KR101669041B1

KR101669041B1 - 스테비오사이드 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스테비오사이드의 생산 방법

Info

Publication number: KR101669041B1
Application number: KR1020150045009A
Authority: KR
Inventors: 이평천; 공민경
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2016-10-25
Also published as: KR20160116775A

Abstract

본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 미생물, 및 상기 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물을 이용한 스테비오사이드의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 또는 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 미생물은 스테비오사이드를 다량으로 생산하는 우수한 효과가 있다. 따라서, 스테비아의 추출물로부터 직접 스테비오사이드를 분리하는 것이 아닌, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작함으로써, 간단한 공정만으로도 스테비오사이드를 대량으로 제공할 수 있어, 상기 스테비오사이드를 이용하는 천연 감미료, 음료 등의 식품 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

스테비오사이드 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스테비오사이드의 생산 방법{Recombinant microoganisms for producing stevioside and method for stevioside using the same}

본 발명은 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 미생물, 및 상기 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물을 이용한 스테비오사이드의 생산방법에 관한 것이다.

스테비아(Stevia rebaudiana)는 국화과의 여러해살이풀로 원산지는 남미의 브라질과 파라과이의 국경지역에 인접한 고산지대이다. 스테비아는 하천이나 습지대 주변에서 자생하며, 잎에 감미 물질이 함유되어 있다. 스테비아의 감미 성분은 스테비올(steviol)을 배당체로 하는 스테비올모노사이드(Steviolmonoside), 스테비올바이오사이드(Steviobioside), 스테비오사이드(Stevioside), 레바우디오사이드-에이(Rebaudioside-A) 등이 있다. 현재까지 스테비오사이드의 생산과 관련된 연구는 스테비아의 잎으로부터 직접 추출하는 것이 주된 내용이었다. 선행 특허문헌으로는 스테비오사이드를 주성분으로 한 스테비아추출물과 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액상에서 β-1,4-갈락토실 전이효소를 작용시켜 스테비오사이드에 갈락토실기를 제조하는 방법(일본특허공개 제58-94367호), 물과 소수성 유기용매를 혼합한 반응계에서 효소반응에 의하여 스테비오사이드를 당전이 스테비오사이드로 전환하여 스테비오사이드의 미질을 개선하는 방법(한국등록특허 특1994-528호), 스테비오사이드와 레바우디오사이드 A 혼합물로부터 알코올과 물에 대한 용해도 차이를 이용하여 각각을 결정형으로 분리하는 방법(일본공개특허 제56-121453호) 및 스테비아 식물에 감마광선을 조사하여 레바우디오사이드 A를 다량 함유케 하는 식물로 유전적 변형을 유발시키는 방법(일본특허공개 제2002-34502호) 등이 개시되어 있다.

스테비오사이드는 설탕의 약 300배에 달하는 단맛을 내는 천연 감미료이며 파라과이, 브라지르 일본 등 여러 나라에서 저칼로리 감미료로 쓰인다. 이에 따라, 이를 이용하기 위하여 스테비오사이드를 효과적으로 대량 생산하는 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은 스테비올로부터 스테비오사이드를 합성할 수 있는 재조합 벡터를 개발하고, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물이 스테비오사이드 생성능을 갖고 있음을 확인하였다. 또한, 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시켜 생성된 돌연변이 미생물은 스테비오사이드를 과생산함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 재조합 벡터로 형질전환된 스테비오사이드 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 미생물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물을 이용한 스테비오사이드의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)에서 유래하고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase, crtE)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에서 유래하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 CPPS(copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 KS(kaurene synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 KO(kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 KAH(kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
(b) 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT85C2((uridine diphosphoglucuronosyltransferase(UGT) 85C2)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT74G1(uridine diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 74G1)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGTx(uridine diphospho-glucuronosyltransferase x)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;로 형질전환된 스테비올(steviol)의 배당체인 스테비오사이드(Stevioside) 생산용 재조합 대장균을 제공한다.

삭제

또한 본 발명은 (Ⅰ) 상기 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물을 배양하는 단계; 및 (Ⅱ) 상기 (Ⅰ) 단계의 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물의 배양물에서 스테비오사이드를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 스테비올 배당체인 스테비오사이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 또는 상기 재조합 미생물에 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 미생물은 스테비오사이드를 다량으로 생산하는 우수한 효과가 있다. 따라서, 스테비아의 추출물로부터 직접 스테비오사이드를 분리하는 것이 아닌, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작함으로써, 간단한 공정만으로도 스테비오사이드를 대량으로 제공할 수 있어, 상기 스테비오사이드를 이용하는 천연 감미료, 음료 등의 식품 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 스테비오사이드의 생합성 대사회로를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 클로닝에 이용된 벡터를 나타낸 도이다((A) 스테비올 재조합 유전자 어셈블리용 pSTV29 벡터, (B) 일반적인 클로닝과정에서 이용하는 pUC_mod 벡터, (C) 글리코실 전이효소 어셈블리용 pBBR322(MCSII) 벡터, (D) pET21a 벡터).
도 3은 스테비올 발현용 벡터의 개열 지도를 나타낸 도이다.
도 4는 UGT74G1 유전자 또는 UGT85C2 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 스테비올 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주에서 스테비올모노사이드의 생산 정도를 LCMS-ESI 분석을 통해 확인한 도이다.
도 5는 UGT74G1 유전자 및 UGT85C2 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 스테비올 발현용 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주에서 루부소사이드의 생산 정도를 LCMS-ESI 분석을 통해 확인한 도이다.
도 6은 재조합 대장균으로부터 발현한 UGTx 단백질을 SDS-PAGE를 통해 나타낸 도이다.
도 7은 UGTx 유전자의 발현에 따른 스테비오사이드의 생산 정도를 LCMS-ESI 분석을 통해 확인한 도이다.
도 8은 UGTx의 서열 분석을 통하여 다른 유사 단백질과의 유사도 및 계통관계를 나타낸 도이다.
도 9는 UGT74G1 유전자, UGT85C2 유전자 및 UGTx 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 도이다.
도 10은 UGT74G1 유전자, UGT85C2 유전자 및 UGTx 유전자를 이용한 스테비오사이드의 생합성 대사회로를 구체적으로 나타낸 도이다.
도 11은 스테비오사이드 생산 재조합 균주로부터 생산된 스테비오사이드를 LCMS-ESI 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12은 글루코스 해당과정에서 넉아웃 하고자 하는 ushA 유전자 및 pgi 유전자를 표시한 도이다.
도 13은 재조합 대장균의 ushA 유전자 넉아웃 여부를 확인하기 위한 프라이머 및 이의 결과를 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 재조합 대장균의 ushA 유전자 및 pgi 유전자의 넉아웃 여부를 확인하기위한 프라이머 및 이의 결과를 전기영동하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15은 ΔushA 돌연변이 균주; 및 ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주의 스테비오사이드 과생산 여부를 LCMS-ESI 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 (a) 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)에서 유래하고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase, crtE)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에서 유래하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 CPPS(copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 KS(kaurene synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 KO(kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 KAH(kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
(b) 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT85C2((uridine diphosphoglucuronosyltransferase(UGT) 85C2)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT74G1(uridine diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 74G1)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGTx(uridine diphospho-glucuronosyltransferase x)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;로 형질전환된 스테비올(steviol)의 배당체인 스테비오사이드(Stevioside) 생산용 재조합 대장균을 제공한다.

삭제

상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 대장균이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 "GGPPS", "CPPS" 및 "KS"는 스테비오사이드 생합성 관련 효소이고, "KO"는 카우린산 생합성 관련 효소이며, "KAH"는 스테비올 생합성 관련 효소이다.

본 발명에 있어서, 상기 "UGT85C2"는 스테비올에서 스테비올모노사이드를 만들고 19-글리코시드에서 루부소사이드를 만드는 효소이다.

