KR102424603B1 - 알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 - Google Patents

알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알코올 탈수소효소 변이체에 관한 것으로, 리시니바실러스(Lysinibacillus) 속 미생물 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신(lysine, K), 314번째 글루탐산(glutamic acid, E), 318번째 리신, 388번째 발린(valine, V) 및 396번째 글루탐산 중 적어도 하나가 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 알코올 탈수소효소 변이체, 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체는 종래의 알코올 탈수소효소들에 비해 기질친화도와 효소 활성이 우수하여 보다 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법{A Mutants of Alcohol Dehydrogenase, and A Method for Preparing Aldehyde Compounds Using The Same}
본 발명은 알코올 탈수소효소 변이체에 관한 것이다.
일반적으로 알데히드 화합물은 목표 물질을 합성하기 위한 중간 화합물로 사용되는 물질이다. 주로, 합성하고자 하는 물질 내의 알코올기를 알데히드기로 선택적으로 치환하는 반응을 진행하여 목표 물질을 합성하게 된다. 이러한 선택적인 치환 반응을 일으킬 수 있는 합성 방법은 이미 공지되어 있고, 다양한 분야에서 실제로 적용 또는 응용하여 사용하고 있다.
알데히드 화합물을 생산하는 방법은 크게 화학적 합성법과 효소나 미생물을 이용하는 생물학적 합성법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 따른 알코올의 산화에 의한 알데히드 화합물의 제조 과정의 경우에는 산화가 과하게 진행되게 의한 카르복시산이 생성되는 것을 방지하기 위해 생성된 알데히드 화합물을 즉시 반응계 외에 취출하거나, 알데히드 화합물을 즉시 안정적이고 재생하기 쉬운 유도체로 바꾸거나, 또는 불활성 용매 중에서 산화 반응을 수행하는 등의 과정이 필요하고, 위험한 시약이나 고가의 촉매를 이용하여야 할 뿐만 아니라, 반응 조건이 엄격하다는 등의 문제점이 있었다. 그에 비해, 생물학적인 합성 방법은 알데히드 화합물을 간단한 공정으로 직접 생산할 수 있어, 위와 같은 문제점을 가지고 있는 화학적 합성법을 대체할 수 있는 생산기술로 주목받고 있다.
상기와 같은 생물학적 합성 방법에는 관련 효소의 개발이 필수적이라고 할 것인데, 이에 관여하는 효소의 하나로 알코올을 산화시켜 알데히드 화합물로 전환시키는 활성을 갖는 촉매인 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)가 있다. 그런데, 위와 같은 알코올 탈수소효소는 알코올을 산화시켜 알데히드 화합물로 전환시키기도 하지만, 가역적으로 알데히드 화합물을 알코올로 다시 환원시키는 활성도 함께 가지고 있어서, 종래 알려진 알코올 탈수소효소는 그 활성이 충분하지 못하여 알데히드 화합물의 생산량이 매우 적은 문제점이 있었다. 뿐만 아니라, 종래의 알코올 탈수소효소는 기질친화도가 낮아서 기질인 알코올이 미량으로 존재하는 환경에서는 그 효소 반응이 진행되기 어려워 이를 미생물에 도입하더라도 사실상 생물학적인 합성 환경에서 알코올을 기질로 이용할 수 없는 문제점이 있었다. 이러한 문제점들로 인해 종래의 알코올 탈수소효소를 적용한 생물학적 합성 방법은 산업적으로 이용하기에는 불충분하였다.
이에, 보다 효소 활성과 기질친화도가 우수한 신규의 알코올 탈수소효소에 관한 연구·개발이 더욱 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 종래에 비해 기질친화도가 향상된 알코올 탈수소효소 변이체와 이를 이용하여 알데히드 화합물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 46번째 리신(lysine, K)이 아스파르트산(aspartic acid, D) 및 글루탐산(glutamic acid, E)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되거나, 318번째 리신(lysine, K)이 세린(serine, S), 트레오닌(threonine, T), 아스파라긴(asparagine, N) 및 글루타민(glutamine, Q)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환되거나, 또는 314번째 글루탐산(glutamic acid, E), 388번째 발린(valine, V) 및 396번째 글루탐산(glutamic acid, E) 중 적어도 하나가 글리신(glycine, G), 알라닌(alanine, A), 발린(valine, V), 이소류신(isoleucine, I) 및 류신(leucine, L)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것인, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 변이체를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 포함하는 상기 알데히드 화합물 생산용 조성물, 및 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 알코올과 함께 반응시키는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물 생산 방법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경에서 배양하는 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체는 종래의 알코올 탈수소효소들에 비해 기질친화도가 현저하게 우수하여 실제로 생물학적 합성 방법에 적용되어 알코올로부터 알데히드 화합물을 생산해 내는데 이용될 수 있고, 알코올을 기질로 알데히드 화합물을 생성함에 있어 독성 물질이나 환경오염을 유발하는 부산물이 발생하지 않기 때문에, 알데히드 화합물을 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의한 알데히드 화합물의 생성 정도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 서열번호 1, 3, 7 및 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 대상으로 0.1 M의 메탄올이 존재하는 환경에서 포름알데히드를 생성할 수 있는지를 HPLC를 통해 확인한 결과이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 '알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)'는 하기 반응식과 같이 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure 112020110790015-pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 알코올 탈수소효소 변이체
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 알코올 탈수소효소 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 리시니바실러스(Lysinibacillus) 속 미생물, 보다 구체적으로는 리시니바실러스 실라니리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus)로부터 유래한 것으로서, 알코올 탈수소효소의 활성을 갖는 단백질이다.
본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신(lysine, K), 314번째 글루탐산(glutamic acid, E), 318번째 리신, 388번째 발린(valine, V) 및 396번째 글루탐산 중 적어도 하나가 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 46번째 리신은 아스파르트산(aspartic acid, D) 또는 글루탐산으로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신은 글루탐산으로 치환될 수 있고, 구체적으로 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 314번째 글루탐산은 글리신(glycine, G), 알라닌(alanine, A), 발린(valine, V), 이소류신(isoleucine, I) 또는 류신(leucine, L)으로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 314번째 글루탐산은 글리신, 알라닌 또는 발린으로, 예컨대 글리신으로 치환될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 318번째 리신은 세린(serine, S), 트레오닌(threonine, T), 아스파라긴(asparagine, N) 또는 글루타민(glutamine, Q)으로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 318번째 리신은 아스파라긴 또는 글루타민으로, 예컨대 아스파라긴으로 치환될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 388번째 발린은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 또는 류신으로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 388번째 발린은 이소류신 또는 류신으로, 예컨대 이소류신으로 치환될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 396번째 글루탐산은 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신 또는 류신으로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 396번째 글루탐산은 발린 또는 이소류신으로, 예컨대 발린으로 치환될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
또한, 상기 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신, 314번째 글루탐산, 318번째 리신, 388번째 발린 및 396번째 글루탐산 중 둘 이상이 각각 독립적으로 상술된 범위 내의 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신과 314번째 글루탐산이 각각 글루탐산과 글리신으로 치환될 수 있고, 특히 상기 변이체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 318번째 리신과 396번째 글루탐산이 각각 아스파라긴과 발린으로 치환될 수 있고, 특히 상기 변이체는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 변이체들은 기본적으로 알코올 탈수소효소로서의 활성을 가진다. 따라서 상기 변이체는 알코올, 특히 저급 알코올을 알데히드 화합물로 변환하고, 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 6, 구체적으로 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올일 수 있으며, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 변이체들은 종래의 알코올 탈수소효소, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소에 비해 기질친화도가 우수하다. 또한, 상기 변이체들은 종래의 알코올 탈수소효소, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소에 비해 효소 활성이 우수하다.
또한, 상기 변이체들은 상기와 같은 기질친화도나 효소 활성에 관한 특성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 추가적으로 변형될 수 있다. 상기와 같은 특성에 영향을 미치지 않는 단백질 또는 펩티드 수준에서의 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 리시니바실러스 실라니리티쿠스(Lysinibacillus xylanilyticus)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열의 46번째 리신을 글루탐산으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 314번째 글루탐산을 글리신으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 318번째 리신을 아스파라긴으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 388번째 발린을 이소류신으로, 그리고 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 396번째 글루탐산을 발린으로 각각 치환한 5개의 변이체(K46E, E314G, K318N, V388I 및 E396V)와, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 46번째 리신과 314번째 글루탐산을 각각 글루탐산과 글리신으로 치환한 변이체(K46E+E314G), 그리고 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 318번째 리신과 396번째 글루탐산을 각각 아스파라긴과 발린으로 치환한 변이체(K318N+E396V)를 제작하였고, 이들 7개의 변이체 모두 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소에 비해 그 활성이 2배 이상 우수함을 확인하였다(도 2 참고).
아울러, 상기와 같은 7개의 변이체 중, 대표적으로 3개의 변이체(K46E, K318N 및 E396V)를 대상으로 100 mM 수준의 메탄올을 기질로 이용하여 반응시켰을 때 포름알데히드가 생성되는지 여부를 확인한 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소에서는 포름알데히드가 거의 생성되지 않는데 비해, 상기 3개의 변이체의 반응 생성물에서는 유의미한 수준으로 포름알데히드가 검출되는 것을 확인하였다(도 3 참고).
추가적으로, 상기 변이체 중 4개의 변이체(K46E, K318N, E396V 및 K318N+E396V)를 대상으로 효소 동역학을 분석하여 기질친화도를 측정한 결과, 4개의 변이체 모두 그 Km 값이 0.5 mM 보다 낮은 수준인 것을 확인하였다(표 4 참고).
2. 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자, 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 다른 측면은 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자를 제공한다.
예컨대, 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 16로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 그러나 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 알코올 탈수소효소 변이체가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환 시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 신규의 변이체이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.
3. 알코올 탈수소효소 변이체의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 알코올 탈수소효소 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체의 생산 방법은 1) 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계, 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 3) 상기 단계 2)에서 알코올 탈수소효소 변이체의 유전자 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 알코올 탈수소효소 변이체를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단 위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 알코올 탈수소효소 변이체의 정제 또는 원래 형태의 알코올 탈수소효소 변이체의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 알코올 탈수소효소 변이체의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 알코올 탈수소효소 변이체는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 정제할 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 변이체들이 모두 알코올 탈수소효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 1 및 도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 알코올 탈수소효소 변이체의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4. 알데히드 화합물의 생산 방법 및 알데히드 화합물 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 이용하여 알코올로부터 알데히드 화합물을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 알데히드 화합물의 생산에 이용되는 알데히드 화합물 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 알데히드 화합물 생산용 조성물은 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 포함한다.
또한, 본 발명의 알데히드 화합물의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체를 알코올과 반응시키는 단계, 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 알데히드 화합물의 생산 방법 및 알데히드 화합물 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 알데히드 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 저급 알코올을 기질로 이용하는 경우 저급 알데히드 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 메탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 포름알데히드가 생성되고, 기질로 에탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 아세트알데히드가 생성되는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 20℃ 내지 55℃의 온도 범위, 바람직하게는 22℃ 내지 45℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 7 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 8 내지 9.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 8.5 내지 9의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 알코올 탈수소효소 변이체의 활성을 향상시키기 위해 상기 알코올 탈수소효소 변이체와 함께 금속 양이온이 함께 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 마그네슘 양이온일 수 있다.
상기 단계 1)의 반응에서, 기질인 상기 알코올은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 알코올은 목적하는 알데히드 화합물의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 상기 알코올의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 알코올이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 알코올 탈수소효소 변이체에 의하여 알데히드 화합물을 지속적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 알데히드 화합물을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 알데히드 화합물의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 알코올이 공급되는 환경하에서 배양하는 단계, 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법은 형질전환체 내에서 발현되는 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 알데히드 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 저급 알코올을 기질로 이용하는 경우 저급 알데히드 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 메탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 포름알데히드가 생성되고, 기질로 에탄올이 이용되는 경우에는 알데히드 화합물로 아세트알데히드가 생성되는 것이다.
상기 알코올이 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 알코올을 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 알코올을 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 알코올이 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 알코올이 생산되는 환경은 상기 알코올의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주 세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 60℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 알데히드 화합물의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.
또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 10에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 8.5 내지 pH 10에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 알데히드 화합물의 발현이 용이하지 않아 알데히드 화합물의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 변이체들의 경우, 종래의 알코올 탈수소효소, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소에 비해 그 효소 활성이 훨씬 우수한 것으로 확인되므로(도 2 내지 도 3 참고), 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 이용하는 본 발명의 알데히드 화합물의 생산 방법에 의하면 알데히드 화합물을 효과적으로 대량생산할 수 있다. 나아가, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 변이체들의 경우, 종래의 알코올 탈수소효소, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소에 비해 기질친화도 역시 훨씬 우수한 것으로 확인되므로(도 3 및 표 4 참고), 상기 알코올 탈수소효소 변이체를 이용하는 본 발명의 알데히드 화합물의 생산 방법에 의하면 기질인 알코올이 매우 적은 농도로 존재하거나 매우 적은 농도로 공급되는 환경, 예컨대 인 비보(in vivo)에서도 알데히드 화합물을 효과적으로 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
알코올 탈수소효소 변이체의 제조
[1-1] 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 유전자의 클로닝 및 형질전환
서열번호 1의 아미노산 서열에서, 46번째 리신을 글루탐산으로 치환한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 K46E 변이체의 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 바와 같은 K46E의 프라이머 쌍과 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 PCR 산물이 삽입된 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
증폭대상 프라이머 쌍 서열(5'->3')
K46E 정방향 프라이머 caatttgttcagagagacctaactcgtgtaagccctcatctgttacg
K46E 역방향 프라이머 cgtaacagatgagggcttacacgagttaggtctctctgaacaaattg
상기와 같이 제작된 재조합 발현 벡터를 대상으로 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 수행한 결과, 상기 서열번호 4의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환 하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2] 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3㎖의 LK 고체 배지(LB 배지+25㎎/㎖ 카나마이신)에 선접종하고 37℃에서 10시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를 단집락 분리 과정으로 3㎖의 LK 고체 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37℃의 진탕 배양기로 18시간 동안 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액 2㎖를 200㎖의 LK 배지가 포함된 1000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 18℃로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 50㎖의 코니칼 튜브(conical tube, SPL Life Sciences Co., Ltd., 한국)에 분주하고, 4℃에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리해 낸 펠렛에 프로피니아 1X 용해 완충 용액(Profinia 1X Lysis buffer, Bio-Rad Laboratories, 미국) 10㎖를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 14000rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kitㄲㅷ His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag가 붙어 있는 약 43 kDa의 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
[1-3] 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 제조
추가적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 314번째 글루탐산을 글리신으로 치환한 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 E314G 변이체, 318번째 리신을 아스파라긴으로 치환한 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 K318N 변이체, 388번째 발린을 이소류신으로 치환한 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 V388I 변이체, 그리고 396번째 글루탐산을 발린으로 치환한 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 E396V 변이체의 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 6, 8, 10 및 12의 염기 서열을 설계하였고, 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]에서와 동일한 방법으로, 하기 표 2의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 6, 8, 10 및 12의 염기 서열을 갖는 유전자를 클로닝하고, 서열번호 5, 7, 9 및 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
증폭대상 프라이머 쌍 서열(5'->3')
E314G 정방향 프라이머 catcacgtttacttaacgctccaacgttttcgcctaacaat
E314G 역방향 프라이머 attgttaggcgaaaacgttggagcgttaagtaaacgtgatg
K318N 정방향 프라이머 cagcagcatcacgattacttaacgcttcaacgttttcgc
K318N 역방향 프라이머 gcgaaaacgttgaagcgttaagtaatcgtgatgctgctg
V388I 정방향 프라이머 tcttctttcttcgctatagggcccatcgcgttc
V388I 역방향 프라이머 gaacgcgatgggccctatagcgaagaaagaaga
E396V 정방향 프라이머 gaagaaagaagagtcacttgtagctgtcgcactttct
E396V 역방향 프라이머 gaagaaagaagagtcacttgtagctgtcgcactttct
또한, 46번째 리신과 314번째 글루탐산을 각각 글루탐산과 글리신으로 치환한 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 K46E+E314G 변이체는 서열번호 4의 염기 서열을 주형으로 상기 표 2에 기재된 E314G 변이체의 프라이머 쌍을 이용하여, 그리고 318번째 리신과 396번째 글루탐산을 각각 아스파라긴과 발린으로 치환한 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 K318N+E396V 변이체는 서열번호 8의 염기 서열을 주형으로 상기 표 2에 기재된 E396V 변이체의 프라이머쌍을 이용하여, 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]에서와 동일한 방법으로, 서열번호 14 및 16의 염기 서열을 갖는 유전자를 클로닝하고, 서열번호 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag가 붙어 있는 약 42 kDa의 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
[1-4] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 제조
대조군으로 이용하기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 주형으로 하여 상기 실시예 [1-1] 및 [1-2]에서와 동일한 방법으로, 하기 표 3의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자를 클로닝하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 각각 분리 및 정제하였다.
증폭대상 프라이머 쌍 서열(5'->3')
서열번호 1 정방향 프라이머 agcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatgtcagacgttctaaagcaatttgtaa
서열번호 1 역방향 프라이머 ctttcgggctttgttagcagccggatcctcgagttaagaaagtgcgacagcttcaagtgactctt
알코올 탈수소효소 변이체의 효소 활성 확인
상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 7개의 단백질 각각, 즉 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질 0.05㎎/㎖를 100mM의 메탄올과 함께, 5mM의 NAD와 10mM의 MgCl2가 포함된 50mM의 CHES 완충 용액(pH 9.5)에 첨가하고, 55℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 포름알데히드의 생성량을 HPLC를 통하여 확인하였다.
상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
그 결과, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 정제 및 분리한 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 알코올로부터 알데히드 화합물을 생성하는 알코올 탈수소효소로서의 활성을 가질 뿐만 아니라, 이들 모두 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소보다 더욱 우수한 효소 활성을 가짐을 확인하였다(도 2).
알코올 탈수소효소 변이체의 동역학적 특성 분석
상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 분리 및 정제한 7개의 단백질 중, 대표적으로 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질(K46E 변이체), 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질(K318N 변이체), 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질(E396V 변이체) 0.05 ㎎/㎖를 100 mM의 메탄올과 함께, 10 mM의 NAD와 5 mM의 MgCl2가 포함된 50mM의 CHES 완충 용액(pH 9)에 첨가하고, 55℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 그 반응물을 대상으로 HPLC를 수행하여 포름알데히드의 생성량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 정제 및 분리한 서열번호 3, 7, 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.05 ㎎/㎖, 100 mM 메탄올과 10 mM NAD와 5 mM의 MgCl2가 포함된 50 mM의 CHES 완충 용액(pH 9.0)에 첨가하고, 55℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 완충 용액에 반응물 40 ㎕과 피리딘, 메탄올, 물이 33:15:2의 비율로 혼합된 용매에 0.13 mM 오쏘-벤질하이드록실아민 하이드로클로라이드가 포함된 용액 100 ㅅL를 넣어 상온에서 10분간 반응시켰다. 13000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 추출하여 필터링한 뒤 HPLC를 통해 성분을 분석하였다.
상기와 같이 준비된 전처리된 샘플 50 ㎕을, ZORBAX ECLIPSE XDB-C18(Agilent, 미국) 칼럼이 장착된 HPLC에 주입하여, 포름알데히드의 생성량을 측정하였다. 상기와 같은 HPLC를 수행함에 이용된 이동상은 0.1% TFA(trifluoroacetic acid, 이동상 A)과 0.095% TFA가 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 H2O를 4:1의 비율로 혼합한 것(이동상 B)으로 구성되고, 1 ㎖/분의 유속으로 50분 동안 흘려주었으며, 상기 이동상 B의 농도를 10%~100%로 올려주었다.
상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소에서는 포름알데히드가 거의 생성되지 않는데 비해(물과 동일한 수준의 피크가 확인됨), 상기 3종의 변이체들(K46E 변이체, K318N 변이체, E396V 변이체)의 반응 생성물에서는 포름알데히드가 유의미한 수준으로 검출되는 것으로 확인되었다(도 3).
또한, 기질로 메탄올을 이용하는 경우에, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질(K46E 변이체), 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질(K318N 변이체), 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질(E396V 변이체) 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 단백질(K318N+E396V 변이체)의 동역학적 특성을 분석하기 위하여, 상기 실시예 [1-2] 및 [1-3]에서 정제 및 분리한 서열번호 3, 7, 11 및 15의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질 0.05㎎/㎖, 10 mM NAD 및 5 mM Mg2+가 포함된 50mM의 CHES 완충 용액(pH 9)에 메탄올을 다양한 농도(0-1.0mM)의 함량으로 첨가하여 55℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 10분 동안 반응시키고, 상기와 같은 방식으로 HPLC를 수행하여 포름알데히드의 생성량을 측정하여 활성을 측정한 후, 마이켈리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten Equation)에 의하여 효소 동역학적 파라미터 값을 계산하여, 그 결과를 아래 표 4에 나타내었다.
역시, 상기 실시예 [1-4]에서 분리 및 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행하여 그 결과를 대조군으로 삼았다.
단백질 K cat (nmol/min·mg) K m (mM) K cat /K m (fold)
서열번호 1 (야생형) 48 ± 5 1.311 ± 0.405 36.61 (1)
K46E 변이체 39 ± 4 0.372 ± 0.231 104.8 (2.9)
K318N 변이체 37 ± 7 0.046± 0.071 804.3 (22)
E396V 변이체 27 ± 3 0.010 ± 0.003 2700 (74)
K318N+E396V 변이체 30 ± 3 0.233 ± 0.107 128.8 (3.5)
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 알코올 탈수소효소의 경우 Km 값이 1.311 mM인데 반해, 상기 K46E 변이체, K318N 변이체, E396V 변이체 및 K318N+E396V 변이체의 Km 값은 각각 0.372 mM, 0.046 mM, 0.010 mM 및 0.233 mM로 모두 0.5 mM 보다 낮은 것으로 확인되었다(표 4 참고).
상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 알코올 탈수소효소 변이체들은 mM이 아닌 μM 단위 수준의 기질이 존재하는 환경, 즉 기질이 매우 낮은 농도로 존재하는 환경에서도 효소 반응을 일으킬 수 있을 정도로 기질친화도가 향상되었음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> A Mutants of Alcohol Dehydrogenase, and A Method for Preparing Aldehyde Compounds Using The Same <130> 2020-DPA-3857 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 1 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser <210> 2 <211> 1206 <212> DNA <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 2 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 3 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K46E <400> 3 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Glu Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 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catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg gagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 7 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K318N <400> 7 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 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tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taatcgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 9 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V388I <400> 9 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Ile Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser <210> 10 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V388I <400> 10 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tatagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 11 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E396V <400> 11 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Val Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser <210> 12 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E396V <400> 12 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgtagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 13 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K46E+E314G <400> 13 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Glu Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Gly Ala Leu Ser Lys Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Glu Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser <210> 14 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K46E+E314G <400> 14 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacgagtt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacacat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg gagcgttaag taaacgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgaagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206 <210> 15 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K318N+E396V <400> 15 Met Ser Asp Val Leu Lys Gln Phe Val Met Pro Lys Thr Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Ile Gln Glu Val Gly Thr Arg Leu Asn Asp Leu Glu 20 25 30 Val Lys Lys Thr Leu Ile Val Thr Asp Glu Gly Leu His Lys Leu Gly 35 40 45 Leu Ser Glu Gln Ile Ala Asn Ile Ile Thr Ala Ala Gly Ile Asp Val 50 55 60 Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Gln Asn Ile Glu 65 70 75 80 Asp Gly Ile Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Ser 85 90 95 Leu Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Ala Ala Lys Gly Ile Gly Leu Ile 100 105 110 Ala Ser Asn Gly Gly Arg Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Lys Ser 115 120 125 Gln Asn Pro Leu Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr 130 135 140 Ala Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Ala Arg Lys 145 150 155 160 Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Leu Leu Ser Ile 165 170 175 Asn Asp Pro Glu Leu Met Ile Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ser Phe Val Ser Thr 195 200 205 Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Glu Lys Val Leu Gln Leu 210 215 220 Val Pro Glu Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Glu Gln Met Val Tyr Ala Gln Phe Leu Ala Gly Met Ala Phe 245 250 255 Asn Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly 260 265 270 Gly Phe Tyr Asn Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro 275 280 285 His Val Cys Arg Phe Asn Leu Thr Ala Arg Thr Glu Arg Phe Ala Arg 290 295 300 Ile Ala Glu Leu Leu Gly Glu Asn Val Glu Ala Leu Ser Asn Arg Asp 305 310 315 320 Ala Ala Glu Lys Ala Ile Val Ala Ile Glu Asn Leu Ser Arg Asp Leu 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Gly Phe Arg Glu Leu Gly Ala Lys Asp Glu Asp Ile 340 345 350 Glu Ile Leu Ala Lys Asn Ala Met Leu Asp Val Cys Ala Ala Thr Asn 355 360 365 Pro Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Ile Lys Gln Ile Ile Thr Asn Ala 370 375 380 Met Gly Pro Val Ala Lys Lys Glu Glu Ser Leu Val Ala Val Ala Leu 385 390 395 400 Ser <210> 16 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K318N+E396V <400> 16 atgtcagacg ttctaaagca atttgtaatg ccaaaaacaa acttatttgg acctggagca 60 attcaagaag ttggtacacg cttaaatgat ttagaagtga aaaagacatt aatcgtaaca 120 gatgagggct tacacaaatt aggtctctct gaacaaattg ctaacatcat tacagctgct 180 ggaattgatg tagcgatttt cccgaaagca gaaccaaatc caacagatca gaacattgaa 240 gacgggattg cagtgtatca tgctgaaaac tgtgattcaa tcgtttctct tggaggcggt 300 agtgcacacg atgcagcaaa aggtatcgga cttattgctt cgaatggtgg acgcattcat 360 gattacgagg gcgttgacaa atcacaaaac ccactggttc cattaatcgc tattaacaca 420 actgctggta cagcaagtga aatgactcgc ttcacaatta ttacggatac agctcgtaaa 480 gtgaagatgg ccatcgtgga caaacatgtt actccactac tatcgattaa tgaccctgag 540 ctaatgatcg gcttacctcc tgctctaaca gcggcaactg gtttagatgc tttaacgcat 600 gcaatcgaat catttgtgtc gacaaacgca acaccaatta ctgatgcatg tgcagaaaag 660 gtacttcagc tagttcctga atatttacca cgtgcctatg caaacggtgc agatttagaa 720 gcacgtgagc aaatggttta cgcacaattt ttagcgggca tggcgtttaa taatgcatca 780 cttggctatg tgcatgcaat tgctcatcaa ttaggtggtt tctataatct accacatggc 840 gtatgtaacg ctattctatt gccacatgtt tgccgcttca acttaacagc acgtactgag 900 cgttttgcaa gaatcgcaga attgttaggc gaaaacgttg aagcgttaag taaccgtgat 960 gctgctgaga aagcaattgt agcaattgaa aatctttcta gagatttgaa cattccaagt 1020 ggcttccgcg aattaggtgc gaaggatgag gatattgaaa tcttagcgaa aaacgcaatg 1080 ttagatgtat gtgctgcaac aaacccacgt aaagcaactt tagaggagat taaacaaatt 1140 attacgaacg cgatgggccc tgtagcgaag aaagaagagt cacttgtagc tgtcgcactt 1200 tcttaa 1206

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 46번째 리신(lysine, K), 314번째 글루탐산(glutamic acid, E), 318번째 리신, 388번째 발린(valine, V) 및 396번째 글루탐산 중 적어도 하나가 각각 독립적으로 다른 아미노산으로 치환된 것으로서,
    상기 46번째 리신은 글루탐산으로 치환되거나;
    상기 314번째 글루탐산은 글리신(glycine, G)으로 치환되거나;
    상기 318번째 리신은 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환되거나;
    상기 388번째 발린은 이소류신(isoleucine, I)으로 치환되거나; 또는
    상기 396번째 글루탐산은 발린으로 치환된 것인, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 318번째 리신은 아스파라긴으로 치환되거나; 또는
    상기 396번째 글루탐산은 발린으로 치환된 것인, 알코올 탈수소효소 변이체.
  5. 청구항 1 및 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알코올 탈수소효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소효소에 비해 저급 알코올에 대한 기질친화도가 향상된 것인 알코올 탈수소효소 변이체.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 저급 알코올은 메탄올인 것인 알코올 탈수소효소 변이체.
  7. 청구항 1의 알코올 탈수소효소 변이체를 암호화하는 유전자.
  8. 청구항 7의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  9. 청구항 8의 재조합 발현 벡터가 숙주 세포에 도입된 형질전환체.
  10. 청구항 9의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 알코올 탈수소효소를 분리하는 단계;를 포함하는 알코올 탈수소효소 변이체의 생산 방법.
  11. 청구항 1의 알코올 탈수소효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 알데히드 화합물 생산용 조성물.
  12. 청구항 1의 알코올 탈수소효소 변이체를 알코올과 함께 반응시키는 단계;를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 알코올 탈수소효소 변이체와 알코올의 반응 생성물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  14. 청구항 9의 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 형질전환체의 배양물로부터 알데히드 화합물을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 알데히드 화합물의 생산 방법.
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