KR100251392B1 - 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법 - Google Patents

트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100251392B1
KR100251392B1 KR1019980002399A KR19980002399A KR100251392B1 KR 100251392 B1 KR100251392 B1 KR 100251392B1 KR 1019980002399 A KR1019980002399 A KR 1019980002399A KR 19980002399 A KR19980002399 A KR 19980002399A KR 100251392 B1 KR100251392 B1 KR 100251392B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ctg
gcc
ggc
atc
gag
Prior art date
Application number
KR1019980002399A
Other languages
English (en)
Other versions
KR19990029104A (ko
Inventor
이광호
김창겸
이진호
전영중
송은경
이세영
Original Assignee
손경식
제일제당주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 손경식, 제일제당주식회사 filed Critical 손경식
Priority to KR1019980002399A priority Critical patent/KR100251392B1/ko
Priority claimed from PCT/KR1999/000131 external-priority patent/WO2000056868A1/en
Publication of KR19990029104A publication Critical patent/KR19990029104A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100251392B1 publication Critical patent/KR100251392B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 전환 활성을 나타내는 신규한 트레할로오스 신테이즈 (Trehalose Synthase) 단백질, 이를 암호화한 신규한 유전자, 이 유전자를 포함한 신규한 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드로 형질전환된 신규한 대장균에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기된 본 발명의 형질전환 대장균을 이용하여 말토오스로부터 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법(Trehalose Synthase Protein and Gene, and a Process for Producing trehalose Using the Same)
본 발명의 목적은 말토오스로부터 트레할로오스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 보다 특정적으로는, 본 발명의 목적은 말토오스를 트레할로오스로 효율적으로 전환시켜줄 수 있는 새로운 효소의 암호화 유전자를 개발하여 이를 유전공학적으로 이용하여 트레할로오스를 경제적이면서 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
트레할로오스는 두 분자의 포도당이 α-1,1 결합으로 이루어진 비환원성 이당류 (α-D-글루코피라노실과 α-D-글루코피라노시드)로서 세균, 효모, 식물체에 자연적으로 존재하여 동결, 건조 및 고 삼투압 조건에서 생체막을 보호하는 기능을 가지고 있다. 또한, 비환원성 당질이기 때문에 단백질, 아미노산, 기타 일반 생물제제와 화학반응(갈변화)을 하지 않는 특성을 갖고 있으며 산성에서도 안정하기 때문에 백신, 호르몬, 혈액, 항체 등의 생물제제의 안정성을 높이는 첨가제로써 사용가능하며 식품 건조시나 가공식품 제조시 방향성분(flavor compound)의 잔류량을 증가시켜주며 본래의 신선한 식품특성을 유지시켜주기 때문에 분말우유, 커피, 과일음료, 냉동쥬스 농축액 그리고 야채쥬스 등의 품질을 획기적으로 향상시켜 줄 수 있는 식품 첨가물로서 응용이 가능하다. 이와 같이 의약용, 식품용, 화장품용 등 그 잠재적 응용범위가 대단히 광범위하지만 현재까지는 경제적인 대량생산 방법이 개발되지 않아 가격이 고가이기 때문에 그 사용 용도가 대단히 제약되어 있다.
종래에 알려진 트레할로오스의 제조방법으로는 미생물균체를 이용하여 효모로부터 추출하여 얻는 방법(일본국특허 공개 평5-91890 및 공개 평6-145186)과 아트로박터속(T. Suzuki, Agric. Biol. Chem., 33(2), 1969), 노카디아속(일본국특허 공개 소50-154485), 마이크로코커스(일본국특허 공개 평6-319578) 및 아미노산 발효균주인 브레비박테리움속(일본국특허 공개 평5-211882)과 같은 미생물의 발효 배양액에서 트레할로오스를 분리 정제하는 방법이 있다. 또한, 포도당을 트레할로오스로 전환하는 세균의 유전자를 식물에 도입한 재조합 식물 이용 방법(M. Scher, Food Processing, April, 95∼96, 1993)등이 있으며 효소를 이용한 방법으로써 말토오스 포스포릴라아제(maltose phosphorylase)와 트레할로오스 포스포릴라아제 (trehalose phosphorylase)를 조합하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 방법(일본국특허 공개 83-216695)등이 있으나 위 방법들은 모두 수율이 낮거나 공정이 번잡한 단점을 가지고 있다. 이외에 최근 발표된 효소공법으로서 말토올리고실 트레할로오스 신테이즈(maltooligosyl trehalose synthase)와 말토올리고실 트레할로오스 트레할로하이드로레이즈(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase)를 사용하여 전분으로부터 트레할로오스를 생산하는 2 단계 효소전환공법(일본국특허 공개 평7-143876 및 EPO 628 630 A2)과 트레할로오스 신테이즈를 이용하여 말토오스로부터 트레할로오스를 직접 생산하는 1 단계 효소전환 공법(일본국특허 공개 평7-170977 및 대한민국특허 공개번호 95-3444)이 있다. 위 두 가지 트레할로오스 제조방법이 경제적인 공법이 되기 위해서는 효소 역가를 극대화하여 가장 경제적인 가격으로 반응시간 및 전이율을 증가시켜 트레할로오스를 생산하는 것이 가장 중요한 해결과제이다.