본 발명에 있어서, 상기 "UGT74G1"는 스테비올에서 19-글리코시드를 만들고 스테비올모노사이드에서 루부소사이드를 만들 뿐만 아니라 스테비올바이오사이드에서 스테비오사이드를 만드는 효소이다.

본 발명에 있어서, 상기 "UGTx를 코딩하는 유전자"는 스테비아 레바우디아나의 글라이코실화 효소에 한정하여, 계통 관계(Phylogenetic relationship)를 보면(도 8), 가장 유사도가 높은 유전자는 UGT91D1임을 확인하였다. 이는 본 발명의 UGTx 유전자와 서열 유사성이 높아 본 발명의 UGTx 유전자 갖고 있는 활성이 있다고 추측할 수 있으나, 스테비아 레바우디아나의 글라이코실화 효소의 기능을 스크리닝함에 있어서 여러 후보 글라이코실화 효소 중 상기 UGT91D1 유전자는 본 발명의 UGTx 유전자와 동일한 활성을 갖고 있지 않은 것으로 기재되어 있다(Richman A, et al., (2005), Plant Journal, 41(1): p. 56-67). 따라서, 본 발명의 UGTx를 코딩하는 유전자는, 상기 UGT91D1와 동일한 활성을 갖는다고 볼 수 없고, 본 발명의 일실시예에 따라 UGTx를 코딩하는 유전자는 스테비오모노사이드에서 스테비오사이드를 생성하거나, 루부소사이드에서 스테비오사이드를 생성하도록 함을 확인하였다.

본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 상기 "목적 유전자의 발현"은 상기 목적 유전자를 발현시켜 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 목적 유전자를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주세포)를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법일 수 있으며, 이를 통해 상기 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종산물을 제조할 수 있다.

본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 pUC19, pSTV28, pBBR1MCS, pBluscriptII, pBAD, pTrc99A, pET, pACYC184 및 pBR322 계열 등의 당업계에 상용화된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 (a) 상기 GGPPS를 코딩하는 유전자, CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자 및 KAH를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 (b) UGT85C2를 코딩하는 유전자, UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;는 해당 조합을 구성하는 각 유전자들을 하나의 벡터에 삽입시키거나, 2 종류 이상의 벡터에 나누어 삽입시킬 수 있다. 이 때 하나의 벡터에 둘 이상의 유전자들이 삽입되는 경우, 유전자들은 항시성 프로모터(예를 들어, constitutive lac promoter), 터미네이터 등을 각각 가진 형태로 삽입될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 GGPPS를 코딩하는 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)에서 유래한 유전자인 것이 바람직하다. 또한, 상기 CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자, KAH를 코딩하는 유전자, UGT85C2를 코딩하는 유전자, UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx을 코딩하는 유전자는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에서 유래한 유전자인 것이 바람직하다.

상기 UGT85C2을 코딩하는 유전자 또는 UGT74G1를 코딩하는 유전자는 코돈 최적화 된 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 "코돈 최적화"는 각종 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자를 지칭함에 따라, DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변화시키지 않고서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 활용을 반영하도록 상기 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변화시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 스테비아 레바우디아나가 식물체이기 때문에 대장균에서 코돈을 잘 발현할 수 있도록 식물체의 코돈이 아닌 대장균의 코돈에 최적화한 것이다.

본 발명에서 상기 "로도박터 스페로이드"는 광합성 세균으로 소수성 및 불용성 화합물을 과잉 생산하는 특징이 있다.

본 발명에서 상기 "스테비아 레바우디아나"는 국화과의 여러해살이풀로 원산지는 남미의 브라질과 파라과이의 국경지역에 인접한 고산지대이다. 스테비아 레바우디아나는 하천이나 습지대 주변에서 자생하며, 잎에 감미물질이 함유되어 있다.

본 발명에 있어서, GGPPS를 코딩하는 유전자, CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자, KAH를 코딩하는 유전자, UGT85C2를 코딩하는 유전자, UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx를 코딩하는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 상기 유전자가 유래한 생물, 바람직하게는 로도박터 스페로이드의 mRNA를 추출하여 합성한 cDNA를 주형으로 목적한 GGPPS를 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다.

또한, 스테비아 레바우디아나의 mRNA를 추출하여 합성한 cDNA를 주형으로 목적한 CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자, KAH를 코딩하는 유전자, UGT85C2를 코딩하는 유전자, UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx을 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 GGPPS를 코딩하는 유전자, CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자, KAH를 코딩하는 유전자, UGT85C2를 코딩하는 유전자, UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx를 코딩하는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직하게는, GGPPS를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로, CPPS를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로, KS를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로, KO를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로, KAH를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로, UGT85C2를 코딩하는 유전자는 서열번호 6으로, UGT74G1를 코딩하는 유전자는 서열번호 7로, UGTx를 코딩하는 유전자는 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 이의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 상기 각 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 (a)의 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (b)의 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에는, 로도박터 스페로이드 유래 GGPPS를 코딩하는 유전자와 스테비아 레바우디아나 유래 CPPS를 코딩하는 유전자, KS를 코딩하는 유전자, KO를 코딩하는 유전자 및 KAH를 코딩하는 유전자를 포함하는 스테비올 생산용 재조합 벡터를 제작하였다. 또한, 스테비아 레바우디아나에서 유래하고 코돈 최적화된 UGT85C2를 코딩하는 유전자, 코돈 최적화된 UGT74G1를 코딩하는 유전자 및 UGTx를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 두개의 벡터를 이용하여 형질전환된 재조합 대장균을 제조하였다.

상기 재조합 대장균은 스테비오사이드를 우수하게 생산하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한 상기 재조합 대장균에 ushA 유전자 또는 pgi 유전자를 넉아웃 시켜 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 대장균의 스테비오사이드의 생성능을 확인한 결과, ushA 유전자만이 넉아웃된 대장균보다 스테비오사이드가 과생성됨을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 재조합 미생물에 ushA 유전자(UDP-Sugar Hydrolase Gene) 또는 pgi 유전자(pig phosphoglucose isomerase gene)를 넉아웃(knockout)시켜 돌연변이를 유발시킨, 스테비오사이드 과생산능을 갖는 돌연변이 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 "ushA 유전자"는, UDP-글루코스를 UDP와 글루코스로 분해하는 효소를 코딩하는 유전자이다. 스테비오사이드 생산시에 발현하는 글라이코실 전이 효소가 UDP-글루코스를 이용하여 글라이코실화를 하기 때문에, UDP-글루코스를 분해하는 상기 ushA 유전자를 넉아웃하여 UDP-글루코스 풀(pool)을 증가 시키기 위함에 그 목적이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "pgi 유전자"는 글루코스의 해당과정 대사 경로 중 상기 pgi 유전자를 넉아웃시킬 경우, 해당과정이 아닌 5탄당 인산경로 (pentose phosphate pathway)로 flux가 가게 된다. 스테비오사이드 생산 관련 유전자가 공동인자(cofactor)로서 NADPH₂를 사용하기 때문에, 5탄당 인산경로 쪽으로 flux가 가면 NADPH₂ 의 효용성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

상기 미생물은 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 뉴트리엔트 브로스(Nutrient broth) 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (Ⅱ) 단계의 재조합 미생물 또는 돌연변이 미생물은 배양물로부터 스테비오사이드의 분리 및 정제 방법은 해당 물질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출, HPLC 등을 이용할 수 있으며, 이들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 스테비올의 배당체인 스테비오사이드의 생합성 관련 효소들에 대한 유전자 선발, 벡터의 확보 및 클로닝 프라이머의 제작

스테비오사이드의 생합성 관련 효소들에 대한 유전자를 선발하고, 벡터의 확보 및 클로닝 프라이머의 제작을 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 도 1의 스테비오사이드의 생합성 대사회로에 나타낸 바와 같이, 스테비오사이드 생합성 관련 효소로는 GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase), CPPS(copalyl diphosphate synthase) 및 KS(kaurene synthase) 등이 있으며, 카우린산 생합성 관련 효소로는 KO(kaurene oxidase)가, 스테비올 생합성 관련 효소로는 KAH(kaurenoic acid hydroxylase)가 더 포함된다. 상기 GGPPS 유전자의 경우 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)로부터 확보하였다. 또한, 나머지 유전자는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)의 잎으로부터 RNA를 확보하였고, 이로부터 cDNA를 합성하여 확보하였다.

