직접 단량체에 결합되거나 또는 링커를 통해 반복 단량체 단위에 결합된 피리딜 기를 가질 것이다.

용어 "염"은 산 및 염기의 중화 반응으로부터 생성될 수 있는 이온성 화합물을 의미하기 위해 본원에서 그의 통상적인 의미로 사용된다. 염은 생성물이 전기적으로 중성 (순 전하 미보유)이 되도록 양이온 (양하전된 이온) 및 음이온 (음이온)으로 이루어진다. 상기 성분 이온은 무기, 예컨대 클로라이드 (Cl^-), 및 유기, 예컨대 아세테이트 (CH₃COO^-) 및 단원자 이온, 예컨대 불소 (F^-), 및 다원자 이온, 예컨대 술페이트 (SO₄ ^{2 -})일 수 있다. 몇몇의 다양한 염이 존재한다. 물에 용해될 때 가수분해되어 히드록시드 이온을 생산하는 염은 염기성 염이고, 물에서 가수분해되어 히드로늄 이온을 생산하는 염은 산성 염이다. 중성 염은 산성 또는 염기성 염이 아닌 것이다. 양쪽성 이온 (zwitterion)은 동일한 분자 내에 음이온성 중심 및 양이온성 중심을 함유하지만, 염으로 간주되지 않는다. 그 예는 아미노산, 임의의 대사체, 펩티드 및 단백질을 포함한다. 용해된 염 (예를 들어 물 내의 염화나트륨)을 함유하는 용융 염 및 용액은 전기를 전도할 수 있기 때문에 전해질로 불린다.

용어 "폴리아크릴산" (PAA)은 아크릴산 단위의 중합체를 의미한다. PAA의 화학식은 (C₃H₄O₂)_n이다. 반복 단위의 수는 분자량이 예를 들어 2,000 내지 약 24,000인 중합체를 생성하도록 선택될 수 있다. 중성 pH의 수용액 내에, PAA의 많은 측쇄는 그의 양성자를 잃고, 음전하를 얻는다. 이것은 PAA를 고분자 전해질, 및 약산 양이온으로 만든다.

용어 "다당류"는 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 반복 단위 (단당류 또는 이당류)로 형성된 중합체 탄수화물 구조를 의미한다. 상기 구조는 종종 선형이지만, 다양한 정도의 분지쇄를 함유할 수 있다. 다당류는 종종 상당히 불균질하고, 반복 단위의 약한 변형을 함유한다. 구조에 따라, 상기 거대분자는 그의 단당류 빌딩 블록 (building block)과 별개의 특성을 가질 수 있다. 다당류 내의 모든 단당류가 동일한 종류일 때, 다당류는 단일다당류로 불리지만, 1 종류 초과의 단당류가 존재할 경우에는 이종다당류로 불린다. 다당류는 C_x(H₂O)_y의 일반식으로 표시되고, 여기서 x는 대체로 200 내지 2500의 큰 수이다. 그 예는 저장 다당류, 예컨대 전분 및 글리코겐; 구조적 다당류, 예컨대 셀룰로스, 키틴 및 아라비노크실란; 펩티도글리칸과 같은 세균 다당류를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 예는 펙틴, 카라기난, 알기네이트, 키토산 등을 포함한다.

이온 결합 다당류는 예시된 키토산, 잔탄, 알긴산, 키틴, 및 펙틴과 같은 것이다. 본원에서 설명되는 이온 결합 다당류는 킬레이션 (chelation)에 의해 작용한다.

용어 "킬레이션"은 킬레이팅제의 작용을 나타내기 위해 그의 통상적인 의미로 사용된다. 킬레이트는 금속 이온 및 킬레이팅제로 이루어진 화학적 화합물이다. 킬레이팅제는 그의 분자가 단일 금속 이온에 대한 몇몇의 결합을 형성할 수 있는 물질이다. 즉, 킬레이팅제는 여러자리 (multidentate) 리간드이다. ASTM-A-380에 따른 킬런트 (chelant)는 "특정 금속 이온과 가용성 복합 분자를 형성하여 이온을 불활성화시킴으로써 침전물 또는 스케일 (scale)을 생성하도록 이온이 다른 원소 또는 이온과 정상적으로 반응할 수 없도록 하는 화합물"이다.

용어 "키토산"은 무작위로 분포된 β-(1-4)-연결된 D-글루코사민 (탈아세틸화된 단위) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (아세틸화된 단위)로 이루어진 선형 다당류를 나타내도록 본원에서 그의 통상적인 의미로 사용된다. 키토산 내의 아미노기는 pH 및 %DD (탈아세틸화도) 값에 의존하는 전하 밀도로 산성 내지 중성 용액에서 양성자 부가를 야기하는 ~6.5의 pK_a 값을 갖는다. 이것은 키토산을 음하전된 표면, 예컨대 점막에 쉽게 결합하는 수용성의 생체접착제 (bioadhesive)로 만든다. 키토산은 극성 약물의 상피 표면을 가로지른 수송을 향상시키고, 생체적합성 및 생분해성이다. 키토산은 갑각류 (게, 새우 등)의 외골격 및 진균의 세포벽 내우 구조적 요소인 키틴의 탈아세틸화에 의해 상업적으로 생산된다. 탈아세틸화도 (%DD)는 NMR 분광법에 의해 결정될 수 있고, 시판되는 키토산의 %DD는 60-100%이다. 평균적으로, 상업적으로 생산된 키토산의 분자량은 3800 내지 20,000 달톤이다. 키토산은 금속 이온의 수거에 적합한 생체중합체로서 설명되었고, 그 이유는 키토산 사슬 상의 아미노기 및 히드록실기가 금속 이온에 대한 킬레이션 부위로서 작용할 수 있기 때문이다. 키토산에 의한 구리 결합에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌 [Food Chemistry 114 (2009) 962-969]에서 볼 수 있다. 키토산은 금속 이온의 수거에 적합한 생체중합체로서 설명되었고, 그 이유는 키토산 사슬 상의 아미노기 및 히드록실기가 금속 이온에 대한 킬레이션 부위로서 작용할 수 있기 때문이다. 이것은 예를 들어 US 2011/0136255에 제시된 구조를 갖는다.

용어 "칼모듈린" (칼슘 조정 단백질 (CALcium MODULated proteIN)의 약어)은 모든 진핵 세포에서 발현되는 칼슘-결합 단백질을 나타내기 위해 본원에서 그의 통상적인 의미로 사용된다. 이것은 많은 상이한 단백질 표적에 결합하고 이를 조절하여, 많은 상이한 세포 기능에 영향을 끼칠 수 있다. 칼모듈린은 칼슘에 대한 결합시에 입체형태 변화를 겪고, 이를 통해 특이적 반응을 위해 특이적 단백질에 결합할 수 있다. 칼모듈린은 4개 이하의 칼슘 이온에 결합할 수 있고, 각각 그의 작용을 효과적으로 조정할 수 있는 번역후 변형, 예컨대 인산화, 아세틸화, 메틸화 및 단백질 분해 절단을 겪을 수 있다. 칼모듈린은 약 148개 아미노산 길이 (16706 달톤)의 작은 산성 단백질이고, 따라서 단백질 시뮬레이션 (simulation) 소프트웨어의 시험에 유용하다. 이것은 각각 Ca^{2 +} 이온에 결합하는 4개의 EF-핸드 (hand) "모티프"를 함유한다. 단백질은 가요성 (flexible) "힌지 (hinge)" 영역에 의해 분리된 2개의 거의 대칭적인 도메인을 갖는다. 칼슘은 이온 배위를 위한 음전기 환경을 공급하는 EF 핸드 모티프에 사용을 통해 결합된다. 칼슘 결합 후에, 메티오닌 잔기로부터의 소수성 메틸기가 입체형태적 변화를 통해 단백질 상에 노출된다. 이것은 소수성 표면을 제시하고, 이 표면은 다시 표적 단백질 상의 염기성 양친매성 나선 (Basic Amphiphilic Helices (BAA 나선))에 결합할 수 있다. 상기 나선은 상보성 소수성 영역을 함유한다.

칼모듈린은 칼슘에 결합하는 예시된 이온 결합 단백질이다. 다른 칼슘 결합 단백질은 트로포닌 C 및 S100B를 포함한다. 천연 금속 이온 결합 단백질이 아닌 다른 단백질이 소분자 킬레이팅제에 커플링될 수 있다. 다른 적합한 이온 결합 단백질은 CopA 및 메탈로티오네인 (구리 결합), 아연 핑거 (finger) 단백질, 시티딘 데아미나제, 및 신경 성장 인자 (아연 결합)를 포함한다.

용어 "보론산"은 유기보란의 보다 큰 클래스에 속하는 탄소-보론 결합을 함유하는 알킬 또는 아릴 치환된 붕산을 나타내기 위해 그의 통상적인 의미로 본원에서 사용된다. 보론산은 루이스 (Lewis) 산으로서 작용한다. 그의 특유한 특징은 당, 아미노산, 히드록삼산 등 (인접한, (1, 2) 또는 때로 (1, 3) 치환된 루이스 염기 공여자 (알콜, 아민, 카르복실레이트)를 갖는 분자)과 가역적인 공유 복합체를 형성할 수 있다는 점이다. 보론산의 pK_a는 ~9이지만, 수용액 내에서 복합체 형성시에, 이것은 pK_a ~7로 4면체형 (tetrahedral) 보로네이트 복합체를 형성한다. 이것은 때로 당류의 형광 검출 또는 막을 가로지른 선택적 수송을 위해 당류에 결합하는 분자 인식의 영역에 사용된다. 보로네이트 에스테르는 보론산과 알콜 사이에 형성된 에스테르이다. 보론산은 화학식 RB(OH)₂로 표시되고, 여기서 R은 임의의 기, 예를 들어 알킬일 수 있다. 보로네이트 에스테르는 화학식 RB(OR)₂로 표시된다.

수성 시스템에서 보론산과 1,2- 또는 1,3-디올 사이의 공유쌍 상호작용은 빠르고 가역적이다. 따라서, 보론산과 당류에 존재하는 히드록실기 사이에 확립된 평형으 당류에 대한 다양한 센서의 개발을 위해 사용될 수 있다. 상기 상호작용에 대한 잠재적인 용도는 당뇨병 혈당 수준의 모니터링을 위한 시스템을 포함한다.

보론산 및 보론산 에스테르는 단당류, 이당류, 올리고당류 및 다당류, 예를 들어 글루코스, 단당류를 포함하는 당류의 검출에 사용되는, 본원에서 실시되는 나노피펫을 기능화하기 위해 사용될 수 있다. 단당류는 더 작은 탄수화물로 가수분해될 없기 때문에 가장 작은 탄수화물이다. 이것은 2개 이상의 히드록실기를 갖는 알데히드 또는 케톤이다. 비변형된 단당류의 일반적인 화학식은 (C·H₂O)_n이고, 문자 그대로 "탄소 수화물"이다. 단당류는 중요한 연료 분자 및 핵산의 빌딩 블록이다. n = 3인 가장 작은 단당류는 디히드록시아세톤 및 D- 및 L-글리세르알데히드이다. 2개의 연결된 단당류는 이당류로 불리고, 이것은 가장 간단한 다당류이다. 보론산 코팅물로 감지될 수 있는 이당류의 예는 수크로스 및 락토스를 포함한다. 올리고당류인 분석물의 예는 이당류, 삼당류 라피노스 및 사당류 스타키오스를 포함한다. 다당류의 예는 전분, 글리코겐, 키틴, 셀룰로스, 칼로스 또는 라미나린, 크리솔라미나린, 크실란, 아라비노크실란, 만난, 푸코이단 및 갈락토만난을 포함한다.

용어 "당류 결합 단백질"은 탄수화물에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미한다. 용어 "당류"는 "탄수화물"과 동의어로 사용된다. 탄수화물 결합 단백질의 예는 렉틴의 패밀리이다. 그 예는 콘카나발린, 만노스-결합 단백질, 땅콩 응집소, 스노드롭 (snowdrop) 렉틴, 리신 (ricin)을 포함한다.

일반적인 방법 및 장치

전압-유도 이온 이동에 의해 수용액 내의 침전을 제어하고, 나노피펫 팁을 통한 이온 전류에 대한 그의 효과를 통해 침전물을 연구하기 위한 방법 및 장치를 본원에서 설명한다. 나노 규모의 초기 단계의 침전 연구는 기술적으로 어렵지만, 상기 현상이 중요한 과정, 예컨대 결정 형성 및 생물 무기화를 반영하기 때문에 매우 가치가 크다. 석영 나노피펫을 나노반응기로서 사용하여, 진동 전류 차단을 생성하기 위해 불용성 염의 침전을 유도한다. 가역적인 과정을 사용하여 침전의 동특성 및 생성되는 나노입자의 상대적인 크기를 측정할 수 있다.

