KR20140122713A - 포도당 탈수소 효소 - Google Patents

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Abstract

스클레로티니아 스클레오티오룸 및 아스퍼질러스 니게르 유래의 포도당 탈수소 효소에서 특정 아미노산 변이를 도입하여 대장균의 생산성이 현저하게 높아진 변이 포도당 탈수소 효소를 얻을 수 있다. 본 발명의 포도당 탈수소 효소는 크실로오스 대해 반응성이 낮다.

Description

포도당 탈수소 효소{GLUCOSE DEHYDROGENASE}
본 발명은 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드를 조효소로 하는 포도당 탈수소 효소 (FAD-GDH), 그 제조방법 및 포도당의 측정에 있어서 그 사용에 관한 것이다.
혈당 농도는 당뇨병의 중요한 표지자이다. 지금까지 포도당 농도를 측정하기 위해 포도당 산화 효소 (GOD), 포도당 6 인산 탈수소 효소 (G6PDH), 피롤로 퀴놀린 퀴논을 조효소로 하는 포도당 탈수소 효소 (PQQGDH) 등을 사용하는 효소법을 이용 하고 있다. 그러나 GOD는 전자 수용체로서 산소를 필요로 하기 때문에 피검 시료 중의 용존 산소 값이 측정 값에 영향을 미친다는 단점이 있다. G6PDH는 반응계에 보효소인 NAD (P)을 첨가하여야 하며 검출계를 복잡하게 하는 문제점이 있었다. 또한 PQQGDH는 포도당에 대해 높은 산화 활성이 있어 전자 수용체로서 산소를 필요로 하지 않는 장점을 가지고 있지만 포도당에 대한 선택성이 낮고, 말토오스에 대해서도 높은 활성을 나타낼 수 있는 문제점이 있다. 따라서 포도당 센서의 인식 소자로 사용할 수 있는 새로운 효소가 요구되고 있다. 또한, 크실로오스(xylose, 자일로오스) 흡수 시험 실시 중에도 혈당을 정확히 측정할 수 있도록, 크실로오스 대한 반응성이 낮은 것이 바람직하다.
곰팡이가 포도당 탈수소 효소를 가지고 있는 것은 종래부터 알려져 있다 (Biochim biophys Acta 139 (2), p.265-276, 1967 참조). 또한 아스퍼질러스 속이나 푸른 곰팡이 속 유래의 포도당 탈수소 효소 및 이를 이용하는 포도당 농도의 측정 방법의 예는 다음의 특허 문헌에 개시되어있다 (일본공개특허 제2007-289148호, 제2008-178380호, 제2008-035748호, 제2008-035747호, 국제공개특허 WO2007/11610, WO2004/058958, WO2006/101239, WO2007/139013). 그러나 곰팡이 유래의 효소는 대부분이 당 단백이며, 기능 발현에 글리코실화반응을 필요로 한다. 특히 포도당 산화 효소 등의 세포 외 분비 효소에서는 글리코실화가 고도로 진행되고 있기 때문에 이러한 곰팡이 유래의 당 단백질을 대장균을 이용하여 재조합 생산하는 것은 매우 어려웠다. 곰팡이 유래 포도당 탈수소 효소도 세포 외 분비 단백질이기 때문에, 곰팡이 유래 포도당 탈수소 효소를 대장균에서 재조합 발현시키는 것이 어렵고, 발현한다고 해도 생산성이 낮기 때문에 배양 단위 용량당 효소의 수율이 매우 낮은 문제가 있다 (Biotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011 참고).
일본공개특허 제2007-289148호 일본공개특허 제2008-178380호 일본공개특허 제2008-035748호 일본공개특허 제2008-035747호 국제공개특허 WO2007/11610 국제공개특허 WO2004/058958 국제공개특허 WO2006/101239 국제공개특허 WO2007/139013
Rolke et al., Mol Plant Pathol 5 (1), p.17-27, 2004 Biotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011
본 발명은 종래의 포도당 탈수소 효소와 비교하여 더 높은 생산성을 가지는 새로운 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 스클레로티니아 스클레오티오룸(Sclerotinia Sclerotiorum) 유래 포도당 탈수소 효소 및 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger) 유래 포도당 탈수소 효소의 유전자를 분리, 또한 그 특정 아미노산 잔기를 치환함으로써 대장균에서 재조합 발현의 생산성이 현저하게 높아지는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서, 또는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입되고 포도당 탈수소 효소 활성을 갖는 단백질에서, S529G, N191X (여기서, X는 K, S, R, 또는 E), G69X (여기서, X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R) 또는 이들의 조합인 아미노산 변이 단백질을 제공한다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 Y70F 또는 Y70M, G71S, A73X (여기서, X가 E, P, M, T 또는 C), M112C 또는 M112L, A113F 또는 A113S, Y521F, S523P, F525W 혹은 F525Y, P527X (여기서, X는 M, I, Q, V 또는 Y), A182R, S505P, V571C, N46E, N240E, N274E, N275K, N370K 또는 N370E으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 변이가 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G, N191S/S529G, N191R/S529G, N191E/S529G로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G/G69X (여기서, X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R이다), N191K/S529G/Y70F, N191K/S529G/F525Y, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/P527V, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y/G69A, N191K/S529G/S505P로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G/S505P/N46E, N191K/S529G/S505P/N240E, N191K/S529G/S505P/N274E, N191K/S529G/S505P/N275E, N191K/S529G/S505P/N370K, N191K/S529G/S505P/N370E로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다.
또한 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 16개의 잔기가 제거되고 17 번째 Ser 잔기가 Met으로 치환된 상기 단백질 중 어느 하나를 제공한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 23개의 잔기가 제거되고, Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn-Thr-Thr-Thr 또는 Met-Ala-Pro-Glu이 추가된 상기 단백질 중 어느 하나를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서, 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입되고, 포도당 탈수소 효소 활성을 갖는 단백질에서, E195K, Q196X (X는 E, D 또는 R이다), Y524F, P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), N368K, T522S 또는 이들의 조합인 아미노산 변이를 가지는 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 E195K/Q196X (X는 E, D 또는 R이다), E195K/Q196E/G73A, E195K/Q196E/S75G, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), E195K/Q196E/G73A/Y524F, E195K/Q196E/G73A/P526X (X는 I, F, S 또는 M이다), E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F, E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X (X는 I, F, Y, S 또는 M이다), N368K/T522S 및 N368K/T522S/E195K/Q196E로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 E195K/Q196E/G73A/S75G/P526M, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S75G 및 E195K/Q196E/G73A로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이를 갖는다. 또한 본 발명은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 20개의 잔기가 제거되고 21 번째 Ala가 Met로 치환된 상기 단백질 중 어느 하나를 제공한다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 26개의 잔기가 제거되고, Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn-Thr-Thr-Thr가 추가 된 상기 단백질 중 어느 하나를 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 포도당 탈수소 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체 또는 형질 도입체를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 포도당 탈수소 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 배양하고, 상기 배양물에서 포도당 탈수소 효소를 수득하는 것을 특징으로 하는 포도당 탈수소 효소의 제조 방법을 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 포도당 탈수소 효소를 이용하여 시료 중의 포도당 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 포도당 분석 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 포도당 탈수소 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 포도당의 분석 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 포도당 탈수소 효소가 전극 표면에 고정화된 효소 전극 및 상기 효소 전극을 작업 전극으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 포도당 센서를 제공한다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입 되고, 포도당 산화 효소 활성은 나타나지 않으면서 포도당 탈수소 효소 활성을 가지고, 크실로오스 대한 반응성이 포도당에 대한 반응성의 20 % 이하인 것을 특징으로 하는 포도당 탈수소 효소를 이용하는 바이오 센서로서, 용존 산소의 영향을 받지 않는 포도당 측정용 바이오 센서를 제공한다.
스클레로티니아 스클레오티오룸(Sclerotinia Sclerotiorum) 유래 FAD-GDH
본 발명은 스클레로티니아 스클레오티오룸(Sclerotinia Sclerotiorum) 유래 포도당 탈수소 효소 (GenBank XP_001584680)를 재조합하여 발현되도록 하는 것이다. 이 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 기재하였다. 스클레로티니아 스클레오티오룸의 게놈 서열은 공개되어있다.