스테비오사이드 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 생합성 관련 효소를 확보하기 위한 클로닝을 수행하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Takara 사의 pSTV29(A) 벡터는 스테비올 재조합 유전자들을 어셈블리할 때 이용하였고, pUC_mod(B) 벡터는 일반적인 클로닝 과정에서 이용하였으며, pBBR322(MCSII)(C) 벡터는 글리코실 전이효소를 어셈블리할 때, (D)는 단백질 발현하여 in vitro assay하는 데에 이용하였다. 본 발명에서 클로닝 및 단백질 발현을 확인하기 위해 이용된 벡터 맵을 도 2에 나타내었다. 또한, 상기 각 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머를 하기 표 1 및 2에 나타내었으며, 하기 표 1 및 표 2의 프라이머 중 밑줄로 표시된 부분은 각 유전자와 상보적인 부분을 나타내었고, 하기 표 3은 각 벡터에 각 유전자를 클로닝한 구체적인 재조합 벡터의 정보를 나타내었다.

유전자	프라이머 염기서열	제한효소 자리	서열번호
GGPPS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGCGTTTGAACAGCGGATTG	XbaI	9
GGPPS	5’-R GGAATTCTCAGACGCGGGCCGCG	EcoRI	10
CPPS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAGACCGGCTTCATC	XbaI	11
CPPS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTCATATTACAATCTCGAAC	NotI	12
KS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAATCTTTCACTATGCATC	XbaI	13
KS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTTACCTTTGTTCTTCATTTTC	NotI	14
KO	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGATGCCGTCACCGGTTTG	XbaI	15
KO	5’-R GGAATTCTCATATCCTGGGCTTTATTATG	EcoRI	16
KAH	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGATTCAGGTGCTGACCC	XbaI	17
KAH	5’-R GGAATTCTTAGACTTGGTGTGGGTGC	EcoRI	18
UGT85C2	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGATGCTATGGCAACTAC	XbaI	19
UGT85C2	5’-R GGAATTCTTAGTTGCGCGCCAGAACGG	EcoRI	20
UGT74G1	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGCTGAACAACAAAAAATC	XbaI	21
UGT74G1	5’-R GGAATTCTTATGCCTTGATCAGCTCGG	EcoRI	22
UGTx	5’-F TCCCCCCGGGAGGAGGATTACAAAATGTACAACGTTACTTATCATC	XmaI	23
UGTx	5’-R GGAATTCTTAACTCTCATGATCGATGG	EcoRI	24

유전자	프라이머 염기서열	제한효소 자리	서열번호
UGTx	5’-F CGGGATCCATGTACAACGTTACTTATCATC	BamHI	25
UGTx	5’-R CCCAAGCTTACTCTCATGATCGATGGC	HindIII	26

플라스미드	특성
pUCM	pUC19으로부터 변형된 앰피실린 내성을 가지고 있으며 지속적으로 발현이 가능한 벡터
pUCM_GGPPS	로도박터 스페로이드로부터 유래한GGPPS 발현 벡터
pUCM_CPPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한CPPS 발현 벡터
pUCM_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한KS 발현 벡터
pUCM_KO	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 KO 발현 벡터
pUCM_KAH	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 KAH 발현 벡터
pUCM_UGT85C2	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 UGT85C2 발현 벡터
pUCM_UGT74G1	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 74G1 발현 벡터
pUCM_UGTx	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGTx 글리코실 전이효소 발현 벡터
pET21a	C-terminal에 6개의 His tag을 갖고 있는 단백질 발현용 벡터
pET21a_UGTx	스테비아 레바우디아나로부터 유래한UGTx 단백질 발현 벡터
pSTV29	스테비올 생성 유전자 어셈블리를 위한 클로람페니콜 내성을 가지고 있는 벡터
pSTV29_GGPPS_CPPS_KS_KO_KAH	스테비아 레바우디아나로부터 유래한CPPS, KS 로도박터 스페로이드로부터 유래한 GGPPS와 스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 KO, KAH 가 어셈블리 되어있는 스테비올 생산 벡터
pBBR1MCS2	글리코실 전이효소 유전자 어셈블리를 위한 카나마이신 내성을 가지고 있는 벡터
pBBR_UGT85C2	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 UGT85C2 발현 벡터
pBBR_74G1	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 74G1 발현 벡터
pBBR_UGT85C2_74G1	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 UGT85C2, 74G1 발현 벡터
pBBR_UGT85C2_74G1_UGTx	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 UGT85C2, 74G1와 스테비아 레바우디아나로부터 유래한UGTx 발현 벡터

실시예 2. 스테비올 제조용 재조합 벡터의 제작

GGPPS, CPPS, KS, KO 및 KAH 유전자를 포함하는 스테비올 제조용 재조합 벡터를 제작하였다.

보다 구체적으로, 스테비올에 관련된 유전자인 GGPPS, CPPS, KS, KO 및 KAH를 하나의 플라스미드에서 발현할 수 있도록 조립하여, 스테비올이 생성될 수 있도록 재조합 벡터를 제작한 후 이를 이용하여 대장균에 형질전환시켰다. 상기 재조합 벡터의 벡터 맵을 도 3에 나타내었다.

그 결과, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 균주 내에서 스테비올 생성이 이루어지는 것을 확인하였다.

실시예 3. UGT85C2 또는 UGT74G1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 스테비올모노사이드의 생산

글리코실 전이효소인 UGT74G1 유전자 또는 UGT85C2와 상기 실시예 2의 스테비올 제조용 재조합 벡터를 함께 발현시켜 스테비올모노사이드를 생산하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 보다 구체적으로, 상기 실시예 2의 스테비올 제조용 재조합 벡터에, 글리코실 전이효소인 UGT74G1 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 또는 UGT85C2 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 각각을 대장균에 형질전환 시켜 각 재조합 대장균을 제작하였다. 그 후, 상기 재조합 대장균이 스테비올모노사이드를 생산하는지 확인하기 위하여, LCMS-ESI를 통해 스테비올모노사이드를 확인하였다. LC는 Agilent사의 1200 Series를, MS는6150 Single Quadrupole mass spectrometer를 이용하였다. 상기 LCMS-ESI의 분석 조건으로는, 40℃의 C18 컬럼에서 0.5 ml/min의 유량(flow rate)를 유지하면서, 2 mM 아세트산 암모늄(ammonium acetate)(pH6.5) 및 0.1% CH₂Cl₂의 CAN과 같은 두 용매를 단계적(gradient)으로 실시하였다. 또한, 음성 모드(negative mode)로 [M-H]^-=479의 SIM(single ion monitoring) 조건으로 스테비올사이드를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 재조합 균주 내에서, UGT85C2 또는 UGT74G1를 코딩하는 유전자를 이용할 경우, 스테비올모노사이드가 효과적으로 생성됨을 확인하였다.