도 1은 석영 나노피펫 (102)를 통한 이온 전류 진동을 측정하는 본 발명에 따른 전기화학적 배치의 예를 보여주고, 여기서 나노피펫의 팁은 다양한 이온 및/또는 탄수화물 종 (112)를 함유하는 용액 (106) 내에 위치한다. 나노피펫 내의 이온 전류 진동의 측정을 위한 전자기기가 제공된다. 이온 전류는 나노피펫의 내부와 외부 사이의 전압 차이에 반응하여 나노세공을 통해 나노피펫 내로 또는 나노피펫 밖으로의 이온의 유동에 의해 발생한다. 전자기기는 피펫 내의 용액과 접촉하는 전극 (104); 음 입력부 (negative input)가 전극 (104)에 연결된 증폭기 (105), 예컨대 악소패치 (Axopatch) 저항 피드백 패치 클램프 및 고속 전류 클램프 증폭기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices) 제조); 및 나노피펫 외부의 샘플 용액 (106) 내의 참조 전극 (110)을 포함한다. 상기 예시적인 배치는 석영 나노피펫을 통한 이온 전류를 측정한다. 팁의 세공 직경은 일반적으로 40-60 nm이다. 아래에서 예시되고 여기서 제시되는 바와 같이, 용액은 다양한 이온, 예컨대 KCl (0.1 M)을 함유하고, 배럴 (102)에서 10 mM 인산칼륨으로 및 조 (104)에서 10 mM Tris-HCl로 pH 7에서 완충된다. 염화아연은 조에 2 내지 20 μM의 농도로 포함된다. 조에 포스페이트-미함유 완충제의 사용은 조 용액 내의 침전을 방지하기 위한 것이다. 따라서, 침전물은 배럴 내부로부터의 포스페이트가 조 용액 내의 아연 이온과 혼합될 때 나노피펫의 팁에 위치한다. 전압 클램프 회로에 대한 추가의 상세한 내용은 US 특허 7,785,785 ("Charge perturbation detection system for DNA and other molecules")에서 볼 수 있다.

상이한 배치의 동일한 장치가, 예를 들어 도 4 및 9에 제시된 바와 같이 금속 이온을 검출하기 위한 수단으로서 이온 전류 정류를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본 실시양태에서, 완충제, 예컨대 pH 7 포스페이트가 나노피펫의 배럴 및 조 용액 둘 모두의 전해질이다. 또한, 도 1에 나노피펫 팁에 인접한 내부 구멍 상에 코팅물 (108)이 제시된다. 상기 영역은 "나노세공"으로서 언급되고, 그 내부에 "나노채널"을 규정한다. 아래에서 추가로 설명된 바와 같이, 코팅물 (108)은 팁에 걸쳐 그물-유사 구조로 연장될 수 있거나, 또는 내부 표면 상의 단일 코팅물일 수 있고, 선택된 이온 또는 탄수화물의 특이적 결합을 위해 사용될 수 있다. 아래에서 설명되는 바와 같이, 폴리아크릴산은 (108)에 제시된 바와 같이 적용될 수 있고, 즉, 나노피펫의 실리케이트 표면에 적용될 수 있고, 키토산은 폴리아크릴산의 상부에 적용된다. Cu 이온은 키토산에 대한 결합을 보이지만, pH 3에서 방출된다.

킬레이터를 사용함으로써 금속 이온을 감지하는 것은 나노세공에서 나노침전으로 인한 전류 진동의 변화를 측정하는 것과 상이하다. 킬레이터가 양이온에 결합할 때, 음이온 전류 정류는 아래에서 설명되는 바와 같이 상기 결합을 나타낸다.

중합체는 중합체가 양이온성이고, 나노세공에 함침될 때 중합체가 양성 전류 정류를 보이도록 합성된다. 당류 결합시에, 양 전하는 중화되고, 이온 전류는 음성 (negatively) 정류된다. 이것은 보론산이 유리에 직접 부착되는 문헌의 다른 시스템에 대해서는 적용되지 않는다. 이 시스템은 당 결합시에 정류의 크지 않은 변화 (음성 내지 약간 더 큰 음성)를 달성한다.

알려진 바와 같이, I-V 곡선 (전류 전압 곡선)은 나노세공을 통한 하전된 이온의 유동에 따라 다양한 특성을 보일 것이다. 정류가 발생할 경우, IV 곡선은 선형이 아닐 것이지만, 양 전압에 반응하여 (양의 정류) 또는 음 전압에 반응하여 (음의 정류) 보다 큰 전류가 통과할 것이다. 전압의 극성은 나노피펫 내의 전극을 기준으로 하여 제시된다. 따라서, 작동시에 본 발명의 장치는 음의 범위, 이어서 양의 범위에서 연속적으로 많은 전압 수준을 인가할 것이다. 예를 들어, 도 4에서, -400 mV 내지 0 및 0 내지 +400 mV의 전압이 14개의 별개의 수준에서 인가되고, I-V 곡선을 생성하기 위해서 전류를 각각의 수준을 측정하였다. 상기 범위는 제시된 시스템의 특정 파라미터가 결정될 때 좁혀질 수 있다.

도 2는 나노피펫 회로의 입체형태 및 이온 전류 진동을 야기하는 용액을 보여준다. 나노피펫 배럴 (202) 내의 음 전위 (V<0으로 제시됨)는 아연 양이온을 조 (106) (도 1)으로부터 세공, 즉, 나노피펫의 개구부로 끌어당기는 반면, 포스페이트 이온은 나노피펫 배럴 (102) 밖으로 밀어낸다 (도 1). 이온의 혼합 (음이온과 양이온의 혼합)은 나노피펫 팁 영역 (118)에서 발생한다. (206)에 제시된 바와 같이 충분한 크기의 침전물이 형성될 때, 세공은 차단되고 이온 전류는 감소한다.

아래에서 설명되는 바와 같이, 고도로 수불용성 염인 인산아연에 대한 반대 이온은 나노피펫의 세공 및 계면으로의 이온 이동을 유발하기 위해 인가된 전위에 의해 분리되었다. (206)에 덩어리로 표시된 세공 차단의 동특성을 분석함으로써, 다음과 같은 2개의 별개의 메카니즘이 확인되었다: 용액으로부터의 침전에 의한 보다 느린 과정, 및 포획된 침전물의 전압-유도 이동에 의한 보다 빠른 과정. 이들 기술은 도 2에 제시된 "반응 대역"으로 간주될 수 있는, 나노반응기 내의 포획된 입자에 대한 침전 동역학을 연구하고 측정을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 제시된 예에서, 입자는 인산아연 염이다. 다른 입자는 단백질, 특히 하전된 것을 포함할 수 있고, 나노피펫은 결정학에 사용되는 것과 같은 결정을 파종하기 위한 조건을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 장치는 또한 반대 이온과의 나노침전을 기초로 하여 양이온 또는 음이온에 대한 전기 센서로서 사용될 수 있다.

또한, 수용체로 관능화된 나노피펫을 사용하여 이온에 가역적으로 결합하는 전기 센서가 개시된다. 제시된 예는 pH, 칼슘, 구리, 및 탄수화물에 대한 센서이다. 수용체는 산성 또는 염기성 관능기를 갖는 분자, 금속 킬레이터, 또는 단백질일 수 있다. 칼슘 바이오센서의 개념에 대한 증거로서, 단백질 칼모듈린을 나노피펫 팁의 내부에 고정하였다. 센서는 중성 pH의 전해질 내의 마그네슘보다 칼슘에 대한 선택성을 보였고, 칼슘 신호전달은 단순히 새 용액에 침지함으로써 역전되었다. 상기 센서는 재현가능한 및 농도-의존성 신호로 20개 초과의 별개의 측정을 위해 사용되었다.

또한, 특정 고분자 전해질로 관능화된 나노피펫은 전이 금속에 가역적으로 결합함이 입증되었다. 그 개념의 증거로서, 외부 층으로서의 키토산 및 석영 내부 상에 적층된 폴리아크릴산 (PAA)으로 변형된 나노피펫은 구리에 가역적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이 경우에, 키토산/PAA는 아래에서 설명되는 바와 같이 적용된다. 나노피펫의 외부는 예를 들어 실란으로 처리된다. Cu 이온은 나노피펫의 내부 표면 상의 폴리아크릴산과 조합된 키토산에 결합한다. pH 3에서, Cu^{2 +} 이온은 키토산으로부터 떨어진다. 나노피펫 외부의 표면 처리는 막, 예를 들어 지질 이중층, 세포막을 통한 나노피펫의 투과를 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다. 나노피펫 외부의 표면 처리는 나노피펫에 대한 수용체의 결합을 변경하지 않는다.

추가로, 아래 제시된 바와 같이, 인가된 전압은 나노피펫의 결합 특성을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 나노피펫은 탄수화물을 포함하여 이온에 결합하기 위해 단백질로 관능화된다. 몇몇의 다른 실시양태에서, 나노피펫은 탄수화물을 검출하기 위해 보론산 또는 보론산 에스테르로 관능화된다. 추가로, pH에 대한 센서는 아민 또는 카르복실산기 함유 고분자 전해질, 아민-함유 생체중합체 키토산, 또는 아미노-실란으로 나노피펫을 관능화함으로써 제조하였다. 또한, pH 센서는 pH 3 내지 pH 8의 상이한 완충제에 대한 가역적인 반응을 신속하게 보였다. 상기 종류의 센서는 가역적인 연속 센서 또는 센서의 어레이를 필요로 하는 많은 상이한 용도, 예컨대 수질의 모니터링, 생체내 단일-세포 검정, 또는 기능성 이온 맵핑 (mapping)에 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1: PLL 및 PAA 고분자 전해질 층을 갖는 나노피펫 바이오센서의 제조 및 특성결정

서터 (Sutter; 미국 캘리포니아주 노바토)로부터 필라멘트 (QF100-70-7.5)가 구비된 석영 모세관을 구입하고 나노피펫을 제시하기 위해 서터 P-2000 레이저 풀러로 잡아당겼다. 사용된 풀러 설정은 히트 (heat) 620, 필라멘트 4, 속도 60, 지연 (delay) 170, 풀 (pull) 180이었다. 설정은 풀러에 따라 가변적이고, 요구되는 전도도로 음이온 전류 정류를 보이는 나노피펫을 제공하기 위해 필요한 만큼 조정되었다. 피펫은 달리 나타내지 않으면 완충된 전해질 (pH 7 Tris-HCl, 10 mM 및 KCl, 100 mM)로 다시 채웠다. 설명된 2개의 센서는 하나의 잡아당겨진 모세관으로 제조된 쌍둥이 피펫이었다. 센서 CaM-1을 고분자 전해질 증착 전에 미처리하고, CaM-2는 기상 증착을 사용하여 트리메틸클로로실란 (TMCS)으로 실란화하였다. 나노피펫을 약 0.1 mL의 TMCS가 존재하는 0.5 L 부피의 밀봉 챔버 내에 10분 동안 두었다. 이어서, 두 피펫을 완충된 전해질로 다시 채우고, 동일한 완충제의 조 내에 침지하였다. 이온 전류는 피펫 배럴 내의 Ag/AgCl 전극 및 조 내의 접지 전극을 사용하여 악소패치 700B 증폭기 (악손 (Axon))으로 측정하였다. +500 mV 내지 -500 mV의 사인파 (sinusoidal) 전위 (5 Hz)를 인가하여 후속 표면 처리 동안 이온 전류를 모니터링하였다. 고분자 전해질 폴리-L-라이신 PLL) 및 폴리아크릴산 (PAA)을, PLL 또는 PAA를 3 ppm의 농도로 함유하는 완충된 전해질 내로 피펫 팁을 순차적으로 침지함으로써 나노피펫의 표면 상에 침적하였고, 여기서 각각의 고분자 전해질 증착 후에 세척하기 위해 완충제 내에 침지하였다. 고분자 전해질 층은 전류 정류의 생성되는 변화 (PLL에 대해 양성, PAA에 대해 음성)는 완충제 내의 침지 동안 유지될 경우 안정한 것으로 결정되었다. CaM-1 및 CaM-2 둘 모두를 다음과 같은 4개의 층으로 관능화하였다: PLL, PAA, PLL, 및 이어서 PAA. 이어서, 피펫을 각각 10 mg/mL의 NHS 및 EDC를 함유하는 용액 (50 mM KCl이 존재하는 100 mM pH 6.1 MES 완충제) 내에 1시간 동안 침지하였다. 마지막으로, 피펫의 팁을 세척하고, 칼모듈린 (소의 뇌, 50 mM KCl이 존재하는 pH 6.1 MES 완충제 (100 mM) 내의 0.05 mg/mL)의 용액에 침지하고, 18h 동안 4 ℃에서 인큐베이팅하였다.

