KR20160144258A - 숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법에 관한 것으로서, 섬유소, 섬유소결합도메인 및 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들을 포함하고, 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들이 각각 섬유소결합도메인과 융합되어 섬유소결합도메인을 통해 섬유소에 결합된 형태의 효소 복합체를 제공하며, 이러한 효소 복합체는 숙신산 합성의 출발 물질로부터 숙신산으로 전환되는 일련의 과정에 작용하는 효소들의 물리적인 간격을 좁힘으로써 중간 생성물이 즉각적으로 다음 반응에 참여할 수 있도록 유도할 수 있고, 그로 인해 전체적인 숙신산 생성의 속도나 수율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법{Enzyme Complex of Succinic Acid Synthetases and Producing Method of Succinic Acid Using the Same}

본 발명은 숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법에 관한 것이다.

숙신산(호박산)은 식품 및 의약품 첨가제, 플라스틱의 원료, 용매 등과 같은 범용화학물질로 널리 활용되고 있는 유기산이다. 현재 사용되고 있는 숙신산은 대부분 석유를 원료로 하는 화학 공정에 의해서 생산되고 있다. 하지만 최근 원유 가격의 상승, 환경에 대한 관심 증가 등으로 숙신산 생산 공정을 재생 가능한 원료를 사용하는 생물 공정으로 대체하려는 노력이 활발하게 이루어지고 있다.

위와 같은 노력의 일환으로, 숙신산 합성에 관여하는 효소(즉, TCA 회로에 관여하는 효소)인 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh), 푸마라아제(fumarase, fum) 등과 같은 효소를 미생물에 도입하여 숙신산의 생산 효율을 향상시키고자 하는 시도가 있었다. 예를 들면, 코리네박테리움의 fumC를 대장균의 fumB로 교체함으로써 본래의 fumC를 가지는 모균주 대비 숙신산의 생성 효율을 15% 향상시킬 수 있음이 연구된 바 있다(특허문헌 1 참고).

이와 같이 미생물을 이용하여 숙신산을 생산하는 경우, TCA 회로의 산화적 인산화 반응을 통해 미생물 내에 C4 화합물들이 축적될 수는 있으나, 세포 내부에서는 TCA 회로에 관여하는 효소들 외에도 다양한 C4 전환효소들이 존재하고 있기 때문에, 실제로는 말산, 푸마르산, 숙신산의 축적이 방해받게 된다. 예를 들면, 옥살아세트산(oxaloacetate, OAA)의 경우, 말산 탈수소효소에 의하여 말산으로 전환되어야 하지만, 동시에 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)에 의해 아스파르트산(aspartate)으로 전환되기도 하고, 말산으로부터 푸마르산을 생합성하는 반응도 탈수소 반응의 역반응으로 진행하기 어려운 것으로 판단되고 있다.

이에, 본 발명자들은 숙신산 합성 효율을 높이기 위해 숙신산 생합성 관련 효소들이 존재하는 물리적 간격을 좁혀 중간 생성물이 즉각적으로 반응에 참여함으로써 다른 기타 효소들에 의해 축적이 방해되는 문제를 해소할 수 있는 시스템에 대하여 연구하였고, 대장균 내에서 불용성 단백질 구조체를 형성하는 것으로 알려져 있는 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)을 이용하여 세포 내에서 숙신산 생합성 관련 효소들을 고정 및 집적함으로써 고효율/고수율로 숙신산을 생산할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국 특허출원 제2013-0094885호

본 발명의 목적은 생물 공정으로 숙신산을 생산함에, 숙신산의 생산 효율을 향상시킬 수 있는 숙신산 합성 효소들의 효소 복합체 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 섬유소, 섬유소결합도메인 및 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들을 포함하고, 상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 각각 상기 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)과 융합되어 상기 섬유소결합도메인을 통해 상기 섬유소에 결합되는 것을 특징으로 하는 숙신산 합성을 위한 효소 복합체를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 효소들의 유전자가 각각 섬유소결합도메인의 유전자와 서로 융합된 형태로 클로닝되어 있는 숙신산 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 숙신산 생산용 재조합 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체로부터 상기 재조합 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 숙신산 합성을 위한 효소 복합체의 인 비보(in vivo) 제조 방법, 및 상기 형질전환체로부터 숙신산 합성에 관여하는 효소와 섬유소결합도메인의 융합 단백질을 발현 및 정제하는 단계 및 상기 발현 및 정제된 재조합 단백질을 시험관 내에서 섬유소로 응집시키는 단계를 포함하는 숙신산 합성을 위한 효소 복합체의 인 비트로(in vitro) 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 숙신산 합성을 위한 효소 복합체를 시험관 내에서 숙신산 합성의 출발 물질과 반응시키는 단계를 포함하는, 효소 복합체를 이용한 인 비트로(in vitro) 상에서의 숙신산 생산 방법을 제공한다.