실시예 4. UGT85C2 및 UGT74G1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 루부소사이드의 생산

UGT85C2 및 UGT74G1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 루부소사이드의 생산하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 대장균 내에서 최종적으로는 루부소사이드를 생성하기 위하여 실시예 2에서 제작한 스테비올 제조용 재조합 벡터와 실시예 3에서 각각의 기능을 확인한 UGT85C2 및 UGT74G1을 하나의 플라즈미드에서 발현할 수 있도록 pBBR322 벡터에 조립한 재조합 벡터를 함께 발현하여 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 균주 내에서 LCMS-ESI를 이용하여 루부소사이드 생성이 이루어지는 것을 확인하였다. 분석 조건은 30℃의 C18 칼럼에서 0.4 ml/min의 유량을 유지하면서 0.01% 포름산(formic acid) 및 100% CAN 용매를 단계적(gradient)으로 실시하였다. 또한, 루부소사이드 측정을 위하여 MS-ESI는 음성 모드(positive mode)에서 [M+H]⁺=665의 SIM(single ion monitoring)조건으로 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 재조합 균주 내에서, UGT85C2 및 UGT74G1를 코딩하는 유전자를 이용할 경우, 루부소사이드가 효과적으로 생성됨을 확인하였다.

실시예 5. UGTx 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 UGTx 유전자 발현 확인 및 스테비오사이드의 생성 확인

5-1. UGTx 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 UGTx 유전자 발현 확인

생체 외 기능 검정(In vitro functional assay)하여 UGTx 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 UGTx 유전자 발현을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, UGTx 유전자를 삽입한 pET21a_UGTx 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 50ml LB배지에서 OD600nm에서 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 뒤, IPTG를 최종농도 1mM로 맞추어 30℃에서 배양하였다. 배양액 내의 균을 원심분리를 통해 모으고, 이를 통해 모아진 세포 펠렛에 글리코실 전이효소(glycosyltransferase) 어세이 완충액(50mM potassium phosphate, pH7.2, 3mM MgCl2, 10μg/ml BSA) 및 라이소자임(lysozyme, 100 mg/ml)을 섞어주었다. 이를 37℃에서 15분간 배양한 뒤 얼음에서 20초 간 3회 초음파 처리하였다. 이를 12000g에서 원심분리 한 후, 상등액을 취하여 UGTx 단백질을 수득하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 약 50kDa 근처에서 밴드를 확인하였으며, 재조합 대장균 내에서 발현된 UGTx를 전체 밴드(fully band)로 확인하였다.

5-2. UGTx 유전자 발현에 따른 스테이오사이드 생성 확인

생체 외 기능 검정(In vitro functional assay)을 통한 UGTx 유전자 발현에 따른 스테이오사이드 생성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 UGTx가 정상적으로 발현된다면, 스테비오사이드 생합성 대사 회로에서 스테비올모노사이드에서 스테비오사이드로 전환이 되어야 하지만, 시중에 스테비올 모노사이드를 판매하지 않아, 루부소사이드 에서 스테비오사이드로 전환이 되는 것을 확인하였다. 따라서 UGTx가 정상적인 기능을 하여 루부소사이드에서 스테비오사이드로의 전환이 이루어진 것을 확인하기 위해, 상기 실시예 5-1에서 수득한 UGTx 유전자가 발현된 재조합 대장균의 단백질 추출물 500㎍과 200㎕의 글리코실전이효소(glycosyltransferase) 어세이 완충액에 녹인 루부소사이드(rubusoside)(Sigma, St Louis, Missouri, USA) 50 uM와 1 mM UDP 글루코스를 섞어 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 생체 외(In vitro) 반응이 끝난 반응물에 부탄올 200㎕을 넣고 추출한 뒤에 이를 액체 크로마토그래피-ESI질량분석기(liquid chromatography-mass spectrometry, LCMS-ESI)를 통하여 UGTx가 제대로 작동된다면 루부소사이드에서 스테비오사이드로의 전환이 이루어지므로 스테비오사이드가 생산된 것으로 확인하였다. 대조군으로 유전자를 발현시키지 않은 공벡터를 삽입한 재조합 대장균의 단백질 추출물을 이용하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, LCMS-ESI를 통하여 스테비오사이드가 확인되었으며, 이를 통하여 UGTx 유전자가 정상적으로 발현됨을 확인하였다.

5-3. UGTx 의 서열 분석

UGTx유전자와 이와 유사힌 유전자와의 유사도 및 계통 관계를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로 보다 구체적으로 계통 관계는 스테비아 레바우디아나에 한정 지었으며, UGTX는 화살표로 나타내었다. 식물 UGT 기능적으로 특성이 알려진 아미노산의 서열을 NCBI 데이터베이스에서 추출한 뒤, 계통수(phylogenetic tree)를 MEGA 6.0 소프트웨어에 의한 부트스트랩핑(bootstrapping)-1000 복제를 이용한 인접 결합 방법(neighbor joining method)으로 작성하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 가장 유사도가 높은 유전자는 UGT91D1임을 확인하였다. 그러나, 상기 유전자는 후보 글라이코실화 효소의 일부분이고, 본 발명의 UGTx 유전자의 스테비오사이드 생성과 유사하게 알려진 바가 없음을 확인하였다.

실시예 6. 스테비오사이드 생산용 재조합 미생물의 제작

상기 실시예 2에서 제작한 스테비올 발현용 재조합 벡터(도 3 참고); 및UGT85C2, UGT74G1 및 UGTx를 코딩하는 유전자 발현용 재조합 벡터(도 9 참고); 를 이용하여, 스테비오사이드를 생성하는 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 재조합 대장균으로부터 생성된 스테비오사이드의 분리 및 정성 분석을 위하여, 전체 배양된 세포를 메탄올로 추출하고 모두 건조한 뒤에 같은 메탄올로 추출하여 농축하였다. 이의 생합성 대사회로를 구체적으로 모식한 도를 도 10에 나타내었으며, 분석 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, UGTx 유전자가 포함되지 않는 벡터를 포함한 대조군에서는 스테비오사이드가 전혀 생성되지 않았으나, UGTx 유전자를 포함한 재조합 벡터를 포함한 군에서는 스테비오사이드가 정상적으로 생성됨을 확인하였다.

실시예 7. 유전자 넉아웃(knockout)을 통한 돌연변이 재조합 미생물의 제작

상기 실시예 6의 스테비오사이드 생산 재조합 대장균에 ushA 유전자 및 pgi 유전자를 넉아웃시켜 돌연변이를 유도한 뒤, 스테비오사이드의 과생산을 유도하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

대장균으로부터 넉아웃 돌연변이 균주를 만드는 것은 FRT-PGK-gb2-neo-FRT를 주형으로 사용하여 넉아웃 하고자 하는 유전자의 약 50bp의 상동(homologous) 부분을 가지고 있는 하기 표 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 linear DNA를 확보하였다. 이를 pRedET vector 시스템을 사용하여 넉아웃 하고자 하는 유전자에 카나마이신 유전자를 삽입하면서 본래의 유전자를 파괴하여 넉아웃 균주를 만들었다. 보다 구체적으로, 도 12에 나타낸 바와 같이, 넉아웃 하고자 하는 유전자인 ushA 및 글루코스 해당과정의 유전자인 pgi를 붉은색 X로 표시하였다. UDP-glucose pool을 증가 시키기 위하여 ushA 유전자의 넉아웃 시켰고, NADPH2 pool을 증가 시키기 위하여, 해당과정(glycolysis) 경로의 pgi 유전자를 넉아웃시켰다. 최초의 넉아웃을 하지 않은 MG1655 야생형 균주를 야생형 대장균을 대조군으로 이용하였고, 상기 실시예 6의 스테비오사이드 생산 재조합 대장균에 ushA 유전자의 넉아웃을 유도하였고, ΔushA 돌연변이 균주의 gDNA를 추출하여 넉아웃 여부를 도 13에 나타낸 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 전기영동하여 확인하였다. 상기 ΔushA 돌연변이 균주에 pgi 유전자를 넉아웃 시킨 뒤, 도 14의 프라이머를 이용하여, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 ΔushA 돌연변이 균주를 대조군으로 하여, 최종적으로 ΔushA 및 Δpgi 넉아웃 된 돌연변이가 제작되었는지 확인하였다. 따라서, ΔushA 돌연변이 균주 뿐 아니라, ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주를 제작하였다.

