CN107446903A - 一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因 - Google Patents

一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物酶技术领域，公开了一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因，果胶酶PetSbs具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，编码基因petSbs具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列。本发明提供了包含petSbs的重组载体，该重组载体为重组质粒。本发明提供了包含重组载体的宿主细胞，重组载体转化宿主细胞得到重组菌株。本发明的果胶酶PetSbs最适pH值为5.0、7.0和7.5，具有耐盐和耐乙醇的性质，可应用于纺织、造纸、食品等行业。

Description

一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，尤其涉及一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因。
背景技术
果胶主要由D-半乳糖醛酸以α-1,4-糖苷键聚合而成，广泛存在于陆生植物的细胞壁中，最高可占细胞壁干重的三分之一，是植物细胞组织的“粘合剂”。果胶酶可将果胶降解为半乳糖醛酸低聚糖或半乳糖醛酸，在纺织、造纸、废水处理、食品、生物技术、饲料等方面应用广泛(Zhou et al.,Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012,17:729–738)。
大部分的酶都只有1个最适pH，而只有很少的酶具有多个最适pH，如来源于曲霉的类群1植酸酶和一些β-葡聚糖酶(Zhou et al.,Food Chemistry,2016,194:156–166)。由于不同的应用环境中pH值常常具有较大差异，所以具有多个最适pH的酶将具有更广泛的用途。
耐盐酶在需要高盐浓度的行业中具有重要的应用价值，如高盐稀态酱油发酵；高盐条件下的发酵可以省略灭菌步骤，降低能耗。但是，由于盐析、金属离子抑制催化氨基酸及底物结合氨基酸等作用，大部分的酶不具有良好的耐盐性。
耐乙醇的酶在利用同步糖化发酵法生产乙醇中具有优势，可提高乙醇产量和生物质利用率、缩短发酵时间，但乙醇会破坏酶中原有的氢键，是常用的蛋白变性剂。因此，大部分的酶不具有良好的耐乙醇性。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有的果胶酶不具有多个最适pH，不同时具有良好的耐盐性和耐乙醇性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶PetSbs及其基因，同时提供了果胶酶PetSbs的制备方法。
本发明的目的在于提供一种果胶酶PetSbs，所述果胶酶PetSbs的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。经BLAST比对，果胶酶PetSbs与GenBank中Parapedobacter indicus来源的蛋白(WP_090625786)具有最高的氨基酸序列一致性，为45.3％。说明果胶酶PetSbs是一种新的果胶酶。
本发明的另一目的在于提供一种所述果胶酶PetSbs的编码基因petSbs，所述编码基因petSbs的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述编码基因petSbs的重组载体，所述重组载体由具有SEQ ID NO.2核苷酸序列的基因片段与表达载体重组构建而成。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述重组载体的重组菌株。
本发明的另一目的在于提供一种所述果胶酶PetSbs的制备方法，所述果胶酶PetSbs的制备方法包括：
用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
培养重组菌株，诱导重组果胶酶PetSbs表达，得到果胶酶PetSbs。
本发明的优点及积极效果为：果胶酶PetSbs有3个最适pH，分别为5.0、7.0和7.5，同时该酶在酸性至碱性(pH4.0～8.5)的环境中都具有良好的活性和稳定性，而现有果胶酶只有1个最适pH，大部分现有果胶酶只在酸性、中性或者碱性中具有良好的活性和稳定性，导致现有的一种果胶酶通常只能应用于一类pH要求相似的行业；果胶酶PetSbs同时具有耐盐和耐乙醇的性质，在5.0～20.0％(w/v)的NaCl或KCl中，或在3.0～15.0％(v/v)的乙醇中，该酶活性和稳定性保持在50％以上，而现有果胶酶不同时具有耐盐和耐乙醇性质。果胶酶PetSbs的优良性质表明其可应用于纺织、造纸、食品等多个行业。
附图说明
图1是本发明实施例提供的果胶酶PetSbs的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组果胶酶PetSbs的SDS-PAGE分析；其中，M:蛋白质Marker；PetSbs:纯化的重组果胶酶PetSbs；
图3是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs的pH活性示意图。
图4是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs的pH稳定性示意图。
图5是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs的热活性示意图。
图6是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs的热稳定性示意图。
图7是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs在不同浓度NaCl中的活性和稳定性示意图。
图8是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs在不同浓度KCl中的活性和稳定性示意图。
图9是本发明实施例提供的纯化的重组果胶酶PetSbs在不同浓度乙醇中的活性和稳定性示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的果胶酶PetSbs最适pH值为5.0、7.0和7.5，具有耐盐和耐乙醇的性质。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的果胶酶PetSbs具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。果胶酶PetSbs总共含244个氨基酸，理论分子量为26.48kDa，其中N端有20个氨基酸为预测信号肽序列“MKRLIYSFIITLFFIQNLSA”，成熟的果胶酶PetSbs含224个氨基酸。果胶酶PetSbs有3个最适pH：在McIlvaine buffer缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为5.0；在0.1M Tris-HCl缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为7.0；在0.1M Glycine-NaOH缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为7.5。经pH值为5.0～9.0的缓冲液处理1h，该酶剩余酶活55％以上。果胶酶PetSbs的最适温度为65℃；在55～110℃下，该酶具有74％以上的活性。果胶酶PetSbs在37℃下稳定；在50℃下，该酶半衰期为1h。添加终浓度为0.1～1.0mM的β-Mercaptoethanol、MgSO4、MnSO4、AlCl3、EDTA、FeSO4和Pb(CH3COO)2，果胶酶PetSbs的活性几乎不受影响。在5.0～20.0％(w/v)的NaCl中，果胶酶PetSbs具有50％以上的活性和稳定性。在5.0～20.0％(w/v)的KCl中，果胶酶PetSbs具有70％以上的活性和稳定性。在3.0～15.0％(v/v)的乙醇中，果胶酶PetSbs具有50％以上的活性和稳定性。
本发明实施例提供了果胶酶PetSbs的编码基因petSbs。具体的，petSbs具有SEQID NO.2所示的核苷酸序列，全长735bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG，来源于鞘氨醇杆菌。
本发明实施例提供了包含petSbs的重组载体，该重组载体为重组质粒。
本发明实施例提供了重组载体的构建方法：将果胶酶PetSbs的编码基因petSbs插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达载体的核苷酸序列相连接。优选的，将本发明的果胶酶基因和表达载体大肠杆菌的质粒pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-petSbs。
本发明实施例提供了包含重组载体的宿主细胞，重组载体转化宿主细胞得到重组菌株。优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种；更优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，将重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-petSbs转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/petSbs。
如图1所示，本发明实施例提供的果胶酶PetSbs的制备方法包括以下步骤：
S101：用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
S102：培养重组菌株，诱导重组果胶酶PetSbs表达；
S103：回收所表达的果胶酶PetSbs。
下面结合试验及具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
一、试验材料和试剂
1、菌株及载体：鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株Sphingobacterium spiritivorum CGMCC 1.10853；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。
2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；pectin购自Sigma公司；Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒购自Zymo Research公司；Truseq DNASample Preparation Kit购自Illumima公司，其它都为国产试剂，均可从普通生化试剂公司购买得到。
3、培养基：
LB培养基：10g Peptone、5g Yeast extract、10g NaCl，加蒸馏水至1000mL，呈中性。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。
CAI培养基：10g Tryptone、5g Yeast Extract、3.55g Na2HPO4、3.4g KH2PO4、2.68g NH4Cl、0.71g Na2SO4、0.49g MgSO4·7H2O、0.03g FeCl3·6H2O、0.5g葡萄糖、2g乳糖、5mL甘油，各组分分别溶解后混合均匀，滴加浓NaOH调节pH值至7.0后定容至1000mL，高温高压灭菌，4℃保存备用。
二、以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：果胶酶基因petSbs的克隆
提取鞘氨醇杆菌基因组DNA：将培养2d的液体菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，500mM NaCl，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min手动混匀一次，在4℃下以10000rpm的速率离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下以10000rpm的速率离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃环境中备用。
用超声打断仪Biorupter将5μg的鞘氨醇杆菌基因组打断为400–600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TurseqDNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3'端加A碱基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。
基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到果胶酶基因petSbs，该基因序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：重组果胶酶PetSbs的制备
以5'CAGGAATACAATGCCTCTAAGT 3'和5'TAAGATAGATTTACCATTTGGG 3'为引物对，鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。PCR结果得到果胶酶基因petSbs，并将该酶基因petSbs与表达载体pEasy-E2相连接，获得含有果胶酶基因petSbs的重组质粒pEasy-E2-petSbs，将pEasy-E2-petSbs转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/petSbs。
取含有重组质粒pEasy-E2-petSbs的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/petSbs，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以2％接种量接种到CAI(含100μg/mL Amp)培养液中，在25℃快速振荡培养约20～24h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后在4℃下13,000rpm离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果(图2)表明，重组果胶酶PetSbs在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。
实施例3：纯化的重组果胶酶PetSbs的性质测定
1、纯化的重组果胶酶PetSbs的活性分析
实施例2纯化的重组果胶酶PetSbs的活性测定方法为紫外吸收法：将底物pectin或polygalacturonic acid溶于缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含50μL适量稀释酶液，450μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应适当时间，然后加0.75mL 0.02M HCl终止反应，冷却至室温后在235nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol不饱和低聚半乳糖醛酸所需的酶量；摩尔吸光系数为4600/M/cm。
2、纯化的重组果胶酶PetSbs的pH活性和pH稳定性测定：
酶的最适pH测定：将果胶酶PetSbs在65℃下和pH为3.0～9.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于pH为3.0～10.0的缓冲液中，在20℃下处理1h，然后在pH 7.0的Tris-HCl缓冲液及65℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：McIlvaine buffer(pH为3.0～8.0)、0.1M Tris-HCl(pH为6.0～9.0)和0.1M Glycine-NaOH(pH为7.0～10.0)。以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶学性质。结果表明：果胶酶PetSbs有3个最适pH；在McIlvaine buffer缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为5.0，在pH4.0～6.0的条件下具有40％以上的酶活性；在0.1M Tris-HCl缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为7.0，在pH6.0～8.0的条件下具有45％以上的酶活性；在0.1M Glycine-NaOH缓冲液中，果胶酶PetSbs的最适pH为7.5，在pH7.0～8.5的条件下具有55％以上的酶活性(图3)。经pH值为5.0～9.0的缓冲液处理1h，该酶剩余酶活55％以上(图4)。
3、纯化的重组果胶酶PetSbs的热活性及热稳定性测定：
酶的最适温度测定：在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中，于50～120℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37～90℃中，处理1h后，在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶学性质。结果表明：果胶酶PetSbs的最适温度为65℃；在55～110℃下，该酶具有74％以上的活性(图5)。果胶酶PetSbs在37℃下稳定；在50℃下，该酶半衰期为1h(图6)。
4、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组果胶酶PetSbs活力的影响：
在酶促反应体系中加入0.1～1.0mM或0.05～0.5％(v/v)的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶活性。结果(表1)表明，添加终浓度为0.1～1.0mM的β-Mercaptoethanol、MgSO4、MnSO4、AlCl3、EDTA、FeSO4和Pb(CH3COO)2，果胶酶PetSbs的活性几乎不受影响；0.1mM的FeCl3、SDS、CoCl2、HgCl2、AgNO3、NiSO4、ZnSO4、CuSO4、CaCl2及0.05％(v/v)的Tween 80和Triton X-100对PetSbs无影响或影响较小；0.5mM的SDS和0.25％(v/v)的Tween 80对PetSbs有微弱的促进作用；1mM的SDS、CoCl2、HgCl2、AgNO3、NiSO4、ZnSO4、CuSO4、CaCl2及0.5％(v/v)的Tween 80和Triton X-100强烈抑制PetSbs的酶活性。
表1.金属离子及化学试剂对重组果胶酶PetSbs活力的影响
a浓度：v/v
5、纯化的果胶酶PetSbs在NaCl中的活性和稳定性：
酶在NaCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入5.0～30.0％(w/v)NaCl，在pH7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶活性。结果表明：在反应体系中加入5.0～15.0％(w/v)NaCl，该酶活性保持在80％以上；在反应体系中加入20％(w/v)的NaCl，该酶仍然具有约50％的活性(图7)。
酶在NaCl中的稳定性测定：将同样酶量的酶液置于5.0～30.0％(w/v)NaCl中，20℃处理1h后，在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶学性质。结果表明：经5.0～30.0％(w/v)NaCl处理1h，，该酶剩余酶活80％以上(图7)。
6、纯化的果胶酶PetSbs在KCl中的活性和稳定性：
酶在KCl中的活性测定：在酶促反应体系中加入5.0～30.0％(w/v)KCl，在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶活性。结果表明：在反应体系中加入5.0～20.0％(w/v)KCl，该酶活性保持在70％以上(图8)。
酶在KCl中的稳定性测定：将同样酶量的酶液置于5.0～30.0％(w/v)KCl中，20℃处理1h后，在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶学性质。结果表明：经5.0～30.0％(w/v)KCl处理1h，，该酶剩余酶活80％以上(图8)。
7、纯化的果胶酶PetSbs在乙醇中的活性和稳定性：
酶在乙醇中的活性测定：在酶促反应体系中加入1.0～30.0％(v/v)乙醇，在pH7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶活性。结果表明：在反应体系中加入1.0～25.0％(v/v)乙醇，该酶活性保持在60％以上(图9)。
酶在乙醇中的稳定性测定：将同样酶量的酶液置于3.0～30.0％(w/v)乙醇中，20℃处理1h后，在pH 7.0的0.1M Tris-HCl的缓冲液中及65℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pectin为底物，反应25min，测定PetSbs的酶学性质。结果表明：经3.0～15.0％(w/v)乙醇处理1h，，该酶剩余酶活50％以上(图9)。
8、纯化的重组果胶酶PetSbs对底物的降解：
在pH 7.0及65℃下，重组果胶酶PetSbs对pectin和polygalacturonic acid的酶活分别为0.75U mg-1和0.34U mg-1。
本发明提供了一种果胶酶PetSbs，其最适pH值为5.0、7.0和7.5，具有耐盐和耐乙醇的性质，可应用于纺织、造纸、食品等行业。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种具有3个最适pH的耐盐耐乙醇果胶酶及其基因
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)
<400> 1
Met Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Phe Ile Ile Thr Leu Phe Phe Ile Gln
1 5 10 15
Asn Leu Ser Ala Gln Glu Tyr Asn Ala Ser Lys Phe Gly Cys Ile Ser
20 25 30
Asp Gly Ile Thr Asn Asn Thr Thr Ala Ile Gln Tyr Ala Ile Asp Phe
35 40 45
Ile Ser Ala Lys Gly Gly Gly Lys Leu Asn Phe Tyr Val Gly Arg Tyr
50 55 60
Val Thr Gly Ser Leu Gln Leu Lys Ser Asn Val Thr Ile Glu Leu His
65 70 75 80
Glu Gly Ala Val Leu Leu Ala Ser Pro Asn Pro Asn Asp Tyr Thr Pro
85 90 95
Val Lys Gly Glu Arg Ala Leu Leu Ile Gly Asp Ser Val Gln His Val
100 105 110
His Leu Thr Gly Lys Gly Val Ile Glu Phe Gln Pro Gln Ala Met Thr
115 120 125
Ser Phe Thr Glu Lys Ile Asn Lys Ala Gly Ile Leu Ser Tyr Ala Ile
130 135 140
Glu Gln Gln Pro Ala Ser Ile Ala Leu Ile His Val Glu Asp Val Lys
145 150 155 160
Val Asp Ser Ile Leu Ile Ser Lys Asn Val Asn Ser Ala Ile Lys Ile
165 170 175
Ile Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ile Glu Asn Val Ala Ile Lys Ser Ala
180 185 190
Ala Ala Gln Ser Leu Gly Leu Thr Val Asp Lys Ala Arg Gly Val Ala
195 200 205
Leu Lys Asn Ile Tyr Val Asp Val Arg Asn Lys Ala Phe Thr Gln Thr
210 215 220
Pro Arg Thr Glu Lys Val Lys Ala Glu Lys Cys Ile Thr Pro Asn Gly
225 230 235 240
Lys Ser Ile Leu
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)
<400> 2
atgaaaagac ttatttatag cttcatcata acactattct ttattcagaa cctttctgcg 60
caggaataca atgcctctaa gtttggttgc atatcggatg gcatcaccaa caatactact 120
gccatacaat atgctataga ctttatttcg gccaaaggag gaggtaagct gaatttttat 180
gtaggacgct atgttacggg gtctctgcag ctgaaatcca atgttaccat cgagcttcat 240
gaaggtgctg tattgttagc tagtcccaat ccgaatgact atacgccagt gaagggagag 300
cgtgcactct tgataggtga cagtgtacag catgttcatc ttacgggaaa gggtgttatc 360
gaattccagc cgcaggctat gacatccttc accgaaaaaa taaataaggc ggggatacta 420
agctatgcta tagagcagca gccggcctct atcgctttaa ttcatgtaga agatgtcaag 480
gtggacagca tcttgatctc caaaaatgtt aactcagcta tcaaaattat cggaggagag 540
cgtatcacta tagaaaatgt cgctataaag tctgctgctg cccaaagttt ggggctgacg 600
gtcgataagg ccagaggggt tgcactgaaa aacatttatg tggatgtgag aaataaagcc 660
ttcacccaaa ctcctagaac cgaaaaggtg aaagctgaaa aatgtatcac cccaaatggt 720
aaatctatct tatag 735

Claims (5)

1.一种果胶酶PetSbs，其特征在于，所述果胶酶PetSbs的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.一种如权利要求1所述果胶酶PetSbs的编码基因petSbs，其特征在于，所述编码基因petSbs的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
3.一种包含权利要求2所述编码基因petSbs的重组载体，其特征在于，所述重组载体由具有SEQ ID NO.2核苷酸序列的基因片段与表达载体重组构建而成。
4.一种包含权利要求3所述重组载体的重组菌株。
5.一种如权利要求1所述果胶酶PetSbs的制备方法，其特征在于，所述果胶酶PetSbs的制备方法包括：
用重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
培养重组菌株，诱导重组果胶酶PetSbs表达，得到果胶酶PetSbs。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113943762A (zh) * 2021-09-30 2022-01-18 广西壮族自治区农业科学院 一种强化南方特色水果果胶酶解产糖工艺和设备
CN114317364A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0388593B1 (de) * 1989-03-17 1996-04-10 Röhm Gmbh Verfahren zur Expression von Polygalakturonidase und Pektinesterase in Aspergillus niger und Aspergillus awamori
WO1997004106A2 (en) * 1995-07-14 1997-02-06 Innogenetics N.V. New saccharomyces cerevisiae pectinase sequences and heterologous expression systems derived therefrom
CN102399764B (zh) * 2011-11-04 2013-04-03 中国农业科学院饲料研究所 一种碱性果胶酶pl-str及其基因和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0388593B1 (de) * 1989-03-17 1996-04-10 Röhm Gmbh Verfahren zur Expression von Polygalakturonidase und Pektinesterase in Aspergillus niger und Aspergillus awamori
WO1997004106A2 (en) * 1995-07-14 1997-02-06 Innogenetics N.V. New saccharomyces cerevisiae pectinase sequences and heterologous expression systems derived therefrom
CN102399764B (zh) * 2011-11-04 2013-04-03 中国农业科学院饲料研究所 一种碱性果胶酶pl-str及其基因和应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113943762A (zh) * 2021-09-30 2022-01-18 广西壮族自治区农业科学院 一种强化南方特色水果果胶酶解产糖工艺和设备
CN113943762B (zh) * 2021-09-30 2024-02-27 广西壮族自治区农业科学院 一种强化南方特色水果果胶酶酶解产糖工艺和设备
CN114317364A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用

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