KR101257897B1 - 재조합 균주에서의 람노실 플라보노이드의 제조방법 - Google Patents

재조합 균주에서의 람노실 플라보노이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사공학적 방법으로 제조된 재조합 균주를 이용한 당화 플라보노이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TTDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자로 형질전환된 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 이용한 람노실 플라보노이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 람노실 플라보노이드 생합성 및 관련 화합물의 글리코실화에 유용하다.

Description

재조합 균주에서의 람노실 플라보노이드의 제조방법{Method for preparing Ramnosyl Flavonoid Using Recombinant Strain}
본 발명은 대사공학적 방법으로 제조된 재조합 균주를 이용한 당화 플라보노이드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 TTDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자로 형질전환된 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 이용한 람노실 플라보노이드의 제조방법에 관한 것이다.
플라보노이드(flavonoid)는 저분자 폴리페놀릭 식물 이차대사산물을 말하며, 과일, 야채,넛트, 줄기, 꽃, 뿌리, 바크, 차, 와인 및 커피에서 발견되는, 일상식품의 보편적인 구성요소이다. 플라보노이드는 항알러지 효과 외에, 항산화, 항균 및 항바이러스 활성를 가지며, 항염증, 항-혈관신생, 진통, 간보호, 세포분열억제, 세포자살 유도, 에스트로제닉 또는 항-에스트로제닉 활성을 가진다(Middleton et al., Pharmacol Rev 52: 673, 2000; Yan et al., Appl. Environ. Microbiol., 71:3617, 2005).
리포필릭 저분자의 글리코실화는 생체 내에서 상기 화합물의 활성을 조절할 수 있는 주된 방법이다. 또한, 많은 생물 활성 천연 물질들이 그들 구조 중의 당성분에 의해서 활성을 나타내고 있다. 이들 당 구조의 변이는 생체 활성 및 모화합물의 약물역학적 성질에도 깊은 영향을 미친다(Kren and Marteinkova, Curr. Med. Chem, 8: 1303, 2001)
예를 들어, 람노오스를 naringein-7-O-glucoside의 글루코오스 부분의 2-OH 또는 6-OH에 결합시키면 포도가 써지고, 귤은 맛이 없게 된다. 천연물에 결합된 당의 역할 때문에, 화합물의 개발 및 천연물을 다양한 당 모이어티와 결합시키는 효소학적 방법의 개발하는 데에 많은 관심이 모아지고 있다. 반합성(semi synthesis, Zhang et al., J Med Chem 48:2600, 2005, Griffith et al., Curr Opin Biotechnol, 16:622, 2005), 대사공학(pathway engineering, Melancon et al., J Am Chem Soc, 127:12240, 2005; Blanchard and Thorson, Curr Opin Chem Biol, 10:263, 2006) 및 in vitro 효소학적 당화법(glycosylation technique, Borisova et al., Angew Chem Int Ed Engl, 45:2748, 2006)을 포함하는 방법들은 천연물의 당 구조를 변화시키는 효율적인 수단으로 알려져 있다. 생합성적 및 효소화학적 당다변화법(glycodiversification method)의 실현가능성은 당 공여체와 아그리콘 수용체의 커플링을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라아제(GTs) 효소의 기질 허용성에 달려있다. 상기 방법들을 이용한 당다변화가 많은 성공을 거두었다 하더라도, 당의 다변화에 대한 과제는 아직 많이 존재한다.
특히, 활성화된 뉴클레오티드 디포스페이트(NDP)-당의 생성과 적절한 수용체 기질은 진보된 화학적 또는 효소적 합성을 요구하고 있으며(Ruprath et al., 2005), in vivo 방법은 유전자 파괴를 위한 유전적 시스템 생합성 경로과 이종 발현(blanchard et al., 2006) 뿐만 아니라, 생합성 경로에 대한 자세한 정보가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 재조합 균주에서, 당화 플라보노이드를 제조하는 방법을 개발하고 자 예의 노력한 결과, TDP-L-람노오즈의 세포내 수준을 증가시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 및 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물을 플라보노이드 함유 배지에서 배양하는 경우, 고농도의 람노실 플라보노이드를 수득할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 고수율로 람노실 플라보노이드를 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 당화 플라보노이드의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자로 형질전환된 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 TDP-L-람노스를 분리하는 단계를 포함하는 TDP-L-람노스의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자 및 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물을 플라보노이드를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 람노실 플라보노이드를 분리하는 단계를 포함하는 람노실 플라보노이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 람노실 플라보노이드 생합성 및 관련 화합물의 글리코실화에 유용하다.