Gene	Sequence
UshA	5'-F CAAAGAGGTTGCGGCTGAAGGCGGTAGCGTGCTGCTACTTTCCGGTGGCGACATTAACAC AATTAACCCTCACTAAAGGGCGG
	5'-R GATAACAGCGAGATCATTTGCTGGTTTTCAGCGATTTCAGGAGTGTAAAGCACGCGCTCG TAATACGACTCACTATAGGGCTC
Pgi	5'-F TGACTGGTTCCTGAAAGCGGCAGGTGATGAAAAACACGTTGCAAAACACTTTGCGGCGCTTTCCACC AATTAACCCTCACTAAAGGGCGG
	5'-R CAGCAGTACAGGCAGGTTTTTCTCGGCAGGCGTGGTGGAGAAATGCTTGTCCATCGCGTGTGCGCCG TAATACGACTCACTATAGGGCTC

실시예 8. 돌연변이 균주에서 스테비오사이드 과생산

상기 실시예 7에서 제작한 ΔushA 돌연변이 균주; 및 ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주;의 스테비오사이드 생산을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수 행하였다.

실시예 7을 수행하여 만든 넉아웃 균주에 스테비오사이드 생산용 벡터를 발현하여 스테비오사이드를 생산하도록 하고 이에 대한 스테비오사이드의 생산량을 비교분석하기 위해 같은 양의 cell을 가지고 추출하여 그 양을 LCMS-ESI로 분석하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 5-2의 조건과 동일한 조건으로 LCMS-ESI을 수행하여, ΔushA 돌연변이 균주; 및 ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주;의 스테비오사이드 생산을 확인하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, ΔushA 돌연변이 균주; 및 ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주는 스테비오사이드를 생산함을 확인하였으며, 특히, 상기 ΔushA 및 Δpgi 돌연변이 균주는 다른 대조군 및 ΔushA 돌연변이 균주에 비하여 우수하게 스테비오사이드를 과생산함을 확인하였다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant microoganisms for producing stevioside and method for stevioside using the same <130> Ajou1-52 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 867 <212> DNA <213> Gene encoding GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase, crtE) <400> 1 atggcgtttg aacagcggat tgaagcggca atggcagcgg cgatcgcgcg gggccagggc 60 tccgaggcgc cctcgaagct ggcgacggcg ctcgactatg cggtgacgcc cggcggcgcg 120 cgcatccggc ccacgcttct gctcagcgtg gccacggcct gcggcgacga ccgcccggct 180 ctgtcggacg cggcggcggt ggcgcttgag ctgatccatt gcgcgagcct cgtgcatgac 240 gatctgccct gcttcgacga tgccgagatc cggcgcggca agcccacggt gcatcgcgcc 300 tattccgagc cgctggcgat cctcaccggc gacagcctga tcgtgatggg cttcgaggtg 360 ctggcccgcg ccgcggccga ccagccgcag cgggcgctgc agctggtgac ggcgctggcg 420 gtgcggacgg ggatgccgat gggcatctgc gcggggcagg gctgggagag cgagagccag 480 atcaatctct cggcctatca tcgggccaag accggcgcgc tcttcatcgc cgcgacccag 540 atgggcgcca ttgccgcggg ctacgaggcc gagccctggg aagagctggg agcccgcatc 600 ggcgaggcct tccaggtggc cgacgacctg cgcgacgcgc tctgcgatgc cgagacgctg 660 ggcaagcccg cggggcagga cgagatccac gcccgcccga acgcggtgcg cgaatatggc 720 gtcgagggcg cggcgaagcg gctgaaggac atcctcggcg gcgccatcgc ctcgatcccc 780 tcctgcccgg gcgaggcgat gctggccgag atggtccgcc gctatgccga gaagatcgtg 840 ccggcgcagg tcgcggcccg cgtctga 867 <210> 2 <211> 2361 <212> DNA <213> Gene encoding CPPS(copalyl diphosphate synthase) <400> 2 atgaagaccg gcttcatctc tcccgccacc gtcttccacc accgtatttc tccggcaacc 60 accttccgcc accacctttc tccggcgacc accaactcca ctggaattgt agctcttaga 120 gacatcaact tccggtgtaa agcggtatcc aaagagtact ctgatttact acaaaaagat 180 gaggcttcat ttaccaagtg ggacgatgac aaagtgaagg accatttgga cacaaataag 240 aatttgtatc caaacgatga gatcaaggag tttgttgaga gcgtgaaagc aatgtttggt 300 tctatgaatg acggagaaat aaatgtgtca gcgtatgata cggcttgggt tgcactcgtg 360 caagatgttg atggaagtgg ttcccctcaa tttccatcaa gtttggagtg gatcgcgaac 420 aatcaactct cagatgggtc ttggggcgat catttgttat tttcggctca tgataggatc 480 attaacacgt tggcatgtgt tatagcgcta acttcttgga acgtccatcc aagtaaatgt 540 gaaaaaggac tgaattttct tagagaaaac atatgtaaac tcgaagacga gaacgcggaa 600 catatgccaa ttggttttga agtcacgttc ccgtcgctaa tagatatcgc aaagaagcta 660 aatattgaag ttcctgagga tactcctgcc ttaaaagaaa tttatgcaag aagagacata 720 aaactcacaa agataccaat ggaagtattg cacaaagtgc ccacaacttt acttcatagt 780 ttggaaggaa tgccagattt ggaatgggaa aaacttctga aattgcaatg caaagatgga 840 tcatttctgt tttctccatc atctactgct tttgcactca tgcaaacaaa agatgaaaag 900 tgtcttcagt atttgacaaa tattgttacc aaattcaatg gtggagttcc gaatgtgtac 960 ccggtggatc tattcgaaca tatttgggta gttgatcgac ttcaacgact tgggatttct 1020 cgttatttca aatcagagat caaagattgc gttgaatata ttaacaagta ttggacaaag 1080 aatgggattt gttgggcaag aaacacgcac gtacaagata ttgatgatac cgcaatggga 1140 tttagggttt taagagcaca tggttatgat gttactccag atgtatttcg acaatttgag 1200 aaggatggta aattcgtatg tttcgctgga cagtcaacac aagccgtcac cggaatgttc 1260 aatgtgtata gagcgtcaca aatgctcttt cccggagaaa gaattcttga agatgcaaag 1320 aaattttcat ataattattt gaaagaaaaa caatcgacaa atgagcttct tgataaatgg 1380 atcatcgcca aagacttacc tggagaggtt ggatatgcgc tagacatacc atggtatgca 1440 agcttaccgc gactcgagac aagatattac ttagagcaat acgggggcga ggatgatgtt 1500 tggattggaa aaactctata caggatggga tatgtgagca ataatacgta ccttgaaatg 1560 gccaaattgg actacaataa ctatgtggcc gtgcttcaac tcgaatggta cactatccag 1620 caatggtatg ttgatatcgg tatcgaaaag tttgaaagtg acaatatcaa aagcgtatta 1680 gtgtcgtatt acttggctgc agccagcata ttcgagccgg aaaggtccaa ggaacgaatc 1740 gcgtgggcta aaaccaccat attagttgac aagatcacct caatttttga ttcatcacaa 1800 tcctcaaaag aggacataac agcctttata gacaaattta ggaacaaatc gtcttctaag 1860 aagcattcaa taaatggaga accatggcac gaggtgatgg ttgcactgaa aaagacccta 1920 cacggcttcg ctttggatgc actcatgact catagtcaag acatccaccc gcaactccat 1980 caagcttggg agatgtggtt gacgaaattg caagatggag tagatgtgac agcggaatta 2040 atggtacaaa tgataaatat gacagctggt cgttgggtat ccaaagaact tttaactcat 2100 cctcaatacc aacgcctctc aaccgtcaca aatagtgtgt gtcacgatat aactaagctc 2160 cataacttca aggagaattc cacgacggta gactcgaaag ttcaagaact agtgcaactt 2220 gtgtttagcg acacgcccga tgatcttgat caggatatga aacagacgtt tctaaccgtc 2280 atgaaaacct tctactacaa ggcgtggtgt gatccgaaca cgataaatga ccatatctcc 2340 aaggtgttcg agattgtaat a 2361 <210> 3 <211> 2352 <212> DNA <213> Gene encoding KS(kaurene synthase) <400> 3 atgaatcttt cactatgcat cgcgtcccct ttgttaacca aatcaaatcg acccgcggct 60 ctgtcagcta ttcatacagc atcaacttca catggtggac aaactaatcc cactaatctg 120 atcattgata caaccaaaga acggatccaa aaacagttta aaaatgtaga aatttctgtt 180 tcttcatatg acacagcatg ggtagccatg gtcccttctc caaactcacc caaatcgcct 240 tgtttccctg agtgtctcaa ttggttaatt aataatcagc ttaatgatgg ttcatggggt 300 cttgttaatc acactcataa tcataatcac ccgttgctta aagattctct atcttcaaca 360 ttagcatgta ttgttgcatt aaaaagatgg aatgttgggg aagatcaaat aaataaaggt 420 ctaagtttta ttgagtcaaa tcttgcttca gctactgaaa aaagtcaacc atctcccatt 480 ggttttgaca tcatatttcc tggtttgctt gagtatgcga aaaacttgga cataaacctc 540 ctttcaaaac aaacagattt tagtttgatg ctacataaga gggaattgga gcaaaaaaga 600 tgccattcaa atgagatgga tggatacttg gcgtatatct ctgaaggact cggtaattta 660 tatgattgga atatggtgaa gaaatatcag atgaaaaatg gttctgtttt caactcacca 720 tcagcaacag ctgctgcttt cattaatcat caaaatcctg gttgtcttaa ttatttaaat 780 tcacttttgg acaagtttgg taatgcagtc ccaacagttt atcctcatga tttatttatc 840 cgactttcta tggttgacac aattgaaaga ttaggaattt cacaccattt cagagtggaa 900 attaaaaatg ttttagatga aacatacaga tgttgggtgg aacgagatga gcaaatattc 960 atggatgttg taacatgtgc tttagccttt cggttattaa ggatcaatgg gtatgaagtt 1020 tccccagatc cattggctga aattactaat gaattagctt tgaaagacga atatgcagct 1080 cttgaaacat atcatgcgtc acatatatta taccaagagg atttatcttc tggaaaacaa 1140 atcttgaagt cagctgattt cctcaaagag ataatatcca ctgattcaaa caggctttct 1200 aaattaattc acaaagaggt ggaaaatgct cttaagttcc ctatcaatac cggtttagaa 1260 cgcataaaca ctagacgaaa tatacagctt tacaatgtag acaatacaag aattctgaaa 1320 actacatatc actcatcaaa tattagtaac actgattacc taaggttggc tgttgaagat 1380 ttctacacct gccaatctat ttatcgtgaa gaattaaaag gtcttgaaag gtgggtggta 1440 gagaataagt tggaccagct caagtttgct aggcaaaaga ccgcctactg ttatttctct 1500 gttgctgcaa cactttcgtc tcccgaatta tcagatgcgc gtatttcatg ggccaaaaat 1560 ggcatattaa ctacagtagt tgatgacttt tttgatatcg gtggtacaat cgatgaattg 1620 accaacctga ttcaatgtgt tgaaaaatgg aatgtagatg tcgacaagga ttgttgttca 1680 gagcatgttc ggattttatt tttagcatta aaagatgcaa tctgttggat tggagatgaa 1740 gcttttaaat ggcaagcgcg cgatgtaact agccatgtta ttcaaacttg gttggaacta 1800 atgaatagta tgttgagaga agctatatgg acaagagatg cttatgtgcc aacattaaat 1860 gaatatatgg aaaacgctta cgtgtcattt gcattaggcc cgattgtcaa gccggctatt 1920 tactttgtgg ggcccaaatt atcagaggag attgttgaaa gctctgaata tcataatcta 1980 tttaagctaa tgagcacgca gggtcgactt ctaaacgata tccatagctt caagagggaa 2040 tttaaggaag gcaaattaaa cgcggtagca ttgcatttga gtaacggaga aagtgggaaa 2100 gtggaagaag aggttgtgga ggagatgatg atgatgatta aaaacaagag gaaagaatta 2160 atgaaattaa tttttgaaga aaatggtagc attgttccta gagcttgtaa agatgcattt 2220 tggaacatgt gtcacgtgtt gaattttttt tacgcaaacg atgacgggtt tactggaaac 2280 acgattcttg atactgtgaa ggacatcatt tacaacccgt tggtgcttgt gaatgaaaat 2340 gaagaacaaa gg 2352 <210> 4 <211> 1542 <212> DNA <213> Gene encoding KO(kaurene oxidase) <400> 4 atggatgcgg ttactggtct gctgactgtt cctgcgactg cgattaccat tggtggcacc 60 gcagtggccc tggcggtcgc tctgatcttc tggtacctga aaagctacac gtccgctcgt 120 cgttctcagt ctaaccacct gccgcgtgta ccggaagtac cgggcgttcc actgctgggt 180 aacctgctgc aactgaagga gaaaaaaccg tacatgacct tcacccgctg ggctgcgacc 240 tacggtccga tctatagcat caaaacgggc gcaacgagca tggtcgtggt atcttctaac 300 gaaatcgcta aagaagcact ggtcacccgc ttccagagca tcagcacccg taacctgtcc 360 aaagccctga aagtgctgac tgctgataag accatggttg caatgtctga ctatgacgac 420 taccacaaga ccgtgaaacg tcacatcctg accgcggtgc tgggcccgaa cgctcagaaa 480 aaacatcgta tccatcgtga tatcatgatg gataacatct ccactcagct gcatgaattt 540 gtgaaaaaca acccggagca ggaggaagtg gacctgcgta aaattttcca gtctgaactg 600 tttggtctgg cgatgcgtca ggctctgggc aaagatgtgg aatccctgta tgtcgaagac 660 ctgaaaatta ccatgaatcg tgacgaaatc ttccaggttc tggttgtaga cccgatgatg 720 ggtgccatcg acgttgattg gcgcgacttc ttcccgtatc tgaaatgggt tccgaacaag 780 aaattcgaaa ataccattca gcagatgtat attcgtcgtg aagccgttat gaaatccctg 840 atcaaagagc acaaaaagcg tattgcatct ggcgagaaac tgaatagcta tattgattac 900 ctgctgagcg aagcgcagac tctgaccgat caacagctgc tgatgtccct gtgggaaccg 960 attatcgagt cttccgatac caccatggta accaccgaat gggcaatgta cgaactggct 1020 aaaaacccga aactgcagga ccgtctgtac cgcgacatca aatccgtttg tggtagcgaa 1080 aaaatcaccg aagagcacct gtcccaactg ccgtacatca ctgcaatctt ccacgagact 1140 ctgcgtcgtc attctccggt tccgatcatc ccactgcgtc acgtgcacga agacactgtt 1200 ctgggcggtt accacgtgcc agccggcacc gaactggcgg ttaacattta cggctgcaac 1260 atggacaaaa acgtctggga aaacccggaa gagtggaacc ctgaacgctt catgaaagaa 1320 aacgaaacta ttgatttcca aaagactatg gcgtttggcg gtggtaaacg cgtatgcgct 1380 ggttctctgc aggcactgct gacggcgtct atcggcatcg gtcgcatggt tcaggaattt 1440 gaatggaagc tgaaagatat gacccaggaa gaagtaaaca cgatcggtct gaccactcag 1500 atgctgcgcc ctctgcgcgc tatcattaag ccgcgtatct aa 1542 <210> 5 <211> 1431 <212> DNA <213> Gene encoding KAH(kaurenoic acid hydroxylase) <400> 5 atgattcagg tgctgacccc gatcctgctg ttcctgatct tctttgtttt ctggaaagta 60 tacaagcacc agaaaactaa aattaacctg ccgccgggca gcttcggttg gccgtttctg 120 ggcgaaactc tggctctgct gcgtgctggc tgggattctg aaccggaacg cttcgtccgt 180 gaacgcatta aaaaacatgg ctccccactg gttttcaaaa cgagcctgtt tggcgatcgt 240 tttgccgtgc tgtgcggtcc ggccggtaac aaatttctgt tttgcaacga gaacaaactg 300 gtggcatctt ggtggcctgt cccggtacgt aaactgttcg gcaaaagcct gctgactatc 360 cgcggcgatg aagccaaatg gatgcgtaaa atgctgctgt cctatctggg cccggatgcg 420 tttgcgaccc attacgcagt aacgatggac gtagtgaccc gccgtcacat tgacgttcac 480 tggcgtggca aagaagaagt caacgtgttc cagaccgtta agctgtatgc cttcgagctg 540 gcatgtcgtc tgttcatgaa tctggatgac ccgaaccaca tcgcgaaact gggctccctg 600 ttcaacatct tcctgaaggg catcattgaa ctgccgatcg acgttcctgg cacccgtttc 660 tactcttcta aaaaggcggc tgcggctatc cgtatcgaac tgaagaaact gattaaagcc 720 cgcaaactgg aactgaagga gggtaaagca tctagctccc aagacctgct gagccatctg 780 ctgacctctc ctgacgaaaa cggtatgttc ctgaccgaag aagagatcgt tgataacatc 840 ctgctgctgc tgttcgcagg tcacgacacg tccgcgctgt ctatcaccct gctgatgaaa 900 accctgggtg aacactccga cgtgtatgat aaagttctga aagaacagct ggaaatttct 960 aaaaccaaag aagcgtggga aagcctgaaa tgggaggata tccagaagat gaaatactcc 1020 tggtctgtta tctgcgaggt gatgcgtctg aatccgccgg ttatcggtac ttaccgtgaa 1080 gcactggtag atatcgacta cgcgggttac actattccga aaggttggaa actgcattgg 1140 agcgcggtgt ccacccagcg tgatgaagca aacttcgaag acgttactcg tttcgacccg 1200 tctcgctttg agggtgcggg tccgaccccg ttcaccttcg ttccgttcgg cggtggtcca 1260 cgcatgtgtc tgggtaagga atttgctcgc ctggaagttc tggctttcct gcacaacatt 1320 gtaacgaact tcaaatggga tctgctgatc ccggacgaga aaatcgaata tgacccgatg 1380 gctactccag ctaaaggtct gccgatccgt ctgcacccac accaagtcta a 1431 <210> 6 <211> 1383 <212> DNA <213> Gene encoding UGT85C2((uridine diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 85C2) <400> 6 atggctgaac aacaaaaaat caaaaagtct ccgcacgttc tgctgatccc gtttccactg 60 cagggccata ttaacccgtt tattcagttc ggtaaacgcc tgatctccaa aggtgttaaa 120 accaccctgg tgaccactat tcacaccctg aacagcacgc tgaaccactc caacaccacc 180 actaccagca tcgaaattca ggcgatctct gatggctgcg acgaaggtgg tttcatgtcc 240 gcaggtgagt cttatctgga aacctttaaa caggttggct ctaaatctct ggctgacctg 300 attaagaaac tgcagagcga aggtactact atcgacgcaa tcatctacga ctccatgacc 360 gaatgggttc tggatgtggc gattgaattt ggtatcgacg gtggtagctt tttcacccag 420 gcttgtgttg taaatagcct gtactatcac gttcataaag gcctgatttc tctgccgctg 480 ggcgaaactg tgtccgttcc gggcttcccg gttctgcagc gttgggaaac ccctctgatc 540 ctgcaaaatc atgagcaaat tcagtctccg tggtcccaga tgctgttcgg tcagttcgcc 600 aacattgacc aggcccgctg ggtgttcacc aactctttct acaaactgga agaagaagtt 660 attgaatgga cccgcaaaat ctggaatctg aaagtgatcg gcccgacgct gccgtccatg 720 tacctggata agcgcctgga tgatgataaa gataacggct tcaatctgta caaagcgaac 780 caccatgaat gtatgaactg gctggacgat aaacctaaag aatctgttgt ctatgttgct 840 ttcggttctc tggttaaaca cggtccggaa caggtggaag aaatcacccg tgctctgatc 900 gacagcgacg tgaactttct gtgggtgatc aaacacaagg aagaaggcaa actgccagaa 960 aacctgagcg aagtcatcaa aactggcaaa ggtctgatcg ttgcatggtg caaacagctg 1020 gacgtactgg cgcacgaatc tgtaggctgc ttcgtgactc actgtggctt caacagcact 1080 ctggaagcga tctccctggg tgtaccggta