아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger) 유래 FAD-GDH
또한 본 발명은 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger) 유래 포도당 탈수소 효소 (GenBank XP_001584680)를 재조합하여 발현되도록 하는 것이다. 이 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 기재하였다. 아스퍼질러스 니게르의 게놈 서열은 공개되어 있으며, 또한 이 효소의 재조합 생산은 Biotechnol. Lett. Volume 33, Number 11, p.2255-2263, 2011에 기재되어 있으며, 단백질이 포도당 탈수소 효소 (GDH)인 것이 기재되어 있다.
포도당 탈수소 효소 (GDH)는 포도당 산화 효소 (GOD)와 달리 포도당 측정에서 용존 산소의 영향을 받지 않기 때문에 포도당 측정용 바이오 센서의 인식 소자로서 유용하다. SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열은 종래의 곰팡이 유래 포도당 탈수소 효소의 아미노산 서열과 약 30 내지 60 % 정도 동일하고 예를 들어, 아스퍼질러스 오리제 TI 계통 유래 포도당 탈수소 효소 (GenBank ACW04779 .1)와는 약 57 %의 아미노산 동일성을 가진다.
본 발명은 Ssc은 스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 포도당 탈수소 효소 (GenB ank XP_001584680)를 의미한다. 본 발명에서는 Ssc을 대장균에서 효율적으로 조작 발현시키기 위해, Ssc-n1, Ssc-n2, Ssc-n3 또는 Ssc-n4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 준비하였다. 본 명세서에서는 Ssc의 N 말단 서열의 차이에 따라 다음의 4 가지 유형을 사용한다.
Ssc-n1
게놈 데이터베이스에 기재된 Ssc의 일차 구조 (스클레로티니아 스클레오티오룸; GenBank XP_001584680; SEQ ID NO: 1에 표시)의 N 말단 서열에서 16개의 잔기가 제거되고 17 번째 Ser 잔기가 Met으로 치환된 Ssc 단백질을 의미한다.
Ssc-n2
게놈 데이터베이스 기재된 Ssc의 일차 구조 (스클레로티니아 스클레오티오룸; GenBank XP_001584680; SEQ ID NO: 1에 표시)의 N 말단 서열에서 23개의 잔기가 제거되고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn을 부가한 Ssc 단백질을 의미한다.
Ssc-n3
게놈 데이터베이스 기재된 Ssc의 일차 구조 (스클레로티니아 스클레오티오룸; GenBank XP_001584680; SEQ ID NO: 1에 표시)의 N 말단 서열에서 23개의 잔기를 제거하고 Met-Asn-Thr-Thr-Thr를 부가한 Ssc 단백질을 의미한다 .
Ssc-n4
게놈 데이터베이스 기재된 Ssc의 일차 구조 (스클레로티니아 스클레오티오룸; GenBank XP_001584680; SEQ ID NO: 1에 표시)의 N 말단 서열에서 23개의 잔기를 제거하고 Met-Ala-Pro-Glu를 부가한 Ssc 단백질을 의미한다.
본 발명에서는 Ang는 아스퍼질러스 니게르 유래 포도당 탈수소 효소 (GenBank XP_001394544)를 의미한다. 본 발명에서는 Ang을 대장균에서 효율적으로 조작 발현시키기 위해, Ang-n1, Ang-n2 또는 Ang-n3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 준비하였다. 본 명세서에서는 Ang의 N 말단 서열의 차이에 따라 다음의 세 가지를 사용한다.
Ang-n1
게놈 데이터베이스 기재된 Ang의 일차 구조 (아스퍼질러스 니게르; GenBank XP_001394544; SEQ ID NO: 2에 표시)의 N 말단 서열에서 20개의 잔기를 제거하고 21 번째 Ala 잔기가 Met로 치환된 Ang 단백질을 의미한다.
Ang-n2
게놈 데이터베이스 기재된 Ang의 일차 구조 (아스퍼질러스 니게르; GenBank XP_001394544; SEQ ID NO: 2에 표시)의 N 말단 서열에서 26개의 잔기를 제거하고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn을 부가한 Ang 단백질을 의미한다.
Ang-n3
게놈 데이터베이스 기재된 Ang의 일차 구조 (아스퍼질러스 니게르; GenBank XP_001394544; SEQ ID NO: 2에 표시)의 N 말단 서열에서 26개의 잔기를 제거하고 Met-Asn-Thr-Thr-Thr를 부가한 Ang 단백질을 의미한다.
본 명세서에서, 대장균의 생산성이 높은 효소는 대장균을 숙주로 재조합 발현시켜 그 배양물에서 효소를 분리하였을 때, 배양액 단위 용량당 (U / L) 얻을 수 있는 효소의 활성이 높은 것을 특징으로 하는 효소 분자를 의미한다. 생산성이 높으면 더 협소한 배양 장치에서 더 낮은 비용으로 효소를 재조합 할 수 있다. 높은 생산성은 작은 배양 장치를 사용하여 적은 비용으로 효소를 재조합하여 생산할 수 있도록 한다. 효소의 생산성은 아미노산 서열을 기반으로 단백질의 물에 대한 용해도 차이, 단백질 단위 질량당 효소 활성의 차이, 효소의 안정성의 차이 등이 종합적으로 반영된다. 또한 효소의 아미노산 서열 역시 배양액 단위 용량 당 숙주의 재조합 발현 속도, 봉입체(inclusion bodies) 형성 용이성, 균체에서의 효소 안정성 및 정제 공정 등에 관여한다.
스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 변이 FAD-GDH
본 발명자는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열에서 N191K, S529G의 변이 또는 N191K/S529G의 이중 변이를 가진 변이 FAD-GDH가 야생형 FAD-GDH와 비교하여 대장균의 높은 생산성을 나타내고, 특히 N191K/S529G의 이중 변이를 가진 FAD-GDH는 높은 생산성과 함께 높은 효소 활성을 나타내는 것을 발견했다. 또한, 본 명세서에서는 스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 FAD-GDH의 아미노산 서열의 아미노산 변이의 위치는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열의 첫 번째 Met를 번호 1로 지정한다. 또한, 본 명세서에서는, 아미노산의 변이 내지 대체는 원래의 아미노산 잔기와 아미노산의 위치 및 변이 후 아미노산 잔기를 순서대로 표시한다. 예를 들어, "S529G"은 529 번째 Ser가 Gly로 대체된 것을 나타낸다. 다중 변이의 조합은 "/"기호로 나타낸다.
또한 스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 변이 FADG-GDH에서 S529G, N191X (여기서 X는 K, S, R, 또는 E) 또는 G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R) 또는 이들의 조합인 아미노산 변이 단백질이 바람직하다. 또한 Y70F 또는 Y70M, G71S, A73X (여기서 X가 E, P, M, T 또는 C), M112C 또는 M112L, A113F 또는 A113S, Y521F, S523P, F525W 혹은 F525Y, P527X (여기서 X는 M, I, Q, V 또는 Y), A182R, S505P, V571C, N46E, N240E, N274E, N275K, N370K 또는 N370E로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 변이를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 다중 변이 중 바람직한 것은 N191K/S529G, N191S/S529G, N191R/S529G, N191E/S529G로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다. 더욱 바람직한 다중 변이로는 N191K/S529G/G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R이다), N191K/S529G/Y70F, N191K/S529G/F525Y, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/P527V, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y/G69A, N191K/S529G/S505P로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질이다. 또한 바람직한 다중 변이로 N191K/S529G/S505P/N46E, N191K/S529G/S505P/N240E, N191K/S529G/S505P/N274E, N191K/S529G/S505P/N275E, N191K/S529G/S505P/N370K, N191K/S529G/S505P/N370E으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 변이 단백질을 들 수 있다.
또한 이러한 변이 FAD-GDH는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 16개의 잔기가 제거되고 17 번째 Ser 잔기가 Met으로 치환되어 있는 단백질 또는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 23개의 잔기가 제거되고, Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Thr -Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn-Thr-Thr-Thr또는 Met-Ala-Pro-Glu가 추가된 단백질에서 이러한 변이 및 다중 변이가 일어난 단백질이 바람직하다.