센서의 전기 특성 및 금속 염에 대한 반응을 상기한 바와 같은 전기 배치를 사용하여 분석하였다. 모든 측정은 0.3 mL 완충제의 조에 직접 첨가된 염화칼슘 또는 염화마그네슘의 분취액 (1 내지 10 ㎕ 부피)이 있는 pH 7-완충된 전해질 용액 내에서 수행하였다. pClamp 소프트웨어를 사용하여 200 Hz의 속도에서 데이타를 얻고, 오리진프로 (OriginPro) 8.5를 사용하여 처리하였다. 연속 측정 데이타에 대해, 사인파 인가된 전압으로부터 생성된 음이온 전류 피크를 검출하고, 시간에 대한 함수로서 플롯팅하였다. 50% 백분위수 피터 및 10점 이동 윈도우 (moving window)를 사용하여 선 평탄화 (line smoothing)를 수행하고, 전류 정류 계수 (r)은 다음 식을 사용하여 계산하였다: r = Log₁₀ I₊/I_- (여기서, I₊는 500 mV의 전위에서 이온 전류의 규모이고, I_-는 -500 mV의 전위에서 이온 전류의 규모이다. 이온 전류의 오차는 측정 사이에 완충제로 세척하면서 실시한 I₊ 및 I_-의 3개의 별개의 측정치의 표준 편차를 반영한다.

실시예 2: 나노피펫에 고정된 칼모듈린에 의한 선택적 및 가역적인 Ca ^{2 +} 결합

생물학적 수용체에 대한 가역적인 및 선택적 이온 결합을 달성하기 위해서, 높은 선택성으로 칼슘 (K_d ~10^-6M)을 가역적으로 킬레이팅하는 칼슘 결합 단백질인 칼모듈린으로 변형된 나노피펫 센서를 연구하였다. 칼슘 농도 (문헌 [Cui et al., Science vol. 293: pages 1289-1292 in 2001 ("Nanowire nanosensors for highly sensitive and selective detection of biological and chemical species")]) 및 단백질-단백질 상호작용 (문헌 [Ivnitiski et al., "An amperometric biosensor for real-time analysis of molecular recognition" Bioelectrochem. Bioenerg. 1998, 45(1), 27-32] 및 [Lin et al., "Label-free detection of protein-protein interactions using a calmodulin-modified nanowire transistor" Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 2010, 107(3), 1047-1052]) 둘 모두를 프로빙하기 위해 고정된 칼모듈린을 사용한 전기 센서가 이전에 보고된 바 있다. 본 발명자들의 전략은 단백질의 세공에 대한 고정, 및 신속하고 가역적인 이온 반응을 위해 수용체를 세공 용액 계면에 위치시킬 필요성 둘 모두를 고려하였다.

예비 연구에서, 양이온에 대한 가장 높은 감수성은 음의 정류를 보이는 세공에서 관찰되었고, 표면 관능화에 대한 본 발명자들의 방법은 최종 센서가 상기 세공을 기초로 함을 확실히 하였다. 고분자 전해질은 하전된 세공 표면과 강한 정전기 상호작용을 보이고, 이온 전류 정류는 나노세공에 대한 고분자 전해질 결합의 탁월한 표시자이다. 이러한 점을 바탕으로, 이온 전류 측정은 나노피펫 내의 고분자 전해질의 층-대-층 증착을 모니터링하고, 요구되는 전도도를 갖는 음성 정류된 나노세공을 제공하기 위해 사용하였다. 단백질 내의 아민기와 최외부 고분자 전해질층 상의 카르복실레이트기 사이의 아미드 결합 형성은 단백질을 석영 표면에 커플링시켰다. 벌크 용액과의 더 큰 상호작용이 존재하는 세공-용액 계면에 수용체를 위치시키기 위해, 세공은 침지에 의해서만 관능화하였고, 나노피펫의 내부는 완충제로 충전되도록 만들었다. 상기 방법은 세공 주위의 직접적인 영역 이외에 표면의 상대적으로 넓은 영역을 관능화할 것이기 때문에, 외부 표면이 소수성 실란으로 코팅된 나노피펫도 시험하였다.

나노피펫의 표면-처리는 몇몇 단계에 대해 표면 화학의 안정성을 결정하기 위해 실시간으로 모니터링하였다. 동일한 모세관으로부터 잡아당겨진 쌍둥이 나노피펫을 동일한 표면 처리 단계를 통해 처리하였다. 처리는 실리카의 표면 상의 매달린 산소 기와의 반응을 수반하였다. PAA 및 PLL 층을 적용하여, 매달린 카르복실기를 생성하였고; 칼모듈린은 상기 기에 결합되었다. 따라서, 석영에 대한 표면 관능화는 고분자 전해질 층 (폴리-L-라이신) PLL; (폴리-아크릴산) PAA의 증착, 이어서 NHS/EDC 결합을 사용한, CaM (칼모듈린) 단백질에 대한 아미드 결합 형성에 의해 달성되었다. 사실상, 석영-PLL-PAA-PLL-PAA의 샌드위치가 생성된다.

센서 CaM-1은 잡아당긴 후에 직접 사용하였고, CaM-2는 먼저 외부 피펫 팁을 실란화하기 위해 트리메틸클로로실란 (TMCS) 증기로 처리하였다. 이온 전류 정류 (ICR)는 나노피펫을 양이온성 폴리-L-라이신 (PLL) 또는 음이온성 폴리아크릴산 (PAA)을 함유하는 중성 완충제 내에 침지하면서 모니터링하고, 여기서 후속 층은 정류가 순수한 완충제 내에서 안정하게 유지된 후에만 부가하였다. 도 4의 전류-전압 도표에서 제시된 바와 같이, 노출된 나노피펫은 음성 ICR을 갖고, 여기서 노출된 피펫 (■), PLL 및 PAA의 두 개의 층 층착 후 (●), 및 CaM과의 커플링 후 (▲)의 전류-전압 반응이 제시된다. PLL/PAA의 두 개의 층 증착 후, 전류는 계속 음성 정류되지만, 규모는 더 작고, 이것은 증착 후의 더 작은 세공을 나타낸다. 상기 거동은 중성 pH에서 또한 음하전된 (pI ~4) 칼모듈린 단백질의 고정화 후에 지속된다. 정류 계수는 전류 전압 곡선에서 관찰된 거동을 반영한다: r = -0.27±0.03 (노출된 피펫), -0.71±0.02 (PLL/PAA의 제2층), 및 -0.533±0.014 (CaM). 이들 측정치의 낮은 오차는 각각의 단계에서 표면의 안정성을 입증한다. 나노피펫을 사용한 전류 정류는 표면 코팅물을 반영하였다 (상이한 관능화와 상이한 정류 계수를 보여주는 도 5a 참조). PLL을 적용한 후에, 전류 정류는 양성 값을 가진 반면, PAA를 적용한 후에 정류는 음성이었다. 전류는 진동 사인파 전위 (-500 내지 500 mV, 5 Hz)를 사용하여 측정하였다. 오차 막대는 각각의 측정 사이에 완충제로 세척하면서 실시한 3개의 별개의 측정치를 반영한다. CaM-변형된 나노피펫은 또한 음성 전류 정류는 보여주었고, 이것은 카르복실레이트-함유 잔기로부터 생성되는 단백질의 총 음전하와 일치한다. -500 mV의 전위에서 전류는 도 5b에 제시된 바와 같이 칼슘 이온의 존재에 의해 강하게 영향을 받는다. 이온 전류는 0.1 mM 염화마그네슘을 첨가하고 0.1 mM 염화칼슘의 존재 하에 pH 7 완충제 내의 시간의 함수로서 제시된다. 칼슘에 대한 선택성은 마그네슘 이온에 비해 칼슘 이온에 대한 보다 큰 신호 변화에 의해 입증된다. 결합의 가역성은 순수한 완충제, 이어서 염화칼슘 내 침지에 의한 신호의 회복에 의해 제시된다.

실시예 3: 금속 이온 결합 중합체 ( Cu 결합 키토산)로 관능화된 pH -감수성 나노피펫 센서

pH의 센서는 나노피펫을 아미노-실란, 아민-함유 생체중합체 키토산 (도 6) 또는 아민 또는 카르복실산기 함유 고분자 전해질로 관능화함으로써 제조하였다. pH 센서는 pH 3 내지 pH 8의 상이한 완충제에 대한 가역적인 반응을 신속하게 보여주었다. 나노피펫을 pH 7 전해질 (10 mM Tris-HCl 완충제가 존재하는 100 mM KCl)로 채우고, 상이한 pH의 완충된 전해질 (10 mM 포스페이트/시트레이트 완충제가 존재하는 100 mM KCl) 내에 담갔다. 이온 전류는 5 Hz에서 -500 내지 500 mV의 사인파 전위를 인가하면서 측정하였다. 측정은 목적하는 pH로 10 mM 포스페이트/시트레이트로 완충한 0.1 M KCl 용액 내에서 수행하였다. 오차 막대는 동일한 센서를 사용한 적어도 4개의 상이한 pH 측정치로부터 계산하였다 (도 6). 도 6은 상이한 pH 값에서 노출된 및 키토산/PAA-관능화된 나노피펫에 대한 정류 계수의 비교를 보여준다. 정류 계수는 양성자 부가 가능 (protonable) 카르복실레이트 및 아민기 때문에 관능화된 나노피펫에서 pH에 대해 보다 감수성이다. 중성 pH에서, 관능화된 나노피펫은 노출된 나노피펫보다 유의하게 더 큰 음의 정류를 보이고, 이것은 코팅물이 나노세공의 표면에서 보다 많은 음하전된 기를 생성함을 보여준다.

실시예 4: 나노피펫 상의 고분자 전해질 및 키토산의 정전기 물리 흡착

키토산 및 폴리아크릴산은 다음 절차를 사용하여 물리 흡착되었다: 나노피펫을 350 ㎕의 pH 3 완충 용액에 침지하고, 10 ㎕의 키토산 원액을 저장기에서 첨가하였다. 키토산의 물리 흡착은 산성 pH에서 이루어져야 하는데, 그 이유는 상기 고분자 전해질이 중성 pH에서 가용성이 아니기 때문이다. 이어서, 나노피펫을 350 ㎕의 pH 7 완충 용액에 옮기고, 10 ㎕의 PAA 원액을 저장기에서 첨가하였다. 이어서, 관능화된 나노피펫을 센서 상에 목적하는 층수에 도달될 때까지 2가지 용액 사이에서 순환시켰다.

원뿔형 기하구조 및 나노미터 크기 세공은 고체 상태 나노세공에 대해 흥미로운 전기화학적 거동을 생성시킨다. 예를 들어, 하전된 나노세공은 비대칭적 전류 출력을 갖는 대칭적 입력 전압에 반응하고, 이때의 효과는 전류 정류로 언급된다. 나노피펫 내의 상기 효과의 기원은 본 발명자들 중의 2인에 의해 출판된 최근의 문헌에서 심도있게 설명된 바 있다 (문헌 [Actis, P.; Mak, A.; Pourmand, N. Bioanalytical Reviews 2010, 1, 177]). 간단히 설명하면, 확산 전기 이중층 두께가 세공 크기와 대등할 때, 나노세공 표면 상의 고정된 하전된 종과 용액 내의 이온 종 사이의 정전기 상호작용은 이온 수송 특성을 변경한다. 정류의 정도를 정량하기 위해, 정류 계수 또는, 몇몇 경우에, 특정 양 전압에서 측정된 전류와, 동일하지만 반대 극성을 갖는 전압에서 측정된 전류 사이의 비의 대수, 즉, r=Log₁₀ I+/I-로서 규정된 정류의 정도로서 표시된 유용한 파라미터가 도입되었다.