본 발명자들은 수년간 토양으로부터 말토오스를 트레할로오스로 전환하는 능력을 가진 미생물을 선별하여 왔으며 그 중 트레할로오스 합성능이 우수하며 기존의 트레할로오스 합성 미생물과는 달리 효소 반응 부산물이 전혀 없는 미생물을 분리 동정하였다. 그 결과 형태학적 특성 및 생리학적 특성상 슈도모나스 스튜트제리종인 것으로 확인하고 이 균주를 슈도모나스 스튜트제리 CJ38로 명명하여 한국종균협회에 1997년 9월 22일에 수탁번호 KFCC-10985로 기탁하였다.
본 발명자들은 트레할로오스 신테이즈 효소를 대량 발현하기 위하여 슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (KFCC-10985)로부터 염색체를 분리하여 제한효소인 Sau3AI과 공지된 벡터 pUC18을 이용하여 트레할로오스 신테이즈 유전자를 클로닝하고 이 유전자의 염기서열을 분석한 결과 유전자의 염기서열 및 이로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열이 지금까지 공지되어 있는 것과는 상이한 새로운 유전자 및 단백질임을 확인하고, 그 유전자를 적절한 벡터와 숙주로서 대장균을 통해 트레할로오스 신테이즈 효소를 대량 생산할 수 있음으로써 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pCJ104내 4.7kb Sau3AI 절편의 DNA 염기서열 및 이로부터 발현된 본 발명에 따른 트레할로오스 신테이즈 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 트레할로오스 신테이즈 유전자를 포함한 신규한 재조합 플라스미드 pCJ104의 작제도이다.
도 3은 본 발명의 신규한 재조합 플라스미드 pCJ104내 4.7kb Sau3AI 절편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 말토오스를 함유한 맥콘키(MacConkey) 한천 배지에서 본 발명의 재조합 플라스미드 pCJ104 및 대조 플라스미드 pUC18을 각각 함유한 대장균 ATCC 35467 균주의 군락색깔을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pCJ122의 작제도이다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 신규한 트레할로오스 신테이즈 단백질에 관한 것이다:
M S I P D N T Y I E W L V S Q S M L H A A R E R S R H Y A G Q A R L W Q
R P Y A Q A R P R D A S A I A S V W F T A Y P A A I I T P E G G T V L E
A L G D D R L W S A L S E L G V Q G I H N G P M K R S G G L R G R E F T
P T I D G N F D R I S F D I D P S L G T E E Q M L Q L S R V A A A H N A
I V I D D I V P A H T G K G A D F R L A E M A Y G D Y P G L Y H M V E I
R E E D W E L L P E V P A G R D S V N L L P P V V D R L K E K H Y I V G
Q L Q R V I F F E P G I K D T D W S V T G E V T G V D G K V R R W V Y L
H Y F K E G Q P S L N W L D P T F A A Q Q L I I G D A L H A I D V T G A
R V L R L D A N G F L G V E R R A E G T A W S E G H P L S V T G N Q L L
A G A I R K A G G F S F Q E L N L T I D D I A A M S H G G A D L S Y D F
I T R P A Y H H A L L T G D T E F L R M M L R E V H A F G I D P A S L I
H A L Q N H D E L T L E L V H F W T L H A Y D H Y H Y K G Q T L P G G H
L R E H I R E E M Y E R L T G E H A P Y N L K F V T N G V S C T T A S V
I A A A L N I R D L D A I G P A E V E Q I Q R L H I L L V M F N A M Q P
G V F A L S G W D L V G A L P L A P E Q V E H L M G D G D T R W I N R G
G Y D L A D L A P E A S V S A E G L P K A R S L Y G S L A E Q L Q R P G
S F A C Q L K R I L S V R Q A Y D I A A S K Q I L I P D V Q A P G L L V
M V H E L P A G K G V Q L T A L N F S A E P V S E T I C L P G V A P G P
V V D I I H E S V E G D L T D N C E L Q I N L D P Y E
또한, 본 발명은 하기 염기서열을 갖는 신규한 트레할로오스 신테이즈 암호화 유전자에 관한 것이다:
ATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC ATG CTG
CAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG CGT CTC TGG CAG
CGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC GCC ATC GCC TCG GTG TGG
TTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAG
GCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGC
ATC CAC AAC GGG CCG ATG AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACC
CCG ACC ATC GAC GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTG
GGG ACC GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCC
ATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC TTC CGC
CTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC ATG GTG GAA ATC
CGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG GCC GGG CGT GAT TCG GTC
AAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGC
CAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGC
GTC ACC GGC GAG GTC ACC GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTG
CAC TAC TTC AAG GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCC
GCG CAG CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCC
CGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC GCC GAG
GGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC AAC CAG CTG CTC
GCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC CAG GAG CTG AAC CTG ACC
ATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTC
ATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTG
CGC ATG ATG CTG CGC GAA GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATC
CAT GCG CTG CAG AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACG
CTG CAC GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CAC
CTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA CAC GCG
CCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC ACC GCC AGC GTG
ATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC ATC GGC CCG GCC GAG GTG
GAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCC
GGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCC
GAG CAG GTC GAG CAC CTG ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGC
GGC TAT GAC CTC GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTG
CCC AAG GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGC
TCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC GAC ATC
GCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG GGA CTC CTG GTG
ATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG CTC ACG GCA CTG AAC TTC
AGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCG
GTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAG
CTG CAG ATC AAC CTC GAC CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCC
GCG CCG CCG GTG ATC TGA GCGC
본 발명은 도 1에 나타낸 4.7kb Sau3AI DNA 절편을 도 2에 도시된 바와 같이 벡터 플라스미드 pUC18에 함유하여 트레할로오스 신테이즈 단백질을 고역가로 발현하는 재조합 플라스미드 pCJ104에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ104로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 숙주로서 이. 콜라이 ATCC 35467을 사용하여 형질전환된 본 발명의 신규한 균주 이. 콜라이 ATCC 35467/pJC104는 한국종균협회에 1997년 9월 22일에 기탁되어 수탁번호 KFCC-10986을 부여받았다.
또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ104의 2.5kb BamHI-BglII DNA 절편을 벡터 플라스미드 pUC18에 함유하여 트레할로오스 신테이즈 단백질을 고역가로 발현하는 재조합 플라스미드 pCJ122에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ122로 형질전환된 대장균에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기된 플라스미드 pCJ104로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 회수하며 균체를 분쇄하고 원심분리하여 상등액을 이 상등액을 직접 말토오스 용액과 반응시키거나 상기 상등액을 통상적인 정제공정을 수행하여 순수한 트레할로오스 신테이즈 효소를 분리한 후 이 효소로 말토오스 용액을 처리하여 말토오스를 트레할로오스로 전환시킴을 특징으로하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기된 플라스미드 pCJ122로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 회수하며 균체를 분쇄하고 원심분리하여 상등액을 이 상등액을 직접 말토오스 용액과 반응시키거나 상기 상등액을 통상적인 정제공정을 수행하여 순수한 트레할로오스 신테이즈 효소를 분리한 후 이 효소로 말토오스 용액을 처리하여 말토오스를 트레할로오스로 전환시킴을 특징으로하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 여러 다양한 제한효소를 사용하여 본 발명의 재조합 플라스미드 pCJ104의 유전자 제한효소 지도를 작성하였다. 현재 공지된 트레할로스 신테이즈 유전자서열은 2개(Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32)로 이들의 유전자 제한효소 지도와 비교 분석한 결과, 본 발명자들이 개발한 pCJ104가 기존에 밝혀진 제한효소 지도와는 전혀 상이한 패턴을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명에서 클로닝하여 얻은 트레할로오스 신테이즈 효소의 N-말단 서열과 대한민국 특허 공개번호 95-3444에 기재된 효소의 N-말단을 비교한 결과 서열의 유사성이 전혀 없는 것으로 밝혀졌으며, 게다가 공지의 미생물에서 얻은 효소의 N-말단 사이에서는 서열의 유사성이 있으나 이들 공지 효소중 어느 것도 본 발명의 효소와는 서열의 유사성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이의 서열비교 결과는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.