또한 이러한 스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 변이 FAD-GDH는 아스퍼질러스 니게르 TI 계통 유래 FAD-GDH와 비교하여 크실로오스 대한 포도당의 선택성이 더 높았다.
아스퍼질러스 니게르 유래 변이 FAD-GDH
본 발명자는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열에서 E195K, Q196E, N368K, T522S의 변이 또는 E195K/Q196E 또는 N368K/T522S의 이중 변이를 가진 변이 FAD-GDH가 야생형 FAD-GDH와 비교하여 대장균의 높은 생산성을 보이고, 특히 E195K/Q196E 이중 변이의 FAD-GDH는 높은 생산성과 함께 높은 효소 활성을 나타내는 것을 발견했다. 또한 본 명세서에서는 아스퍼질러스 니게르 유래 FAD-GDH의 아미노산 서열의 아미노산 변이의 위치는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열의 두 번째 Met를 번호 1로 지정한다. 또한 본 명세서에서는, 원래 아미노산 잔기와 아미노산의 위치 및 변이 후 아미노산 잔기를 순서대로 표시한다. 예를 들어, "E195K"은 195 번째 Glu이 Lys로 대체된 것을 나타낸다. 다중 변이의 조합은 "/"기호로 나타낸다.
또한 아스퍼질러스 니게르 유래 변이 FADG-GDH에서 E195K, Q196X (X는 E, D 또는 R이다), Y524F, P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), N368K, T522S 또는 이들의 조합인 아미노산 변이 단백질이 바람직하다. 바람직한 다중 변이로는 E195K/Q196X (X는 E, D 또는 R이다), E195K/Q196E/G73A, E195K/Q196E/S75G, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), E195K/Q196E/G73A/Y524F, E195K/Q196E/G73A/P526X (X는 I, F, S 또는 M이다), E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F, E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X (X는 I, F, Y, S 또는 M 이다), N368K/T522S 및 N368K/T522S/E195K/Q196E이 있다. 특히 바람직한 다중 변이는 E195K/Q196E/G73A/S75G/P526M, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S75G 및 E195K/Q196E/G73A이다.
또한 이러한 변이 FAD-GDH는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 20개의 잔기가 제거되고 21 번째 Ala 잔기가 Met 치환된 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 26개의 잔기가 제거되고, Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn- Thr-Thr-Thr가 추가된 단백질에서 이러한 변이 및 다중 변이가 되어있는 단백질이 바람직하다.
또한 이러한 아스퍼질러스 니게르 유래 변이 FAD-GDH는 아스퍼질러스 니게르 TI 계통 유래 FAD-GDH와 비교하여 크실로오스 대한 포도당의 선택성이 더 높았다.
FAD-GDH의 제조 방법
본 발명의 FAD-GDH는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 스클레로티니아 스클레오티오룸 및 아스퍼질러스 니게르 유래의 야생형 FAD-GDH를 인코딩하는 유전자의 서열은 각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 기재되는 아미노산 서열에 따라 쉽게 결정할 수 있다. FAD-GDH를 인코딩하는 유전자는 스클레로티니아 스클레오티오룸 및 아스퍼질러스 니게르의 게놈에서 클로닝하여도 좋고, 일련의 화학 합성된 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 PCR에 의해 제조하여도 좋고, 또는 자동화 DNA 합성기 등을 사용하여 모든 합성 할 수 있다. 유전자 서열은 사용될 숙주에서 더 높은 발현 수준이 달성되도록 코돈을 선택한 후 적절히 설계 또는 수정하는 것이 바람직하다. 특정 숙주의 코돈 사용의 특징은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 변이 FAD-GDH를 인코딩하는 유전자는 천연 FAD-GDH를 인코딩하는 유전자에서 제거될 아미노산 잔기를 인코딩하는 염기 서열을 원하는 아미노산 잔기를 인코딩하는 염기 서열로 치환하여 구축 할 수 있다. 이러한 위치 특이적 염기 서열 치환을 위한 다양한 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들면 적절하게 설계된 프라이머를 가진 PCR로 할 수 있다. 또는 변이 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 모두 합성 할 수 있다.
본 발명의 FAD-GDH에서는 바람직한 포도당 탈수소 효소 활성을 가지는 한, 상기에 기재된 것들보다 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실 또는 치환될 수 있고, 또 다른 아미노산 잔기가 부가될 수 있다. 이러한 변이 FAD-GDH는 바람직하게는 야생형 FAD-GDH와 적어도 80 %의 서열이 동일하다. 서열 동일성은 바람직하게는 적어도 85 %이며, 보다 바람직하게는 적어도 90 %이며, 더욱 바람직하게는 95 % 이상이다.
이렇게 얻은 유전자를 적당한 발현 벡터에 삽입하고 이를 적당한 숙주 (예를 들어 대장균)에서 형질 전환한다. 외래성 단백질을 발현시키기 위한 많은 벡터 숙주 계가 당해 기술 분야에서 알려져 있으며 숙주로는 예를 들면, 박테리아, 효모 배양 세포 등의 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 당쇄가 결합한 포도당 탈수소 효소의 제조를 원하는 경우에는 진핵 세포를 숙주로 사용한다. 얻어진 형질 전환체는 표준 방법에 따라 배양하고, 배양 세포 또는 배양물으로부터 FAD-GDH를 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 측면에 있어서, 대장균의 형질 전환체를 F. William Studier et.al., Protein Expression and Purification 2005에 ZYP broth에 기재되어있는 배지(이하, A 배지)에서 배양한다. 특히 이 배지는 일반적으로 대장균 배지에 사용되는 LB 배지를 기초로 하고 0.5 % 글리세롤, 0.05 % 포도당 0.2 % 알파-유당, 25 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 100 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4를 첨가한 배지이다.
A 배지에서 15 ℃ 내지 25 ℃, 바람직하게는 약 20 ℃에서 배양하여 재조합 단백질을 발현시킨다. 이를 통해 일반적으로 사용되는 IPTG 유도 방식보다 높은 생산율을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 변이 효소를 단백질 접힘을 촉진하는 것으로 알려져 있는 샤페론 GroEL 및 GroES과 공동 발현시킴으로써 더 높은 생산성을 얻을 수 있다. 샤페론과의 공동 발현 예를 들어, 본 발명의 변이 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 GroEL 및 GroES 유전자를 아라비노오스(arabinose) 유도하에 발현 벡터 (예를 들어, 상용 샤페론 벡터 pGro7, TaKaRa)와 함께 대장균에 도입하여 배양하고, 형질 전환체를 어느 정도 증식 한 후 아라비노오스를 가하여 샤페론의 발현을 유도함으로써 할 수 있다.
이렇게 얻어진 재조합 FAD-GDH는 예를 들어, 겔 여과, 이온 교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토 그래피, 액체 크로마토 그래피, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 면역 침전, 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동, 투석 등 당해 기술 분야에서 알려진 정제 방법의 모든 것을 사용하여 정제 할 수 있다.
효소 활성의 측정 방법
본 발명의 FAD-GDH는 FAD를 조효소로서 포도당을 산화하여 글루코노락톤을 생성하는 반응을 촉매하는 작용이 있다. 본 발명의 FAD-GDH의 포도당 탈수소 효소 활성은 탈수소 효소에 의한 포도당의 산화에 따라 환원되는 FAD의 양을 산화 환원 색소의 정색 반응에 의해 정량할 수 있다. 정색 시약으로는 예를 들어, PMS (페나진 메토설페이트), DCIP (2,6-디클로로 페놀 인도 페놀), 페리 시안화 칼륨 또는 페로센 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 FAD-GDH의 포도당 산화 활성 측정은 탈수소 효소와 기질의 반응에 의해 생성하는 과산화수소를 정량함으로써 할 수 있다. 과산화수소의 측정은 예를 들어, 퍼옥시다아제 및 토린다 시약 (TODB), 4-아미노 안티피린을 사용하여, 형성되는 색소의 흡광도의 경시 변화를 측정함으로써 수행 할 수 있다.