gtagcgatgc cgcagttctc cgaccagacc 1140 acgaacgcta aactgctgga tgaaatcctg ggcgttggtg tccgtgttaa ggcagatgag 1200 aacggtattg tgcgtcgtgg taacctggca tcttgcatca aaatgattat ggaagaggag 1260 cgtggtgtaa tcatccgtaa aaacgcggtc aaatggaagg atctggccaa agtagccgtt 1320 cacgagggcg gcagctctga caacgacatc gtcgagttcg tgtccgagct gatcaaggca 1380 taa 1383 <210> 7 <211> 1383 <212> DNA <213> Gene encoding UGT74G1(uridine diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 74G1) <400> 7 atggctgaac aacaaaaaat caaaaagtct ccgcacgttc tgctgatccc gtttccactg 60 cagggccata ttaacccgtt tattcagttc ggtaaacgcc tgatctccaa aggtgttaaa 120 accaccctgg tgaccactat tcacaccctg aacagcacgc tgaaccactc caacaccacc 180 actaccagca tcgaaattca ggcgatctct gatggctgcg acgaaggtgg tttcatgtcc 240 gcaggtgagt cttatctgga aacctttaaa caggttggct ctaaatctct ggctgacctg 300 attaagaaac tgcagagcga aggtactact atcgacgcaa tcatctacga ctccatgacc 360 gaatgggttc tggatgtggc gattgaattt ggtatcgacg gtggtagctt tttcacccag 420 gcttgtgttg taaatagcct gtactatcac gttcataaag gcctgatttc tctgccgctg 480 ggcgaaactg tgtccgttcc gggcttcccg gttctgcagc gttgggaaac ccctctgatc 540 ctgcaaaatc atgagcaaat tcagtctccg tggtcccaga tgctgttcgg tcagttcgcc 600 aacattgacc aggcccgctg ggtgttcacc aactctttct acaaactgga agaagaagtt 660 attgaatgga cccgcaaaat ctggaatctg aaagtgatcg gcccgacgct gccgtccatg 720 tacctggata agcgcctgga tgatgataaa gataacggct tcaatctgta caaagcgaac 780 caccatgaat gtatgaactg gctggacgat aaacctaaag aatctgttgt ctatgttgct 840 ttcggttctc tggttaaaca cggtccggaa caggtggaag aaatcacccg tgctctgatc 900 gacagcgacg tgaactttct gtgggtgatc aaacacaagg aagaaggcaa actgccagaa 960 aacctgagcg aagtcatcaa aactggcaaa ggtctgatcg ttgcatggtg caaacagctg 1020 gacgtactgg cgcacgaatc tgtaggctgc ttcgtgactc actgtggctt caacagcact 1080 ctggaagcga tctccctggg tgtaccggta gtagcgatgc cgcagttctc cgaccagacc 1140 acgaacgcta aactgctgga tgaaatcctg ggcgttggtg tccgtgttaa ggcagatgag 1200 aacggtattg tgcgtcgtgg taacctggca tcttgcatca aaatgattat ggaagaggag 1260 cgtggtgtaa tcatccgtaa aaacgcggtc aaatggaagg atctggccaa agtagccgtt 1320 cacgagggcg gcagctctga caacgacatc gtcgagttcg tgtccgagct gatcaaggca 1380 taa 1383 <210> 8 <211> 1458 <212> DNA <213> Gene encoding UGTx(uridine diphospho-glucuronosyltransferase x) <400> 8 atgtacaacg ttacttatca tcaaaattca aaagcaatgg ctaccagtga ctccatagtt 60 gacgaccgta agcagcttca tgttgcgacg ttcccatggc ttgctttcgg tcacatcctc 120 ccttaccttc agctttcgaa attgatagct gaaaagggtc acaaagtctc gtctctttct 180 accaccagaa acattcaacg tctctcttct catatctcgc cactcataaa tgttgttcaa 240 ctcacacttc cacgtgtcca agagctgccg gaggatgcag aggcgaccac tgacgtccac 300 cctgaagata ttccatatct caagaaggct tctgatggtc ttcaaccgga ggtcacccgg 360 tttctagaac aacactctcc ggactggatt atttatgatt atactcacta ctggttgcca 420 tccatcgcgg ctagcctcgg tatctcacga gcccacttct ccgtcaccac tccatgggcc 480 attgcttata tgggaccctc agctgacgcc atgataaatg gttcagatgg tcgaaccacg 540 gttgaggatc tcacgacacc gcccaagtgg tttccctttc cgaccaaagt atgctggcgg 600 aagcatgatc ttgcccgact ggtgccttac aaagctccgg ggatatctga tggataccgt 660 atggggctgg ttcttaaggg atctgattgt ttgctttcca aatgttacca tgagtttgga 720 actcaatggc tacctctttt ggagacacta caccaagtac cggtggttcc ggtgggatta 780 ctgccaccgg aaatacccgg agacgagaaa gatgaaacat gggtgtcaat caagaaatgg 840 ctcgatggta aacaaaaagg cagtgtggtg tacgttgcat taggaagcga ggttttggtg 900 agccaaaccg aggttgttga gttagcattg ggtctcgagc tttctgggtt gccatttgtt 960 tgggcttata gaaaactaaa aggtcccgcg aagtcagact cggtggagtc gccagacggg 1020 ttcgtggaac gaactcgtga tcgtgggttg gtctggacga gttgggcacc tcagttacga 1080 atactgagcc atgagtcggt ttgtggtttc ttgactcatt gtggttctgg atcaattgtg 1140 gaagggctaa tgtttggtca ccctctaatc atgctaccga tttttgggga ccaacctctg 1200 aatgctcgat tactggagga caaacaggtg ggaatcgaga taccaagaaa tgaggaagat 1260 ggttgcttga ccaaggagtc ggttgctaga tcactgaggt ccgttgttgt ggaaaacgaa 1320 ggggagatct acaaggcgaa cgcgagggcg ctgagtaaaa tctataatga cactaaggtt 1380 gaaaaagaat atgtaagcca attcgtagac tatttggaaa agaatgcgcg tgcggttgcc 1440 atcgatcatg agagttaa 1458 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GGPPS <400> 9 gctctagaag gaggattaca aaatggcgtt tgaacagcgg attg 44 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GGPPS <400> 10 ggaattctca gacgcgggcc gcg 23 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for CPPS <400> 11 gctctagaag gaggattaca aaatgaagac cggcttcatc 40 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CPPS <400> 12 ttcccttgcg gccgctcata ttacaatctc gaac 34 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KS <400> 13 gctctagaag gaggattaca aaatgaatct ttcactatgc atc 43 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KS <400> 14 ttcccttgcg gccgcttacc tttgttcttc attttc 36 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KO <400> 15 gctctagaag gaggattaca aaatggatgc cgtcaccggt ttg 43 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KO <400> 16 ggaattctca tatcctgggc tttattatg 29 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KAH <400> 17 gctctagaag gaggattaca aaatgattca ggtgctgacc c 41 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KAH <400> 18 ggaattctta gacttggtgt gggtgc 26 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UGT85C2 <400> 19 gctctagaag gaggattaca aaatggatgc tatggcaact ac 42 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UGT85C2 <400> 20 ggaattctta gttgcgcgcc agaacgg 27 <210> 21 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UGT74G1 <400> 21 gctctagaag gaggattaca aaatggctga acaacaaaaa atc 43 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UGT74G1 <400> 22 ggaattctta tgccttgatc agctcgg 27 <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UGTx <400> 23 tccccccggg aggaggatta caaaatgtac aacgttactt atcatc 46 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UGTx <400> 24 ggaattctta actctcatga tcgatgg 27 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UGTx in subcloning <400> 25 cgggatccat gtacaacgtt acttatcatc 30 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UGTx in subcloning <400> 26 cccaagctta ctctcatgat cgatggc 27 <210> 27 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for UshA <400> 27 caaagaggtt gcggctgaag gcggtagcgt gctgctactt tccggtggcg acattaacac 60 aattaaccct cactaaaggg cgg 83 <210> 28 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UshA <400> 28 gataacagcg agatcatttg ctggttttca gcgatttcag gagtgtaaag cacgcgctcg 60 taatacgact cactataggg ctc 83 <210> 29 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Pgi <400> 29 tgactggttc ctgaaagcgg caggtgatga aaaacacgtt gcaaaacact ttgcggcgct 60 ttccaccaat taaccctcac taaagggcgg 90 <210> 30 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Pgi <400> 30 cagcagtaca ggcaggtttt tctcggcagg cgtggtggag aaatgcttgt ccatcgcgtg 60 tgcgccgtaa tacgactcac tatagggctc 90

Claims

(a) 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)에서 유래하고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 GGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase, crtE)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)에서 유래하고, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 CPPS(copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 KS(kaurene synthase)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 KO(kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 KAH(kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
(b) 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT85C2((uridine diphosphoglucuronosyltransferase(UGT) 85C2)를 코딩하는 유전자; 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGT74G1(uridine diphospho-glucuronosyltransferase(UGT) 74G1)를 코딩하는 유전자; 및 스테비아 레바우디아나에서 유래하고, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 UGTx(uridine diphospho-glucuronosyltransferase x)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;로 형질전환된 스테비올(steviol)의 배당체인 스테비오사이드(Stevioside) 생산용 재조합 대장균.
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제1항에 있어서,
상기 (a)의 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 스테비오사이드 생산용 재조합 대장균.
제1항에 있어서,
상기 (b)의 재조합 벡터는 하기의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는, 스테비오사이드 생산용 재조합 대장균.
제1항의 재조합 대장균에 ushA 유전자(UDP-Sugar Hydrolase Gene) 또는 pgi 유전자(pig phosphoglucose isomerase gene)를 넉아웃(knockout)시켜 돌연변이를 유발시킨, 스테비오사이드 과생산능을 갖는 돌연변이 재조합 대장균.
(Ⅰ) 제1항, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 배양하는
단계; 및
(Ⅱ) 상기 (Ⅰ) 단계의 재조합 대장균의 배양물에서 스테비오사이드를 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는 스테비올의 배당체인 스테비오사이드의 생산 방법.