또한, 본 발명의 신규한 트레할로오스 신테이즈 효소는 문헌(Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3) 및 (Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32)에 기재된 효소와 전체서열을 비교해 보아도 서열의 유사성이 없음이 확인되었다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 플라스미드 pCJ104 또는 pCJ122를 포함한 형질전환체를 배양하여 세포파쇄 후 효소전환 반응을 실시한 결과 모균주인 슈도모나스 스튜트제리의 트레할로오스 신테이즈 효소보다 현저하게 증폭된 효소역가를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 사용 및 제조된 플라스미드 및 균주의 특성 및 입수방법은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
트레할로오스 신테이즈 효소의 N-말단 서열
균주 및 플라스미드 특성 입수방법
슈도모나스스튜트제리 CJ38 트레할로오스 신테이즈 효소 함유한야생균주 KFCC-10985
대장균 NM522 hsd△5, △(lac-pro) [F', Pro+, lacIqZ △M15] Amersham
대장균 ATCC35467 [malP,Q::Tn5 ompBCS1 F-araD139△(arg F-lac) 205U169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25] ATCC
pCJ104 pUC18에 4.7kbSau3AI DNA 절편함유 (트 레할로오스 신테이즈 유전자), Apr 본발명
pCJ121 pUC18에 3.35kbKpnI DNA 절편함유 (트 레할로오스 신테이즈 유전자), Apr 본발명(대조군)
pCJ122 pUC18에 2.5kbBamHI-BglII DNA 절편함 유(트레할로오스 신테이즈 유전자), Apr 본발명
pCJ123 pUC18에 1.2kb BamHI-EcoRI DNA 절편함유 본발명(대조군)
pUC18 및 pUC19 Apr, 2.7kb New EnglandBiolabs
슈도모나스 스튜트제리의 배양시에는 영양 배지(0.3% 육즙, 0.5% 펩톤, pH 6.8)를, 대장균 배양시에는 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, pH 7.0)를, 전기장 충격법에 의한 형질전환 후 발현시에는 SOC배지(2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 포도당)를 각각 사용한다. 트레할로오스 생합성효소 유전자 클로닝용 배지로는 맥콘키(MacConkey) 한천배지(4% bacto MacConkey agar base, 2.0% 말토오스, pH 7.0)를 사용한다. 엠피실린은 50mg/L의 농도가 되도록 첨가한다. 전기장 충격법(electroporation)에 의한 대장균 형질전환에는 BIO-RAD사 제품의 진 펄서, 펄스조절기, 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳을 사용하였다. 본원에서 사용한 유전자 조작법은 주로 분자클로닝 실험 조작법(Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., Sambrook, J., E.F.Frisch, and T.Maniatis) 및 분자클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. vol. 152, Berger, S.L., A.R.Kimme) 등의 방법에 준하여 실시하였다.
본 발명에서의 효소반응은 pH 6.0 내지 11, 바람직하게는 7.0 내지 10이 적당하며, 반응 온도는 4 내지 45℃, 바람직하게는 20 내지 40℃가 적당하다. 기질농도는 말토오스 50%까지 사용할 수 있으며, 효소는 세포 파쇄액을 사용하거나 정제하여 사용할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 구체적으로 예시된다.
실시예 1
트레할로오스 신테이즈 유전자의 클로닝 (도 2)
(1) 슈도모나스 스튜트제리의 염색체 DNA의 분리
슈도모나스 스튜트제리를 초기 휴지기까지 영양배지에서 키운 뒤 원심분리하여 균체를 회수한 후 TE (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))용액으로 2회 세척하였다. 세척된 균체를 20mL의 STE 완충액 (20% 수크로즈, 10mM Tris (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))에 현탁한 후 5mg/mL의 리소자임과 RNase A를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 처리하였다. 반응이 끝난 후 SDS를 최종농도가 1% 되도록 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 최종 반응액은 동일 부피의 페놀을 4시간 동안 처리하고 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 4시간동안 처리하고 원심분리하여 다시 상등액을 얻었다. 이 상등액에 5M NaCl를 최종농도가 0.1M 되도록 첨가하고 2배 부피의 무수 에탄올을 처리하고 유리막대로 염색체 DNA를 얻었다. 얻은 DNA는 70% 에탄올로 세척한 후 TE 용액에 녹이고 이후 실험에 사용하였다.