음하전된 석영 나노세공은 음성 전류 정류 (r < 0)를 보인다. 정류는 하전된 기능성 층, 예컨대 폴리-L-라이신, 덴드리머, 아미노실란 및 키토산으로 나노세공 표면을 변형시킴으로써 반전될 수 있다 (r > 0)

고분자 전해질의 정전기 물리 흡착은 간단한 전기화학적 측정에 의해 모니터링할 수 있다. 키토산 골격으로부터의 양하전된 아미노기는 음하전된 나노피펫 표면 상의 고분자 전해질의 물리 흡착을 허용한다. 키토산 물리 흡착은 단지 상기 다당류가 중성 pH에서 불용성이기 때문에 산성 pH에서 발생한다. 이와 유사하게, 폴리아크릴산 (PAA)의 카르복실기는 중성 pH에서 중합체에게 음전하를 부여하여, 양하전된 키토산 나노피펫 상에 대한 물리 흡착을 허용한다. 모든 고분자 전해질 층의 증착은 전기화학적 측정에 의해 모니터링하였다. 정류 계수는 나노피펫 표면 전하의 지표이다. 상기 파라미터를 석영 나노피펫에 대한 층-대-층 회합의 효과를 정량하기 위해 이용하였다. 흥미롭게도, 다층 회합은 나노피펫의 정류 특성을 증가시켰다: pH7에서 정류 계수는 노출된 나노피펫에 대한 -0.1로부터 키토산/PAA의 5개 층의 물리 흡착 후의 -0.8로 증가하였고, 이후에 일정하였다. 이와 유사하게, pH 3에서, 정류 계수는 0에서 5층 후에 0.65로 증가하였다 (도 7). 정류 계수 이외에, 5층 후에, PAA 또는 키토산의 추가의 첨가시에 총 전류의 변화는 존재하지 않았다. 이것은 키토산 PAA 혼합 층으로 이미 충분히 덮인 센서 표면 상에 고분자 전해질이 적층되지 않았음을 나타낸다. 이들 결과는 PET 막 내의 단일 비대칭적 나노채널의 표면 전하가 그 내로 회합되는 층의 수에 따라 크게 감소함을 보여주는 문헌 [Ali, M.; Yameen, B.; Cervera, J.; Ramirez, P.; Neumann, R.; Ensinger, W.; Knoll, W.; Azzaroni, 0. Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 8338]에서 설명된 바와 대조적이다. 상기 거동은 층 회합에 의해 완전한 층보다는 혼합된 층을 유도하는 불완전한 다층 형성에 의해 설명될 수 있다. 따라서, 상기 가정을 확인하기 위해 키토산/PAA 변형된 나노피펫의 pH 반응을 연구하였다. 측정은 목적하는 pH로 10 mM 포스페이트/시트레이트로 완충된 0.1 M KCl 용액 내에서 수행하였다. 오차 막대는 동일한 센서를 사용하여 적어도 4개의 상이한 pH 측정치로부터 계산하였다 (도 8). 키토산의 pK_a 값은 ~6.5이고, PAA의 값은 4.8이다. 완전한 층-대-층 회합을 가정할 때, PAA가 최외부 층일 경우, 나노피펫은 pH<4.8에서 중성이고 pH>4.8에서 음하전되어야 한다. 이와 비슷하게, 키토산이 최외부 층일 경우, 나노피펫은 pH<6.5에서 양하전되고, 그 이상에서는 중성이어야 한다. 그러나, 키토산/PAA 나노피펫의 정류 계수는 pH<5에서 양성이고, pH>5에서 음성이다. 이것은 pH<5에서 나노피펫 투과선택성이 키토산의 양성자 부가된 아미노기에 의해 좌우되고, pH>5에서는 PAA의 음하전된 카르복실기에 의해 좌우됨을 나타내고, 따라서 혼합된 층 형성을 입증한다.

실시예 5: 키토산 및 PAA 다층으로 정전기적으로 변형된 석영 나노피펫에 대한 선택적 및 가역적 Cu ^{2 +} 결합 .

석영 나노피펫 상의 키토산 및 PAA 층의 물리 흡착은 노출된 센서에서 관찰되지 않은 가역적인 금속 결합 특성을 제시한다. 키토산 및 PAA의 킬레이팅 특성은 잘 알려져 있고, 문헌에 잘 기재되어 있다. 키토산은 몇몇 금속 이온에 결합하지만; 구리 이온에 대해 보다 강한 친화도를 보인다. 따라서, 구리 이온의 키토산/PAA 센서에 대한 복합체화를 연구하는 것이 모델시스템으로서 결정되었다.

시약: 키토산은 서메이 (CERMAY)로부터 구입하였다. pH 3 HCl 용액 내의 5 mg/ml 키토산의 원액을 제조하고 본원에 기재된 모든 실험에서 사용하였다. 폴리아크릴산은 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. pH 7.4의 PBS 용액을 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 수성 시약은 >18 MΩcm^-1 저항의 초순수를 사용하여 제조하였다.

센서 제작: 나노피펫은 1.0 mm의 외경 및 0.70 mm의 내경을 갖는 필라멘트가 구비된 석영 모세관 (QF100-70-5; 서터 인스트루먼트 컴퍼니 (Sutter Instrument Co.))으로 제작하였다. 이어서, 모세관을 50 nm의 내경을 갖는 나노피펫을 제작하도록 미리 프로그래밍된 P-2000 레이저 풀러 (서터 인스트루먼트 컴퍼니)를 사용하여 잡아당겼다. 사용된 파라미터는 히트 625, Fil 4, Vel 60, Del 150, 및 Pul 192이었다. 생성되는 나노피펫 팁은 37 내지 82 nm의 내경, 및 56 nm의 평균 직경을 가졌다.

측정 배치: 모든 측정은 나노피펫을 통한 전류 유동이 참조 전극을 극성화하기에는 너무 작기 때문에 2개의 전극 배치로 수행하였다. 작용 (working) 전극으로서 작용하는 센서는 pH 7로 완충된 0.1 M KCl, 10 mM Tris-HCl로 다시 채우고, Ag/AgCl 전극을 삽입하였다. 또 다른 Ag/AgCl 접지 전극을 보조/참조 전극으로 작용하는 벌크 용액 내에 넣었다. 두 전극은 디지데이타 (DigiData) 1322A 디지타이저 (digitizer) (몰레큘라 디바이시즈)가 구비된 악소패치 700B 증폭기, 및 pClamp 10 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈)가 설치된 PC에 접속되었다. 시스템은 실온에서 수행된 측정의 지속시간 동안 교란되지 않은 상태로 유지되었다.

도 9는 노출된 나노피펫 센서 및 PLL/PAA로 코팅된 것에 대한 -500 및 +500 mV의 전위에서의 이온 전류를 보여준다. 저장기 내의 Cu^{2 +}의 첨가는 센서의 투과선택성에 즉시 영향을 끼쳐, -500 mV의 전위에서 이온 전류의 감소를 야기한다. 결합은 완전히 가역적이고, 센서는 임의의 기능 상실 없이 5회까지 재생된다. 재생은 센서를 60초 동안 pH 3 완충제 내에 침지함으로써 수행한다. 산성 pH는 키토산 아미노기에 양성자를 부가하여, 용액 내에서 구리 이온의 방출을 일으킨다 (도 10). 다른 재생 방법, 예컨대 중성 pH의 시트레이트 완충제 및 0.1% EDTA 내의 침지는 동등한 성공을 보여주었다. 구리 결합을 위해 두 고분자 전해질의 조합 효과를 고려하는 것이 중요하다. 실험은 벌크 용액 내에 구리의 첨가 시에 출력 전류의 변동을 거의 보이지 않은 키토산 및 PAA만으로 나노피펫이 관능화될 때 수행하였다. 또한, 고분자 전해질과 석영 사이의 계면은 센서가 구리 결합 특성의 완전한 상실 전에 단지 1회 재생될 때 안정하지 않았다. 키토산 및 PAA의 혼합된 층이 나노피펫 상에 구축될 때, 계면은 다수의 검출 사이클에 걸쳐 안정하였다. FTIR 측정을 통해, 왕 (Wang) 및 공동연구자들은 -NH₂, -OH 및 COOH 기가 모두 키토산/PAA 애타풀자이트 (attapulgite) 복합재에 의한 구리 흡착에 관여함을 입증하였다 (문헌 [Wang, X.; Zheng, V.; Wang, A. Journal of Hazardous Materials 2009, 168: 970]). 유사한 킬레이션 메카니즘이 키토산/PAA 센서에서 발생하여 금속 결합 능력을 향상시키는 것으로 추측되었다.

상이한 농도의 구리 이온에 대한 센서의 반응을 조사하였다 (도 11). 센서는 증가하는 Cu^{2 +} 농도에 대해 선형으로 반응한다 (도 11, 삽입도). 정규화된 전류의 변화 vs. Cu^{2 +} 농도는 랭뮤어 (Langmuir) 흡착 등온선과 유사하다. 전류는 다음 식에 따라 정규화되었다:

여기서, I_s는 용액 내에 구리 이온의 첨가 후의 신호이고, I_b는 순수한 완충제에서 측정된 기준선 신호이다. 결합 과정이 평형 과정인 것으로 가정하면, 정규화된 전류의 변동은 센서에 결합된 구리 이온의 수에 비례하고, 결합 부위는 무관하고, 복합체화 식은 다음과 같이 제시된다:

센서에 대한 Cu^{2 +} 결합에 대한 열역학적 친화도 상수 K는 다음 식을 이용하여 추정할 수 있다:

여기서, I_max는 최대 표면 적용 범위에서의 I_n 값이고, c는 용액 내의 구리 이온의 농도이다. 도 11의 선형 피트로부터, 4x10⁴ M^-1의 K 값은 외삽될 수 있다. 상기 값은 상이한 플랫폼을 사용하여 키토산에 대한 양이온 흡착에 대해 계산된 값과 매우 일치한다.

실시예 6: 인가된 전압의 파형, 진폭 및 주파수의 영향

인가된 전압, 즉, 나노피펫 내부의 용액 함유 전극과 외부 용액 내의 전극 사이의 전압은 검출 메카니즘에서 중대한 역할을 한다. 분자는 나노피펫의 팁에 포획되거나 농축될 수 있다. 또한, 인가된 전압은 센서의 감지 영역 내부에서 결합 이벤트의 확률을 증가시킨다. 먼저, 사인파 파형의 진폭 및 주파수가 구리 이온의 결합시에 나노피펫 전기 신호에 어떻게 영향을 주는지 연구하였다. 인가된 전압의 (a) 진폭 및 (b) 주파수의 함수로서 고정 농도의 Cu^{2 +} (20 μM)에 대한 센서의 반응을 다음 조 용액에서 측정하였다: 0.1 M KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.

인가된 전압이 높을수록 키토산/PAA 센서에 의한 구리 이온의 킬레이션시에 출력 전류의 변화가 더 컸다. 동일한 구리 농도 (20 μM)에 대해, 전류는 1 V 진폭에서 그의 초기 값의 5%로 감소한 반면, 50 mV 인가시에는 단지 46% 감소가 검출되었다.

흥미롭게도, 인가된 사인파 전압의 주파수가 높을수록 센서에 의한 구리의 결합시에 측정된 변화는 더 작았다. 벌크 용액 내의 20 μM Cu^{2 +} 농도에 대해, 전류는 1 KHz 주파수에서 그의 초기 값의 68%로 감소한 반면, 0.5 Hz에서는 58%로 감소하였다.

AC 전압에 대한 센서의 반응이 특성화된 후에, DC 전압의 효과를 조사하였다. 센서에 대한 구리의 결합은 인가된 전압에 의해 제어될 수 있다. 양 전압이 인가될 때, 양이온은 전기영동적 유동 때문에 나노피펫 팁에서 고갈된다. 사이 효과를 센서에 대한 구리의 결합에 이용하는 것은 인가된 전압을 제어함으로써 촉발될 수 있다. 양 전압 인가시에 구리 이온이 나노피펫 팁으로부터 고갈되기 때문에 결합이 발생하지 않고, 전압을 음 전압으로 전환하자마자, 결합이 발생하여 이온 유동의 감소를 야기하고, 이 변화는 다음 양 전압 단계에서 반영된다 (도 13).

실시예 7: 나노피펫을 사용한 침전물의 검출을 위한 전압-개폐 나노반응기

본 실시예는 나노피펫 개구부를 가로질러 전압 바이어스 (bias)가 이온 이동을 제어하고 2가지 수성 매질의 계면에서 불용성 염의 침전을 일으키기 위해 사용될 수 있는 방식을 개시한다. 또한, 나노세공에서 인산아연 침전으로 인한 진동 전류를 생성하기 위해 요구되는 조건, 및 침전물의 특성 및 그의 세공으로부터 후속적인 제거의 조사를 설명한다. 추가로, 침전에 의해 영구적으로 차단된 것으로 보이는 세공이 전압 펄스로 잠시 개방될 수 있고, 이 방법은 세공 차단의 운동학을 검사하기 위해 사용됨을 제시한다.