아울러, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 숙신산 합성의 출발 물질의 존재 하에서 배양시키는 단계를 포함하는, 효소 복합체를 이용한 인 비보(in vivo) 상에서의 숙신산 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 숙신산 합성 효소들을 섬유소결합도메인으로 고정하여 세포 내에서 숙신산 합성의 출발 물질(예, 포도당)로부터 숙신산으로 전환되는 일련의 과정에 작용하는 효소의 물리적인 간격을 좁힘으로써, 중간 생성물이 즉각적으로 다음 반응에 참여할 수 있도록 유도할 수 있고, 그로 인해 전체적인 숙신산 생성의 속도나 수율을 향상시킬 수 있다. 또한 세포 내에서 각 효소들이 고정된 상태로 존재할 수 있도록 함으로써, 각 효소의 안정성 또한 확보할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 숙신산 생합성 경로를 나타낸다.
도 2는 숙신산 합성에 관여하는 효소들 중 일부인 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh) 및 푸마라아제(fumarase, fum)가 섬유소결합도메인에 융합된 이후, 섬유소에 결합하여 숙신산 합성을 위한 메타볼론을 형성하는 과정을 나타낸 예시도이다.
도 3은 본 발명의 숙신산 합성을 위한 효소 복합체의 개략도이다.
도 4는 숙신산 합성에 관여하는 효소들 중 일부인 pckA, mdh 및 fum가 각각 섬유소결합도메인에 융합된 단백질(이하 '효소-CBD 융합 단백질'이라고 합니다)인 pckA-CBD, mdh-CBD 및 fum-CBD의 형성 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다:
C: 조추출물(crude extract);
P: 정제된 효소(purified enzyme); 및
W: 폐기물(waste).
도 5는 효소-CBD 융합 단백질들을 이용하여 포스포에놀피루브산으로부터 푸마르산 생산 시, 온도에 의한 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 효소-CBD 융합 단백질을 이용하여 포스포에놀피루브산으로부터 푸마르산 생산 시, 섬유소(아비셀)의 존부에 의한 영향을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 대장균 내에서 효소 복합체를 이용한 글루코스로부터 숙신산 생산 여부 및 그 효율을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다:
●- pckA, mdh, fumC가 도입된 대장균에서의 숙신산 생산량;
○- pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD가 도입된 대장균에서의 숙신산 생산량;
△- pckA, mdh, fumC가 도입된 대장균에서의 포도당 소모량; 및
▲- pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD가 도입된 대장균에서의 포도당 소모량.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 숙신산 합성을 위한 효소 복합체

본 발명의 일 측면은 숙신산 합성을 위한 효소 복합체를 제공한다.

도 3은 상기와 같은 본 발명의 일 측면에 따른 숙신산 합성을 위한 효소 복합체의 구조를 도시한 예시도이다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 효소 복합체는 섬유소, 섬유소결합도메인 및 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들을 포함한다.

상기 섬유소는 본 발명의 효소 복합체의 지지체가 되는 것으로서, 생물체 내에 존재하는 모든 종류의 섬유소일 수 있다. 따라서 상기 섬유소는 동물 또는 식물에서 유래된 것일 수 있고, 특히 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그노셀룰로오스 등 일 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서는 결정성의 셀룰로오스의 일종인 아비셀을 이용하여 효소 복합체의 효과를 확인하였다.

상기 숙신산 합성에 관여하는 효소는 포도당에서부터 숙신산이 생성되는 일련의 대사 과정에 참여하는 모든 효소를 의미하며, 그 중에서 선택된 둘 이상의 효소이다. 특히, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소는 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh), 푸마라아제(fumarase, fum) 및 숙신산 유비퀴논 산화환원효소(succinate ubiquinone oxidoreductase, sdhABCD)로 이루어진 군으로부터 선택된 서로 다른 2 종류 이상일 수 있다.

상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들은 대장균 유래의 효소들일 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 말산 탈수소효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 푸마라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 숙신산 유비퀴논 산화환원효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들은 각 효소들의 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 말산 탈수소효소는 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되며, 상기 푸마라아제는 서열번호 8의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화되고, 상기 숙신산 유비퀴논 산화환원효소는 서열번호 9의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 본 발명의 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들 및 이들의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 서열번호 6 내지 서열번호 9의 염기 서열을 포함하는 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다.

상기 섬유소결합도메인(cellulose binding domain, CBD)은 섬유소에 결합하는 특성을 가진 도메인으로서, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들을 상기 섬유소에 결합 및 고정시키는 역할을 한다. 상기 섬유소결합도메인의 일 말단에는 숙신산 합성에 관여하는 효소들이, 그리고 상기 섬유소결합도메인의 타 말단에는 섬유소가 각각 결합됨으로써, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들이 섬유소 상에 결합 및 고정될 수 있는데, 상기 섬유소결합도메인은 일 말단이 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들과 융합된 재조합 단백질의 형태로 존재할 수도 있고, 다른 종류의 매개체를 통해 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들과 결합될 수 있다. 그리고 상기 섬유소결합도메인의 타 말단은 도메인 자체가 가지고 있는 섬유소 결합 특성에 의해 상기 섬유소에 결합될 수 있다. 상기 섬유소결합도메인은 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)에서 유래한 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이라면 제한없이 이용될 수 있다. 또한, 상기 섬유소결합도메인은 서열번호 10의 염기 서열을 포함하는 유전자에 의하여 암호화될 수 있으나 이에 한정되지 않고, 서열번호 10의 염기 서열과 실질적으로 동일한 염기 서열이라면 제한없이 이용될 수 있다.

상기와 같은 본 발명의 효소 복합체에서는 숙신산 합성에 순차적으로 관여하는 효소들이 섬유소 상에 조밀하게 모여있기 때문에, 어느 한 효소에 의해 생성된 중간 생성물이 다음 효소와 즉각적으로 반응을 일으킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 숙산산 합성에 관여하는 효소들 중 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소, 말산 탈수소효소 및 푸마라아제가 섬유소결합도메인을 통해 섬유소 상에 결합 및 고정된 효소 복합체를 제조하였는데, 상기와 같은 효소들이 섬유소 상에 밀집되어 있기 때문에, 상기 효소 복합체 상에서 포도당으로부터 대사된 포스포에놀피르부산이 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소에 의하여 옥살로아세트산으로 전환된 후, 중간 생성물인 상기 옥살로아세트산이 그 다음 효소인 말산 탈수소효소와 바로 반응을 일으킬 수 있게 되고, 나아가 말산 탈수소효소에 의해 생성된 말산 역시 그 다음 효소인 푸마라아제와 바로 반응을 일으킬 수 있게 된다(도 3 참고). 따라서 상기와 같은 본 발명의 효소 복합체는 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소들 세포질 내에 각각이 유리된 상태로 존재하는 경우에 비해 생성된 중간체들이 지체없이 다음 단계의 효소 반응에 참여하게 되므로, 더욱 빠른 속도로 숙신산이 생성될 수 있고, 그 결과 숙신산의 수율이 더욱 향상될 수 있게 되다. 본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 상기와 같은 효과를 확인하였다(도 6 및 도 7 참고).