(2) 유전자 라이브러리(genomic library)의 제조
슈도모나스 스튜트제리로부터 분리 정제된 염색체 DNA를 제한효소인 Sau3AI으로 37℃, 15 내지 30분간 부분 절단하고, 열처리하여 이 제한효소를 불활성화 시킨 뒤, 아가로스 겔에서 전기영동하고 3∼10kb 크기의 DNA 절편을 취하였다. 이를 Gene-Clean II kit 를 사용하여 3∼10kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 도 2에 나타낸 바와 같이 플라스미드 pUC18을 제한효소 BamHI으로 절단하고 송아지 장 포스파타제(calf intestinal phosphatase)를 처리한 뒤, 부분 절단한 3∼10kb 크기의 DNA 절편과 혼합하고 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)로 15℃에서 16시간 결합시킨 후 형질전환에 사용하였다. 형질전환은 아래 기술한 방법에 의해 전기장 충격법으로 행하였다. LB 배지에서 14 내지 15시간 배양한 대장균 NM522를 1L LB 배지에 초기 흡광도(600nm)가 0.07 내지 0.1 되게 접종한 뒤 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하였다. 이 균체를 원심분리한 후 1L의 HEPES〔N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N-(2-에탄설폰산)〕완충용액에 현탁하고 재차 원심분리하여 다시 500mL의 차가운 멸균 탈이온 증류수에 현탁하였다. 이를 다시 원심분리한 뒤 균체를 다시 20mL 10% 글리세롤에 현탁시키고 원심분리한 후 최종 2 내지 3mL의 10% 글리세롤 용액에 현탁하여 최종 균체 농도 2∼4×1010/mL로 조정하여 사용하였다. 이 세포 현탁액을 드라이아이스/에탄올로 급속 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하여 약 1개월간 형질전환 빈도의 감소없이 사용할 수 있었다. 나누어 보관된 세포 현탁액 40uL를 얼음 속에서 녹인 뒤 여기에 DNA 연결 혼합액을 가해 섞은 뒤 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳에 넣고 축전량(capacitance) 및 전기장의 세기를 25uF 및 12.5kV/cm에 고정하고 200 내지 400Ω의 저항에서 1회의 전기장 충격을 가했다. 전기장 충격 후 즉시 1mL의 SOC 배지를 넣어 섞은 뒤 37℃에서 1시간동안 배양후 LB-암피실린 한천 배지에 도말하여 24시간 배양하고 5만개 이상의 콜로니를 얻었다. 이들 콜로니들을 LB 브로쓰에 함께 2시간동안 배양한 후 알카리 용균방법으로 DNA를 분리 정제하여 유전자 라이브러리를 제작하였다.
(3) 트레할로오스 신테이즈의 유전자 클로닝
상기 제작된 유전자 라이브러리를 말토오스를 탄소원으로 이용하지 못하는 대장균 ATCC35467에 전기장충격법을 이용하여 형질전환하고 말토오스(20g/L)를 함유한 맥콘키-암피실린 한천 배지에 도말하였다. 본 클로닝 시스템은 유전자 클로닝에 의해서 슈도모나스 스튜트제리의 트레할로오스 신테이즈 유전자가 대장균에 도입되면 말토오스가 대장균내에 존재하는 트레할레이즈에 의해 포도당으로 전환된 후 대사되어 pH가 저하되면 맥콘키 한천 배지의 콜로니의 색깔이 노란색에서 붉은색으로 변화되는 점을 이용한 것이다. 이러한 원리를 이용하여 유전자 라이브러리를 대장균 ATCC35467에 형질전환시킨 후 맥콘키 한천 배지에서 붉은 색을 나타내는 콜로니를 획득하였다(도 3). 플라스미드 DNA를 분리한 결과 약 4.7kb의 DNA 단편이 함유되었음을 확인하고 플라스미드 pCJ104라 명명하였다. 효소분석을 하기위해서 대장균 ATCC35467/pUC18 (대조균주), 대장균 ATCC35467/pCJ104 및 슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (유전자원 야생균주)를 배양하였다. 대장균의 경우 LB배지에서, 슈도모나스 스튜트제리의 경우 영양 배지에서 각각 초기 휴지기까지 세포를 키운 후 원심분리하여 균체를 분리한뒤 세포파쇄하여 효소원으로 이용하였다. 효소반응 조건은 기질농도는 20% 말토오스를, 완충액은 20mM 디에탄올아민을, pH는 8.5 내지 9.0에서, 온도는 35℃를 선택하여 실시한 후 1.0% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 고압액체크로마토그라피(HPLC)로 말토오스 및 트레할로오스를 정량분석하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
효소역가분석
균주 비효소활성(U*/단백질 mg) 배양역가(U/배양액 ml)
슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (유전자원 균주) 0.1 0.023
이. 콜라이ATCC35467/pUC18 0 0
이. 콜라이ATCC35467/pCJ104(클로닝균주) 0.26 0.175
*U=umol 트리할로스/분
실시예 2
트레할로오스 신테이즈 유전자의 제한효소 지도제작 (도 4)
통상의 방법으로 플라스미드 pCJ104를 분리한 후 여러 가지 제한효소를 이용하여 대략적인 제한효소지도를 작성하였다.