도 1은 TDP-glucose synthase 유전자 및 TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCDTGSDH(A) 및 TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimeerase 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pAC-EPKR(B)의 유전자 지도이다.
도 2는 TDP-L-람노스의 HPLC 및 ESI-MS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3은 pAC-GerFK의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 E.coli (TDEKRGt-3) 균주에서의 당화 플라보노이드의 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 5는 3-O-람노실 퀘세틴의 HPLC 및 LC-MS로 분석결과를 나타낸 것이다.
도 6은 3-O-람노실 캠페롤의 HPLC 및 LC-MS로 분석결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3-O-람노실 퀘세틴의 ESI/MS-MS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 8은 3-O-람노실 캠페롤의 ESI/MS-MS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 3-O-람노실 퀘세틴 및 3-O-람노실 캠페롤의 TLC 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10은 3-O-알로실퀘세틴의 ESI/MS-MS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아라비노오스 농도 및 OD600의 수치에 따른 당화 플라보노이드의 생산수율을 나타낸 것이다.
도 12는 퀘세틴 함유 배양에서의 아라비노오스 농도별 수율(A) 및 캠페롤 함유 배양에서의 시간에 따른 수율을 나타낸 것이다.
도 13은 IPTG 농도 및 배양시간에 따른 수율을 나타낸 것이다.
일관점에서, 본 발명은 TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자로 형질전환된 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 TDP-L-람노스를 분리하는 단계를 포함하는 TDP-L-람노스의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 TDP-L-rhamnose(Thymidyldiphosphate-L-rhamnose)를 합성할 수 있는 대장균 균주를 제조하였으며, 상기 균주는 플라보노이드 당화에 사용할 수 있다. TDP-glucose의 합성이 TDP-L-rhamnose를 포함하는 TDP-당의 시작점이기 때문에, 탄소 흐름의 채널을 TDP-글루코오스 합성에 가능한 많이 보내는 것이 본 발명의 대사공학의 논리적인 첫걸음일 것이다(Ma et al., 1997; Yan et al., 2007). 따라서, 본 발명에서는 글루코오스 -6-포스페이트가 프럭토오스-6-포스페이트로 전환되는 경로를 차단한 E.coli BL21(DE3)/Δpgi를 사용하여, 글루코오스-1-포스페이트로 전환되도록 하였다(Kurummbang et al., J Appl Microbiol DOI 10.1111/j. 1365-2672, 2009). 상기 TDP-L-rhamnose 경로는 상기 TDP-L-rhamnose를 합성하기 위하여 각각 대장균에서 과발현시켰다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자 및 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 상기 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물을 플라보노이드를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 람노실 플라보노이드를 분리하는 단계를 포함하는 람노실 플라보노이드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 플리보노이드는 3-하이드록시 플라보노이드인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 3-하이드록시 플라보노이드는 퀘세틴(Quercetin), 켐페롤(kaempferol), 피세틴(fisetin) 및 미리세틴(myricetin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 TDP-L-rhamnose(Thymidyldiphosphate-L-rhamnose)를 합성할 수 있는 대장균 균주를 제조하였으며, 상기 외부유래 기질을 각각의 당으로 당화하여, TDP-L-rhamnose를 생성하는 각 균주에서, Arabidopsis thaliana 유래의 글리코실트랜스퍼라아제 유전자(araGt-3)를 과발현시켰으며, 분리산물은 TLC, ESI/MS, LS/MS 및 ESI-MS/MS로 분석하여 확인하였다.
글리코실레이션의 주된 기능은 기질과 산물에 안정성, 무독화, 용해성을 갖도록 하는 것이다. 글리코실화된 산물을 생성하기 위하여, 본 발명의 일 양태에서는 대장균에서 TDP-L 람노오스의 생합성 유전자 클러스터를 과발현시켰으며, Arabidopsis thaliana 유래의 글리코실트랜스퍼라아제 유전자를 과발현시켜, 플라보노이드를 글리코실화하였다.
글리코실화를 위하여, 플라보노이드, 퀘세틴(Quercetin)과 캠페롤(kaempferol)는 외부로부터 바이오트랜스포메이션 시스템의 숙주세포에 첨가하였다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 숙주세포의 생산 수율을 향상시키기 위하여, 아라비노오스, IPTG 농도, OD600, 기질농도, 배양시간 등의 조건을 최적화하였다.
본 발명의 일 양태에서는, 0.2mM의 각각의 플라보노이드를 공급하여, 24mg/L의 3-O-rhamnosyl quercetin 및 12.9 mg/L의 3-O-rhamnosyl kaempferol를 수득할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장균에서의 TDP-당의 생산을 위한 유전자 조작
(1) 대장균에서의 TDP-L-람노스의 생산
저분자물질 당화에서 뉴클레오티드 활성화 당은 필수적인 요소이다.
TDP-L-람노스(TDP-L-rhamnose) 생합성 경로를 과발현시키기 위하여, 대장균에서 과발현시킬 유전자들은 각각 TDP-glucose synthase 유전자는 Thermus caldophilus GK24(ATCC), TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자는 Salmonella thyphimurium LT2(ATCC), TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimeerase 유전자와 TDP-glucose 4-ketoreducase 유전자는 Streptomyces antibioticus Tu99(ATCC)의 유전자를 분리하여 클로닝하였다.
상기 TDP-glucose synthase 유전자 및 상기 TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자는 pCDFDuet-1/Smr벡터(Novagen, Germany)에 표 3에 나타낸 서열번호 1 ~ 2 및 서열번호 3~4의 프라이머를 각각 사용하여, PCR법으로 클로닝하여, pTGSDH를 제작하였다 (도 1의 A).
상기 TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimeerase 및 상기 TDP-glucose 4-ketoreducase는 pACYC-Duet-1/Cmr벡터(Novagen, Germany)에 서열번호 표 3에 나타낸 서열번호 5 ~ 6 및 서열번호 7 ~ 8의 프라이머쌍을 각각 사용하여, PCR법으로 클로닝하여 pAC-EPKR을 제작하였다 (도 1의 B).
표 1은 본 발명에서 사용한 벡터를 나타낸 것이고, 표 2는 본 발명에서 사용한 균주를 나타낸 것이다.
Figure 112010056076470-pat00001
Figure 112010056076470-pat00002
본 발명에서 사용한 프라이머
프라이머명 서열 제한효소 서열번호
TSF GGATCCTATGAAGGCTCTCGTGCTGTCCG BamHI 1
TSR AAGCTTTCATGTGTGGATCTGCACCTTGC HindIII 2
DHF AGATCTTATGAAGATACTTATTACTGGCGG BglII 3
DHR CGAGATATCTTACTGGCGTCCTTCATAGTT EcoRV 4
EpiF: GGATCCAATGGAGTTACTCGACGTCGACG BamHI 5
EpiR: AAGCTTTCACGGGCCGGTCCCACGCCGGC HindIII 6
KRF: GATATCAATGAGATGGCTGATCACCGGCG EcoRV 7
KRR: CTCGAGTCATGCTGCTCCTCGCCGGGTCGGT XhoI 8
gerFF: GGATCCAATGACAGTCATACCTGCCGACG BamHI 9
gerFR AAGCTTTCAGCTGGAGCGTCTCCAGTAGG HindIII 10
gerKF GATATCAATGACTGCTGATCGCTGGGCCG EcoRV 11
gerKR CTCGAGTCAGCGCTTGTGAAGGCGGTACC XhoI 12
arGt-3F AGCGAATTCATGACCAAATTCTCCGAG EcoRI 13
arGt-3R AGCCTCGAGCTAAACTTTCACAATTTC XhoI 14
상기 제작된 TDP-glucose synthase 유전자 및 TDP-glucose 4, 6-dehydratase 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCDTGSDH 및 TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimeerase 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pAC-EPKR을 E.coli BL21(DE3)/Δpgi에 삽입하여, E.coli BL21(DE3)/Δpgi/pCDTGSDH/pAC-EPKR을 제작하고, 앰피실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 및 클로람페이콜을 각각 50μg/mL로 함유하는 Luria-Bertani 배지에 접종하여 37℃에서 배양하여, TDP-L-람노스 생합성 경로를 과발현시켜, glucose-1-P를 TDP-L-람노스로 유도하며, TDP-L-rhamnos을 생산하였다. TDP-L-rhamnos를 분리하기 위하여, 배양된 세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, 20mM Tris-HCl (pH 7.5)로 세척한 후, 초음파로 세포벽을 파쇄하였으며, 상등액을 TDP-L-람노스 분석에 사용하였다.
역상 HPLC 분석은 C18 칼럼(30105-254630, Thermo, ODS Hypersil; 4.6 x 250mm' 5μm 직경입자)에서 70% H2O(0.1% trifluoroacetic acid) 및 30% 아세토니트릴 용액 그래디언트로, 1ml/분으로 수행하였다. 흡광도는 퀘세틴(Quercetin) 검출을 위해서는 330nm에서 측정하였으며, 캠페롤(Kaempferol) 검출을 위해서는 260nm에서 측정하였다. 분리된 화합물은 LC/MS 및 ESI-MS/MS 분석을 수행하였다.
HPLC 분석 결과, 리텐션 타임 8.6분의 피크가 TDP-L-람노스 와 유사하였고(도 2의 A), 추가 확인을 위하여, ESI-MS/MS 분석을 수행하여 m/z- 547에서 TDP-L-람노스의 예상 질량 피크가 나타났다 (도 2의 B).
따라서, E.coli BL21(DE3)/Δpgi/pCDTGSDH/pAC-EPKR에서 TDP-L-람노스 생합성 경로가 잘 발현되고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 대장균에서의 TDP-6-deoxy-allose의 생산
대장균에서 TDP-6-deoxy-allose(TDP-6-deoxy-allose)를 합성하기 위하여, Streptomyces sp. KCTC 0041BP로부터 TDP-hexose-3-epimerase 유전자(GerF), TDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase 유전자(GerK)를 클로닝하여 pAC-GerFK를 제작하였다(도 3). 클로닝은 pACYCDuet-1(Novagen, Germany)을 벡터로 하고, 삽입될 각각의 유전자 단편은 서열번호 9~10 및 서열번호 11~12를 이용한 PCR법으로 수득하여 수행하였다.
상기 제작한 pCDTGSDH 및 pAC-GerFK를 E.coli BL21(DE3)/Δpgi에 트랜스포메이션하여, E.coli BL21(DE3)/Δpgi/ pCDTGSDH/pAC-GerFK를 제작하고, 상기 (1)의 방법으로 배양한 후, 세포를 파쇄하여 상등액을 분석한 결과, TDP-6-deoxy-allose가 생성되는 것을 확인하였다.
실시예 2: 당화된 천연물의 생산을 위한 대사공학적 조작
플라보노이드 당화 시스템을 향상시키기 위하여 대사공학적으로 조작한 균주를 제작하였다.
플라보노이드 당화 시스템을 향상시키기 위해서는 세포 내 고농도 TDP-L-람노스 및 고농도의 글리코실트랜스퍼라아제 효소가 요구된다. 본 실시예에서 글리코실트랜스퍼라아제는 Arabidopsis thaliana의 글리코실트랜스퍼라아제 유전자(Argt-3, GenBank accession No. AF360160)의 cDNA는 RIKEN Bioresouce Center에서 구입하였으며, 상기 cDNA 룰 pET28a+ 벡터에 서열번호 13 ~ 14의 프라이머 쌍을 사용하여, PCR 법으로 클로닝하여, pArGt-3을 제작하였다.
상기 pArGt-3를 실시예 1의 (1)에서 제작한 E.coli BL21(DE3)/Δpgi/pCDTGSDH/pAC-EPKR에 트랜스포메이션하여, 최종적으로 E.coli (TDEKRGt-3)을 제작하였다 (도 4).
상기 E.coli (TDEKRGt-3) 균주에 퀘세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)을 외부로부터 첨가하여 람노실 플라보노이드 생산을 확인하였다.
상기 방법과 동일하게, 실시예 1의 (2)에서 제작한 E.coli BL21(DE3)/Δpgi/ pCDTGSDH/pAC-GerFK에도 pArGt-3를 트랜스포메이션하여, 최종적으로 E.coli (TDGerFKGt-3)을 제작하였다. 상기 E.coli (TDGerFKGt-3)에는 퀘세틴을 외부로부터 첨가하여 알로실 플라보노이드 생산을 확인하였다.
E.coli (TDEKRGt-3) 균주 및 E.coli (TDGerFKGt-3)균주는 각각 LB 배지에서 배양하였으며, OD600에서 배양액의 수치가 0.6에 도달했을때, 0.3mM의 IPTG(isoprpyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하고, 300mg/mL의 L-아라비노오스를 첨가하여 30분간 배양한 다음, E.coli (TDEKRGt-3) 균주에는 0.2mM의 퀘세틴 및 0.2mM의 캠페롤을 첨가하여 람노실 퀘세틴 및 람노실 캠페롤 생산을 유도하였으며, E.coli (TDGerFKGt-3)균주에는 0.2mM 퀘세틴을 첨가하여 알로실 퀘세틴의 생산을 유도하였다.
상기 배양액을 25℃에서 60시간 배양하고, 상층액을 두배 부피의 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출된 산물을 농축하여, 메탄올에 녹인 후 이후 분석에 사용하였다.
상기 당화 플라보노이드의 생산 실험은 글리코실트랜스퍼레이즈가 발현유도되지 않는 조건에서도 수행되었으며, 이 경우 당화산물은 검출되지 않았다. 또한, 유전자가 삽입되지 않은 벡터를 이용한 실험에서도 당화산물은 검출되지 않았으며, 이러한 대조실험 결과는 본 실시예의 신뢰도를 확인할 수 있다.
(1) 람노실 플라보노이드 및 알로실 플라보노이드의 생산
상기 과정으로 분리된 배양산물을 HPLC 및 LC-MS로 분석하였다.
LC-MS 결과, 3-O-람노실 퀘세틴(3-O-rhamnosyl Quercetin)의 경우, 잔류시간 4.6분에서 질량(m/z+) 449에서 피크가 나타났으며(도 5), 3-O-람노실 켐페롤(3-O-rhamnosyl kaempferol)의 경우, 6.08분에서 질량(m/z+) 433의 피크가 나타났다(도 6).
추가확인을 위하여, 양성모드에서 페어런츠 질량 m/z+ 449 및 m/z+ 433으로 ESI-MI/MS를 수행하였다. m/z+ 449 단편은 람노스 부분(m/z+ 303, 퀘세틴)의 손실을 나타내는 예상된 경로를 수반하고 있었고 (도 7), 비슷한 패턴이 m/z+ 433 단편에서도 관찰되었다 (도 8). 페어런츠 이온은 [M+H-H2O]+ 및 [M+H-2H2O]+단편을 나타내었다(Boue et al., J Chromatogr A, 991:61 2003; Chen et al., J Liq Chromatogr Relat Technol, 26:1623, 2003; Mendez and Salas, Trends Biotechnol, 19:449, 2001).
분리된 산물은 TLC 분석을 통하여 다시 한번 확인하였으며, TLC는 실리카겔-60 프리코티드 커머셜 플레이트 20cmㅧ20cm, 0.2mm 층두께(Merk, Germany)를 사용하고, 에틸아세테이트/메탄올/물/톨루엔의 비가 100:15.5:13.5:2인 용출액으로 용출시켰고, 용출액으로 전개시킨 후 건조하고, 10% H2SO4를 함유하는 메탄올을 스프레이한 후 110℃에서 10분간 처리하여 플라보노이드와 그 당화물을 확인하였다. 그 결과, 대조군과 확연히 차이가 나는 각가의 플라보노이드 당화물 스팟을 확인하였다 (도 9의 a 및 d). 추가 확인을 위하여, 산물은 HPLC로 분리한 후 다시 TLC로 확인하였다(도 9의 b). 최적 탄소원을 확인하기 위하여, 동일 농도의 글루코오스, 아라비노오스 및 2% 글리세롤을 배양액에 첨가한 산물을 분리하여, TLC 분헉한 결과, L-아라비노오스가 적절한 탄소원이라는 것을 확인할 수 있었다(도 9의 c).
상기 방법으로 배양된 E.coli (TDGerFKGt-3)균주의 배양액의 HPLC, LC/MS 및 ESI-MS/MS 결과, 잔류 시간 4.71분에서 질량(m/z+ 449.3)에서 3-O-알로실퀘세틴의 피크가 확인되었다(도 5). 추가 확인을 위하여, ESI-MS/MS 분석 결과, 페어런츠 질량 (m/z+ 449.3)은 알로실 부분 및 아글리콘의 손실이 확인되었다(m/z+303.03) (도 10).
실시예 3: 람노실 플라보노이드 생산의 최적화
람노실 플라보노이드의 생산 수준을 최적화 시키기 위하여, 적당량의 탄소원, 글루코오스, 아라비노오스, 및 글리세롤을 각각의 배양에 첨가하였으며, 아라비노오스를 첨가하였을때, 공정조작된 효소의 발현 수준을 증가시키는 것을 확인하였다(도 9의 c).
0~500mg의 아라비노오스를 배양 시간 간격을 달리하여 첨가하여 분석하였다. 최적 밀도는 12시간 간격으로 첨가하는 것이었다. 최적 성장은 퀘세틴 첨가의 경우, OD600=2.2이고, 캠페롤 첨가의 경우 OD600=2.45이며, 300mg/mL L-아라비노오스 첨가 시에 48시간 배양하였을 때이었다(도 11).
300mg/mL의 아리비노오스를 첨가하고, 48시간 배양 하였을 때, 24.04mg/L 3-O-람노실 퀘세틴 및 12.9mg/L 3-O-람노실 캠페롤의 최대생산량을 확인하였다 (도 12).
당화 플라보노이드의 생산은 배양 12시간 후부터 관찰되었으며, 최대 수준은 48시간 배양 후에 관찰되었다(도 12).
공정조작된 효소의 발현 유도를 위하여 첨가하는 IPTG의 농도에 따른 최적 조건을 확인한 결과, 0.3mM의 IPTG를 첨가하였을 때, 최대 수준의 생산량을 확인할 수 있었다 (도 13).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Sunmoon University Cooperation Foundation <120> Method for preparing Ramnosyl Flavonoid Using Recombinant Strain <130> P10-B102 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggatcctatg aaggctctcg tgctgtccg 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aagctttcat gtgtggatct gcaccttgc 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agatcttatg aagatactta ttactggcgg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgagatatct tactggcgtc cttcatagtt 30 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatccaatgg agttactcga cgtcgacg 28 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aagctttcac gggccggtcc cacgccggc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatatcaatg agatggctga tcaccggcg 29 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctcgagtcat gctgctcctc gccgggtcgg t 31 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggatccaatg acagtcatac ctgccgacg 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aagctttcag ctggagcgtc tccagtagg 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gatatcaatg actgctgatc gctgggccg 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctcgagtcag cgcttgtgaa ggcggtacc 29 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agcgaattca tgaccaaatt ctccgag 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agcctcgagc taaactttca caatttc 27

Claims (6)

  1. 포도당으로부터 glucose-1-phosphate 생성능을 가지는 미생물에 TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase를 코딩하는 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자 및 TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물.
  2. 제1항의 TDP-L-람노스 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 TDP-L-람노스를 분리하는 단계를 포함하는 TDP-L-람노스의 제조방법.
  3. 포도당으로부터 glucose-1-phosphate 생성능을 가지는 미생물에 TDP-glucose synthase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4, 6-dehydratase를 코딩하는 유전자, TDP-4-keto-6-deoxyglucose 3, 5-epimerase를 코딩하는 유전자, TDP-glucose 4-ketoreducase를 코딩하는 유전자 및 글리코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물.
  4. 제3항의 람노실 플라보노이드 생산능을 가지는 재조합 미생물을 플라보노이드를 함유하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 및 배양액에서 람노실 플라보노이드를 분리하는 단계를 포함하는 람노실 플라보노이드의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 플리보노이드는 3-하이드록시 플라보노이드인 것을 특징으로 하는 람노실 플라보노이드의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 3-하이드록시 플라보노이드는 퀘세틴(Quercetin), 켐페롤(kaempferol), 피세틴(fisetin) 및 미리세틴(myricetin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 람노실 플라보노이드의 제조방법.
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