2. 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터 및 형질전환체

본 발명의 다른 측면은 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들의 유전자가 각각 섬유소결합도메인의 유전자와 서로 융합된 형태로 클로닝되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소 및 섬유소결합도메인에 관해서는 상기 "1. 숙신산 합성을 위한 효소 복합체 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 숙신산 합성을 위한 효소 복합체 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 재조합 벡터 및 형질전환체에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

상기 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하는데, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 특히, 본 발명에서는 플라스미드 벡터가 이용될 수 있는데, 상기 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선택 마커 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

상기 숙신산 합성에 관여하는 효소의 유전자와 섬유소결합도메인의 유전자는 상기와 같은 제한효소 절단부위에 클로닝될 수 있고, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소의 유전자와 섬유소결합도메인의 유전자는 서로 융합되어 발현될 수 있는 상태로 클로닝된다. 상기와 같이 서로 융합되어 발현될 수 있는 상태로 클로닝되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있는데, 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소의 유전자와 섬유소결합도메인의 유전자의 융합 단백질을 설계하고 상기 융합 단백질의 유전자 컨스트럭트를 먼저 제조한 후 이를 벡터에 삽입할 수도 있고, 두 개의 유전자를 별도로 순차적으로 벡터에 삽입하여 백터 내에서 두 유전자가 서로 융합되도록 할 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pET21a 벡터에 숙신산 합성에 관여하는 효소인 pckA, fumC, mdh의 유전자들을 먼저 삽입한 다음, 이후에 이들 유전자와 융합될 수 있도록 섬유소결합도메인들을 각각 삽입함으로써, pckA, fumC, mdh의 유전자들과 섬유소결합도메인의 융합 단백질인 pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD가 발현될 수 있도록 재조합 벡터를 제조하였다(실시예 1 참고).

또한, 상기와 같이 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들의 유전자가 각각 섬유소결합도메인의 유전자와 서로 융합된 형태의 유전자 컨스럭트들은 각각의 컨스트럭트가 서로 다른 벡터에 따로따로 삽입되어 있을 수도 있고, 2 이상의 유전자 컨스트럭트가 하나의 벡터에 함께 삽입되어 있을 수도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 3 종류의 숙신산 합성에 관여하는 효소들이 하나의 숙주세포 내에서 효과적으로 발현될 수 있도록 하기 위하여, pckA-CBD 융합 단백질과 mdh-CBD 융합 단백질의 유전자 컨스트럭트는 하나의 벡터에 삽입하고, fumC-CBD 융합 단백질의 유전자 컨스트럭트는 별도의 벡터에 삽입하였다(실시예 1 참고).

상기 재조합 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 숙신산 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 본 기술 분야에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 활성형 단백질 입자를 효과적으로 정제할 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 도입되어 형질전환체를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명의 형질전환체에는 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들의 유전자가 각각 섬유소결합도메인의 유전자와 서로 융합된 형태로 클로닝되어 있는 재조합 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

3. 효소 복합체의 제조 방법

본 발명의 다른 측면은 상기 "2. 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터 및 형질전환체 " 항목에서 설명한 재조합 벡터 및 형질전환체를 이용하여, 상기 "1. 숙신산 합성을 위한 효소 복합체 "에서 설명한 효소 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 숙신산 합성을 위한 효소 복합체는 상기 "2. 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터 및 형질전환체 " 항목에서 설명된 바와 같이 제조된 형질전환체에서 상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들과 섬유소결합도메인의 융합 단백질을 발현시킴으로써 인 비보(in vivo) 상에서 제조될 수 있다. 형질전환체 내에서 상기 융합 단백질이 발현되면, 상기 융합 단백질이 형질전환체 내에 존재하는 섬유소에 결합될 수 있고, 이러한 과정을 통해 형질전환체 내에서 발현되는 융합 단백질이 섬유소결합도메인을 통해 섬유소 상에 결합됨으로써 형질전환체 내에서 자연스럽게 효소 복합체가 생성될 수 있다. 상기와 같이 형질전환체 내의 인 비보(in vivo) 환경에서 효소 복합체가 생성된 경우, 상기와 같은 형질전환체의 인 비보(in vivo) 환경을 그대로 숙신산의 생성에 이용하거나, 또는 상기 형질전환체로부터 효소 복합체를 분리해 낸 다음, 분리된 효소 복합체를 이용하여 인 비트로(in vitro) 환경에서 숙신산의 생성에 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 숙신산 합성을 위한 효소 복합체는 상기 "2. 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터 및 형질전환체 " 항목에서 설명된 바와 같이 제조된 형질전환체에서 상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들과 섬유소결합도메인의 융합 단백질을 발현 및 분리ㅇ정제해 낸 다음, 이들 융합 단백질을 시험관 내에서 섬유소에 결합시키는 과정을 통해 인 비트로(in vitro) 상에서도 제조될 수 있다. 상기와 같이 제조된 효소 복합체는 인 비트로(in vitro) 환경에서 숙신산의 생성에 이용할 수 있다.

4. 효소 복합체를 이용한 숙신산 제조 방법

본 발명의 또 다른 측면은 상기 "1. 숙신산 합성을 위한 효소 복합체 "에서 설명한 효소 복합체를 이용하여, 인 비보(in vivo) 환경 또는 인 비트로(in vitro) 환경에서 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.

먼저, 인 비보(in vivo) 환경에서는 상기 "2. 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 재조합 벡터 및 형질전환체 " 항목에서 설명한 형질전환체를 숙신산 합성의 출발 물질의 존재 하에서 배양함으로써, 숙신산을 합성할 수 있다. 상기 "3. 효소 복합체의 제조 방법 "항목에서 설명한 바와 같이, 상기 형질전환체에서는 숙신산 합성에 관여하는 효소들과 섬유소결합도메인의 융합 단백질들이 발현된 다음, 상기 형질전환체 내에 존재하는 섬유소에 결합됨으로써 자연스럽게 효소 복합체가 형성되는바, 상기 형질전환체를 숙신산 합성의 출발 물질과 함께 배양함으로써 숙신산을 생산할 수 있다.

상기 숙신산 합성의 출발 물질은 숙신산 합성 경로의 모든 중간 생성물이 이에 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로 포도당, 포스포에놀피루브산, 옥살로아세트산, 말산 및 푸마르산으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙수세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 30℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 40℃ 내지 57℃, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 55℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 30℃ 미만 또는 60℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 숙신산 합성에 관여하는 효소들의 효소 복합체가 형성됨에도 불구하고 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 숙신산의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 숙신산 합성 효소 유전자들을 도입한 대장균을 대조군으로 하고, 숙신산 합성 효소의 유전자 및 섬유소결합도메인 유전자가 융합되어 발현되도록 클로닝된 벡터를 도입한 대장균을 실험군으로 하여 각 대장균을 5분 동안 50℃에서 배양하였을 때, 효소가 섬유소결합도메인에 융합된 실험군에서 숙신산 합성의 중간 생성물인 푸마르산 생성량이 현저히 향상됨을 확인하였다(도 5 참고).

또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 4.3 내지 pH 9.5에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질 전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형지전환체의 생장하기 어렵기 때문에 숙신산 합성 효소들과 섬유소결합도메인의 융합 단백질의 발현이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 이들 융합 단백질이 발현되어 효소 복합체가 형성된다고 하더라도 숙신산 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.

상기 형질전환체는 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 혐기성 조건은, 예를 들면 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm, 약 0.2 내지 0.3 vvm 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면 20℃ 내지 60℃ 또는 35℃ 내지 55℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 목적 C4 디카르복실산이 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 숙신산을 고효율로 생산하는 것을 목적으로 하나, 숙신산 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들, 예를 들어 옥살로아세트산, 말산 및 푸마르산의 고효율 생산에도 사용할 수 있도 있다. 일 예로, 푸마르산을 고효율로 생산하기 위해서는, 상기와 같은 형질전환체의 배양 시간을 조절하여 숙신산이 생성되기 전에 푸마르산을 회수함으로써 달성할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 pckA-CBD 융합 단백질, fumC-CBD 융합 단백질 및 mdh-CBD 융합 단백질이 발현될 수 있도록 형질전환된 대장균을 포도당이 함유된 배지에서 배양함으로써, 단순히 숙신산 합성 효소 pckA, mdh 및 fumC만을 도입한 경우에 비해, 숙신산 생성 효율이 향상됨을 확인하였다(도 7 참고).

다음으로, 인 비트로(in vitro) 환경에서는 상기 "1. 숙산산 합성을 위한 효소 복합체 " 항목에서 설명한 효소 복합체를 숙신산 합성의 출발 물질과 함께 시험관 내에서 반응시킴으로써, 숙신산을 합성할 수 있다.

상기 숙신산 합성의 출발 물질은 숙신산 합성 경로의 모든 중간 생성물이 이에 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로 포도당, 포스포에놀피루브산, 옥살로아세트산, 말산 및 푸마르산으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기와 같은 효소 복합체와 숙신산 합성의 출발 물질의 반응은 30℃ 내지 60℃, 바람직하게는 40℃ 내지 57℃, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 55℃에서 수행될 수 있고, pH 4.3 내지 pH 9.5에서, 바람직하게는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.

그리고 상기와 같은 인 비트로(in vitro) 환경에서의 숙신산 생성 방법 또한 숙신산을 고효율로 생산하는 것을 목적으로 하나, 상기 효소 복합체를 구성하는 효소의 종류를 조절함으로써, 옥살로아세트산, 말산, 푸마르산 등과 같은 숙신산 제조 공정에서 생산되는 중간 산물들을 고효율로 생상하는데 이용될 수도 있다. 예를 들어, 옥살로아세트산을 출발 물질로 하여 푸마르산을 고효율로 생산하고자 하는 경우, 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh)와 푸마라아제(fumarase, fum)만으로 상기 효소 복합체를 구성하고, 이를 옥살로아세트산과 함께 반응시킴으로써 달성할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 pckA-CBD 융합 단백질, fumC-CBD 융합 단백질 및 mdh-CBD 융합 단백질이 발현될 수 있도록 형질전환된 대장균에서 상기 세 융합 단백질들을 분리·정제한 다음, 시험관 내에서 상기 세 융합 단백질들을 아비셀에 결합시켜 효소 복합체를 제조하였고, 이들을 포스포에놀피루브산과 반응시키킴으로써, 단순히 숙신산 합성 효소 pckA, mdh 및 fumC가 유리된 상태로 반응시킨 경우에 비해, 숙신산 중간 생성물인 푸마르산의 생성 효율이 향상됨을 확인하였다(도 6 참고).

상기와 같이 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro) 환경에서 생성된 숙신산은 본 기술 분야에서 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 회수될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 및 실험예 ]

pck A, mdh , fum C, pck A-CBD, fum C-CBD, mdh -CBD 유전자의 제조

대장균 MG1655로부터 pckA의 유전자(서열번호 6), mdh의 유전자(서열번호 7), fumC의 유전자(서열번호 8)를, 그리고 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)로부터 CBD의 유전자(서열번호 10)를 확보하고, Wizard Genomic DNA purification kit(Promega)를 통해 각 미생물들의 게놈 DNA를 추출하였고, NCBI 서열정보를 바탕으로 제작된 하기 표 1과 같은 프라이머를 이용하여 PCR로 상기 유전자들을 증폭하였다.

프라이머 명칭	제한 효소	서열(5'~3') 및 제한효소 부위	서열번호
pckA NdeI F	NdeI	GGAATTC CATATG CGCGTTAACAATGGTTTGAC	11
pckA HindⅢ R	HindⅢ	CCC AAGCTT CAGTTTCGGACCAGCCGCTAC	12
mdh NdeI F	NdeI	GGAATTC CATATG AAAGTCGCAGTCCTCGGC	13
mdh HindⅢ R	HindⅢ	CCC AAGCTT CTTATTAACGAACTCTTCGCCCAGG	14
fumC NdeI F	NdeI	GGAATTC CATATG AATACAGTACGCAGCGAAAAAGATTC	15
fumC HindⅢ R	HindⅢ	CCC AAGCTT ACGCCCGGCTTTCATACTGC	16
PT CBDcex HindⅢ R	HindⅢ	CCC AAGCTT CCTCCGACGCCGACCC	17
CBDcex XhoI R	XhoI	CCG CTCGAG GCCGACCGTGCAGGGC	18

pckA의 유전자, fumC의 유전자, mdh의 유전자는 NdeI과 HindⅢ 제한 효소를 이용하여 pET21a 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터인 pET21a/pckA, pET21a/fumC, pET21a/mdh를 제작하였고, 상기 세 재조합 벡터들에 HindⅢ와 XhoI를 이용하여 CBD의 유전자를 삽입하여 재조합 벡터인 pET21a/pckA-CBD, pET21a/mdh-CBD, pET21a/fumC-CBD를 제작하였다. 상기 재조합 벡터 pET21a/pckA-CBD, pET21a/mdh-CBD, pET21a/fumC-CBD에서 pckA의 유전자, mdh의 유전자, fumC의 유전자와 CBD의 유전자 사이에는 구조적/기능적 구획을 제공을 위해 18bp의 짧은 프롤린-트레오닌(PT) 서열을 삽입하였다. 상기와 같이 제작된 6개의 재조합 벡터들(pET21a/pckA, pET21a/fumC, pET21a/mdh, pET21a/pckA-CBD, pET21a/mdh-CBD, pET21a/fumC-CBD)을 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 형질전환하고, 50㎍/㎖ 엠피실린이 포함된 LB 배지에 도말 배양하여 형질전환체를 선별하였다.

pck A , fum C , mdh , pck A -CBD, fum C -CBD, mdh -CBD의 발현 및 정제

상기 실시예 1에서 제작된 6개의 형질전환체를 3㎖의 LB 배지가 포함된 시험관에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그 다음 상기 종균 배양된 배양액을 500 ㎖의 LB 배지가 포함된 2,000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 그런 다음, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 되는 시점에 최종농도 0.1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 각 유전자들(pckA, mdh, fumC, pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD)의 대량 발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 200rpm, 배양 온도는 37℃를 유지하도록 조절하고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150rpm로, 배양 온도를 16℃로 각각 조정하여 16시간 이상 배양하였다.

상기와 같이 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 6,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨으로 두 번 세척한 다음, 50mM의 제일인산나트륨, 300mM의 염화나트륨, 10mM의 이미다졸(immidazole)과 단백질분해효소 저해제인 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 0.1mM을 첨가하여, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다.

상기 세포 파쇄물은 다시 13000g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 침전된 세포 펠렛은 제거한 후 세포 상등액만을 취하였다. 그리고 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템(fast protein liquid chromatography system)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 His-tag을 이용한 IMAC 흡착 컬럼을 장착하여, 상기 세포 상등액에서 발현된 단백질들을 분리 및 정제하였고, SDS-PAGE를 통해 정제된 단백질들(pckA, mdh, fumC, pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD)을 확인하였다(도 4).

CBD와의 융합 및 반응 온도 조건에 따른 생성 효율 확인

상기 실시예 2에서 분리 및 정제된 6개의 단백질들에 대하여, CBD가 융합되지 않은 효소들과 CBD가 융합된 융합 단백질 형태의 효소들을 각각 분리하여 CBD의 융합이 효소의 활성에 미치는 영향, 그리고 이들 효소의 활성이 반응 온도에 어떻게 영향을 받는지 확인하였다. 구체적으로, pckA, mdh, fumC을 각각 1:1:1의 비율로 혼합한 효소액 1과 pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD을 1:1:1의 비율로 혼합한 효소액 2를, 10mM 포스포에놀피루브산, 10mM ADP, 1mM NADH, 20mM MgCl₂가 포함된 50 mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)에 첨가하여 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 각각 5분 동안 반응을 진행하고, 200mM HCl을 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 후 UV 254㎚에서 푸마르산의 생성량을 측정하였다.

그 결과, 단순히 pckA, mdh, fumC 효소들만을 혼합하였던 효소액 1에 비하여, CBD를 융합시킨 융합 단백질 형태의 pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD를 혼합한 효소액 2가 모든 온도 구간에서 향상된 생산성을 나타내었고, 그 중 50℃의 온도 조건에서 현저히 생산성이 향상되는 것으로 확인되었다(도 5).

이처럼, 비록 섬유소에 결합시키지 않았지만, 각 효소들을 CBD와 융합시키는 것만으로도 생산성이 향상되는 상기와 같은 결과로부터 CBD와 융합시키는 것만으로도 어느 정도의 효소를 응집시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

섬유소(아비셀)에 의한 효소 응집에 따른 생성 효율 확인

상기 실시예 3의 효소액 1과 효소액 2를, 10 mM 포스포에놀피루브산, 10mM ADP, 1mM NADH, 20mM MgCl₂ 및 1g/L 아비셀(avicel)이 포함된 50 mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)(이하 '아비셀이 포함된 완충용액'이라고 합니다) 및 10mM ADP, 1mM NADH 및 20mM MgCl₂이 포함된 50 mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)(이하 '아비셀이 포함되지 않은 완충용액'이라고 합니다)에 각각 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 반응을 진행하고, 200mM HCl을 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 후 UV 254㎚에서 푸마르산의 생성량을 측정하였다.

그 결과, CBD를 융합시키지 않은 효소액 1에서는 아비셀의 첨가 유무에 상관 없이 생산성이 동일한 반면, CBD를 융합시킨 효소액 1에서는 아비셀의 첨가에 따라 생산성이 더욱 향상되는 것으로 확인되었다(도 6).

상기와 같은 결과로부터, 섬유소인 아비셀의 존재로 인해, 각 효소들에 융합된 CBD가 상기 아비셀에 결합하여, 아비셀을 지지체로 하여 CBD를 통해 각 효소들이 응집되는 효소 복합체가 형성되고, 그로 인해 생산성이 더욱 향상됨을 알 수 있다.

인 비보( in vivo ) 환경에서의 숙신산 생성

인 비보(in vivo) 환경에서 상기와 같은 효소 복합체의 형성 및 그에 따른 숙신산의 생산성을 확인하기 위하여, pckA, mdh, fumC 효소들을 발현하는 형질전환체와 CBD를 융합시킨 융합 단백질 형태의 pckA-CBD, fumC-CBD, mdh-CBD을 발현하는 형질전환체를 제조하였다.

구체적으로, 상기와 같은 세 효소들을 하나의 세포 내에서 효과적으로 발현시키기 위하여, 상기 세 효소를 복제 기점과 항생제 마커가 서로 다른 두 개의 벡터에 나누어서 다시 클로닝을 하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제작한 상기 pET21a/pckA, pET21a/fumC, pET21a/mdh 벡터를 주형으로 PCR을 수행하여 pckA, mdh 및 fumC의 유전자를 각각 증폭하였고, pckA의 유전자와 fumC의 유전자를 함께 pET21a 벡터(Novagen, 미국)에, mdh의 유전자를 pACYCDuet-1 벡터(Novagen, 미국)에 각각 다시 클로닝하여, 2개의 재조합 벡터인 pET21a/pckA/mdh와 pACYCDuet-1/fumC를 제작하였고, 이들 재조합 벡터들을 각각 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 다음, 이를 50㎍/㎖의 엠피실린과 34㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별함으로써, 형질전환체 1을 제작하였다.

그리고, 마찬가지로, 상기 실시예 1에서 제작한 상기 ET21a/pckA-CBD, pET21a/mdh-CBD, pET21a/fumC-CBD를 주형으로 PCR을 수행하여 pckA-CBD, mdh-CBD 및 fumC-CBD의 유전자를 각각 증폭하였고, pckA-CBD의 유전자 및 fumC-CBD의 유전자를 함께 pET21a 벡터(Novagen, 미국)에, mdh-CBD의 유전자를 pACYCDuet-1 벡터(Novagen, 미국)에 각각 다시 클로닝하여, 2개의 재조합 벡터인 pET21a/pckA-CBD/mdh-CBD와 pACYCDuet-1/fumC-CBD를 제작하였고, 이들 재조합 벡터들을 각각 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 다음, 이를 50㎍/㎖의 엠피실린과 34㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별함으로써, 형질전환체 2를 제작하였다.

상기와 같이 제작된 형질전환체 1과 형질전환체 2를 50㎍/㎖의 엠피실린과 34㎍/㎖의 클로람페니콜이 포함된 LB 배지 3㎖이 들어있는 시험관에 접종하고, 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 상기와 같이 종균 배양된 형질전환체 1과 형질전환체 2의 배양액을 포도당 10g/ℓ, 효모 추출물(yeast extract) 5g/ℓ, NaHCO₃ 10g/ℓ, NaH₂PO₄ㆍH₂O 8.5g/ℓ, K₂HPO₄ 15.5g/ℓ, 앰피실린 50㎍/㎖ 및 클로람페니콜 34㎍/㎖이 함유된 배지가 100 ㎖이 들어있는 200 ㎖ 세럼병(serum bottle)에 1%(v/v)에 각각 첨가하고, 상층에 있는 산소를 CO₂로 교환한 후, 30℃, 250rpm의 조건에서 본 배양을 실시하여 숙신산의 생산을 유도하였다.

그리고 시간별로 배양액을 체취한 후 13000g로 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 0.22㎛ 필터로 여과한 후, 상등액만을 취하여 HPLC로 배양액 내에 있는 포도당과 숙신산을 분석하였다. 이때 상기 포도당과 숙신산 농도의 측정은 RI 검출기와 양이온 교환 칼럼(Aminex HPX-87H, BioRad Labs)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행하였고, 상기 양이온 교환 칼럼은 50℃에서 0.6㎖/분의 속도로 4mM H₂SO₄ 용액을 통과시키도록 조정하였다.

그 결과, 형질전환체 1 및 형질전환체 2에서 거의 유사한 비율로 포도당을 소모하였음에도, 60시간 이후에, 형질전환체 1(대조군)에서는 66 mM/cell_DCW의 숙신산이 생성되는 반면, 형질전환체 2(실험군)에서는 80 mM/cell_DCW 이상의 숙신산이 생성됨을 확인하였다(도 7).