pCJ104 DNA를 AatII, BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV, KpnI, NcoI, NdeI, PstI, SacI, SacII, SalI, SmaI, SphI, XhoI등 약 20여 가지의 제한효소를 이용하여 단일절단법(single-digest procedure) 이중절단법(double-digest procedure) 또는 삼중절단법을 실시한 후 0.7% 및 1.5%의 아가로스 겔에서 각각 전기영동하고 상호 비교분석하여 대략적인 제한지도를 작성하였다(도 4).
실시예 3
트레할로오스 신테이즈 유전자의 서브클로닝 및 효소분석
(1) 트레할로오스 신테이즈 유전자의 서브클로닝 (도 5)
플라스미드 pCJ104의 4.7kb 중에서 어느 부위가 트레할로오스 신테이즈 유전자가 위치하는지를 확인하기 위해서 서브클로닝을 실시하였다. 먼저 제한효소 KpnI으로 절단하여 3.35kb 절편을 분리 정제후 벡터 pUC18/KpnI/CIP 와 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pUC18/KpnI에 정방향으로 들어간 pCJ121을 제작하였다. 한편 제한효소 BamHI 및 BglII로 이중절단하여 2.5kb BamHI-BglII 절편을 분리, 정제한후 벡터 pUC18/BamHI/CIP에 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pUC18/BamHI에 정방향으로 들어간 pCJ122을 제작하였다. 마지막으로, 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 이중절단하여 1.2kb BamHI-EcoRI 절편을 분리, 정제한 후 벡터 pUC18/BamHI/EcoRI과 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pCJ123을 제작하였다.
상기에서 제작한 플라스미드들을 각각 대장균 ATCC35467에 형질전환시킨 후 실시예 1의 방법에서와 같이 2.0% 말토오스를 함유한 맥콘키-암피실린 한천배지에 도말하여 콜로니의 색변화를 확인한 결과 플라스미드 pCJ121 및 pCJ122를 각각 함유한 대장균 ATCC35467은 붉은색을 나타냈지만 pCJ123을 함유한 대장균 ATCC35467은 말토오스를 분해하지 못해서 콜로니 색깔이 노란색을 나타내었다(표 4). 따라서, 도 5에서 나타낸 유전자 제한효소 지도중에서 1.2kb의 BamHI-EcoRI 절편보다는 큰 2.5kb의 BamHI-BglII 절편내에 트레할로오스 신테이즈 효소를 암호화한 유전자가 존재함을 알 수 있다.
2.0% 말토오스를 함유한 맥콘키-암피실린 한천 배지에서의 콜로니 색 변화
균주 맥콘키-암피실린 한천+말토오스 20g/l
이. 콜라이 ATCC35467/pCJ121 붉은색 콜로니
이. 콜라이 ATCC35467/pCJ122 붉은색 콜로니
이. 콜라이 ATCC35467/pCJ123 노란색 콜로니
(2) 서브클로닝된 플라스미드를 함유한 미생물의 트레할로오스 신테이즈 효소역가분석
상기에서 제작한 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ121, 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122 및 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ123을 LB-Ap배지에서 초기 휴지기까지 배양후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액으로 두차례 세척한 후 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액에 현탁하여 초음파 균체분쇄기로 균체를 분쇄하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액의 적당량을 트레할로오스 신테이즈 반응액(20%말토오스, 20mM 디에탄올아민, pH 8.5-9.0)에 첨가하여 35℃에서 반응시킨 뒤 1.0% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 HPLC로 분석하였다. 1단위 효소 활성은 1분당 1umol의 트레할로오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 이의 결과는 표 5에 기재하였다.
이중 효소역가분석에서 가장 강력한 효소역가를 나타내는 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122을 선별하여 5-L 발효조에서 표 6에 기재된 조건으로 고밀도 배양을 하였다. 그 결과 비효소활성은 LB배지에서 배양했을 때와 거의 같은 5.0 U/mg 단백질이였으며 고밀도배양에 의해서 효소의 배양역가는 30U/배양액ml로 증가하였다 (표 5). 실시예 1에서 명기한 슈도모나스 스튜트제리의 비효소활성 및 배양역가와 비교하면 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122는 슈도모나스 스튜트제리에 비해 비효소활성은 50배, 배양역가는 약 1300배 증가하였다.