포도당에 대한 선택성
본 발명의 FAD-GDH의 포도당에 대한 선택성은 기질로, 만노오스, 갈락토오스, 크실로오스, 락토오스 및 말토오스 등의 각종 당을 사용하여 위에서 설명한 바와 같이 효소 활성을 측정하고 포도당을 기질로 했을 때의 활성에 대한 상대 활성을 검토하여 측정할 수 있다.
본 발명의 FAD-GDH는 포도당에 대한 선택성이 높았고, 특히 말토오스 및 갈락토오스 대한 반응성은 측정 한계보다 같거나 낮은 수준이었다. 따라서, 본 발명의 FAD-GDH로 제작된 분석 키트 또는 효소 센서는 포도당 측정에 대해 선택성이 높고, 피검 시료에 말토오스 등 다른 당이 포함되어 있는지 그 가능성이 있는 경우 또한 고감도에서 포도당을 감지 할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 FAD-GDH는 크실로오스 대해 반응성이 낮다는 특징이 있다. 이것은 크실로오스 흡수 시험을 실시하고 있는 경우에도 혈당이 정확하게 측정 할 수 있다는 장점을 제공한다.
포도당 분석 키트
본 발명은 또한 본 발명에 따른 FAD-GDH를 포함한 포도당 분석 키트를 제공하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 포도당 분석 키트는 본 발명에 따른 FAD-GDH를 적어도 1 회 분석에 충분한 양으로 포함한다. 일반적으로, 키트는 본 발명의 FAD-GDH 이외에, 분석에 필요한 완충액, 매개체, 교정 곡선 보정을 위한 포도당 표준 용액, 및 사용 지침서를 포함한다. 본 발명에 따른 FAD-GDH는 여러 가지의 형태로 예를 들어, 동결 건조 된 시약으로 또는 적절한 저장 용액의 용액으로 제공 할 수 있다.
포도당 센서
본 발명은 또한 본 발명에 따른 FAD-GDH가 그 표면에 고정화 된 효소 전극, 및 이 효소 전극을 이용하는 포도당 센서를 제공한다. 전극으로는 탄소 전극, 금 전극, 백금 전극 등을 이용해 본 발명의 효소를 고정화한다. 탄소 전극 경우 스크린 인쇄 등에 의해 생성되는 전극이고 금, 백금 전극 경우 스퍼터링에 의해 제조되는 전극일 수 있다. 고정화 방법은 예를 들면, 가교 시약을 이용하는 방법, 고분자 매트릭스에 봉입하는 방법, 투석 필름으로 코팅하는 방법 또는 광 가교 폴리머, 전도성 고분자, 산화 환원 폴리머 등을 이용한 방법이 있다. 대안으로 페로센 또는 그 유도체 대표되는 전자 매개체와 함께 폴리머나 또는 전극에 흡착 고정하여도 좋고, 또한 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 글루타르 알데히드를 이용하여 본 발명의 FAD-GDH를 탄소 전극에 고정화 한 후 아민기를 갖는 시약으로 처리하여 글루 타르 알데히드를 차단한다.
포도당 농도의 측정은 다음과 같이 수행 할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣어 매개체를 추가하여 일정 온도로 유지한다. 매개체로는 페리시안화 칼륨, 페나진 메토설페이트, 루테늄 복합체 등을 사용할 수 있다. 작용 전극으로 본 발명의 FAD-GDH를 고정화한 전극을 이용하고, 대전극 (예를 들면 백금 전극) 및 필요에 따라 기준 전극 (예를 들면 Ag / AgCl 전극)을 사용한다. 탄소 전극에 일정한 전압을 인가하여 전류가 정상이 된 후 포도당을 포함한 시료를 첨가하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 포도당 용액에 의해 제작한 교정 곡선에 따라 시료 중의 포도당 농도를 계산할 수 있다.
본 발명의 FAD-GDH는 혈당 분석 장비에서 사용하는데 특히 유용하다. 분석 장치는 일반적으로 시판되고 있는 혈당 측정용 전류 바이오 센서 테스트 스트립과 유사한 구조로 할 수 있다. 예를 들어, 분석 장치는 절연체, 시약 포트 및 샘플 수용부에 장착 된 2개의 전극 (작용 전극 및 기준 전극)으로 구성될 수 있다. 본 발명의 FAD-GDH 및 매개체를 시약 포트에 넣는다. 혈액 샘플 등의 샘플을 샘플 수용 부에 추가하여 샘플에 포함된 포도당이 FAD-GDH와 반응하여 전류가 발생하고, 이 전류 값에서 혈중 포도당 농도를 측정할 수 있다. 전기 화학적 검출 외에 광 센서를 이용하여 포도당을 측정 할 수 있다.
본 명세서에서, 「~를 포함하는 (comprising)」이라는 표현 양태는 「본질적으로 ~로 이루어지는 (essentially consisting of)」라는 표현 및 「~로 이루어지는 (consisting of)」라는 표현 양태를 포함한다.
본 명세서에서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고 문헌의 내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
[실시예]
이하, 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 포도당 탈수소 효소 (Ssc) 및 아스퍼질러스 니게르 유래 포도당 탈수소 효소 (Ang) 재조합 유전자의 제조
스클레로티니아 스클레오티오룸 유래 포도당 탈수소 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다. N 말단에서 16 번째까지의 구역은 신호 펩타이드인 것으로 추정된다. 예를 들어, 신호 서열 절단 부위를 예측하는 방법으로 통로 서버 SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)를 활용할 수 있다. 이 서버는 The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark에서 운영되고 있으며, 논문에서 설명된 방법에 따라 임의의 아미노산 서열에 대한 신호 서열의 존재 가능성을 검색하고 절단 부위를 예상한다. (Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Soren Brunak and Gunnar von Heijne. Protein Engineering, 10:1-6, 1997) SignalP 3.0 Server를 사용한 측정에 따르면, N 말단에서 16 번째까지는 신호 펩타이드인 것으로 추정할 수 있다. 시작 메티오닌의 하류에서 17 번째 Ser이 Met으로 치환된 서열을 가지는 아미노산 서열로 코팅되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 최종적으로 디자인되어 합성된다 (Ssc-n1).
또는 N 말단 서열에서 23개의 잔기을 제거하고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn을 부가한 서열을 갖는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 최종적으로 디자인되어 합성된다 (Ssc-n2). 또는 N 말단 서열에서 23 개의 잔기을 제거하고 Met-Asn-Thr-Thr-Thr-를 부가한 서열을 갖는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 디자인되어 최종적으로 합성된다 (Ssc-n3). 또는 N 말단 서열에서 23 잔기를 제거하고 Met-Ala-Pro-Glu-를 부가한 서열을 갖는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 최종적으로 디자인되어 합성된다 (Ssc-n4).
아스퍼질러스 니게르 유래 포도당 탈수소 효소 (Ang)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 나타난다. N 말단에서 20 번째까지 위와 같이 예측하여 신호 펩타이드인 것으로 추정할 수 있다. SignalP 3.0 Server를 사용한 예측에 따르면, N 말단에서 20 번째까지 신호 펩타이드인 것으로 추정되므로 시작 메티오닌의 하류에 21 번째 Ala을 Met으로 치환한 서열을 가지는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 디자인되어 최종적으로 합성된다 (Ang-n1). 또는 N 말단 서열에서 26개의 잔기를 제거하고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn을 부가한 서열을 갖는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 최종적으로 디자인되어 합성된다 (Ang-n2). 또는 N 말단 서열에서 26개의 잔기를 제거하고 Met-Asn-Thr-Thr-Thr-를 부가한 서열을 갖는 아미노산 서열로 코딩되어 대장균에 의한 재조합에 적합한 코돈을 포함하는 유전자 서열이 최종적으로 디자인되어 합성된다 (Ang-n3).
재조합 생산 숙주로서 대장균 BL21 (DE3) ［F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal(λcI 857, ind1,　Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3);Novagen］을 사용하였다. 유전자 발현 벡터로는 pET30c [kan, lacI; Novagen/Merck KGaA]를 사용하였다. 샤페론 동시 발현용 벡터로는 pGro7 [GroEL, GroES; Takara Bio Inc.]를 각각 사용하였다.
실시예 2
효소 활성의 측정
본 발명의 FAD-GDH의 포도당 탈수소 효소의 활성은 탈수소 효소와 기질의 반응에 의해 환원되는 DCIP (2,2'-다이클로로다이아이소프로필 에테르)의 색 감소를 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 반응 조건은 명시하지 않는 한 다음을 따랐다: 효소 용액을 포함한 반응 용액 (10 mM 인산 칼륨 (pH7.0) +0.6 mM PMS +0.06 mM DCIP 농도는 모든 최종 농도)에 기질을 추가하여 반응을 시작하고 600 nm의 흡광도 변화를 측정했다. 사용된 기질은 최종 농도 50 mM 포도당으로 하였다. 1 μmol의 DCIP을 환원시키는 효소의 양을 1 단위로 정의하고, 하기 식에 따라 활성 값을 계산하였다. pH7.0에서 DCIP의 몰 흡광 상수는 16.3 mM-1cm-1로 하였다.
단위 / ml = ΔABS / min × 1/16.3 × 10
본 발명의 FAD-GDH의 포도당 산화 활성 측정은 탈수소 효소와 기질의 반응에 의해 형성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 및 토린다 시약 (TODB) 및 4-아미노 안티피린을 사용하여 생성된 염료의 546 nm에서의 흡광도의 경시 변화를 측정함으로써 구하였다. 반응 조건은 명시하지 않는 한 다음을 따랐다: 효소 용액을 포함한 반응 용액 (10 mM 인산 칼륨 (pH7.0) +1.5 mM 4-아미노 안티피린 +1.5 mM TODB +2 U / ml 퍼옥시 디아제 농도는 모든 최종 농도)에 기질을 추가하여 반응을 시작하고 546 nm의 흡광도 변화를 측정했다. 기질은 최종 농도 50 mM 포도당을 이용해 분당 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1 단위로 정의하고 하기 식에 따라 활성 값을 계산하였다. TODB의 pH7.0의 몰 흡광 상수는 38 mM-1cm-1로 하였다.
단위 / ml = ΔABS / min × 2 / 38 × 10
단위 / mg = Unit / ml / 단백질 mg / ml
실시예 3
A 배지를 사용한 GDH의 제조 및 효소 표본 준비
A 배지를 이용하여 Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소를 제조하였다. Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소를 코딩하는 유전자를 삽입한 발현 벡터 pET30c을 이용하여 대장균 BL21 (DE3)에 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환체 BL21 (DE3) / pET30c (GDH)를 3 mL LB 배지에 접종하고 하룻밤 37 ℃에서 진탕 배양하였다. 그런 다음 A 배지 (Km 50μg/mL) 100 mL에 전 배양 용액 1 ml을 접종하고, 20 ℃에서 사카구치 플라스크를 이용하여 120 rpm으로 진탕 배양하였다.
A 배지 : LB 배지 +0.5 % 글리세롤, 0.05 % 포도당 0.2 % α-락토오스, 25 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 100 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4 (ZYP 배지; F. William Studier et.al., Protein Expression and Purification (2005)에 기재된 방법 수정).
배양 중, 적절한 시간 간격으로 배양액 300 μl를 회수하고, 회수한 균체에 60μl의 버그버스터 시약(BugBuster Reagent)을 첨가하고 20분 동안 4 ℃에서 진탕하여 균체를 용균시켰다. 10 mM 인산 칼륨 60 μl을 더하여 원심 분리(16,000 × g, 4 ℃, 20분)하여 상층액을 회수하고 그 활성을 측정했다.
Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소는 GDH 활성을 갖는 수용성 효소로 발현되었다. A 배지에서 배양하여 얻은 Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소들의 효소 활성을 측정한 결과 포도당 탈수소 효소 활성만이 확인되고 포도당 산화 효소 활성은 검출되지 않았다.
실시예 4
기질 특이성의 평가
상기 실시예 3의 A 배지를 사용하여 얻은 효소에 포도당, 맥아당, 크실로오스와 갈락토오스를 기질로 기질특이성을 측정했다. 그 결과, 기질 농도 5 mM에서 포도당을 100 %로 했을 때의 Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소들의 탈수소 효소 활성은 말토오스, 갈락토스에 대해서는 활성이 나타나지 않았고 자일로오스(크실로오스)에 대해서는 10 % 정도였다. 동일한 조건에서 지금까지보고 된 FAD-GDH는 포도당을 100 %로 했을 때의 크실로오스의 탈수소 효소 활성은 21 %였다. 따라서 Ssc, Ang 또는 이들의 변이 효소는 이미 보고된 GDH보다 크실로오스 대한 효소 활성이 낮은 것으로 나타났다.
실시예 5
Ssc 및 Ang의 변이 도입
위치 특이적 변이 도입은 QuikChange (등록 상표) 방법에 의해 실시했다. QuikChange (등록 상표) 방법은 실시예 1에서 제조한 유전자를 템플릿으로 변이 도입용 프라이머에 의해 PCR 증폭을 실시했다. 이어 PCR 후, 시료에 DpnI을 추가하고 37 ℃, 60분간 배양하여 템플릿 DNA만을 제조하였다. 상기 시료를 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환했다. LB 한천 배지 (50 μg/ml 카나마이신)에서 하룻밤 배양 후 무작위로 선택한 클론에서 플라스미드를 추출하여 염기 서열을 분석하여 목적의 변이가 도입된 것을 확인했다. 얻은 PCR 단편을 NdeI, HindIII(37 ℃, 2시간)로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단된 pET30c로 연결하여 그 결과 대장균 BL21 (DE3)을 형질 전환시켰다. LB 한천 배지 (50μg/ml 카나마이신)에 의해 하룻밤 배양 후 무작위로 선택한 클론에서 플라스미드를 추출하여 염기 서열 분석에 의해 변이 도입을 확인했다.
이렇게 하여, 다음 Ssc 변이 효소를 발현하는 형질 전환체를 얻었다:
S529G, N191X (여기서 X는 K, S, R, 또는 E이다) 또는 G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R이다)을 포함하는 변이 효소. 또한 Y70F 또는 Y70M, G71S, A73X (여기서 X가 E, P, M, T 또는 C), M112C 또는 M112L, A113F 또는 A113S, Y521F, S523P, F525W 혹은 F525Y, P527X (여기서 X는 M, I, Q, V 또는 Y이다), A182R, S505P, V571C, N46E, N240E, N274E, N275K, N370K 또는 N370E로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 다중 변이 변이 효소. 또한 N191K/S529G, N191S/S529G, N191R/S529G, N191E/S529G 다중 변이 효소. 또한 N191K/S529G/G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R이다), N191K/S529G/Y70F, N191K/S529G/F525Y, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/P527V, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y/G69A, N191K/S529G/S505P 다중 변이 효소. 또한 N191K/S529G/S505P/N46E, N191K/S529G/S505P/N240E, N191K/S529G/S505P/N274E, N191K/S529G/S505P/N275E, N191K/S529G/S505P/N370K, N191K/S529G/S505P/N370E 다중 변이 효소를 구축했다.
또한, 다음 Ang 변이 효소를 발현하는 형질 전환체를 얻었다:
N368K, T522S, E195K, Q196X (X는 E, D 또는 R이다), N368K/T522S, E195K/Q196X (X는 E, D 또는 R이다), N368K/T522S/E195K/Q196E, E195K/Q196E/G73A, E195K/Q196E/S75G, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X (X는 G, V, I, F, Y S, T, C, M, H 또는 Q이다), E195K/Q196E/G73A/Y524F, E195K/Q196E/G73A/P526X (X는 I, F, S 또는 M이다), E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F, E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X (X는 I, F, Y, S 또는 M이다), N368K/T522S 및 N368K/T522S/E195K/Q196E.
실시예 6
변이 효소의 생산 및 활성 측정
각 변이 효소를 발현하는 형질 전환 체 BL21 (DE3)을 전 배양하였다. 300 ml 배플된(baffled) 플라스크를 사용하여 A 배지 60 ml에 대해 1% 로 접종하고 20 ℃, 28시간, 125 rpm 조건에서 진탕 배양하였다. 배지 50 ml를 채취하여 젖은 세포(wet cells) 1 g당 5 ml의 비율로 BugBuster (등록 상표) 단백질 추출 시약 (Novagen)을 추가하여 현탁하여 완만하게 진탕하면서 실온에서 15분간 배양을 실시했다. 원심 (15 Krpm / 4 ℃ / 20분)에 의해 불용성 분획을 제거 후 얻어진 상층액을 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6.5)로 4 ℃에서 하루 동안 투석했다. 투석 종료 후 원심분리하여 그 상층을 효소 표본으로 준비했다. 불용성 분획은 불용성 분획을 포함하는 현탁액의 2 ml에 대해 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6.5)을 1 ml의 비로 현탁했다.
일부 다중 변이 효소는 작은 스케일의 발현계를 사용하였다. 각 변이 효소를 발현하는 형질 전환체 BL21 (DE3)을 전 배양하고 A 배지 3 ml에 1 vol % 양을 접종했다. 37 ℃에서 4시간 배양 후 20 ℃에서 20시간 진탕 배양하였다. 배양 후 배지 2 ml를 채취하고 400 μl의 BugBuster (등록 상표)를 추가 현탁 후 실온에서 15분간 진탕했다. 그 후, 원심 (15000 rmp / 4 ℃ / 20분)을 실시하여 얻어진 상층액을 효소 표본으로 준비했다.
GDH 활성 측정은 DCIP (0.3 mM) / PMS (0.6 mM) 계에서 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6.5)을 사용하여 기질로 포도당 (Glc; 1,2,4,10,20,40 mM), 크실로오스 (Xyl; 4,40 mM)를 사용했다.
또한 열 안정성 시험은 다음과 같이 진행하였다. 45 ℃로 예열한 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6.5) 800 μl 상기 효소 표본을 200 μl 첨가 혼합하여 즉시, 미리 45 ℃로 가열 해 둔 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6. 5) 100 μl에 혼합물 100 μl를 첨가했다 (최종 농도 10 배 희석). 첨가 한 후 45 ℃에서 2, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30분 배양했다. 일정 시간 경과 후, 신속하게 얼음으로 냉각했다. GDH 활성 측정은 DCIP (0.3 mM) / PMS (0.6 mM) 계에서 20 mM 인산 칼륨 완충액 (pH6.5)을 사용하여 기질은 Glc (40 mM)을 사용했다.
Ssc 변이 효소의 평가 결과를 표 1 내지 표 6에 나타낸다. 표 안의 수치는 비활성 (U / mg) 및 생산성 (U / L)는 40 mM 포도당을 기질로 하여 동일한 조건에서 수행 한 몇 회분의 데이터의 평균치이다. 또한 얻어진 효소 표본을 이용하여 기질 (포도당; 1,2,4,10,20,40 mM) 농도와 활성과의 상관 관계를 관찰하고 그로 인해 얻은 포화 곡선으로부터 획득한 미카엘리스·멘텐 상수 (Km 값) 및 뚜렷한 최대 활성(Vmax)을 구하였다.
Figure pct00001
표 1은 60 ml 배양액에서 Ssc-n1에 변이를 도입한 효소의 평가 결과이다. N191K 또는 N191S, N191R, N191E로 치환한 변이 효소는 야생형인 N191 (358U / L)을 포함한 효소에 비해 생산성이 N191K (735U / L)는 2 배, N191S (1516U / L)는 4.2 배, N191R (2245U / L)는 6.3 배, N191E (1967U / L)는 5.5 배로 모두 생산성이 향상되었다. 또한 S529G (1673U / L)는 4.7 배 향상되었다. 또한 이 가운데 이러한 변이를 결합한 Ssc-n1 N191K/S529G (3409U / L)는 9.5 배의 생산성의 대폭적인 향상에 성공했다.
Figure pct00002
표 2는 60 ml 배양액에 Ssc-n2 및 Ssc-n3, Ssc-n4을 이용한 이중 변이의 평가 결과이다. N191K/S529G를 포함하는 이중 변이 Ssc-n2, Ssc-n3, Ssc-n4의 효소들은 야생형인 Ssc-n1에 비해 생산성이 향상되었을 뿐만 아니라, Ssc-n2, Ssc-n3, Ssc-n4보다 더 높은 생산성을 보여 주었다. 또한 S529G에 N191S, N191R 또는 N191E를 결합한 Ssc-n 2의 이중 변이에서도 야생형인 Ssc-n2 및 Ssc-n1보다 향상된 생산성을 나타내었다. 이상의 결과에서 이중 변이 N191K/S529G는 Ssc의 생산성 향상에 매우 효과적인 변이임을 입증한다.
Figure pct00003
표 3은 60 ml 배양액에 Ssc-n2를 이용하여 N191K/S529G와 G69A (또는 H 또는 N) 또는 Y70F 또는 A73E 또는 A73P 변이와의 조합을 평가한 결과이다. 모든 변이에서 야생형인 Ssc-n1에 비해 생산성이 향상되었다. A73E와 G69H 이외의 조합은 모두 Ssc-n2보다 생산성이 향상되었다. 또한 모든 변이 효소에서 크실로오스와의 반응성은 같은 농도의 포도당에 대한 활성의 5 ~ 7 % 정도이며, 야생형보다 훨씬 포도당에 대한 특이성이 높아, 크실로오스 대한 활성이 감소했다.
Figure pct00004
　표 4는 3 ml 배양액에 Ssc-n2를 이용한 N191K/S529G와 각종 변이를 조합한 다중 변이 효소의 평가 결과이다. 여기서 기준이 되는 활성은 야생형인 Ssc-n1이다. 모든 다중 변이 효소들이 기준 활성 값을 상회하여 생산성 향상에 효과적인 것으로 나타났다. 또한 Ssc-n2의 60 ml와 비교하여, A73M, M112C 및 A113F 이외의 조합 변이들은 Ssc-n2보다 높은 생산성을 달성하였고, N191K/S529G와 각종 변이의 조합이 생산성 향상에 효과적인 것으로 나타났다. 이 중에서도 특히 N191K/S529G/F525Y, N191K/S529G/P527Y 및 N191K/F525Y/S529G/P527Y에서 매우 높은 생산성을 달성했다.
Figure pct00005
표 5는 60 ml 배양액에 Ssc-n2를 이용한 N191K/S529G 및 F525W 또는 F525Y, P527V 또는 P527Y 변이와 다중 변이 효소의 평가 결과이다. 모든 다중 변이 효소에서도 Ssc-n1 및 Ssc-n2의 생산성을 웃돌았고 N191K/S525G/P527Y는 N191K/S525G의 생산성을 상회하는 뛰어난 변이 효소임을 지적했다.
Figure pct00006
표 6은 3 ml 배양액에 Ssc-n2를 이용한 N191K/S529G와 각종 변이를 조합한 다중 변이 효소의 평가 결과이다. 모든 다중 변이 효소도 Ssc-n1 및 Ssc-n2의 생산성을 상회하여 이러한 변이의 조합을 통해 생산성을 향상시킬 것으로 나타났다. 이 중에서도 특히 N191K/S529G/S505P는 뛰어난 생산성을 보여 주었다. 또한 열 안정성이 향상된 변이가 포함되어있는 것이 밝혀졌다.
Ang 변이 효소의 평가 결과를 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다. 표 안의 수치는 비활성 (U / mg) 및 생산성 (U / L)는 40 mM 포도당을 기질로 하여 동일한 조건에서 수행한 몇 회분의 데이터의 평균치이다. 또한 얻어진 효소 표본을 이용하여 기질 (포도당; 1,2,4,10,20,40 mM) 농도와 활성과의 상관 관계를 관찰하고 그로 인해 얻은 포화 곡선으로부터 획득한 미카엘리스·멘텐 상수 (Km 값) 및 뚜렷한 최대 활성(Vmax)을 구하였다.
Figure pct00007
표 7은 60 ml 배양액에서 Ang-n1, Ang-n2 및 Ang-n3에 변이를 도입한 효소의 평가 결과이다. 모든 변이 효소가 야생형인 Ang-n1에 비해 생산성이 향상되었다. Ang-n2를 이용한 변이 효소의 평가는 T522S 및 N368K/T522S 이중 변이에서 Ang-n1 및 Ang-n2보다 훨씬 생산성이 높았다. 또한 Ang-n1, Ang-n2 및 Ang-n3와 E195K/Q196E과 결합시킴으로써 크게 생산성이 향상되었다. 또한 Ang-n2와 E195D 또는 E195R 및 Q196E과 결합하여 대폭적인 생산성 향상을 달성할 수 있었다. 따라서 이러한 변이 및 그 조합에 의해 생성된 변이 효소는 생산성이 향상된 변이형 효소인 것이 밝혀졌다.
Figure pct00008
표 8은 3 ml 배양액의 Ang-n2를 이용한 E195K/Q196E와 다른 아미노산 변이의 조합을 평가한 결과이다. 이러한 변이 효소는 Ang-n2보다 높은 생산성을 보여 유효한 변이임을 밝혀졌다. 또한 자일로오스에 대한 활성도 낮은 것으로 밝혀졌다. 특히 E195K/Q196E/G73A 및 E195K/Q196E/S75G는 생산성을 향상시키고 E195K/Q196E/G73A/S75G은 생산성과 기질 특이성을 향상시키고 E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A는 기질 특이성이 향상되었다. 또한 E195K/Q196E/Y524F은 생산성과 Km을 향상시키고 E195K/Q196E/P526X는 기질 특이성이 향상되었다.
이들 중 특히 흥미로운 변종에 대해 60 ml에서 배양하고 초산을 이용하여 효소를 정제하여 평가했다. 결과를 표 9에 나타낸다. E195K/Q196E/G73A/S75G/P526M는 생산성, Vmax 및 기질 특이성이 향상되었다.
Figure pct00009
실시예 7
효소 센서의 제조 및 평가
Ssc 변이 효소인 Ssc-n2 N191K/S529G 및 Ang 변이 효소인 Ang-n2 E195K/Q196E을 이용하여 효소 전극을 제작하였다. 본 발명의 변이 FAD-GDH의 5 단위에서 카본 페이스트 20 mg을 첨가하여 동결 건조시켰다. 이를 잘 혼합 한 후 이미 카본 페이스트가 약 40 mg 충전된 카본 페이스트 전극의 표면에만 충전하고, 여과지에서 연마했다. 이 전극을 1 % 글루타르알데히드를 포함한 10 mM MOPS 완충액 (pH7.0)에서 실온에서 30분간 처리한 후, 20 mM 리진을 포함한 10 mM MOPS 완충액 (pH7.0)에서 실온에서 20분간 처리하고 글루타르알데히드를 차단했다. 이 전극을 10 mM MOPS 완충액 (pH7.0)에서 실온에서 1시간 이상 평형화시켰다. 전극은 4 ℃에서 저장했다.
제작한 효소 센서를 이용하여 포도당 농도 측정을 실시했다. 본 발명의 변이 FAD-GDH를 고정화한 효소 센서를 이용하여 0.1 mM 내지 5 mM의 범위에서 포도당을 정량할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Ultizyme International Ltd. <120> Glucose Dehydrogenase <130> PUZ-9009WO <150> JP 2011-288830 <151> 2011-12-28 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 589 <212> PRT <213> Sclerotinia sclerotiorum <400> 1 Met Asn Arg Leu Leu Pro Ala Val Ala Leu Ala Ser Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Pro Glu Leu Asn Leu Ala Tyr Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly 20 25 30 Thr Ser Gly Leu Val Ile Ala Asn Arg Leu Ser Glu Leu Asn Val Thr 35 40 45 Val Ala Val Ile Glu Ala Gly Asp Leu Gly Tyr Glu Asn Val Asn Ile 50 55 60 Thr Asn Pro Ala Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Thr Asn Ile Asp Trp 65 70 75 80 Ala Tyr Gln Ser Val Asn Gln Lys Tyr Ala Gly Asn Ala Thr Gln Thr 85 90 95 Leu Arg Ala Gly Lys Val Ile Gly Gly Thr Ser Thr Ile Asn Gly Met 100 105 110 Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Ala Trp Glu Ala Leu 115 120 125 Gly Asn Asp Gly Trp Asn Trp Glu Asn Leu Phe Pro Tyr Tyr Lys Lys 130 135 140 Ser Gln Arg Leu Glu Pro Pro Thr Ala Ala Gln Ala Glu Ser Gly Ala 145 150 155 160 Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Asn Gly Val Asp Gly Pro Leu Lys Val Gly 165 170 175 Trp Leu Asn Asn Leu Ala Asn Asp Asp Phe His Ile Thr Leu Asn Asp 180 185 190 Thr Tyr Ala Ser Leu Gly Val Phe Ala Asn Glu Asp Val Asn Thr Gly 195 200 205 Arg Met Val Gly His Asn Arg Tyr Pro Ala Thr Tyr Asp Ser Thr Leu 210 215 220 Asn Val Arg His Asp Ala Gly Arg Ala Tyr Tyr Tyr Pro Ile Ala Asn 225 230 235 240 Arg Thr Asn Leu His Leu Tyr Pro Asn Thr Met Ala Gln Arg Leu Thr 245 250 255 Trp Lys Ser Gly Ala Asp Ile Pro Thr Thr Asn Gly Val Glu Val Leu 260 265 270 Ala Asn Asn Ser Ser Ile Pro Tyr Thr Ile Ser Ala Asn Ser Glu Val 275 280 285 Ile Leu Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Ser 290 295 300 Gly Ile Gly Asn Pro Ser Ile Leu Asn Lys Tyr Asn Ile Pro Val Val 305 310 315 320 Val Asp Leu Pro Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Asn Asn 325 330 335 Gly Leu Ala Tyr Thr Val Ser Glu Asp Ala Ser Phe Ser Gly Val Gly 340 345 350 Thr Leu Val Ala Tyr Pro Ser Ala Ala Gln Val Phe Gly Ser Glu Ile 355 360 365 Gln Asn Ile Ser Thr His Val Leu Asp Ser Leu Pro Ser Tyr Ala Ala 370 375 380 Gln Val Ser Ala Ala Ser Gly Asn Ile Thr Lys Ala Ala Asp Leu Leu 385 390 395 400 Glu Phe Phe Lys Ile Gln Tyr Asp Leu Ile Phe Ser Ser Thr His Pro 405 410 415 Ile Pro Met Ala Glu Ile Leu Val Met Pro Ser Thr Thr Gly Phe Thr 420 425 430 Thr Glu Tyr Trp Ala Leu Leu Pro Phe Ala Arg Gly Asn Ile His Ile 435 440 445 Thr Ser Ser Ile Pro Gly Thr Pro Ala Ala Ile Asn Pro Asn Tyr Tyr 450 455 460 Met Leu Asp Trp Asp Ile Thr Ser Gln Phe Thr Thr Ala Lys Phe Ile 465 470 475 480 Arg Ser Ile Tyr Ala Thr Ser Pro Leu Ser Asn Leu Val Gly Ser Glu 485 490 495 Thr Lys Pro Gly Leu Glu Thr Val Ser Ala Asn Ala Thr Glu Ala Glu 500 505 510 Trp Ser Glu Trp Ile Lys Ala Gly Tyr Arg Ser Asn Phe His Pro Val 515 520 525 Ser Thr Ala Ala Met Met Pro Arg Glu Val Gly Gly Val Val Asp Ser 530 535 540 Arg Leu Lys Val Tyr Gly Thr Ser Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser 545 550 555 560 Ile Leu Pro Met Gln Val Cys Gly His Leu Val Ser Thr Leu Tyr Ala 565 570 575 Val Ala Glu Arg Ala Ala Asp Leu Ile Lys Glu Glu Ile 580 585 <210> 2 <211> 588 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 2 Met Leu Phe Pro Ser Leu Ala Leu Ala Ala Phe Ser Leu Gly Val Thr 1 5 10 15 Ala Lys Ser His Ala Asp Ser Pro Ala His Tyr Asp Phe Val Ile Val 20 25 30 Gly Gly Gly Thr Ser Gly Leu Val Val Ala Asn Arg Leu Ser Glu Leu 35 40 45 Ser Asp Val Thr Val Ala Val Ile Glu Ala Gly Glu Ser Ala Leu Asn 50 55 60 Asn Phe Asn Val Ser Asn Val Met Gly Tyr Ser Thr Ala Phe Gly Thr 65 70 75 80 Glu Val Asp Trp Ala Tyr Gln Thr Glu Asn Gln Thr Tyr Ala Gly Gly 85 90 95 Leu Gln Gln Thr Ile Arg Ala Gly Lys Ala Leu Gly Gly Thr Ser Thr 100 105 110 Ile Asn Gly Met Ser Tyr Thr Arg Ala Glu Asp Val Gln Ile Asp Asn 115 120 125 Trp Glu Val Leu Gly Asn Asp Gly Trp Asn Trp Lys Asn Leu Phe Gln 130 135 140 Tyr Tyr Lys Lys Ser Glu Gly Phe Gln Val Pro Thr Lys Asp Gln Ile 145 150 155 160 Ala His Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Ser Tyr His Gly Leu Asn Gly Pro 165 170 175 Leu Lys Val Gly Trp Pro Asn Ser Met Thr Asn Ser Ser Val Phe Pro 180 185 190 Val Leu Glu Gln Thr Phe Glu Lys Leu Gly Val Gln Tyr Asn Pro Asp 195 200 205 Ser Glu Gly Gly Lys Met Val Gly Phe Thr Val His Pro Asp Thr Leu 210 215 220 Asp Arg Glu Met Asn Val Arg Glu Asp Ala Ala Arg Ala Tyr Tyr Trp 225 230 235 240 Pro Tyr Glu Ala Arg Ser Asn Leu Lys Ile Ile Ser Asn Thr Arg Ala 245 250 255 Asn Lys Val Ile Trp Ala Asn Thr Thr Gln Gly Glu Ala Val Ala Val 260 265 270 Gly Ile Glu Val Thr Asn Ala Tyr Gly Thr Glu Thr Ile Tyr Ala Asp 275 280 285 Lys Glu Val Ile Leu Ser Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Ala Ile Leu 290 295 300 Glu Leu Ser Gly Ile Gly Asn Pro Asp Val Leu Asn Lys His Asn Ile 305 310 315 320 Pro Val Lys Val Asn Ile Thr Thr Val Gly Glu Asn Leu Gln Asp Gln 325 330 335 Thr Asn Asn Ala Leu Ser Trp Glu Gly Val Asp Thr Leu Thr Gly Leu 340 345 350 Ala Thr Phe Ser Val Leu Pro Ser Val Asn Gln Leu Tyr Gly Asp Asn 355 360 365 Val Thr Ala Leu Ala Ser Tyr Val Lys Ser Gln Leu Ala Ser Tyr Ala 370 375 380 Lys Thr Val Ala Ser Ala Ser Asn Gly Ala Val Lys Glu Ala Asn Leu 385 390 395 400 Val Glu Ala Phe Glu Arg Gln Tyr Asp Leu Ile Phe Asn Ser Gln Val 405 410 415 Pro Tyr Thr Glu Val Val Phe Ala Pro Ser Gly Asn Ser Phe Ala Val 420 425 430 Glu Tyr Trp Pro Leu Leu Pro Phe Ser Arg Gly Ser Val His Ile Gln 435 440 445 Ser Ala Asn Ala Ser Asp Tyr Pro Ala Ile Asn Pro Asn Tyr Phe Met 450 455 460 Phe Asp Gln Asp Ala Glu Ala Gln Val Thr Val Ala Gln Tyr Ile Arg 465 470 475 480 Lys Ala Leu Gly Thr Ala Pro Leu Asn Ser Leu Val Gly Glu Glu Val 485 490 495 Ser Pro Gly Leu Asp Val Leu Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Thr Trp 500 505 510 Thr Lys Trp Val Lys Glu Asn Tyr Arg Thr Asn Tyr His Pro Val Gly 515 520 525 Thr Thr Ser Met Leu Pro Arg Glu Lys Gly Gly Val Val Ser Pro Glu 530 535 540 Leu Lys Val Tyr Gly Thr Lys Asn Val Arg Val Val Asp Ala Ser Val 545 550 555 560 Leu Pro Phe Gln Leu Cys Gly His Leu Thr Ser Thr Leu Tyr Ala Val 565 570 575 Ala Glu Arg Ala Ser Asp Leu Ile Lys Glu Ser Tyr 580 585

Claims (21)

  1. SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입되고 포도당 탈수소 효소 활성을 갖는 단백질에서, E195K, Q196X (X는 E, D 또는 R이다), Y524F, P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), N368K, T522S 또는 이들의 조합인 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  2. SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서, E195K/Q196X (X는 E, D 또는 R이다), E195K/Q196E/G73A, E195K/Q196E/S75G, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X (X는 G, V, I, F, Y, S, T, C, M, H 또는 Q이다), E195K/Q196E/G73A/Y524F, E195K/Q196E/G73A/P526X (X는 I, F, S 또는 M이다), E195K/Q196E/G73A/S75G/Y524F, E195K/Q196E/G73A/S75G/P526X (X는 I, F, Y, S 또는 M이다), N368K/T522S 및 N368K/T522S/E195K/Q196E로 이루어진 군에서 선택되는 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  3. 제2항에 있어서, E195K/Q196E/G73A/S75G/P526M, E195K/Q196E/Y524F, E195K/Q196E/P526X, E195K/Q196E/S69E/N70D/G73A, E195K/Q196E/G73A/S75G, E195K/Q196E/S75G 및 E195K/Q196E/G73A로 이루어진 군에서 선택되는 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 20 잔기가 제거되고 21 번째 Ala 잔기가 Met로 치환된 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 26 잔기가 제거되고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn-Thr-Thr-Thr이 추가된 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  6. SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입되고 포도당 탈수소 효소 활성을 갖는 단백질에서, S529G, N191X (여기서 X는 K, S, R, 또는 E), G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R) 또는 이들의 조합인 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  7. 제6항에 있어서, Y70F 또는 Y70M, G71S, A73X (여기서 X가 E, P, M, T 또는 C), M112C 또는 M112L, A113F 또는 A113S, Y521F, S523P, F525W 혹은 F525Y, P527X (여기서 X는 M, I, Q, V 또는 Y), A182R, S505P, V571C, N46E, N240E, N274E, N275K, N370K 또는 N370E로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  8. SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G, N191S/S529G, N191R/S529G, N191E/S529G로 이루어진 군에서 선택되는 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  9. SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G/G69X (여기서 X가 A, H, N, C, D, F, K, L, M, N 또는 R이다), N191K/S529G/Y70F, N191K/S529G/F525Y, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/P527V, N191K/S529G/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y, N191K/S529G/F525Y/P527Y/G69A, N191K/S529G/S505P로 이루어진 군에서 선택되는 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  10. SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 N191K/S529G/S505P/N46E, N191K/S529G/S505P/N240E, N191K/S529G/S505P/N274E, N191K/S529G/S505P/N275E, N191K/S529G/S505P/N370K, N191K/S529G/S505P/N370E으로 이루어진 군에서 선택되는 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 16 잔기가 제거되고 17 번째 Ser 잔기가 Met로 치환된 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질에서 그 N 말단 서열에서 23 잔기가 제거되고 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Thr-Asp-Ser-Thr-Leu-Asn 또는 Met-Asn-Thr-Thr-Thr 또는 Met-Ala-Pro-Glu이 추가된 변이 아미노산을 포함하는 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 인코딩하는 유전자.
  14. 제13항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  15. 제14항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 또는 형질도입체.
  16. 제15항의 형질전환체를 배양하고, 배양물에서 포도당 탈수소 효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 포도당 탈수소 효소의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 이용하여 시료 중의 포도당 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 포도당 분석 방법.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 포도당 분석 키트.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질이 전극 표면에 고정화된 효소 전극.
  20. 제19항의 효소 전극을 작용 전극으로 이용하는 것을 특징으로 하는 포도당 센서.
  21. SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 삽입된 포도당 탈수소 효소를 이용하고, 포도당 산화 효소 활성을 나타내지 않되 포도당 탈수소 효소 활성을 가지고, 크실로오스에 대한 반응성이 포도당에 대한 반응성의 20 % 이하인 것을 특징으로 하는 용존 산소의 영향을 받지 않는 포도당 측정용 바이오 센서.
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