시약 및 용액

금속 염의 원액 (100 내지 500 mM)을 5% HCl을 함유하는 Milli-Q 초순수 내에 제조하였다. 이어서, 이들을 실험일에 완충제 내에 희석하였다. 염화칼슘 4수화물은 피셔 (Fisher)로부터 구입하였다. 염화아연, 염화철(III), 및 염화마그네슘 (1.00 M 용액)은 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 완충제 용액은 염화칼륨 (베이커 (Baker)), 이염기성 인산나트륨 (시그마), 및 TRIS-HCl (1 M 용액, pH 7.00, 시그마)로부터 제조하고, HCl (1 M) 또는 KOH (0.1 M)로 조정하였다. 분석을 위해 사용된 모든 완충제 용액은 10 mM 완충제 및 100 mM 염화칼륨을 함유하였다.

석영 나노피펫 제작

나노피펫은 1.0 mm의 외경 및 0.70 mm의 내경을 갖는, 필라멘트를 갖는 석영 모세관 (QF100-70-5; 서퍼 인스트루먼트 컴퍼니 (Suffer Instrument Co.))으로부터 제작하였다. 이어서, 모세관을 약 50 nm의 내경을 갖는 나노피펫을 제작하기 위해 예비프로그래밍된 P-2000 레이저 풀러 (서퍼 인스트루먼트 컴퍼니)를 사용하여 잡아당겼다. 사용된 파라미터는 히트 625, 필라멘트 4, 속도 60, 지연 170, 및 풀 180이었다. 10 mM 완충제 및 100 mM KCl의 용액 내에서, 피펫은 -0.5 V의 전위에서 -2500 내지 -4000 pA의 전류를 제공하였다.

측정 배치

나노피펫을 통한 이온 전류를 측정하기 위해 2개의 전극 배치를 이용하였다. 나노피펫을 완충제 용액으로 다시 채우고, Ag/AgCl 전극을 삽입하였다. 또 다른 Ag/AgCl 전극은 보조/참조 전극으로 작용하는 0.3 mL 벌크 용액 내에 넣었다. 두 전극은 디지데이타 1322A 디지타이저 (몰레큘라 디바이시즈)가 구비된 악소패치 700B 증폭기, 및 pClamp 10 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈)가 설치된 PC에 접속되었다. 양 전위는 반대 전극에 비해 피펫의 배럴 내의 전극에 인가된 애노드 전위를 나타낸다. 실험은 24℃에서 수행하였다.

전압-유도 나노침전

전압-유도 혼합에 의해 인산아연 침전을 유도하기 위해, 나노피펫의 배럴을 포스페이트 완충 전해질의 용액으로 다시 채우고, 팁을 포스페이트-비함유 Tris-HCl 완충제 내에 침지하였다. 염화아연 용액의 분취액을 조에 첨가하고, 반복된 피펫팅에 의해 교반하였다. +500 내지 -800 mV의 전압을 인가하면서 시스템을 모니터링하였다. 상이한 pH에서 실험은 6, 7, 8, 또는 10의 pH 값을 갖는, 배럴 내의 포스페이트 완충제만 상이하였다.

전류 진동의 운동학

-500 mV의 전위에서 -3500 내지 -4500 pA의 전류 값을 갖는 나노피펫을 선택하였다. -300 내지 -500 mV의 전위는 전류 진동을 생성하고, 그에 대한 역치는 고 및 저 전도도 상태에 대해 설정되었다. 고 전도도로부터 저 전도도까지 시간을 측정함으로써, 세공 폐쇄의 기울기를 pA/ms 단위로 추정하였다. 고 및 저 전도도 상태는 다음과 같이 설정되었다: -500 mV, -1700 및 -1200 pa; -400 mV, -1200 및 -700 pA; -350 mV, -900 및 -400 pA; -300 mV, -1000 및 -500 pA. 세공의 일시적 개방을 위해 2상 파형을 사용하였고, 여기서 인가된 전위는 각각 2.5 s의 기간 동안 +500 내지 -500 mV 사이에서 진동하였다. 고 전도도에 대한 역치는 -3500 pA에 설정하고, 저 전도도 상태는 -2000 pA에 설정하였다. 기울기는 저 전도도 상태에 도달하기 위해 요구되는 시간으로부터 계산하였다.

데이타 분석

데이타는 Clampex 소프트웨어를 사용하여 1 kHz의 속도로 샘플링하였다. 데이타 처리는 Clampfit 및 오리진프로 8.5 (오리진랩 (OriginLab, 미국 매사추세츠주 노쓰햄턴))를 이용하여 이루어졌다. 고 전도도 대 저 전도도 상태에서 상대적인 시간의 계산은 음성 (고 전도도) 또는 양성 (저 전도도) 피크를 찾기 위해 오리진프로의 피크 탐색 기능을 이용하였고, 각각의 상태에서 이벤트의 수는 총 이벤트의 백분율로서 계산하였다.

결과

나노반응기로서 나노피펫을 사용하기 위해, 이온 이동을 통해 세공에서 인산아연의 침전을 제어하기 위한 조건을 확립하였다. 대표적인 배치에서, Ag/AgCl 전극을 나노피펫의 배럴을 채운 전해질 용액 (10 mM 완충제를 함유하는 100 mM KCl) 내로 삽입한다. 피펫 팁을 또한 Ag/AgCl 접지 전극을 담은 전해질 조 내에 침지한다 (도 1 참조).

전위를 인가할 때, 항정 이온 전류가 측정된다. 그러나, 마이크로몰 농도의 염화아연을 조에 첨가할 때, 시스템은 고 전도도 및 저 전도도의 진동 기간을 겪는다. 이들 사이클은 나노피펫 팁 내부에서 고도 불용성 인산아연의 침전, 및 세공으로부터 그의 후속적인 퇴출에 기인하였다. 그러한 피펫 내의 나노침전에 의해 야기된 진동은 도 3에 제시된 바와 같이 수초 정도이고, 저 전도도의 요동 (fluctuating) 상태 및 고 전도도의 상태로의 급속한 단기간 진동을 특징으로 한다. -350 mV 전위에서 이온 전류의 시간 도표 (도 3)은 세공의 완전한 개방으로 종결되지 않는 몇몇 침전 이벤트를 보여주고; 대신에, 저-전도도 상태가 -400 내지 -700 pA 사이에서 요동하는 많은 이벤트가 존재한다. 이들은 아마도 세공을 완전히 차단하기 위해 충분한 크기로 성장하기 전에 퇴출되는 침전물 때문이다. 그러나, 고 전도도 상태에 도달할 때, 전류는 대략 -1200 pA의 최대값에 지속적으로 도달한 후, -400 pA로 신속히 하락한다. 이것은 세공의 완전한 제거 후 신속한 침전을 나타낸다.

침전 반응이 아연 및 포스페이트 이온의 전압-유도된 이온 이동에 의해 제어되고, 2가지 용액의 계면인 나노세공에서 혼합함으로써 단순히 발생하지 않음을 보여주기 위해, 아연 및 포스페이트 반대 이온을 2가지 별개의 용액 내에서 단리하였고; 포스페이트 이온은 나노피펫의 내부에 한정되고, 아연 이온은 조 내에 한정되었다 (도 1). 상기 시스템에서 진동 전류 차단을 유도하기 위한 최소 요구 전압은 -300 mV이다. +500 mV 내지 -200 mV의 전위에서, 안정한 전류가 보였다. -300 mV에서, 전류는 신속한 요동으로 즉시 차단되었다. 나노침전 반응에 대한 전압 역치의 존재는 2가지 용액의 계면에서 2개의 반대-이온 사이에 혼합이 거의 없음을 나타낸다. 양 전위를 인가하면 전류 정류 때문에 보다 작은 크기의 신호를 제공하였지만, 신호는 아연 또는 포스페이트 염의 존재에 의해 영향을 받지 않는다. 상기 전압-의존적 효과는 반대 전하의 전극을 향한 이온의 이동과 일치하고, 이때 포스페이트 및 아연 이온은 피펫 팁에서 만난다 (도 2). 염화아연이 피펫 배럴 내부에 있고 포스페이트가 조 내에 있도록 용액의 배치가 역전될 때, 양 전위 또는 음 전위에서 차단은 일어나지 않는다. 상기 입체형태에서 양 전위는 아연 이온이 피펫에서 밀려나가고, 포스페이트가 조로부터 세공으로 이동할 때 이론상 침전을 일으킬 수 있지만, 이것은 관찰되지 않는다. 상기 입체형태에서 전류 차단의 결여는 피펫의 내부 팁에서 양이온 (예컨대 아연)의 배제 때문일 수 있고, 이것은 원뿔형 나노세공에서 전류 정류의 원인으로서 종종 언급되는 현상이다.

pH 및 조 내의 이온의 농도 및 조성을 변화시킴으로써 침전물의 특성에 대한 추가의 조사를 수행하였다. 침전물은 인산아연 (K_sp가 10^-35 (mol.L^-1)인 수성 시스템 내에서 고도 불용성인 염)으로 이루어진 것으로 가정되었다. pH 7에서 용액 내의 주요 화학종은 인산이수소 (H₂PO₄ ^-) 및 인산수소 (HPO₄ ^{2 -})인 반면, 인산아연은 열역학적으로 안정하고, 중성 또는 산성 pH에서 용액 내에 형성된다. 용액은 대략 1x10^-7 M 포스페이트 및 아연 이온으로 포화된다. 진동 전류 거동은 염화아연을 2 내지 40 μM의 농도로 조에 첨가하고, pH 6 내지 pH 10의 포스페이트 완충제로 채운 피펫 내에서 보였다. 칼슘 및 마그네슘과 같은 다른 2가 이온을 이들 농도에서 시험하였지만, 유일한 다른 대등한 차단은 세공을 비가역적으로 차단한 염화철(III) (10 μM)이었다. 이것은 아마도 수산화철(III) 침전 (인산아연보다 훨씬 덜 가용성인 염 (K_sp Fe(OH)₃ 10^-39) 때문이다.

침전에 의해 차단된 나노세공이 자발적으로 제거되는 몇몇 가능한 메카니즘이 존재한다. PET 트랙-에칭된 나노세공에서 칼슘 및 코발트의 포스페이트 염에서 보이는 전류 진동에 대해, 침전은 과포화 수준으로 염 농도의 국소 증가를 일으키는, 비대칭적 나노세공에서 염의 전압-유도된 농축에 기인하였다. 이것은 나노세공에서 이온 결핍 때문에 침전물이 신속하게 용해한다는 가설을 이끈다. 전산 연구는 제2 메카니즘을 지지하였고, 여기서 침전물에서 인산수소에 의해 공여된 양성자는 세공 표면에서 산화물에 의해 수용되어, 세공-입자 상호작용을 약화시키고 입자가 이동에 의해 제거되도록 한다. 본원에 보고된 세공 차단에 대해, 효과는 인산아연에 대한 포화 수준보다 훨씬 높은 1 내지 100 마이크로몰의 염화아연의 농도에서만 관찰된다. 따라서, 후자의 메카니즘은 본원에서 관찰된 진동에 대한 설명을 제공한다. 상기 메카니즘을 지지하기 위해, 포스페이트 완충제를 채우고 인산아연의 포화 용액에 침지한 피펫에서 전류 진동을 유도하였다. 그러한 경우에 침전물은 아마도 용해되기보다는 세공으로부터 배출된다 (도 14 참조). 도 14에 구멍에서 V <0으로서 제시된 음 전위에서, 반대로 하전된 이온들은 피펫 내부 및 외부의 용액의 계면으로 이동한다. 인산아연이 세공에서 침전하여, 이온 전류를 감소시킨다. 침전물이 충분한 크기로 성장되었을 때, 전기영동력에 의해 세공으로부터 제거된다.

인산아연 침전물이 생각되는 바와 같이 세공 밖으로 이동하면, 전류 진동이 음 전위에서만 보이는 이유가 설명되어야 한다. 침전물의 정확한 화학 조성은 현재 알려지지 않았지만, 인산아연의 덩어리는 제타 (zeta) 전위에 의해 측정될 때 중성 pH에서 순수한 음전하를 갖는 것으로 나타났다. 침전 및 세공의 차단이 세공에서 증가된 전기장을 일으킬 것이고, 따라서 음 전위는 전기영동 및 전기삼투력에 의해 침전물을 세공 밖으로 조 내로 이동시킬 수 있다. 인가된 전압은 이들 실험에서 낮지만 (-300 내지 -500 mV), 전압 하락은 최고 임피던스의 영역, 예컨대 차단된 세공을 가로질러 최대일 것이다. 전기영동력에 의한 입자 배출은 또한 수산화철(III)이 세공으로부터 자발적 제거를 보이지 않는 이유를 설명하는 것을 도울 수 있고, 여기서 입자는 양 전하를 보유하고, 음하전된 석영 표면과 강한 상호작용을 하는 것으로 예상될 것이다. 흥미롭게도, 폴리-L-라이신 전해질 층의 증착 후에 양성 전류 정류를 보이는 피펫은 인산아연의 전압-유도된 혼합이 차단되었지만, 개방 상태로의 임의의 진동을 나타내지 않았다. 아마도, 음하전된 침전물은 양하전된 세공에 대해 높은 친화도를 가지고, 쉽게 제거될 수 없다.

전압-제어된 나노반응기를 사용하여 나노침전의 과정을 개시하는 것에 추가로, 침전물의 크기는 또한 제어될 수 있다. 세공이 나노피펫의 팁에서 전기력 때문에 제거되면, 전위 증가는 세공을 완전히 차단하지 않는 보다 작은 입자를 배출하는 것으로 예상된다. 이것은 -600 mV의 전위에 도달 시에 실험에 의해 입증되었고, 여기서 2가지 구분되는 저-전도도 상태가 보인다 (도 15).

상이한 전류 수준에 대한 계수를 보여주는 막대그래프는 -300, -400, -500, 및 -600 mV에 대한 고 전도도 및 저 전도도의 상태를 보여준다. -600 mV에서, 폐쇄 상태에 비해 개방 상태에서 명백하게 더 시간이 소모되었고, 이것은 또한 시간 도표에서 가시적이다 (도 15a). 예를 들어, -300 mV에서 시스템은 고 전도도 상태 41% 시간 소모를 보여주는 반면, -600 mV에서 그 값은 73%이었다. 이것은 전위가 증가할 때, 침전물이 세공을 차단하는 것이 방지됨을 나타낸다. 측정된 다른 전압과 달리, -600 mV에서 시간 도표는 3가지 상태를 보여준다: 중간 상태 (-3000 내지 -3500 pA), 및 고 전도도 상태 (-6000 pA)보다 드물고 더 긴 지속시간 동안 발생하는 저 전도도 상태 (-800 pA). 중간 상태는 세공을 부분적으로만 차단한 후에만 배출되는 침전물에 대응하는 것으로 생각된다. -600 mV 미만의 전압에서, 침전물은 세공을 완전히 차단하기에 충분한 크기로 성장한 후에만 제거된다.

몇몇 지점에서, 염은 세공 내에 침전물이 배출될 수 없는 정도로 축적할 것으로 예상된다. 상기 기의 침전을 또한 나노반응기에서 연구하였고, 뜻밖의 현상이 밝혀졌다. 많은 나노피펫은 나노침전에 의한 차단의 3개의 기를 겪었다. 제1 기는 고정 음의 인가 전위에서 자발적 전류 진동이었다. 20분 이상의 기간 후에, 세공은 차단되고, 항정 상태의 저-전도도를 나타냈다. 그러나, 상기 기에서, 세공은 양 전위의 급속한 펄스에 의해 일시적으로 고-전도도 상태로 될 수 있었다. 마지막으로, 피펫은 비가역적으로 차단될 것이다. 처음 2개의 기에 대해, 목표는 세공이 제거되고 및 후속적으로 차단될 때 피펫에서 발생하는 사건을 이해하기 위한 것이었다. 반대 극성의 전위 하에 일어나므로 2가지 시스템에 대해 세공 개방의 운동학을 비교할 수 없었다. 기재된 2개의 기에서 피펫에 대해 작용하는 상이한 메카니즘이 존재하는지 밝히기 위해 세공 폐쇄의 운동학을 조사하였다.

세공이 나노세공을 통해 밖으로 음하전된 입자 이동을 일으키는 음 전위에 의해 제거될 수 있으면, 양 전위는 침전물을 반대 방향으로 피펫 팁의 보다 넓은 축으로 이동시키는 것으로 예상된다. 차단된 세공에 대해, +500 mV의 펄스를 잠시 인가한 후 (0.2 내지 2s), -500 mV로 전압을 역전시켰다. 음 전압에서, 고 전도도 상태가 앞서 차단된 세공으로부터 보이지만, 이것은 다시 신속하게 차단된다 (데이타를 제시하지 않음). 짧은 개방 상태는 전류 진동을 겪는 피펫에서 개방 상태와 동일한 크기이고, 따라서 전압의 신속한 변화 때문에 일시 전류보다는 개방 세공에 기인한다. 일시적인 고-전도도 상태는 침전물이 피펫 팁으로부터 멀리 이동되었고 용액으로부터의 침전에 의해 교체됨을 나타내거나, 전위가 양에서 음으로 역전될 때 입자가 세공을 향해 역으로 이동됨을 나타낸다.

세공 폐쇄의 운동학은 2가지 상이한 메카니즘에 대해 구분될 것이다: 나노침전 대 세공 내로 입자의 이동. 진동 대 차단된 세공에서 차단 운동학을 비교하기 위해, 두 조건에 대해 -500 mV에서 개별 이벤트에 대한 전류 차단의 속도를 정량하였다. +500 mV 펄스로 잠시 개방된, 차단된 세공에 대해, 차단 이벤트에서 전류는 전류 진동을 겪는 세공에 대해 4±2 pA/ms에 비해, 74±13 pA/ms의 기울기로 감소한다. 유의하게 더 빠른 전류 차단은 용액으로부터 나노침전 이외의 차단 메카니즘을 나타낸다. 대신에, 이것은 나노세공을 통해 빠져나가기에는 너무 큰 입자의, 기저부로부터 팁까지 나노피펫 내부의 전압-유도 왕복 (shuttling)을 나타낸다. 따라서 상기 현상은 단지 인산아연 염에서만 관찰되었고, 수산화철(III)과 같은 다른 침전물로부터 차단에서 발생하지 않았다.

차단된 나노피펫 내의 침전물이 양 전위의 펄스 동안 팁 내에서 실제로 이동하면, 입자는 교번 전압으로 포획될 수 있어서, 세공을 차단되지 않은 상태로 둔다. 충분히 높은 주파수의 사인파 전위를 인가함으로써, 인산아연에 의해 차단된 것으로 보이는 피펫으로부터 "개방" 전류가 생산될 수 있다. 측정을 위해, pH 7 포스페이트 완충제 (100 mM KCl을 함유하는 10 mM)을 채운 피펫을 2 μM 염화아연을 함유하는 pH 7 Tris 완충제 (100 mM KCl을 함유하는 10 mM)의 조 내에 침지하였다. 피펫은 수분 동안 -500 mV의 고정 전위 후에 차단되었고, 500 내지 -500 mV의 사인파 전위를 0.1, 0.5, 1, 및 5 Hz 주파수에서 인가하였다. 보다 낮은 주파수, 예컨대 0.1 Hz에서, 세공은 전위가 음 전압으로 진동할 때 차단되기 전에 잠시 고-전도도 상태에 접근하는 것으로 보일 수 있었다. 보다 고 주파수에서, 훨씬 더 높은 전도도 상태가 달성되고, 세공은 차단되기 전에 양 전위에 의해 제거된다.

보다 높은 주파수의 사인파 전압을 사용하여 달성된 고-전도도 상태는 진동 전기장을 사용하여 나노침전물의 공간 내의 포획을 나타내고, 또한 전류의 크기가 인가된 전위의 주파수를 사용하여 정밀하게 제어되도록 한다.

실시예 8: 탄수화물 (당류)-반응성 관능화된 중합체 코팅물

나노세공 채널에 적용된 보론산 화학을 이용하여 샘플 용액 내에서 당류를 감지하기 위해 나노피펫 센서를 개발하였다. 근거는 당류가 세공 (이는 개구부 직경에서 예를 들어 10-40 nm일 수 있다)에 비해 작을 수 있지만, 보론산에 대한 당류의 결합은 중성 보론산을 음하전된 보로네이트로 전환시킬 수 있다는 것이다. 나노피펫 및 다른 원뿔형 나노세공은 전류 정류, 또는 이온 투과선택성을 나타내고, 이것은 표면 전하에 감수성이다. 공지의 표면 변형 방법에 기반한 가역적인 센서를 제조하기 위한 시도 - 공유 보론산의 부착 (그 개략도를 도 17에 예시한다) 또는 관능화된 고분자 전해질의 증착을 통해 -는 충분히 감수성이 아니거나 비가역적으로 반응하지 않는 센서를 생성시켰다. 도 17에 제시된 바와 같이 공유 변형된 나노피펫에서, 이온 전류는 pH 7 완충제 내에서 3 mM 글루코스에 반응하였다. 그 이유는 인식 요소가 세공 벽뿐만 아니라 세공의 전체 단면을 덮으면 나노세공의 감수성이 증가할 것이기 때문이다 (나노세공 내로 및/또는 그를 가로질러 연장하도록 가교결합된 중합체의 도면에 대해 도 18c를 참조한다; 주: 중합체는 나노세공을 부분적으로 차단하지만 완전히 차단하지는 않도록 그물-유사 상태이고; 그물은 일반적으로 나노세공의 내부의 가장 먼 부분에 위치할 것이다). 그러한 시스템의 전위 감수성은 중합체 상에 포스페이트 기의 양성자 부가의 결과로서 박막 나노세공의 정류 거동을 변화시킨, 공유 부착된 pH-반응성 "중합체 솔 (brush)"을 사용하여 입증되었다 (문헌 [Yameen, et al. Chem. Commun. 46, 1908-1910 (2010)]). 그러나, 그러한 시스템은 반응을 일으키기 위해 하전된 분석물 (히드로늄 이온)에 의존한다. 중성 분석물의 결합이 나노세공 환경의 전하 상태의 변화를 일으켜, 전류 정류에 영향을 미치는 선행 나노세공 센서는 알려지지 않았다.

방법

시약 및 용액: 모든 원액은 Milli-Q 초순수 내에 제조하였다. 완충제 용액은 염화칼륨 (베이커), 인산나트륨 (이염기성), 탄산나트륨, 및 중탄산나트륨 (시그마)로부터 제조하고, HCl (1 M) 또는 KOH (0.1 M)으로 조정하였다. 알리자린 레드 술포네이트 (ARS), 8-히드록시피렌-1,3,6-트리술폰산, 삼나트륨 염 (HPTS), 에스쿨레틴, L-글루코스, 및 L-프룩토스는 시그마로부터 구입하였다. 분석을 위해 사용된 모든 완충제 용액은 달리 지시하지 않으면 10 mM 완충제 및 100 mM 염화칼륨을 함유하였다.

중합체 PVP - BA 의 합성: 폴리(4-비닐피리딘) (MW 60,000)은 시그마로부터 구입하고 받은 상태로 사용하였다. o-브로모메틸페닐보론산의 합성은 확립된 절차를 이용하여 수행하였다. 자기 교반 막대를 담은 10 mL 환저 플라스크에 폴리(4-비닐피리딘) (0.100 g, 0.00167 mmol) 및 m-브로모메틸 페닐보론산 (0.206 g, 0.954 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 시약을 용해시키기 위해 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 및 메탄올 (2 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 23시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄 (10 mL)을 담은 50 mL 비이커에 적가하여 생성물을 침전시켰다. 생성물의 완전한 침전을 위해 비이커를 얼음조에 넣었다. 이어서, 용액을 제거가능한 상단부 (top)가 있는 2-부분 프릿 (fritted) 필터 내에 붓고, 아르곤 기체를 사용하는 불활성 조건 하에 진공-여과하였다. 생성물을 3 x 15 mL부의 디클로로메탄으로 세척한 후에, 진공 건조기 내에 방치하여 밤새 건조시켰다. 단리된 생성물은 0.257 g (90% 수율)이었다. ¹H-NMR은 중합체의 82% 알킬화를 보여주었다 (데이타를 제시하지 않음).

형광법을 이용한 탄수화물 반응의 측정: 메탄올/물 (1:1) 내에 PVP-BA (0.006 % w/v) 및 HPTS (1.5x10^-6 M)로 이루어지는 프로브 용액을 제조하였다. 1 mL의 프로브 용액의 분취액을 큐벳에 첨가한 후, 1 mL의 카르보네이트 완충제 (20 mM 카르보네이트, 100 mM 염화칼륨, pH 9.5)을 첨가하였다. 460 nm (여기) 및 515-570 nm (방출)의 필터 쌍을 이용하여 형광을 판독하였다. 당류 용액 (물 중 500 mM)의 분취액을 첨가하고, 용액을 1 min 동안 천천히 피펫팅하여 혼합하고, 각각의 첨가 후에 형광을 측정하였다. 첨가된 총 부피는 20 ㎕ (총 부피의 1%)를 초과하지 않았다. 형광 신호를 형광 증가 (F/F₀)로 전환시켰다. 다수의 블랭크 값으로부터 평균한 신호를 기준선 형광, F로서 취하였다. 각각의 신호를 블랭크 값으로 나누어 형광 증가를 얻었다.

석영 나노피펫 전극을 사용한 전류 측정: P-2000 레이저 풀러 (서터 인스트루먼트 컴퍼니)를 사용하여 1.0 mm의 외경 및 0.70 mm의 내경을 갖는, 필라멘트를 갖는 석영 모세관 (QF100-70-5; 서터 인스트루먼트 컴퍼니)으로부터 나노피펫을 제작하였다. 사용된 파라미터는 히트 625, 필라멘트 4, 속도 60, 지연 170, 및 풀 180이었다. 이온 전류를 측정하기 위해, 2개의 전극 배치를 사용하였다. 나노피펫을 완충제 용액 (포스페이트/KCl, pH 7)으로 다시 채우고, Ag/AgCl 전극을 삽입하였다. 또 다른 Ag/AgCl 전극을 보조/참조 전극으로 작용하는 0.3 mL 벌크 용액 내에 넣었다. 두 전극은 디지데이타 1322A 디지타이저 (몰레큘라 디바이시즈)가 구비된 악소패치 700B 증폭기, 및 pClamp 10 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시즈)가 설치된 PC에 접속되었다. 나노피펫 전극의 완전한 습윤을 보장하기 위해, 나노피펫 팁을 N,N-디메틸포름아미드 내에 완충제로 다시 채운 후 5-10초 동안 침지하였다. 양 전위는 반대 전극에 비해 나노피펫의 배럴 내의 전극에 인가된 애노드 전위를 나타낸다. 실험은 24℃에서 수행하였다.

나노피펫 내에 PVPBA 의 함침: 나노피펫 배럴을 포스페이트 완충제 (pH 7)로 채우고, 반대 전극을 담은 카르보네이트 완충제 (pH 9.5) 내에 침지하였다. 나노피펫이 음성 전류 정류를 보이는 것을 입증한 후에, 0.03% (w/v) 중합체를 함유하는 메탄올 용액 내에 잠시 침지한 후, 카르보네이트 용액으로 돌려보냈다. 중합체의 성공적인 고정화는 전류 정류의 완전한 역전을 일으켰다.

중합체-변형된 나노피펫을 사용한 탄수화물 반응의 측정: 변형된 나노피펫을 반대 전극을 담은 0.30 mL의 카르보네이트 완충제 용액 (pH 9.5) 내에서 분석하였다. 용액에 순수한 물 내의 농축된 분석물 용액의 분취액을 첨가하였다. 첨가된 총 부피는 부피 변화를 5%로 제한하기 위해 15 ㎕를 초과하지 않았다. 반응을 실시간으로 측정하기 위해, 0.5 Hz의 주파수에서 -500 내지 +500 mV의 사인파 전위를 사용하여 전류를 분석하였다. 분취액 첨가 이후 신호가 안정화된 후에, 전압을 0.5 mV/ms의 속도로 -500에서 +500 mV까지 스위핑 (sweeping)함으로써 전류를 분석하였다. 각각의 측정은 5회 스위핑으로 이루어졌다.

전기화학적 데이타 분석: pClamp 소프트웨어 (전압 스위핑에 대한 샘플링 주파수 1000 Hz, 사인파 기능에 대해 200 Hz)로 기록한 이온 전류 측정치를 분석 및 그래프 작성을 위해 오리진프로 8.5 (오리진랩스)로 전송하였다. 각각의 데이타 점에 대한 I-V 곡선을 생성하기 위해, 500 mV s^-1의 스캔 속도에서 -800 내지 +800 mV의 5회 전압 스위핑을 평균하고, 각각의 지점에 대해 표준 편차를 계산하였다. 결합 등온선을 생성하기 위해, 고정 전위에서 전류를 분석물 농도의 함수로서 플롯팅하였다.

관능적 고분자 전해질의 화학적 특성

양이온성 탄수화물-반응성 중합체를 제조하기 위해, m-브로모메틸 페닐보론산을 사용하여 분자량 60,000의 상업적으로 이용가능한 폴리(4-비닐피리딘) (PVP)를 알킬화시켰다. 생성물인 PVP-BA가 N,N-디메틸포름아미드 및 메탄올 내에서 반응 혼합물로부터 침전되었다. 이것은 메탄올 내에 약한 가용성이고 (1% w/v 이하), 산성 메탄올/물 용액 내에 난용성이고, 다른 수성 및 유기 용매 내에 실질적으로 불용성이다. 벤질 브로마이드로 알킬화시킨, 벤질화된 버전의 중합체 (PVP-Bn)는 훨씬 더 높은 용해도를 보였다. 중합체의 알킬화 효능은 ¹H-NMR 스펙트럼의 통합에 의해 결정하였다. 중합체 PVP-BA는 약 85% 알킬화를 보인 한편, PVP-Bn에 대해 알킬화 효능은 90%이었다. PVP-BA에 대해 170,000 및 PVP-Bn에 대해 150,000로서 중합체의 몰 질량을 추정하기 위해 이들 값을 사용하였다. 폴리(비닐피리딘)과 같은 고분자 전해질은 단백질 흡수 및 겉보기 pK_a를 특성화하기 위해 적정에 의해 분석할 수 있다.³²

중합체 PVP-BA의 pH-의존성을 평가하기 위해, 메탄올/물 내의 1% w/v의 용액을 pH 2로 산성화하였다. 히드록시드로 적정할 때, 중합체는 약 pH 8에서 빠르게 침전하였다. 상기 침전 지점은 고도로 재현가능하였고, 용액 내의 페닐보론산의 pK_a와 일치한다. 이 지점에서, 보론산의 보로네이트로의 전환은 피리디늄기로부터의 전하를 효과적으로 중화하여, 훨씬 더 적은 극성의 양쪽성 이온 중합체를 형성할 것이다. 상기 침전 지점은 보론산의 pK_a를 2 pH 단위만큼 낮추는 것으로 알려진 20 mM 단당류의 존재 하에 조정된다 (침전 데이타에서 pH 참조, 도 20). pH 7.8±0.2에서 PVP-BA의 침전에 비해, 글루코스는 pH 6.5±0.1에서 침전이 일어나도록 하고, 프룩토스는 pH 5.58±0.08에서 침전을 일으킨다. 프룩토스는 대부분의 보론산 수용체와 높은 친화도를 갖는 것으로 알려져 있다. 상기 연구는 글루코스 및 프룩토스가 둘 모두 사용된 PVP-BA에 결합하는 것을 보여준다. 상기 방법은 다양한 고분자 전해질이 나노피펫 상의 코팅물로서 사용될 수 있는지 결정하기 위해, 및 예를 들어, 음하전된 기를 첨가하거나 음하전된 기의 위치를 변경시킴으로써 중합체의 pH 반응성을 조정하기 위해 사용될 수 있다.

탄수화물과 양이온성 중합체의 상호작용을 보다 잘 특성화하기 위해, 각각 중합체 PVP-BA 및 PVP-Bn과 상호작용할 수 있는 3가지 비색 염료를 선택하였다. 글루코스 감지를 위한 대용물로서 작용하는 이들 염료는 상업적으로 이용가능하고, 공개된 구조를 갖는다. 알리자린 레드 술포네이트 (ARS)는 카테콜 및 음전하를 모두 함유하고, 에스쿨레틴은 카테콜만을 함유하고, 8-히드록시피렌-1,3,6-트리술폰산, 삼나트륨 염 (HPTS)은 3개의 음전하를 갖는 염료이다. 각각의 염료의 용액을 중합체로 적정하고, 흡수 스펙트럼을 기록하였다. PVP-BA 또는 PVP-Bn과 함께 ARS 염료에 대한 대표적인 흡수 스펙트럼을 도 21에 제시한다. 보론산을 함유하지 않는 PVP-Bn의 존재 하에, 420 nm에서 최대 흡수도는 감소하고, 432 nm로 적색-이동한다. PVP-BA를 염료에 첨가할 때, 최대 흡수도는 증가하고, 467 nm로 이동한다. 이들 2가지 구분되는 현상은 보론산 결합 및 정전기 상호작용 모두로 인한 상호작용을 보여준다. 또한, ARS는 BA 중합체에 결합하지만, Bn 중합체에는 결합하지 않는다.

λ_max에서 흡수도 차이를 측정함으로써, 중합체 농도의 함수로서 △A를 보여주는 곡선을 얻었다. 중합체에 대한 각각의 염료의 감수성은 표 1에 요약한, 곡선의 선형 부분의 기울기를 이용하여 측정하였다. PVP-BA (보론산-첨부된 다가양이온)에 대해, ARS에 대한 친화도는 HPTS의 2배였고, 이것은 정전기적 인력 및 결합 형성 모두의 상승 효과를 보여준다. 이와 반대로, PVP-Bn은 ARS에 비해 HPTS에 대해 더 강한 친화도를 보여주고, 이것은 모든-정전기 메카니즘과 일치한다. 중요하게는, 에스쿨레틴에 대한 친화도는 PVP-BA보다 PVP-Bn에 대해 일차수 더 낮다. 이것은 보론산의 부재 하에, 다가양이온 및 하전되지 않은 카테콜 사이에 상호작용이 거의 없음을 보여준다. △A 대 중합체 농도를 플롯팅하면 시험한 모든 염료에 대해 평탄한 곡선을 생성하지만, 어느 것도 표준 결합 등온선에 대한 우수한 피팅을 보이지 않았다. 이것은 아마도 다수의 결합 부위 (중합체 사슬당 약 500)를 갖고 염료의 존재 하에 응집할 수 있는 중합체의 복합체 성질 때문이다.

관능적 중합체로 함침된 나노피펫

보론산-함유 다가양이온 PVP-BA으로 관능화된 나노채널을 형성하기 위해, 포스페이트 완충제를 채운 석영 나노피펫 (세공 직경 20-40 nm)을 사용하였다. 상기 매질 내에서 중합체는 불용성이다. 중합체 첨가 전에, 이들은 pH 7에서 음성 정류된 이온 전류를 보인다. 즉, IV 도표는 음 전압에서 보다 높은 전류를 보여준다. 나노채널을 중합체로 관능화하기 위해, 나노피펫을 0.3% 농도 (w/v)로 중합체를 함유하는 메탄올 용액 내에 잠시 침지하였다. 나노피펫 팁을 중성 완충제 용액으로 돌려보내면, 전류 정류가 역전되어, 양 전위에서 더 높은 비선형 전도도를 보여준다. PVP-BA 피펫은 +전압에서 더 큰 이온 전류, 및 음 전위에서 매우 적은 전류를 보여주었다.

반전된 전류 정류는 중합체가 시스템의 임피던스가 가장 높은 나노피펫의 세공을 관통하는 증거이다. 양의 정류가 수시간에 걸쳐 안정한 몇몇 그러한 중합체-변형된 나노채널을 생성하였다. 중합체는 나노피펫의 외부 상에 보이지 않았다. 아마도, 변형된 이온 전류가 나노채널 내에 함침된 중합체로부터 생성하여, 음하전된 석영에 대한 정전기적 인력 및 완충제 내의 제한된 용해도 둘 모두에 의해 제자리에 유지된다. 나노채널 내의 중합체를 가시화하는 것은 현실적이지 않지만, 시스템에 유사하도록 마이크로피펫을 유사하게 처리하였다. 중합체의 가시화를 위해 20 ㎛ 세공 직경의 마이크로피펫을 1 mM ARS를 함유하는 포스페이트 완충제로 채웠다. 중합체를 메탄올 용액 내에 침지하면 마이크로피펫의 가장 팁에서 보라색 색상을 생성시켰다. 20분 후에도, 매우 적은 중합체가 피펫 팁의 보다 넓은 개구부까지 확산되었다.

변형된 나노피펫 전극의 pH 감수성은 석영 나노피펫보다 상당히 더 크다. 노출된 석영 나노피펫의 음의 정류는 pH 3에서 근소한 감소만을 보여주고, 이것은 실란옥시기의 양성자 부가에 상응한다. 이와 반대로, 함침된 PVP-BA를 갖는 나노피펫은 pH 8 내지 pH 3의 음 전위에서 실질적으로 전도도를 보이지 않는다 (데이타를 제시하지 않음). 양 전위에서 전도도는 pH 감소에 따라 증가하고, 여기서 pH 5 내지 pH 3에서 가장 큰 변화를 보여주었다. 나노채널/중합체 물질의 전기화학적 거동은 용액 내의 중합체의 특성으로부터 예측되지 않고, 이것은 pH 7 내지 8의 양성자 부가 상태에서 최대 변화를 겪는다.

음이온성 카테콜 ARS는 시험된 염료 중에서 용액 내의 중합체 PVP-BA에 대해 최고 친화도를 보여주었다. 상기 염료를 사용하여 이온 투과선택성의 조정을 시험하기 위해, 중합체-변형된 나노피펫을 pH 9.5의 카르보네이트 완충제에 침지하였다. 이들 염기성 조건 하에, 음이온성 보로네이트 에스테르의 형성이 보장된다.³⁴ 도 22에 제시된 바와 같이, 변형된 나노채널 냉에 모든 양의 정류를 무효화하기 위해 60 μM정도의 적은 ARS가 충분하다. 360 μM ARS에서, 전류는 음 정류된다. 도 22를 살펴보면, 360에서 화살표는 음 전압에서 증가된 음의 전류를 나타낸다. 본 실시예에서, 약 -1 nA의 음의 전류가 -500 mV에서 관찰된 반면, +500 mV는 약 +0.6 nA를 생성하였다. 본 실시예는 또한 블랭크, 60 μM 및 360 μM 농도의 ARS가 구분될 수 있는 방식을 보여준다. 이온 전류 정류가 역전되므로, 염료 첨가는 나노세공 또는 나노채널의 차단을 일으키는 것으로 나타나지 않는다. 대신에, 매트릭스 내에서 정전하의 역전에 기반하여 채널의 이온 투과성은 역전된다.

낮은 농도의 ARS (<0.1 mM)에서, 이온 전류 정류의 조정은 완전히 가역적이고, 이때 세척 매질을 요구하지 않는다. 보다 높은 농도는 시스템을 영구적으로 음성 정류되도록 하였다. 이것은 특히 염료가 벌크 용액 내로 확산하는 것이 방지되는 중합체 매트릭스 내로 깊게 투과하는 경우에, 중합체 및 염료 사이의 강한 상호작용 때문일 수 있다.

ARS를 사용하여 보여진 변형된 나노채널 내의 이온 전류 정류의 역전은 염료의 전하 및 보론산-함유 매트릭스 내에서 pK_a 이동 둘 모두 때문일 수 있다. 중성 탄수화물에 대해, 정류의 변화는 나노채널 내의 보론산/보로네이트 평형에 기여하여야 한다. 중합체-함침된 나노채널에 프룩토스 (10 mM)를 첨가하면 양에서 음으로 전류 정류의 신속한 반전을 일으켰다 (도 23-24). 도 23의 곡선은 블랭크 나노피펫에서는 정류가 거의 없지만, 10 mM 프룩토스의 존재가 음의 정류를 보여주는 IV 곡선을 생성시켰음 (즉, 음 전압에서 보다 높은 전류)을 보여준다. 도 24는 프룩토스에 노출 및 나노피펫 팁을 순수한 완충제로 돌려보냈을 때 모두 전류 정류의 완전한 반전을 위한 반응 시간이 3 내지 5분인 점에서 결합의 가역성을 보여준다. 흥미롭게도, 초기 양의 정류된 I-V 곡선의 단지 일부만이 프룩토스에 노출된 후에 회복된다. 도 23에 제시된 바와 같이, 음 전위에서 전도도는 반복된 사이클의 프룩토스 노출에서 완전하고 재현가능한 교체를 겪는다. 이것은 양 전위에 대해서는 반드시 그렇지는 않다. 도 23에 제시된 바와 같이, PVP-BA 변형된 나노피펫에 대한 초기 신호는 600 mV이하의 양 전위에서 고도로 개방된다. 상기 개방 상태는 프룩토스에 노출된 후에 완전히 회복되지 않는다. 이것은 탄수화물 결합의 결과로서 나노채널 내에서 매트릭스의 일부 조건화를 나타낸다. 전류 정류의 크기는 상이한 중합체-함침된 나노채널 사이에서 상이하지만, 시험된 몇몇 시스템에 대해 프룩토스의 존재 하에 정류의 반전은 완전하고 가역적이었다 (도 25). 예시적인 점 (254 및 255)는 상이한 실험에서 각각 양의 정류 및 음의 정류를 보여준다.

음 전위에서 전류 반응의 완전한 역전 때문에, 개방 상태 및 폐쇄 상태 사이에 프룩토스 조정된 개폐를 보여주기 위해 고정된 음 전위에서 전류를 이용할 수 있다. 도 24에 제시된 바와 같이, -500 mV에서 전류는 몇몇 사이클의 프룩토스 노출에서 완전히 가역적이다. 중요하게는, 신호를 회복하기 위해 요구되는 세척 조건은 없다. 또한 I-V 곡선의 평탄성으로부터 중합체 매트릭스는 전기장에 의해 영향을 받는 것으로 보이지 않음을 알아야 한다. 대신에, 나노채널에서 이온 투과성을 조정하는 것은 오직 중성 탄수화물의 존재이다.

ARS에서와 같이, 프룩토스에 대한 변형된 나노채널의 반응은 농도-의존적이다 (도 26-27). -500 mV의 전위에서 전류를 프룩토스 농도의 함수로서 플롯팅함으로써, 주어진 나노채널에 대해 다음 식에 의해 제시된 결합 친화도를 결정할 수 있다:

상기 모델은 S를 신호, 본 경우에 이온 전류로서, S_max를 분석물로 포화시킬 때 계산된 신호로서, [A]를 분석물 농도로서, K_b를 결합 상수 (M^-1 단위)로서 사용한다. 곡선의 피팅으로부터 결정된 결합 상수는 제시된 나노채널에 대해 360±110 M^-1이고, 이것은 용액 내에 모노-페닐보론산을 사용하여 측정된 결합 상수와 일치한다. 이들 친화도는 넓게 변할 수 있지만, 일반적으로 100 내지 5000 M^-1 범위 내에 있다. 용액 상 중합체에 대해 나노채널-한정된 중합체의 반응을 비교하기 위해, 나노채널 전극과 유사하게, 정전하에 의해 조정되는 형광-기반 검정을 수행하였다. 염료 HPTS를 사용함으로써, 알로스테릭 (allosteric) 지시약-치환 검정 (AIDA)을 이용하여 프룩토스 반응을 측정하였다. 용액 내에서, HPTS는 PVP-BA 중합체와 기저-상태 복합체를 형성하여, 형광을 켄칭한다. 2가지 성분은 양이온성 고분자 전해질이 음이온성 염료로 정전기에 의해 당겨진다. pH 9.5에서, 프룩토스 첨가는 중합체 상의 보론산기를 음이온성 보로네이트로 만들어, 중합체 상의 총 양 전하를 중화시키고 형광 염료를 치환한다. 상기 시스템에서, 겉보기 결합 상수는 프룩토스에 대해 3200±400 M^-1로서 결정되었다 (도 26). 상기 친화도는 원뿔형 나노채널에서 중합체를 사용하여 측정된 것보다 더 크지만, 보론산-프룩토스 결합에 대해 여전히 보고된 값 내에 있다. 중합체에 대한 환경은 두 시스템에 대해 매우 상이하지만, 두 경우 모두에 신호를 제공하는 것은 중합체 전하에서 조정이다. 잘 특성화된 수용체 매트릭스를 사용하여 자극-반응성 나노유체 다이오드를 빠르게 조작하는 능력은 나노세공에서 이온 투과성을 제어하기 위해 새로운 전략을 제공한다.

따라서, 도 25 및 26의 데이타는 인정되는 검정에서 얻어진 형광 값이 고정 음 전압에서 다양한 농도의 프룩토스에서 얻어진 이온 전류 값과 대등하고, 본 발명의 전기화학적 방법이 형광 방법보다 더 높은 동역학 범위를 가짐을 보여준다.

PVP-BA 중합체가 함침된 나노피펫을 포함하는 센서는 또한 pH 9.5에서 음의 정류의 증가에서 글루코스에 반응하는 것으로 나타났다. 완충제에서 1.42의 음의 정류 비를 보여주는 센서를 20 mM 글루코스에 노출시켰고, 이때 음의 전류가 증가하여 1.99의 음의 정류 비를 생성시켰다. 음의 전류 비는 전위 -500 mV에서 전류 대 전위 +500 mV에서 전류의 비로서 정의된다.

결론

상기 구체적인 설명은 본 발명을 예시하고 입증하기 위한 것으로 의도되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 보지 않아야 하며, 본 발명의 범위는 첨부되는 특허 청구항의 문자 그대로의 범위 및 동등한 범위에 의해 규정된다. 본원에서 언급되는 임의의 특허 또는 간행물은 명시적으로 제시될 수 없지만 당 분야의 기술자에 의해 이해되는 본 발명의 특정 측면의 수행에 유용한 방법 및 물질의 상세한 내용을 전하기 위한 것으로 의도된다. 상기 특허 또는 간행물은 언급되는 방법 또는 물질의 설명 및 실행을 위해 필요한 바에 따라, 마치 그 각각이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되고 본원에 제시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

Claims (29)

1. (a) 나노세공으로 이어지는 나노피펫의 내부 구멍 (bore)을 규정하는 모세관 부분;
   (b) 내부에 전극 및 상기 나노세공을 통해 외부 용액과 소통하는 내부 용액을 함유하기에 적합한 상기 내부 구멍; 및
   (c) (i) 상기 나노세공의 내부 표면에 직접 결합되는 고분자 전해질 층; 및
   (ii) 이온 또는 200 원자 질량 단위 미만의 분자량을 갖는 소분자로 이루어진 군 중에서 선택되는 분석물에 대한 결합에 특이적인, 상기 고분자 전해질에 연결되는 결합 분자
   를 포함하는, 상기 나노세공의 내부 표면 상의 코팅물
   을 포함하는, 샘플 내의 분석물을 검출하는 장치에 사용하기 위한 나노피펫.
2. 제1항에 있어서, 상기 결합 분자가 보론산 또는 보론산 에스테르인 나노피펫.
3. 제2항에 있어서, 상기 고분자 전해질이 다가양이온인 나노피펫.
4. 제3항에 있어서, 상기 다가양이온이 폴리알킬 피리딘 또는 폴리아민인 나노피펫.
5. 제2항에 있어서, 상기 코팅물이, 상기 나노세공 내로 연장되고 이를 부분적으로 차단하는 부분을 추가로 포함하는 것인 나노피펫.
6. 제1항에 있어서, 결합 분자가 킬레이팅제인 나노피펫.
7. 제6항에 있어서, 고분자 전해질 층이 (a) 폴리아크릴산 층, (b) 폴리아민 층, 및 (c) 폴리아크릴산 및 폴리아민이 교대로 존재하는 층으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 나노피펫.
8. 제7항에 있어서, 폴리아민이 폴리알킬 피리딘인 나노피펫.
9. 제1항에 있어서, 결합 분자가, 다당류 또는 폴리펩티드인 이온 결합 중합체인 나노피펫.
10. 제9항에 있어서, 중합체가 키토산인 나노피펫.
11. 제9항에 있어서, 중합체가 칼모듈린인 나노피펫.
12. 샘플 내로 개방된 나노세공을 갖는, 제1항에 정의된 나노피펫;
    내부 용액과 접촉하도록 배열된, 상기 내부 구멍 내의 전극, 및 상기 샘플과 접촉하도록 배열된 참조 전극;
    당류 결합에 대해 특이적이고 상기 당류에 결합하기에 효과적인 결합 분자; 및
    전극 사이에 전압을 생성하고, 샘플, 나노세공 및 내부 용액을 통한 양이온 및 음이온 전류를 측정하기 위한 전압 제어 회로
    를 포함하고, 상기 샘플 내의 당류가 상기 결합 분자를 포함하는 상기 코팅물에 결합할 때 음이온 전류의 농도 의존적 변화를 야기하는 것인,
    샘플 내의 당류 분석물을 측정하기 위한 나노피펫 장치.
13. 제12항에 있어서, 결합 분자가 단백질인 나노피펫 장치.
14. 제12항에 있어서, 결합 분자가 보론산 또는 보론산 에스테르인 나노피펫 장치.
15. 제12항에 있어서, 나노피펫이 석영인 나노피펫 장치.
16. 제12항에 있어서, 상기 전압 제어 회로가 전압 클램프 증폭기를 포함하는 것인 나노피펫 장치.
17. 제12항에 있어서, 상기 코팅물이 다가양이온을 포함하는 것인 나노피펫 장치.
18. 제1항에 있어서, 결합 분자가 감지 분자이고, 여기서 고분자 전해질 층 및 감지 분자는 나노세공 내로 연장되고 이를 부분적으로 차단하기 위해 나노세공에 적용되는 것인 나노피펫.
19. 제1항에 있어서, 결합 분자가, 다당류인 이온 결합 중합체인 나노피펫.
20. 제1항에 정의된 나노피펫을 사용하여 샘플 내의 분석물을 검출하는 방법.
21. 제12항에 정의된 나노피펫 장치를 사용하여 샘플 내의 글루코스를 측정하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 결합 분자가 보론산 또는 보론산 에스테르인 방법.
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