서브클로닝된 플라스미드를 함유한 미생물의 트레할로오스 신테이즈 효소역가분석
균주 비효소활성(U/mg 단백질) 5-L 발효조에서의 배양역가(U/배양액 ml)
이. 콜라이ATCC35467/pCJ121 0.43 -
이. 콜라이ATCC35467/pCJ122 4.95 30
이. 콜라이ATCC35467/pCJ123 0 -
5-L 발효조 발효배지 및 배양조건
발효배지 (g/l) 배양조건
글리세롤 50 pH 7.0
(NH4)2SO4 6 온도 33℃
KH2PO4 2 800 rpm
MgSO47H2O 1 1.0 vvm
효모추출액 5
미량원소 1 ml
아미노산 (쓰레오닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 히스티딘, 아르기닌) 0.5
슈도모나스 스튜트제리로 유래된 본 발명의 신규한 트레할로오스 신테이즈 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 플라스미드 및 형질전환된 대장균은 트레할로오스 신테이즈의 발현정도가 탁월함이 명백하며 이 대장균의 추출액 또는 순수하게 정제된 신규한 트레할로오스 신테이즈 효소를 이용함으로써 말토오스로부터 간편하면서도 높은 수율로 트레할로오스를 생산할 수 있음으로 본 발명이 산업적으로 유용함은 자명하다.

Claims (4)

  1. 하기 아미노산 서열의 트레할로오스 신테이즈 단백질:
    M S I P D N T Y I E W L V S Q S M L H A A R E R S R H Y A G Q A R L W Q
    R P Y A Q A R P R D A S A I A S V W F T A Y P A A I I T P E G G T V L E
    A L G D D R L W S A L S E L G V Q G I H N G P M K R S G G L R G R E F T
    P T I D G N F D R I S F D I D P S L G T E E Q M L Q L S R V A A A H N A
    I V I D D I V P A H T G K G A D F R L A E M A Y G D Y P G L Y H M V E I
    R E E D W E L L P E V P A G R D S V N L L P P V V D R L K E K H Y I V G
    Q L Q R V I F F E P G I K D T D W S V T G E V T G V D G K V R R W V Y L
    H Y F K E G Q P S L N W L D P T F A A Q Q L I I G D A L H A I D V T G A
    R V L R L D A N G F L G V E R R A E G T A W S E G H P L S V T G N Q L L
    A G A I R K A G G F S F Q E L N L T I D D I A A M S H G G A D L S Y D F
    I T R P A Y H H A L L T G D T E F L R M M L R E V H A F G I D P A S L I
    H A L Q N H D E L T L E L V H F W T L H A Y D H Y H Y K G Q T L P G G H
    L R E H I R E E M Y E R L T G E H A P Y N L K F V T N G V S C T T A S V
    I A A A L N I R D L D A I G P A E V E Q I Q R L H I L L V M F N A M Q P
    G V F A L S G W D L V G A L P L A P E Q V E H L M G D G D T R W I N R G
    G Y D L A D L A P E A S V S A E G L P K A R S L Y G S L A E Q L Q R P G
    S F A C Q L K R I L S V R Q A Y D I A A S K Q I L I P D V Q A P G L L V
    M V H E L P A G K G V Q L T A L N F S A E P V S E T I C L P G V A P G P
    V V D I I H E S V E G D L T D N C E L Q I N L D P Y E
  2. 하기 염기서열의 트레할로오스 신테이즈 암호화 유전자:
    ATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC ATG CTG
    CAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG CGT CTC TGG CAG
    CGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC GCC ATC GCC TCG GTG TGG
    TTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAG
    GCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGC
    ATC CAC AAC GGG CCG ATG AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACC
    CCG ACC ATC GAC GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTG
    GGG ACC GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCC
    ATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC TTC CGC
    CTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC ATG GTG GAA ATC
    CGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG GCC GGG CGT GAT TCG GTC
    AAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGC
    CAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGC
    GTC ACC GGC GAG GTC ACC GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTG
    CAC TAC TTC AAG GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCC
    GCG CAG CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCC
    CGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC GCC GAG
    GGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC AAC CAG CTG CTC
    GCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC CAG GAG CTG AAC CTG ACC
    ATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTC
    ATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTG
    CGC ATG ATG CTG CGC GAA GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATC
    CAT GCG CTG CAG AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACG
    CTG CAC GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CAC
    CTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA CAC GCG
    CCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC ACC GCC AGC GTG
    ATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC ATC GGC CCG GCC GAG GTG
    GAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCC
    GGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCC
    GAG CAG GTC GAG CAC CTG ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGC
    GGC TAT GAC CTC GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTG
    CCC AAG GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGC
    TCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC GAC ATC
    GCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG GGA CTC CTG GTG
    ATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG CTC ACG GCA CTG AAC TTC
    AGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCG
    GTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAG
    CTG CAG ATC AAC CTC GAC CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCC
    GCG CCG CCG GTG ATC TGA GCGC
  3. 플라스미드 pCJ104의 2.5kb BamHI-BglII 절편을 벡터 플라스미드 pUC18에 함유하여 제1항의 트레할로오스 신테이즈 단백질을 고역가로 발현하는 재조합 플라스미드 pCJ122.