상기와 같은 결과로부터, 각 효소들을 CBD에 융합시켜 형질전환시키면 형질전환체 내에서도 효소 복합체가 형성되고, 그로 인해 숙신산의 생성 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology <120> Enzyme Complex of Succinic Acid Synthetases and Producing Method of Succinic Acid Using the Same <130> 2015-DPA-1017 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 540 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Arg Val Asn Asn Gly Leu Thr Pro Gln Glu Leu Glu Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Ile Ser Asp Val His Asp Ile Val Tyr Asn Pro Ser Tyr Asp Leu Leu 20 25 30 Tyr Gln Glu Glu Leu Asp Pro Ser Leu Thr Gly Tyr Glu Arg Gly Val 35 40 45 Leu Thr Asn Leu Gly Ala Val Ala Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Gly 50 55 60 Arg Ser Pro Lys Asp Lys Tyr Ile Val Arg Asp Asp Thr Thr Arg Asp 65 70 75 80 Thr Phe Trp Trp Ala Asp Lys Gly Lys Gly Lys Asn Asp Asn Lys Pro 85 90 95 Leu Ser Pro Glu Thr Trp Gln His Leu Lys Gly Leu Val Thr Arg Gln 100 105 110 Leu Ser Gly Lys Arg Leu Phe Val Val Asp Ala Phe Cys Gly Ala Asn 115 120 125 Pro Asp Thr Arg Leu Ser Val Arg Phe Ile Thr Glu Val Ala Trp Gln 130 135 140 Ala His Phe Val Lys Asn Met Phe Ile Arg Pro Ser Asp Glu Glu Leu 145 150 155 160 Ala Gly Phe Lys Pro Asp Phe Ile Val Met Asn Gly Ala Lys Cys Thr 165 170 175 Asn Pro Gln Trp Lys Glu Gln Gly Leu Asn Ser Glu Asn Phe Val Ala 180 185 190 Phe Asn Leu Thr Glu Arg Met Gln Leu Ile Gly Gly Thr Trp Tyr Gly 195 200 205 Gly Glu Met Lys Lys Gly Met Phe Ser Met Met Asn Tyr Leu Leu Pro 210 215 220 Leu Lys Gly Ile Ala Ser Met His Cys Ser Ala Asn Val Gly Glu Lys 225 230 235 240 Gly Asp Val Ala Val Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr 245 250 255 Leu Ser Thr Asp Pro Lys Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly 260 265 270 Trp Asp Asp Asp Gly Val Phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys 275 280 285 Thr Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Glu Pro Glu Ile Tyr Asn Ala Ile 290 295 300 Arg Arg Asp Ala Leu Leu Glu Asn Val Thr Val Arg Glu Asp Gly Thr 305 310 315 320 Ile Asp Phe Asp Asp Gly Ser Lys Thr Glu Asn Thr Arg Val Ser Tyr 325 330 335 Pro Ile Tyr His Ile Asp Asn Ile Val Lys Pro Val Ser Lys Ala Gly 340 345 350 His Ala Thr Lys Val Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Leu 355 360 365 Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Ala Asp Gln Thr Gln Tyr His Phe Leu 370 375 380 Ser Gly Phe Thr Ala Lys Leu Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Thr Glu 385 390 395 400 Pro Thr Pro Thr Phe Ser Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Leu Ser Leu 405 410 415 His Pro Thr Gln Tyr Ala Glu Val Leu Val Lys Arg Met Gln Ala Ala 420 425 430 Gly Ala Gln Ala Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Asn Gly Thr Gly Lys 435 440 445 Arg Ile Ser Ile Lys Asp Thr Arg Ala Ile Ile Asp Ala Ile Leu Asn 450 455 460 Gly Ser Leu Asp Asn Ala Glu Thr Phe Thr Leu Pro Met Phe Asn Leu 465 470 475 480 Ala Ile Pro Thr Glu Leu Pro Gly Val Asp Thr Lys Ile Leu Asp Pro 485 490 495 Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Pro Glu Gln Trp Gln Glu Lys Ala Glu Thr 500 505 510 Leu Ala Lys Leu Phe Ile Asp Asn Phe Asp Lys Tyr Thr Asp Thr Pro 515 520 525 Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Ala Gly Pro Lys Leu 530 535 540 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Lys 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tggcagttcc acccgaccgg cattgccggt gcgggcgtac 1560 tggtcaccga aggttgccgt ggtgaaggcg gttatctgct gaacaaacat ggcgaacgtt 1620 ttatggagcg ttatgcgccg aacgccaaag acctggcggg ccgtgacgtg gttgcgcgtt 1680 ccatcatgat cgaaatccgt gaaggtcgcg gctgtgatgg tccgtggggg ccacacgcga 1740 aactgaaact cgatcacctg ggtaaagaag ttctcgaatc ccgtctgccg ggtatcctgg 1800 agctttcccg taccttcgct cacgtcgatc cggtgaaaga gccgattccg gttatcccaa 1860 cctgtcacta catgatgggc ggtattccga ccaaagttac cggtcaggca ctgactgtga 1920 atgagaaagg cgaagatgtg gttgttccgg gactgtttgc cgttggtgaa atcgcttgtg 1980 tatcggtaca cggcgctaac cgtctgggcg gcaactcgct gctggacctg gtggtctttg 2040 gtcgcgcggc aggtctgcat ctgcaagagt ctatcgccga gcagggcgca ctgcgcgatg 2100 ccagcgagtc tgatgttgaa gcgtctctgg atcgcctgaa ccgctggaac aataatcgta 2160 acggtgaaga tccggtggcg atccgtaaag cgctgcaaga atgtatgcag cataacttct 2220 cggtcttccg tgaaggtgat gcgatggcga aagggcttga gcagttgaaa gtgatccgcg 2280 agcgtctgaa aaatgcccgt ctggatgaca cttccagcga gttcaacacc cagcgcgttg 2340 agtgcctgga actggataac ctgatggaaa cggcgtatgc aacggctgtt tctgccaact 2400 tccgtaccga aagccgtggc gcgcatagcc gcttcgactt cccggatcgt gatgatgaaa 2460 actggctgtg ccactccctg tatctgccag agtcggaatc catgacgcgc cgaagcgtca 2520 acatggaacc gaaactgcgc ccggcattcc cgccgaagat tcgtacttac taatgcggag 2580 acaggaaaat gagactcgag ttttcaattt atcgctataa cccggatgtt gatgatgctc 2640 cgcgtatgca ggattacacc ctggaagcgg atgaaggtcg cgacatgatg ctgctggatg 2700 cgcttatcca gctaaaagag aaagatccca gcctgtcgtt ccgccgctcc tgccgtgaag 2760 gtgtgtgcgg ttccgacggt ctgaacatga acggcaagaa tggtctggcc tgtattaccc 2820 cgatttcggc actcaaccag ccgggcaaga agattgtgat tcgcccgctg ccaggtttac 2880 cggtgatccg cgatttggtg gtagacatgg gacaattcta tgcgcaatat gagaaaatta 2940 agccttacct gttgaataat ggacaaaatc cgccagctcg cgagcattta cagatgccag 3000 agcagcgcga aaaactcgac gggctgtatg aatgtattct ctgcgcatgt tgttcaacct 3060 cttgtccgtc tttctggtgg aatcccgata agtttatcgg cccggcaggc ttgttagcgg 3120 catatcgttt cctgattgat agccgtgata ccgagactga cagccgcctc gacggtttga 3180 gtgatgcatt cagcgtattc cgctgtcaca gcatcatgaa ctgcgtcagt gtatgtccga 3240 aggggctgaa cccgacgcgc gccatcggcc atatcaagtc gatgttgttg caacgtaatg 3300 cgtaaaccgt aggcctgata agacgcgcaa gcgtcgcatc aggcaaccag tgccggatgc 3360 ggcgtgaacg ccttatccgg cctacaagtc attacccgta ggcctgataa gcgcagcgca 3420 3420 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Cellulomonas fimi <400> 10 ggtccggccg ggtgccaggt gctgtggggc gtcaaccagt ggaacaccgg cttcaccgcg 60 aacgtcaccg tgaagaacac gtcctccgct ccggtcgacg gctggacgct cacgttcagc 120 ttcccgtccg gccagcaggt cacccaggcg tggagctcga cggtcacgca gtccggctcg 180 gccgtgacgg tccgcaacgc cccgtggaac ggctcgatcc cggcgggcgg caccgcgcag 240 ttcggcttca acggctcgca cacgggcacc aacgccgcgc cgacggcgtt ctcgctcaac 300 ggcacgccct gcacggtcgg c 321 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pckA NdeI F <400> 11 ggaattccat atgcgcgtta acaatggttt gac 33 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pckA Hind3 R <400> 12 cccaagcttc agtttcggac cagccgctac 30 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdh NdeI F <400> 13 ggaattccat atgaaagtcg cagtcctcgg c 31 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdh Hind3 R <400> 14 cccaagcttc ttattaacga actcttcgcc cagg 34 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fumC NdeI F <400> 15 ggaattccat atgaatacag tacgcagcga aaaagattc 39 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fumC Hind3 R <400> 16 cccaagctta cgcccggctt tcatactgc 29 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PT CBDcex Hind3 R <400> 17 cccaagcttc ctccgacgcc gaccc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBDcex XhoI R <400> 18 ccgctcgagg ccgaccgtgc agggc 25

Claims (20)

1. 섬유소;
   섬유소결합도메인; 및
   숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들을 포함하고,
   상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 각각 상기 섬유소결합도메인과 융합되어 상기 섬유소결합도메인을 통해 상기 섬유소에 결합되는 것을 특징으로 하는 숙신산 합성을 위한 효소 복합체.
2. 청구항 1에 있어서,
   숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh), 푸마라아제(fumarase, fum) 및 숙신산 유비퀴논 산화환원효소(succinate ubiquinone oxidoreductase, sdhABCD)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
4. 청구항 2에 있어서,
   상기 말산 탈수소효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
5. 청구항 2에 있어서,
   상기 푸마라아제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
6. 청구항 2에 있어서,
   상기 숙신산 유비퀴논 산화환원효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 섬유소결합도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 복합체.
8. 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들의 유전자가 각각 섬유소결합도메인의 유전자와 서로 융합된 형태로 클로닝되어 있는 재조합 벡터.
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 숙신산 합성에 관여하는 2 종류 이상의 서로 다른 효소들은 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소(phosphoenolpyruvate carboxykinase, pckA), 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase, mdh), 푸마라아제(fumarase, fum) 및 숙신산 유비퀴논 산화환원효소(succinate ubiquinone oxidoreductase, sdhABCD)로 구성된 군에서 선택되는 2 종류 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 포스포에놀피루브산 카르복시인산화효소의 유전자는 서열번호 6의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
11. 청구항 9에 있어서,
    상기 말산 탈수소효소의 유전자는 서열번호 7의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
12. 청구항 9에 있어서,
    상기 푸마라아제의 유전자는 서열번호 8의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
13. 청구항 9에 있어서,
    상기 숙신산 유비퀴논 산화환원효소의 유전자는 서열번호 9의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
14. 청구항 8에 있어서,
    상기 섬유소결합도메인의 유전자는 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 재조합 벡터.
15. 청구항 8의 제조합 백터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
16. 청구항 15에 있어서,
    상기 숙주세포는 세균, 효모 및 곰팡이로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
17. 청구항 15의 형질전환체를 숙신산 합성의 출발 물질의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.
18. 청구항 17에 있어서,
    상기 출발 물질은 포도당, 포스포에놀피루브산, 옥살로아세트산, 말산 및 푸마르산으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.
19. 청구항 17에 있어서,
    상기 형질전환체를 배양하는 단계는 30℃ 내지 60℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.
20. 청구항 17에 있어서,
    상기 형질전환체를 배양하는 단계는 pH 4.3 내지 pH 9.5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 숙신산 생산 방법.

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