  4. 제3항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 회수하며 균체를 분쇄하고 원심분리한 후 이에 따라 형성된 상등액을 말토오스 용액과 직접 반응시키거나 상기 상등액을 통상적인 정제공정을 수행하여 순수한 트레할로오스 신테이즈 효소를 분리한 후 이 효소로 말토오스 용액을 처리하여 말토오스를 트레할로오스로 전환시킴을 특징으로하는 트레할로오스의 제조방법.
KR1019980002399A 1997-09-30 1998-01-26 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법 KR100251392B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019980002399A KR100251392B1 (ko) 1997-09-30 1998-01-26 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019970050562 1997-09-30
KR19970050562 1997-09-30
KR101997050562 1997-09-30
KR1019980002399A KR100251392B1 (ko) 1997-09-30 1998-01-26 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법
PCT/KR1999/000131 WO2000056868A1 (en) 1999-03-24 1999-03-24 Trehalose synthase protein, gene, plasmids, microorganisms, and a process for producing trehalose

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR19990029104A KR19990029104A (ko) 1999-04-26
KR100251392B1 true KR100251392B1 (ko) 2000-04-15

Family

ID=34830996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980002399A KR100251392B1 (ko) 1997-09-30 1998-01-26 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100251392B1 (ko)

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990029104A (ko) 1999-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230151347A1 (en) A genetically modified bacillus subtilis strain, optimized vectors, and uses thereof
KR20150059760A (ko) 3-에피메라아제
JPS6371183A (ja) ホスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用
US20030092143A1 (en) Enzymes and genes used for producing vanillin
US7553652B2 (en) Process for the preparation of (S)- or (R)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid
KR100427529B1 (ko) 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 재조합형 열안정성 효소
CN114196559A (zh) 甜菊醇糖苷转运
KR100395445B1 (ko) 환원성 전분당으로부터 비환원성 당질을 생성하는 재조합 열안정성 효소
KR101083974B1 (ko) 캔디다 유틸리스 기원의 글루타티온 신테타제 암호화 유전자
KR100356926B1 (ko) 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의제조법
KR101669041B1 (ko) 스테비오사이드 생산능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스테비오사이드의 생산 방법
JP3650632B2 (ja) マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素
KR100251392B1 (ko) 트레할로오스 신테이즈 단백질 및 유전자, 및 이를 이용한 트레할로스의 제조방법
Nakano et al. Purification and some properties of a trehalase from a green alga, Lobosphaera sp.
US6800474B1 (en) Trehalose synthase protein, gene, plasmids, microorganisms, and a process for producing trehalose
KR20020022045A (ko) 유게놀 및 페룰라산 분해대사의 유전자를 특이적으로불활성화함으로써 치환된 페놀을 생성하기 위한 생산균주의 구축
EP0544250B1 (en) Gene coding for esterase and novel microorganism containing said gene
KR100380970B1 (ko) 아스로박터 유레아휘션스로부터 분리된 레반 프룩토트랜스퍼라제 및 이를 이용하여 레반으로부터 디프룩토스 디언하이드라이드 4를 생산하는 방법
EP0387067B1 (en) Novel recombinant DNA and method for production of physiologically active substance
KR100356927B1 (ko) 시스-3-히드록시-l-프롤린의제조법
US6916641B2 (en) (R)-2-hydroxy-3-phenylpropionate (d-phenyllactate) dehydrogenase and gene encoding the same
JP3557271B2 (ja) 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体
KR960007743B1 (ko) 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법
KR970005914B1 (ko) 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법
JP3358686B2 (ja) 新規なグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及び該遺伝子を用いたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20090109

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee