CN110381751A - 莱鲍迪苷e生物合成产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷d4 - Google Patents
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Abstract
在一些方面,本发明涉及通过使用莱鲍迪苷E产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4。在一些方面,本发明涉及突变体CP1酶、突变体HV1酶以及宿主细胞,和利用此类酶例如产生莱鲍迪苷D4的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月6日提交的美国临时申请号62/467,467的优先权,该申请的内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明的领域涉及可用于通过工程化为所选微生物的生物合成途径来产生特定甜菊醇糖苷的方法和工艺。更特别地,本披露涉及产生先前未知的莱鲍迪苷(rebaudioside)——可以通过酶促转化由莱鲍迪苷E(“Reb E”)合成的莱鲍迪苷D4(“RebD4”)。
背景技术
若干种甜菊醇糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶中发现的化合物,并且已经被广泛用作食品、饲料和饮料中的高强度、低热量甜味剂。这些天然存在的甜菊醇糖苷具有相同的碱二萜结构(甜菊醇骨架)),但在甜菊醇骨架的C13和C19位置上它们的碳水化合物残基修饰(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和结构不同。有趣地是,基础甜菊醇结构的糖‘装饰’中的这些变化显著且不可预料地影响单独的甜菊醇糖苷自身的特性。这些性状包括但不限于味道特征、结晶点、溶解度和感知甜度以及其他差异。具有已知结构的甜菊醇糖苷包括甜菊苷,莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M和杜克苷A。在商业用途方面,莱鲍迪苷M通常被认为是安全的(即,它具有‘GRAS’状态)并且正在研究用于食品和饮料市场的广泛用途。
基于干重,甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、和杜克苷A分别占野生型甜叶菊叶中的甜菊醇糖苷总重量的9.1%、3.8%、0.6%、和0.30%,而其他甜菊醇葡糖苷(例如Reb E)以低得多的量存在,其中Reb D4根本不存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购的,并且在此类提取物中甜菊苷和莱鲍迪苷A是最常见的主要组分。相比之下,其他已知的甜菊醇糖苷典型地作为次要或微量组分存在于甜叶菊提取物中。例如,莱鲍迪苷A在典型的商业制品中的量可以从总的甜菊醇糖苷含量的约20%至多于90%变化,其中莱鲍迪苷B的量是总甜菊醇糖苷的约1%-2%,莱鲍迪苷C的量可以是总甜菊醇糖苷的约7%-15%,并且莱鲍迪苷D的量可以是总甜菊醇糖苷的约2%。在此类提取物中,莱鲍迪苷M仅以极少量存在。有趣的是,莱鲍迪苷E也是甜叶菊植物品种中存在最少的甜菊醇糖苷之一,占存在的总糖苷的不到0.5%。
作为天然甜味剂,并且如上所述,不同甜菊醇糖苷中的每一种具有不同程度的甜度、‘口感’和与这些莱鲍迪苷相关的特定后味。相对于食糖(即“蔗糖”),甜菊醇糖苷的甜度显著更高。例如,甜菊苷比蔗糖甜100-150倍,但在多种味道测试中指出具有苦的后味;而莱鲍迪苷A和E比蔗糖甜250-450倍,并且后味特征比甜菊苷好得多。然而,这些甜菊醇糖苷自身仍然保持显著的后味。因此,通常已知甜菊提取物的味道特征深受提取物中多种甜菊醇糖苷的相对含量的影响,这反过来可能受到地下植物所经历的环境条件和所用提取方法的影响。植物产量、天气条件和提取条件的这些变化可导致甜味菊提取物中甜菊醇糖苷的组成不一致,使得不同批次的提取产物之间的味道特征变化很大。甜叶菊提取物的味道特征也可以受到提取方法后残留在产物中的植物来源的或环境来源的污染物(如色素、脂类、蛋白类、酚类和糖类)影响。这些污染物典型地具有其自身的异味,使得所得提取物不适合用于在消费品中使用。此外,分离甜叶菊提取物中不丰富的甜菊醇莱鲍迪苷的单独或特定组合的成本是花费和资源过高的。鉴于一些特定甜菊醇糖苷的质量和可用性有限,商业供应可以通过生物转化更好地解决,其中天然酶或特定微生物可以被修饰以携带所需的酶并使用商业上重要的发酵过程来特异性地增加目的糖苷的产生。例如,先前已经报道了通过使用修饰的微生物的发酵途径,甜菊苷到Reb E的生物转化(参见,Yu等人,美国申请号15/016,589,作为美国专利申请公开号US 2016/0207954公布)。可替代地,其他非生物合成手段可用于开发目的甜菊醇糖苷。
因此,需要作为商业产品开发的具有更好和更一致的味道特征的甜菊醇糖苷以及对于这种甜菊醇糖苷需要利用相对常见的起始底物(例如更丰富的甜菊醇糖苷)作为起始分子,以便产生理想的糖苷可以在商业上尽可能具有成本效益。
发明内容
本披露涵盖了例如在细胞系统中从Reb E产生Reb D4的方法。
特别地,当前披露提供了通过特定的UDP-糖基转移酶从Reb E产生甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D4“Reb D4”,其被鉴定为(13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯])。
当前方法提供了使用特定的合成途径用于合成特定甜菊醇糖苷的方法。
在一些方面,本披露提供了突变体CP1酶,该突变体CP1酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些方面,本披露提供了重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,重组多肽具有与如本文所述的突变体CP1酶(例如,包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的突变体CP1酶)相同或基本上相同的活性。
在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:8具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的核苷酸序列。在一些实施例中,核苷酸序列编码如本文所述的突变体CP1酶,例如包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的突变体CP1酶。
在一些方面,本披露提供了突变体CP1酶,该突变体CP1酶包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些方面,本披露提供了重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,重组多肽具有与如本文所述的突变体CP1酶(例如,包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的突变体CP1酶)相同或基本上相同的活性。
在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:10具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的核苷酸序列。在一些实施例中,核苷酸序列编码如本文所述的突变体CP1酶,例如包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的突变体CP1酶。
在一些方面,本披露提供了突变体HV1酶,该突变体HV1酶包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些方面,本披露提供了重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,重组多肽具有与如本文所述的突变体HV1酶(例如,包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的突变体HV1酶)相同或基本上相同的活性。
在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:12具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的核苷酸序列。在一些实施例中,核苷酸序列编码如本文所述的突变体HV1酶,例如包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的突变体HV1酶。
在一些方面,本披露提供了包含载体的宿主细胞,该载体能够产生具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的C1m2酶。在一些方面,本披露提供了包含载体的宿主细胞,该载体能够产生具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的C1m3酶。在一些方面,本披露提供了包含载体的宿主细胞,该载体能够产生具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的突变体HV1酶。在一些实施例中,宿主细胞选自下组,该组由以下组成:细菌、酵母、丝状真菌、蓝细菌藻类和植物细胞。在一些实施例中,宿主细胞选自下组,该组由以下组成:埃希氏杆菌属(Escherichia);沙门氏菌属(Salmonella);芽孢杆菌属(Bacillus);不动杆菌属(Acinetobacter);链霉菌属(Streptomyces);棒状杆菌属(Corynebacterium);甲基弯曲菌(Methylosinus);甲基单胞菌(Methylomonas);红球菌属(Rhodococcus);假单胞菌属(Pseudomonas);红杆菌属(Rhodobacter);集胞藻属(Synechocystis);酵母属(Saccharomyces);接合酵母属(Zygosaccharomyces);克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces);假丝酵母属(Candida);汉逊酵母属(Hansenula);德巴利氏酵母属(Debaryomyces);毛霉菌属(Mucor);毕赤酵母属(Pichia);球拟酵母属(Torulopsis);曲霉属(Aspergillus);Arthrobotlys;短杆菌属(Brevibacteria);微杆菌属(Microbacterium);节细菌属(Arthrobacter);柠檬酸杆菌属(Citrobacter);埃希氏杆菌属(Escherichia);克雷白氏杆菌属(Klebsiella);泛菌属(Pantoea);沙门氏菌棒状杆菌(Salmonella Corynebacterium);梭菌属(Clostridium);和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。在一些实施例中,宿主细胞是从选自下组的植物分离的细胞,该组由以下组成:大豆;油菜籽;向日葵;棉花;玉米;烟草;苜蓿;小麦;大麦;燕麦;高粱;稻;西兰花;花椰菜;卷心菜;欧洲防风草;甜瓜;胡萝卜;芹菜;香芹菜;番茄;马铃薯;草莓;花生;葡萄;草籽作物(grass seedcrop);甜菜;甘蔗;豆类;豌豆;黑麦;亚麻;阔叶树;针叶树;饲草(forage grasses);拟南芥;稻(水稻(Oryzasativa));野大麦(Hordeumyulgare);风倾草(switchgrass)(柳枝稷(Panicum vigratum));短柄草属物种(Brachypodium spp.);芸苔属物种(Brassica spp.);和海甘蓝(Crambe abyssinica)。
在一些方面,本披露提供了产生甜菊醇糖苷组合物的方法,该方法包括将底物与重组多肽一起孵育,该重组多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80%(例如,至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,重组多肽是与SEQID NO:7具有至少80%(例如,至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的UDP-糖基转移酶。在一些实施例中,底物选自下组,该组由以下组成:甜菊苷或莱鲍迪苷E及其组合。在一些实施例中,通过该方法产生的甜菊醇糖苷化合物是莱鲍迪苷D4,使得该甜菊醇糖苷组合物包含莱鲍迪苷D4。
在一些方面,本披露提供了产生莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括将底物与重组多肽一起孵育,该重组多肽包含与SEQ ID NO 7具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,底物选自下组,该组由以下组成:Reb E、甜菊苷、及其组合。在一些实施例中,方法进一步包括将重组蔗糖合酶与底物和重组多肽一起孵育。
在一些方面,本披露提供了用于从莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括:(a)制备包含莱鲍迪苷E、选自下组的底物、和C1m2的反应混合物,该组由以下组成:蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖);以及(b)将该应混合物孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4,其中葡萄糖与莱鲍迪苷E共价偶联以产生莱鲍迪苷D4。在一些实施例中,方法进一步包括将蔗糖合酶添加至反应混合物中。在一些实施例中,蔗糖合酶选自下组,该组由以下组成:拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3和绿豆(Vigna radiate)蔗糖合酶。在一些实施例中,蔗糖合酶是拟南芥蔗糖合酶1。在一些实施例中,产生的Reb D4的纯度高于70%(例如,高于70%、高于75%、高于80%、高于85%、高于90%、高于91%、高于92%、高于93%、高于94%、高于95%、高于96%、高于97%、高于98%、高于99%、或100%)。在一些实施例中,方法进一步包括将HV1酶添加至反应混合物中。
在一些方面,本披露提供了用于从莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括:(a)制备包含莱鲍迪苷E、选自下组的底物、和C1m3的反应混合物,该组由以下组成:蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖);以及(b)将该应混合物孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4,其中葡萄糖与莱鲍迪苷E共价偶联以产生莱鲍迪苷D4。在一些实施例中,方法进一步包括将蔗糖合酶添加至反应混合物中。在一些实施例中,蔗糖合酶选自下组,该组由以下组成:拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3、和绿豆蔗糖合酶。在一些实施例中,蔗糖合酶是拟南芥蔗糖合酶1。在一些实施例中,产生的Reb D4的纯度高于70%(例如,高于70%、高于75%、高于80%、高于85%、高于90%、高于91%、高于92%、高于93%、高于94%、高于95%、高于96%、高于97%、高于98%、高于99%、或100%)。在一些实施例中,方法进一步包括将HV1酶添加至反应混合物中。
在一些方面,本披露提供了甜味剂,该甜味剂包含通过如上所述的方法或如本文其他方式所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物或甜菊醇糖苷。
在一些方面,本披露提供了GXT6酶,该GXT6酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些方面,本披露提供了重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90%(例如,至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,重组多肽具有与如本文所述的GXT6酶(例如,包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的GXT6酶)相同或基本上相同的活性。在一些方面,本披露提供了包含载体的宿主细胞,该载体能够产生具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的GXT6酶。
在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
在一些方面,本披露提供了CP1酶,该CP1酶包含SEQ ID NO:3。在一些方面,本披露提供了核酸,该核酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在一些方面,本披露提供了使用图9中所述的酶和底物、或其子集(例如,以甜菊苷、Reb E、或Reb D4开始和/或利用HV1、C1m2、C1m3、UGT76G1、CP1和/或CR1)产生Reb M的方法。在一些实施例中,使用含有图9中所述的酶和底物、或其子集(例如,以甜菊苷、Reb E、或Reb D4开始和/或利用HV1、C1m2、C1m3、UGT76G1、CP1和/或CR1)的体外反应混合物产生RebM。在一些实施例中,Reb M是在表达图9中所述的酶、或其子集(例如,HV1、C1m2、C1m3、UGT76G1、CP1和/或CR1)的细胞中体内产生,其中将该细胞与图14中所述的底物(例如,甜菊苷、Reb E、或Reb D4)一起孵育。在一些实施例中,细胞是酵母细胞。在一些实施例中,细胞是细菌细胞。在一些实施例中,细胞是植物细胞。
在产品/商业实用性方面,在美国市场上有几十种含有甜菊醇糖苷的产品,并且可以用于从镇痛药到驱虫剂以及食品和作为膳食补充剂的所有产品。含有甜菊醇糖苷的产品可以是气溶胶、液体、凝胶或颗粒配制品。
至于细胞系统,在一些实施例中,其选自下组,该组由以下组成:细菌、酵母及其组合,或任何允许用所选基因进行遗传转化并随后从甜菊醇生物合成产生所希望的甜菊醇糖苷的细胞系统。在最优选的微生物系统中,大肠杆菌用于产生所希望的甜菊醇糖苷化合物。
虽然本披露易有多种修饰和可替代的形式,但是其具体的实施例通过附图中的实例的方式显示并将在本文中详细描述。然而,应该理解的是,本文给出的附图和具体实施方式并非旨在将本披露限制于所披露的特定实施例,相反,其旨在覆盖落入由所附权利要求书限定的本披露的精神和范围内的所有修饰、等同物和替代物。
参考附图,在下文对本发明优选的实施例的具体实施方式中,本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示从Reb E产生Reb D4的甜菊醇糖苷生物合成途径。
图2显示通过C1m2和C1m3酶催化的Reb E体外产生Reb D4。A:显示莱鲍迪苷E(“RebE”)的标准品。B:显示莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)的标准品。在16小时通过C1m2(C)和C1m3(D)酶促产生Reb D4。
图3显示通过C1m2突变体产生的化合物的LC-MS分析。
图4显示通过C1m3突变体产生的化合物的LC-MS分析。
图5显示通过GXT6β-葡糖苷酶水解Reb D4、Reb E和Reb D。在16小时,通过GXT6β-葡糖苷酶水解Reb D4、Reb E和Reb D。A:显示莱鲍迪苷D(“Reb D”)、莱鲍迪苷M(“Reb M”)和莱鲍迪苷A(“Reb A”)的标准品。B:显示莱鲍迪苷E(“Reb E”)、莱鲍迪苷KA(“KA”)、甜菊苷(“ST”)、和甜茶苷(“Rub”)的标准品。C:显示莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)和Reb WB2(“WB2”)的标准品。D:显示莱鲍迪苷WB1(“WB1”)和Reb WB2(“WB2”)的标准品。E:显示Reb E的水解。F:D4的水解。G:显示Reb D的水解。
图6显示产生的化合物的水解以证实通过C1m2和C1m3突变体进行的Reb E到RebD4的生物转化。A:显示莱鲍迪苷D(“Reb D”)、莱鲍迪苷M(“Reb M”)和莱鲍迪苷A(“Reb A”)的标准品。B:显示莱鲍迪苷E(“Reb E”)、莱鲍迪苷KA(“KA”)、甜菊苷(“ST”)、和甜茶苷(“Rub”)的标准品。C:显示莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)和Reb WB2(“WB2”)的标准品。D:显示莱鲍迪苷WB1(“WB1”)和Reb WB2(“WB2”)的标准品。在16小时,通过C1m2(E)和C1m3(F)进行的RebE的生物转化。在16小时,通过GXT6水解产生的化合物。G:显示在C1m2反应中产生的化合物的水解。H:显示在C1m3反应中产生的化合物的水解。
图7显示通过Hv1和C1m2或C1m3酶的组合,从甜菊苷体外产生Reb D4。A:显示莱鲍迪苷D(“Reb D”)、莱鲍迪苷M(“Reb M”)和莱鲍迪苷A(“Reb A”)的标准品。B:显示莱鲍迪苷E(“Reb E”)和甜菊苷(“ST”)的标准品。C:显示莱鲍迪苷D4(“Reb D4”)的标准品。在16小时,通过HV1与C1m2(D)或C1m3(E)的组合产生Reb D4。
图8显示通过HV1与C1m2(A)或C1m3(B)的组合产生的Reb D4的LC-MS分析。
图9显示来自甜菊苷的Reb M的生物合成途径。
图10显示甜菊醇糖苷WB1的结构。
具体实施方式
本文使用的术语解释:
甜菊醇糖苷是一类化学化合物,甜菊醇糖苷是南美植物甜叶菊(菊科)叶有甜味的原因,并且可用作食品、饲料和饮料中的甜味剂。
定义:
细胞系统是提供异位蛋白质表达的任何细胞。它包括细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。它包括原核细胞和真核细胞。它还包括基于细胞组分例如核糖体的蛋白质的体外表达。
编码序列对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
培养细胞系统。培养包括提供允许细胞繁殖和分裂的适当培养基。它还包括提供资源以使细胞或细胞组分可以翻译和制备重组蛋白。
蛋白质表达。蛋白质产生可以在基因表达后发生。它由DNA转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后mRNA被翻译成多肽链,多肽链最终折叠成蛋白质。DNA通过转染存在于细胞中,转染是一种故意将核酸引入细胞的过程。该术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可以指其他方法和细胞类型,但其他术语是优选的:“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒DNA转移。在动物细胞中,转染是优选的术语,因为转化也用于指在这些细胞中发展成癌状态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒感染包括在本申请的转染定义下。
酵母。根据当前披露,酵母是真核的单细胞微生物,其被分类为真菌界的成员。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物,但是一些物种可用于当前披露,这些物种是那些能够通过形成称为伪菌丝或假菌丝的连接芽殖细胞串来发展多细胞特征的物种。
在本披露中所用的UGT酶的名称与UGT命名委员会采用的命名系统一致(Mackenzie等人,“The UDP glycosyltransferase gene super family:recommendednomenclature updated based on evolutionary divergence[UDP糖基转移酶基因超家族:基于进化分歧更新的推荐命名法]”Pharmacogenetics[遗传药理学],1997,第7卷,第255-269页),其通过家族数字、表示亚家族的字母和代表单独基因的数字的组合分类UGT基因。例如,名称“UGT76Gl”是指由属于UGT家族数字76(其是植物的起源)、亚家族G和基因数字l的基因编码的UGT酶。
结构术语:
如本文所用的,单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”包括复数指代,除非所述内容另外清楚地指示。
就在本说明书或权利要求中所用的术语“包括”、“具有”或等等来说,这种术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的,如“包含”在权利要求书中被用作过渡词时所解释的。
用语“示例性”在本文使用以意指“作为实例、情况或说明”。本文中被描述为“示例性”的任何实施例并不必须被解释为优选的或优越于其他实施例。
术语“互补”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于描述能够互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如,对于DNA来说,腺苷互补于胸腺嘧啶,胞嘧啶互补于鸟嘌呤。相应地,本主题技术也包括互补于如在所附的序列表中报道的完整序列以及那些实质上相似的核酸序列的分离的核酸片段。
术语“核酸”和“核苷酸”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定,该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,这些类似物具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外表明,特定的核酸序列也暗示涵盖其保守性修饰变体或简并变体(例如简并密码子置换)和互补序列,以及明确指示的序列。
术语“分离的”对本领域普通技术人员给出了它的普通的和惯常的意思,并且当被用在分离的核酸或分离的多肽的语境中时,其非限制性地用于指由人手脱离其原本环境而存在并因此不是天然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽能以纯化的形式存在或可以存在于非原本环境,例如转基因宿主细胞中。
如本文所用的,术语“孵育”意指混合两种或更多种化学或生物实体(例如化学化合物和酶)并使它们在有利于产生甜菊醇糖苷组合物的条件下相互接触的方法。
术语“简并变体”是指具有因一个或多个简并密码子置换而不同于参考核酸序列的残基序列的核酸序列。简并密码子置换可以通过生成其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列实现。核酸序列和其所有的简并变体会表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思;这三个术语有时互换使用,并且非限制性地用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物,无论其大小或功能。虽然“蛋白质”通常用于指相对大的多肽,而“多肽”通常用于指小的多肽,但本领域中这些术语的用法重叠并且是变化的。如本文所用的,术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质,除非另外注明。当指代多核苷酸产物时,术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此,示例性多肽包括多核苷酸产物、天然存在的蛋白质及其同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和其他等同物、变体以及前述物质的类似物。
当用于指参考多肽时,术语“多肽片段”和“片段”对本领域普通技术人员给出了它们普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指与参考多肽本身相比其中氨基酸残基缺失而剩余氨基酸序列通常与参考多肽上的相应位置相同的多肽。此类缺失可以发生在该参考多肽的氨基末端或羧基末端,或作为另外一种选择同时在这两处发生。
术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指这样的肽片段,其是全长多肽或蛋白质的一部分,并且具有与全长多肽或蛋白质基本上相同的生物活性,或执行基本上相同的功能(例如,进行相同的酶促反应)。
可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”是指这样的氨基酸序列,其例如通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加而与参考多肽有一个或多个氨基酸不同。在一方面,变体是保持了参考多肽的部分或全部能力的“功能变体”。
术语“功能变体”进一步包括经保守置换的变体。术语“经保守置换的变体”是指这样的肽,其由于一个或多个保守氨基酸置换而具有不同于参考肽的氨基酸序列,并且保持了该参考肽的部分或全部活性。“保守氨基酸置换”是用功能上相似的残基置换氨基酸残基。保守置换的实例包括:非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间的相互置换;带电荷或极性(亲水性)残基间的相互置换,如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间的相互置换;碱性残基如赖氨酸或精氨酸间的相互置换;或酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸间的相互置换;或芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸间的相互置换。预计此类置换对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点具有轻微影响或没有影响。短语“经保守置换的变体”还包括这样的肽,其中残基被化学来源的残基所替换,前提条件是所得到的肽保持如本文所述的参考肽的部分或全部活性。
术语“变体”,结合主题技术的多肽,进一步包括功能活性多肽,该功能活性多肽具有与参考多肽的氨基酸序列至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%相同的氨基酸序列。
术语“同源”以其所有语法形式和拼写变化是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系,包括来自超家族的多核苷酸或多肽以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人,Cell[细胞]50:667,1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性,正如其序列相似性所反映的,无论是在百分比同一性方面或是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如,两个同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少900%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%相同的氨基酸序列。
“合适的调控序列”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思,并且非限制地用于指位于编码序列的上游(5’-非编码序列)、之内或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列,并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思,并且非限制地用于指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常,编码序列位于启动子序列的3’。启动子可整个来源于天然基因,或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成,或甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应理解的是不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或应答不同的环境条件的表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到,由于在大多数情况下,调控序列的准确界限尚未完全定义,所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列间的关联,使得其中一个的功能受到另一个的影响。例如,当启动子可以影响编码序列的表达时,则该启动子与该编码序列可操作地连接(即,该编码序列处于该启动子的转录控制之下)。编码序列能以有义或反义取向被可操作地连接至调控序列。
如本文所用的,“表达”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指来源于本主题技术的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指基因产物在转基因或重组生物中的产量超过在正常或非转化生物体中的产生水平。
“转化”对本领域普通技术人员给出了它普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指将多核苷酸转移到靶细胞中。该被转移的多核苷酸可以被并入靶细胞的基因组或染色体DNA中,得到基因上稳定的遗传,或其可以独立于宿主染色体而复制。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因的”或“转化的”生物。
当在本文中与宿主细胞连用时,术语“转化的”、“转基因的”以及“重组的”对本领域普通技术人员给出了它们各自的普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指已经向其中引入异源核酸分子的宿主生物的细胞,例如植物或微生物细胞。核酸分子可以被稳定地整合到宿主细胞的基因组中,或核酸分子可以作为染色体外的分子存在。这种染色体外的分子可以是自主复制的。经转化的细胞、组织或主题应当被理解为不仅涵盖转化过程的最终产物,还涵盖其转基因子代。
当在本文中与多核苷酸连用时,术语“重组的”、“异源的”以及“外源的”对本领域普通技术人员给出了它们普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指源于相对于特定宿主细胞为外来的多核苷酸(例如,DNA序列或基因)或如果来自相同来源,其是从其原始形式被修饰的。因此,宿主细胞中的异源基因包括这样的基因,其相对于该具体宿主细胞而言是内源的,但已经通过例如使用定点诱变或其他重组技术进行了修饰。这些术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此,这些术语是指这样的DNA片段,其相对于细胞而言是外来的或异源的,或相对于细胞而言是同源的但元件处在不常见于该宿主细胞内的位置或形式。
类似地,当在本文中与多肽或氨基酸序列连用时,术语“重组的”、“异源的”和“外源的”意指这样的多肽或氨基酸序列,其相对于该具体宿主细胞而言起源于外部来源,或者如果来自相同来源,则在其原始形式上经过修饰。因此,可以在宿主细胞中表达重组DNA片段以产生重组多肽。
术语“质粒”、“载体”以及“盒”对本领域普通技术人员给出了它们各自普通的和惯常的意思,并且非限制性地用于指通常携带基因的染色体外元件,这些基因不是细胞的中心新陈代谢的部分,并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可能是任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA,其中大量核苷酸序列已经被接合或重组成独特的构造,其能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3’非翻译序列引入到细胞中。“转化盒”是指特定的载体,其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、有利于具体宿主细胞的转化的元件。“表达盒”是指特定的载体,其含有外来基因并具有除该外来基因以外的、允许该基因在外来宿主中的增强表达的元件。
本披露部分地涉及Reb E在Reb D4的产生中的用途。从生物学角度来看,所有甜菊醇糖苷都是通过甜菊醇的一系列糖基化反应形成的,这些反应典型地由UDP-糖基转移酶(UGT)酶催化,使用尿苷5’-二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)作为糖部分的供体。在植物中,UGT是可以将葡萄糖残基从UDP-葡萄糖转移到甜菊醇的差异性很大的一组酶。在这些反应中,甜菊苷通常是多种莱鲍迪苷化合物生物合成的中间体。例如,甜菊苷在甜菊苷的C-13-O-葡萄糖的C-3’的糖基化产生莱鲍迪苷A;而在甜菊苷的19-0-葡萄糖位置的C-2’处的糖基化产生莱鲍迪苷E。
根据当前披露,莱鲍迪苷E的特异性和定向的糖基化(在C-19-O-葡萄糖处)可以从Reb E产生莱鲍迪苷Reb D4,然后可以通过UGT酶进一步导向Reb D4的糖基化以产生莱鲍迪苷M。先前未报道从Reb E酶促产生Reb D4的合成步骤。甜菊醇糖苷生物合成途径的第一个关键步骤涉及通过酶KAH的活性将对映-异贝壳杉烯酸转化为甜菊醇。已经表明,UGT76G1展示出针对形成莱鲍迪苷B的甜菊醇二糖苷和导致莱鲍迪苷A产生的甜菊苷的多种葡糖基化活性。此外,已经评估了KAH、UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1对于对映-异贝壳杉烯酸和甜菊醇的相互作用亲和力。针对KAH预测的模型显示出对于配体甜菊醇的最高亲和力,其次是甜菊醇-单苷和对映-异贝壳杉烯酸。UGT76G1的三维模型的对接结果表明其对于对映-异贝壳杉烯酸的最高结合亲和力,但也表明这些酶具有与甜菊醇糖苷生物合成途径中多于一种的配体相互作用的能力。根据当前披露,UGT76G1中结构域中的突变可以引起葡糖基化活性的特异性改变,从而导致产生可替代的莱鲍迪苷。
根据当前披露,改善甜叶菊提取物的味道品质的实用方法是提高那些通常具有更理想的味道特征的莱鲍迪苷化合物的产率,并且通过更有效的合成途径来实现这一目的。在测试的那些甜菊醇糖苷中,许多人认为Reb M具有用于在多种食品和饮料中有用的最理想的味道和化学特征。然而,如上所述,该植物在其叶中含有极少量的这种化合物,因此需要开发可替代的生物合成方法以实现大规模产生该糖苷以及为食品和饮料行业提供替代的甜味剂。本文提供了该途径的一部分。
因此,需要作为商业产品开发的具有更好和更一致的味道特征的甜菊醇糖苷以及对于这种甜菊醇糖苷需要利用相对常见的起始底物(例如更丰富的甜菊醇糖苷)作为起始分子,以便产生理想的糖苷可以在商业上尽可能具有成本效益。本披露提供了通过莱鲍迪苷E从甜菊苷产生莱鲍迪苷D4的方法。
更进一步,植物提取过程典型地采用固液提取技术,使用己烷、氯仿和乙醇等溶剂进行甜菊醇糖苷回收(Catchpole等人,2003)。然而,溶剂提取本身是能量密集型的,产生有毒废物处理问题,需要大量面积用于植物本身生长并且产生的产物需要进一步纯化来回收少量成分。因此,还需要新的产生方法来降低甜菊醇糖苷产生的成本,并减少大规模培养和加工对环境的影响(Yao等人,1994)。一种这样的潜在解决方案是使用发酵生物转化技术,其允许在某些微生物物种中产生,这增加了可用于商业的所希望的甜菊醇糖苷的选择性、丰度和纯度。
除此之外,虽然消费者赞成并积极寻求天然和生物来源的食品、饲料、香料或药用成分,但他们也关注采购、一致的味道特征和环境可持续产生。在这种情况下,当前披露的微生物发酵和产生方法提供了在数量方面可用于各种工业和研究的Reb D4,同时以比无机合成或当前植物提取技术更自然的方式做到。
因此,存在对开发一种经济且方便地产生Reb D4的新颖方法的需要,以进一步实现人和动物的消费。特别地,当前披露提供了使用Reb E,通过工程化的微生物产生Reb D4的方法。
本披露涉及使用允许转化的UGT酶从Reb E产生目的甜菊醇糖苷,Reb D4。本主题技术提供具有用于合成甜菊醇糖苷的UDP糖基转移酶活性(例如1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性和1,3-13-O-葡萄糖糖基化活性)的重组多肽。本主题技术的重组多肽可用于甜菊醇糖苷化合物的生物合成。在本披露中,UDP-糖基转移酶(UGT)是指将糖残基从活化的供体分子(典型地为UDP-葡萄糖)转移到受体分子的酶。1,3-19-O-葡萄糖糖基化活性是指将糖部分转移至莱鲍迪苷E的19-O葡萄糖部分的C-3’以产生莱鲍迪苷D4(Reb D4)的酶活性(图1)。
合成生物学
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是熟知的并且描述于:例如,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第2版;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor[冷泉港实验室:冷泉港],N.Y.[纽约],1989(在下文中称为“Maniatis”);和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with Gene Fusions[基因融合实验];ColdSpring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor[冷泉港实验室:冷泉港],N.Y.[纽约],1984;以及Ausubel,F.M.等人,在Current Protocols in Molecular Biology[当前分子生物学方案]中,Greene Publishing and Wiley-Interscience[格林出版社和威利国际科学出版社]出版,1987;(这些文献各自通过引用以其全文特此并入本文)。
糖基化通常被认为是控制植物天然产物的生物活性和储存的普遍存在的反应。在迄今为止已研究的大多数植物物种中,小分子的糖基化由转移酶超家族催化。这些糖基转移酶(GT)已被分类为超过60个家族。其中,家族1GT酶(也称为UDP糖基转移酶(UGT))将UDP活化的糖部分转移至特定的受体分子。这些是转移在甜菊醇糖苷中的此类糖部分以产生多种莱鲍迪苷的分子。这些UGT中的每一个都具有它们自己的活性谱和优选的结构位置,在那里它们转移它们的活化的糖部分。
生产系统
原核生物中蛋白质的表达大部分通常在具有含指导融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体的细菌宿主细胞中完成。融合载体将一些氨基酸添加至在其中编码的蛋白质,通常添加至重组蛋白的氨基端。这种融合载体典型地有三个目的:l)增加重组蛋白的表达;2)增加重组蛋白的溶解度;以及3)通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助重组蛋白的纯化。通常,在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白裂解位点以在纯化融合蛋白后使重组蛋白从融合部分分离。此类载体在本披露的范围内。
在实施例中,表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于在细菌细胞中转录和翻译的元件可以包括启动子、针对蛋白复合体的编码区和转录终止子。
本领域普通技术人员会知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述,用于并入本主题技术的表达载体的多核苷酸可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)的常规技术制备。
已经开发了若干种分子生物学技术以通过互补的粘性末端将DNA可操作地连接至载体。在一个实施例中,可以将互补的均聚物小片段添加至待被插入载体DNA的核酸分子中。载体和核酸分子然后通过互补的均聚物尾之间的氢键连接以形成重组DNA分子。
在一个可替代的实施例中,提供的含有一个和或多个限制性位点的合成的接头用于将本主题技术的多核苷酸可操作地连接至表达载体。在实施例中,多核苷酸通过限制性内切酶消化产生。在实施例中,将核酸分子用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理,这些酶用它们的3’-5’核酸外切酶活性去除突出的3’-单链末端,并用它们的聚合活性填补凹进的3’-末端,从而产生平末端DNA片段。在酶的存在下将平末端片段然后用大摩尔过量的接头分子进行孵育,该酶可以催化平末端DNA分子的连接,例如噬菌体T4 DNA连接酶。因此,反应产物是在其末端携带有聚合的接头序列的多核苷酸。这些多核苷酸然后用适当的限制性酶裂解并连接至已经用酶裂解而产生与多核苷酸的那些末端相容的末端的表达载体。
可替代地,可以使用具有不依赖于连接的克隆(ligation-independent cloning,LIC))位点的载体。然后所要求的PCR扩增的多核苷酸可以不经限制性消化或连接而被克隆到LIC载体中(Aslanidis和de Jong,Nucl.Acid.Res.[核酸研究]18,6069-74,(1990);Haun等人,Biotechniques[生物技术]13,515-18(1992),这些文献以与其一致的程度通过引用并入本文)。
在实施例中,为分离和/或修饰用于插入所选质粒的目标多核苷酸,适合用PCR。可以设计用于在序列的PCR制备中使用的适当的引物以分离核酸分子的所要求的编码区、添加限制性核酸内切酶或LIC位点、将编码区放入所希望的阅读框。
在实施例中,使用PCR,使用适当的寡核苷酸引物制备用于并入本主题技术的表达载体中的多核苷酸。编码区被扩增,同时引物本身变为并入扩增的序列产物中。在实施例中,扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点,该位点使得扩增的序列产物被克隆到适当的载体。
可以通过传统的转化或转染技术将表达载体引入到植物或微生物宿主细胞中。用本主题技术的表达载体进行适当细胞的转化是通过本领域已知的方法完成的,并典型地取决于载体和细胞的类型。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体转染、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。
通过本领域熟知的技术可以鉴定成功转化的细胞(即,含有表达载体的那些细胞)。例如,可以培养用本主题技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域熟知的技术检查细胞中是否存在表达载体DNA。
宿主细胞可以含有先前所述的表达载体的单拷贝,或可替代地,该表达载体的多个拷贝。
在一些实施例中,转化的细胞为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施例中,细胞是选自下组的植物细胞,该组由以下组成:卡诺拉油菜(canola)植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞、和矮牵牛植物细胞。
含有指导外来蛋白质高水平表达的调控序列的微生物宿主细胞表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些中的任何可以被用于构建用于在微生物宿主细胞中表达本主题技术的重组多肽的载体。然后可以通过转化将这些载体引入适当的微生物中以允许本主题技术的重组多肽的高水平表达。
可用于合适的微生物宿主细胞的转化的载体或盒在本领域是熟知的。典型地,载体或盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列、选择性标记以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录起始控制的多核苷酸的5’区和控制转录终止的DNA片段的3’区。对于两个控制区均优选的是来源于与被转化的宿主细胞同源的基因,虽然应该被理解的是这些控制区不需要来源于被选作宿主的特定物种的天然的基因。
可用于驱动在所希望的微生物宿主细胞中表达重组多肽的起始控制区或启动子对于本领域技术人员来说是非常多的并且是熟悉的。事实上,任何能驱动这些基因的启动子都适合于本主题技术,该启动子包括但不限于CYCI、HIS3、GALI、GALIO、ADHI、PGK、PH05、GAPDH、ADCI、TRPI、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中的表达);AOXI(可用于在毕赤酵母属中的表达);以及lac、trp、JPL、IPR、T7、tac和trc(可用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)中的表达)。
终止控制区也可以来源于对微生物宿主天然的多种基因。对于本文所述的微生物宿主来说,任选地可以包括终止位点。
在植物细胞中,本主题技术的表达载体可以包括可操作地连接至能指导本主题技术的重组多肽在所希望的发育阶段中在所希望的组织中表达的启动子的编码区。出于方便,待表达的多核苷酸可以包含来源于相同多核苷酸的启动子序列和翻译前导序列。编码转录终止信号的3’非编码序列也应该存在。表达载体还可以包含一个或多个内含子以促进多核苷酸表达。
对于植物宿主细胞,能够诱导编码区表达的任何启动子和任何终止子的任何组合可以用在本主题技术的载体序列中。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可以使用的有效的植物启动子的一种类型是高水平植物启动子。与主题技术的表达载体可操作连接的此类启动子应该能促进载体的表达。在本主题技术中可以使用的高水平植物启动子包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子,例如来自大豆(Berry-Lowe等人,J.Molecular andApp.Gen.[分子与应用基因],1:483498(1982),该文献的全文以与其一致的程度特此并入本文))以及叶绿素alb结合蛋白的启动子。这两种启动子已知在植物细胞中是光诱导的(参见,例如,Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective[植物基因工程农业视角],A.Cashmore,Plenum.[普莱南出版公司],N.Y.[纽约](1983),第2938页;Coruzzi,G.等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],258:1399(1983);和Dunsmuir,P.等人,Journal of Molecular and Applied Genetics[分子与应用基因学杂志],2:285(1983),这些文献以与其一致的程度通过引用特此并入本文)。
Reb
E的前体合成
如前所述,甜菊醇糖苷是负责南美植物甜叶菊(菊科(Rosaceae))的叶和植物覆盆子(Rubus chingii)(蔷薇科(Asteraceae))的甜味的化学化合物。这些化合物是糖基化的二萜。特别地,它们的分子可被视为甜菊醇分子,其羟基氢原子被葡萄糖分子取代以形成酯,并且羟基氢被葡萄糖和鼠李糖的组合取代以形成缩醛。
在当前披露中制备目的化合物的一种方法是采用常见或廉价的前体(例如在工程化的微生物(如细菌和/或酵母)中通过生物合成化学来源的或产生的甜菊醇或甜茶素(rubososide)),并且通过已知的或廉价的方法合成靶标甜菊醇糖苷(如Reb E)。
本披露的方面涉及在能够产生甜菊醇的微生物系统中重组表达酶的方法。通常,此类酶可包括:柯巴基焦磷酸合酶(CPS)、贝壳杉烯合酶(KS)和香叶酰二磷酸合酶(GGPPS)。这应该在表达内源类异戊二烯合成途径(例如非甲羟戊酸(MEP)途径或甲羟戊酸途径(MVA))的微生物菌株中发生。在一些实施例中,细胞是细菌细胞,包括大肠杆菌,或酵母细胞如酵母属细胞、毕赤酵母属细胞或耶氏酵母属细胞。在一些实施例中,细胞是藻细胞或植物细胞。
此后,从发酵培养物中回收前体用于在化学合成中使用。典型地,这是甜菊醇,尽管它可以是贝壳杉烯或来自细胞培养物的甜菊醇糖苷。在一些实施例中,从气相回收甜菊醇、贝壳杉烯和/或甜菊醇糖苷,而在其他实施例中,向细胞培养物中添加有机层或聚合物树脂,并从有机层或聚合树脂中回收贝壳杉烯、甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。在一些实施例中,甜菊醇糖苷选自莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜克苷A。在一些实施例中,产生的萜类是甜菊二糖苷或甜菊苷。还应理解,在一些实施例中,离体进行至少一个酶促步骤,例如一个或多个糖基化步骤。
本披露的一部分是Reb E甜菊醇糖苷的产生,然后将其进一步酶促转化为Reb D4。根据当前披露,当使用糖部分的多步化学组装成甜菊醇骨架将二萜类甜菊醇从甜茶苷和甜菊苷转化时,发生用于将微生物产生的甜菊醇转化为所希望的甜菊醇糖苷(本文为Reb D4)的生物合成。
甜菊醇糖苷的生物合成
如本文所述,本技术的重组多肽具有UDP-糖基转移酶活性,并且可用于开发用于制备天然来源中不存在或典型具有低丰度的甜菊醇糖苷(分别例如莱鲍迪苷D4和莱鲍迪苷M)的生物合成方法。本技术的重组多肽具有UDP-糖基转移酶活性,可用于开发用于制备新颖的甜菊醇糖苷(例如莱鲍迪苷D4)的生物合成方法,并且实现莱鲍迪苷M的合成产生。
底物可以是能在被一种或多种UDP糖基转移酶催化的反应中被转化为甜菊醇糖苷化合物的任何天然的或合成的化合物。例如,底物可以是天然甜叶菊提取物、甜菊醇、甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜茶苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷G或莱鲍迪苷E。底物可以是纯的化合物或不同化合物的混合物。优选地,底物包括选自下组的化合物,该组由以下组成:甜茶苷、甜菊苷、甜菊醇、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷E及其组合。
本文所述的方法还提供了偶联反应系统,其中本文所述的重组肽可以与一种或多种另外的酶组合起作用以改善效率或修饰甜菊醇糖苷化合物的整体生物合成的结果。例如,另外的酶可以通过(例如,使用蔗糖作为葡萄糖残基的供体)将糖基化反应产生的UDP转化回UDP-葡萄糖而再生糖基化反应所需的UDP-葡萄糖,因此改善糖基化反应的效率。在一些实施例中,酶是蔗糖合酶。在一些实施例中,另外的酶是拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3或绿豆蔗糖合酶。例如在美国专利号9,522,929中披露了此类酶,该专利通过引用并入本文。
在另一个实施例中,本主题技术的方法进一步包括用本文所述的重组蔗糖合酶、底物和重组多肽孵育重组UDP-糖基转移酶。重组UDP-糖基转移酶可以催化不同于本主题技术的重组多肽所催化的反应的糖基化反应。
合适的UDP-糖基转移酶包括本领域已知的或本文所述能够催化甜菊醇糖苷化合物的生物合成中一种或多种反应的任何UGT(如UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1或它们的功能同源物)。
典型地,在本主题技术的体外方法中,UDP-葡萄糖以从约0.2mM至约5mM,优选从约0.5mM至约2mM,更优选从约0.7mM至约1.5mM的浓度包含于缓冲液中。在实施例中,当重组蔗糖合酶被包含在反应中时,蔗糖也以从约100mM至约500mM,优选从约200mM至约400mM,更优选从约250mM至约350mM的浓度包含在缓冲液中。
典型地,在本主题技术的体外方法中,基于干重,重组多肽与底物的重量比为从约1:100至约1:5,优选从约1:50至约1:10,更优选从约1:25至约1:15。
典型地,体外方法的反应温度为从约20℃至约40℃,适合地从25℃至约37℃,更适合地从28℃至约32℃。
本领域技术人员将认识到,由本文所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得所希望的风味或甜味剂组合物。例如,如本文所述产生的富集有莱鲍迪苷M或Reb D4的组合物可以与含有莱鲍迪苷A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合,或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所希望的甜味剂组合物。可替代地,从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本上纯的甜菊醇糖苷(例如,莱鲍迪苷D4)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糖糊精、天冬苯丙二肽酯、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的,可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得所希望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D4、莱鲍迪苷M或它们的组合)可以包含在食物产品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充剂、医药营养品以及药品中。
本领域技术人员将认识到,由本文所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物可以被进一步纯化并与其他的甜菊醇糖苷、香料或甜味剂混合以获得所希望的风味或甜味剂组合物。例如,如本文所述产生的富集有莱鲍迪苷D4的组合物可以与含有莱鲍迪苷A作为主要甜菊醇糖苷的天然甜叶菊提取物混合,或与其他合成的或天然的甜菊醇糖苷产物混合以制备所希望的甜味剂组合物。可替代地,从本文所述的甜菊醇糖苷组合物获得的基本上纯的甜菊醇糖苷(例如,莱鲍迪苷D4)可以与其他的甜味剂(如蔗糖、麦芽糖糊精、天冬苯丙二肽酯、三氯蔗糖、纽甜、乙酰氨基磺酸钾和糖精)结合。如本领域已知的,可以调节甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的量以获得所希望的味道。本文所述的甜菊醇糖苷组合物(包括莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D4、莱鲍迪苷M或它们的组合)可以包含在食物产品(如饮料、软饮料、冰激凌、乳制品、甜品、谷物、口香糖、烘焙商品等)、膳食补充剂、医药营养品以及药品中。
用同一性评分分析序列相似性
如本文所用的,“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的整个比对窗口中不变的程度。用于测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列片段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。
如本文所用的,术语“序列同一性百分比”或“百分比同一性”是指参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比的相同核苷酸的百分比,这是当这两个序列最佳比对时(在比较窗口上适当的核苷酸插入、缺失或缺口总共小于参考序列的20%)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员熟知的,并且可以通过如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的搜索相似性方法的工具来进行,并且优选地通过这些算法的计算机化实施,例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,可作为Wisconsin (马塞诸塞州柏林顿(Burlington,MA)的阿赛乐德公司(AccelrysInc.))的一部分获得。用于测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列片段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其部分,或与更长的多核苷酸序列。出于本披露的目的,还可以使用针对翻译的核苷酸序列的BLASTX 2.0版本和针对多核苷酸序列的BLASTN2.0版本来确定“百分比同一性”。
序列同一性的百分比优选使用序列分析软件包(Sequence Analysis SoftwarePackageTM)(版本10;威斯康辛州麦迪逊(Madison,WI)的遗传学计算机组公司(GeneticsComputer Group,Inc.))的“BestFit(最佳拟合)”或“Gap(缺口)”程序确定。“Gap”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]48:443-453,1970)来找到两个序列的比对,其使匹配数最大化并使缺口数最小化。“BestFit”对两个序列之间的最佳相似性片段进行最佳比对,并使用Smith和Waterman的局部同源性算法插入缺口以使匹配数最大化(Smith和Waterman,Advances in AppliedMathematics[应用数学进展],2:482-489,1981;Smith等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]11:2205-2220,1983)。最优选使用“Best Fit”程序确定同一性百分比。
用于确定序列同一性的有用方法也披露于基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中,该程序可从美国国立卫生研究院(National Institute of Health)(贝塞达斯(Bethesda),马里兰州(Md.)20894)的国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家中心生物技术信息(National Center Biotechnology Information,NCBI)公开获得;参见BLAST Manual[BLAST手册],Altschul等人,NCBI,NLM,NIH;Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990);BLAST程序的2.0版本或更高版本允许在比对中引入缺口(缺失和插入);对于肽序列,BLASTX可用于确定序列同一性;并且,对于肽序列,BLASTN可用于确定序列同一性。
如本文所用的,术语“基本百分比序列同一性”是指至少约70%序列同一性,至少约80%序列同一性,至少约85%同一性,至少约90%序列同一性,或甚至更大的序列同一性(例如约98%或约99%序列同一性)的百分比序列同一性。因此,本发明的一个实施例是多核苷酸分子,该多核苷酸分子与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约85%同一性、至少约90%序列同一性、或甚至更高的序列同一性,例如约98%或约99%序列同一性。具有当前披露的C1m2和C1m3序列活性的多核苷酸分子能够指导多种甜菊醇糖苷的产生,并且与本文提供的多核苷酸序列具有基本百分比序列同一性,并且涵盖在本披露的范围内。
同一性和相似性
同一性是在序列比对后一对序列之间相同的氨基酸的分数(可以仅使用序列信息或结构信息或一些其他信息来完成,但通常仅基于序列信息),并且相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对而分配的得分。相似性指数可以是以下BLOSUM62、PAM250或GONNET中的任何一种,或本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有缺口)。25%或更高的同一性意味着功能的相似性,而18%-25%意味着结构或功能的相似性。请记住,两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20%的同一性。相似性是两个序列比较时它们之间的相似程度。这取决于它们的同一性。
从前面的描述显而易见的是,本披露的某些方面不受本文所示的实例的特定细节的限制,因此预期本领域技术人员将想到其他修饰和应用、或其等同物。因此预期权利要求书应该覆盖不脱离本披露的精神和范围的所有此类修饰和应用。
而且,除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本披露所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试,但优选的方法和材料是以上所述的。
尽管出于理解的目的通过说明和实例详细地描述了前述发明,但是对于本领域技术人员显而易见的是,可以实施某些改变和修饰。因此,描述和实例不应解释为限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求书描述。
除非另外定义,本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。虽然类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和材料可以用于本披露的实践或测试,但优选的材料和方法描述如下。
当考虑到以下非限制性实例时,会更充分地理解本披露。虽然指示了本主题技术的优选的实施例,但应该理解的是这些实例仅通过说明的方式给出。从上面的讨论和这些实例中,本领域技术人员可以确定本主题技术的必要特征,并在不违背其精神和范围下,可以做出本主题技术的多种变化和修饰以使其适应各种用途和条件。
实例
1.酶促合成Reb D4
有若干种制备Reb D4的酶促方法。本文呈现了一种从Reb E开始的方法。
将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,然后在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养液中于37℃生长直至OD600达到0.8-1.0。通过添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,并使培养物在16℃再生长22小时。通过离心(3,000x g;10min;4℃)收获细胞。收集细胞团块并立即使用或保存在-80℃。
将细胞团块重悬浮于裂解缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液,pH 7.2、25μg/ml溶菌酶、5μg/ml DNA酶I、20mM咪唑、500mM NaCl、10%甘油和0.4%TRITON X-100)中。在4℃通过超声处理破坏细胞,并通过离心(18,000x g;30min)澄清细胞碎片。将上清液上样到经过平衡的(平衡缓冲液:50mM磷酸钾缓冲液,pH 7.2、20mM咪唑、500mM NaCl、10%甘油)Ni-NTA(凯杰公司(Qiagen))亲和柱上。在上样蛋白样品后,将柱用平衡缓冲液洗涤以去除未结合的污染蛋白。用含有250mM咪唑的平衡缓冲液洗脱带His标签的B-glu1重组多肽。
使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(森尼韦尔市(Sunnyvale),加利福尼亚州(CA))进行HPLC分析,该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。使用具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱来表征甜菊醇糖苷。在HPLC分析中将在水中的乙腈用于洗脱。检测波长为210nm。
突变体酶
基于UGT76G1结构,设计了一系列循环排列(PLoS computational Biology[PLoS计算生物学],2012;BIOINFORMATICS[生物信息学],2015)和一组突变,并测试其功能。循环排列分析是开发或修饰目的酶的有力工具。在测试了若干个版本的循环排列后,在UGT76G1的一个版本中发现了显著的活性。已证明该循环突变“循环排列1”(“CP1”)在甜菊醇核心的葡糖基化方面具有显著的活性。根据当前披露,研究了CP1酶的活性并且评估了其辅助RebD4向Reb M的转化的能力。广义而言,CP1是UGT76G1的变体,具有其转换的结构域和鉴定的突变位点。
基于CP1建模分析,选择CP1酶的多个突变位点以测试Reb E到Reb D4的生物转化。在一系列此类突变之后,分离出少量突变体,这些突变体可以在糖基化活性和甜菊醇核心的装饰方面根据需要起作用。将远离野生型CP1的位置突变体提供在表1中。利用这些酶,开发了能够将Reb E直接生物转化为莱鲍迪苷D4的基因修饰的微生物。例如,发现两个CP1突变体(C1m2和C1m3)具有用于Reb E到Reb D4的生物转化的高酶活性。C1m2(SEQ ID NO:7)包括两个突变位点,并且C1m3(SEQ ID NO:9)含有三个突变位点(来自CP1序列)。
表1.CP1的突变位点。
位置 | 氨基酸 |
3 | W-L |
6 | L-A,L-G |
90 | T-A;T-G |
91 | S-G;S-L |
93 | V-A;V-G |
181 | S-G |
183 | F-V;F-A;F-G |
184 | G-A |
185 | L-A |
350 | G-A |
389 | L-V |
410 | S-G |
418 | H-V |
450 | T-A;T-G |
451 | K-A |
452 | D-A |
454 | K-L;K-V |
2.鉴定具有用于从Reb E产生Reb D4的活性的UGT突变体:
为证实Reb E到莱鲍迪苷D4的体外转化,使用Reb E作为甜菊醇糖苷底物测定C1m2和C1m3酶突变体。将重组多肽(10μg)在200μL体外反应系统中测试。该反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)、3mM MgCl2、1mg/ml Reb E底物、和1mM UDP-葡萄糖。反应在37℃进行并通过添加200μL的1-丁醇终止。将样品用200μL的1-丁醇提取三次。将合并的级分干燥并溶于70μL的80%甲醇中,用于高效液相色谱(HPLC)分析。
使用Dionex UPLC ultimate 3000系统(森尼韦尔市(Sunnyvale),加利福尼亚州(CA))进行HPLC分析,该系统包括四元泵、温控柱室、自动采样器和UV吸光度检测器。使用具有保护柱的Synergi Hydro-RP柱来表征甜菊醇糖苷。在HPLC分析中将在水中的乙腈用于洗脱。检测波长为210nm。Reb D和Reb D4在HPLC谱中具有不同的保留时间。然而,Reb D4和RebE具有接近的保留时间。(图2,A和B)。
如图2所示,C1m2和C1m3酶可以将Reb E转化为与Reb D4标准品具有相似保留时间的化合物,这指示这两个突变体具有用于Reb D4产生的酶活性。
3.通过LC-MS分析鉴定Reb D4产生
如图2所示,Reb E和Reb D4的保留时间非常接近。通过当前HPLC方法很难在反应中区分Reb E和Reb D4。为证实Reb E到Reb D4的转化,通过LC-MS分析对产生的化合物进行分析。
为在相关的反应中鉴定Reb D4化合物,通过LC-MS,使用Synergy Hydro-RP柱对来自C1m2和C1m3生物转化的样品进行分析。流动相A是在水中的0.1%甲酸,并且流动相B是在乙腈中的0.1%甲酸。流速是0.5ml/分钟。流动相B在20%B处开始,并保持2分钟。然后在15分钟内运行线性梯度至45%B。然后在0.5分钟内%B增加至90%,并随后保持8分钟。在0.5分钟内重新建立起始条件,并在下一次注射之前再保持4.5分钟用于柱的重新平衡。在Bruker Impact II上、用优化的方法、以正离子模式进行样品的质谱分析。将漏斗1RF保持在400Vp-p处,漏斗2RF保持在400Vp-p处,传输时间为120μs,并且预脉冲存储为15μs。在每次运行结束时,用甲酸钠簇完成m/z标度的完全校准。使用次级/任选的6通阀将所有洗脱液在前2分钟转移至废液中,以保持源清洁。
如图3和4所示,产生的化合物具有与Reb D4相同的分子量。还可以在相同的保留时间处检测Reb E底物。这些结果提供了支持在通过C1m2和C1m3酶催化的这些反应中产生Reb D4的证据。
4.通过酶促测定鉴定Reb D4产生
根据当前披露,建立酶促测定以证实Reb D4的产生。修饰β-葡糖苷酶测定以检测在相关反应中的Reb D4产生。在该测定中,β-葡糖苷酶可以水解甜菊醇糖苷以去除一个或多个葡萄糖基团。筛选后,发现β-葡糖苷酶(GXT6,SEQ:5)具有特异性酶活性以水解Reb D4、Reb E和Reb D。因此,进行酶促测定以区分在当前披露的反应中存在的三种化合物。
如图5所示,GXT6可以将Reb D4水解为Reb WB1。通过GXT6,可以将Reb E水解为甜菊苷和甜茶苷;通过GXT6可以将Reb D水解为Reb A。所有化合物在HPLC谱中具有不同的保留时间,并且可以被清楚地区分。
使用通过C1m2和C1m3从Reb E生物转化而产生的化合物运行相同的酶促反应。如图6所示,Reb WB1仅可以在C1m2和C1m3反应中产生。在C1m2和C1m3反应中可以产生较少的或不产生Reb A和甜茶苷。这些结果提供了证实在C1m2和C1m3反应中Reb D4的生物合成的证据。C1m2和C1m3具有用于Reb E到Reb D4的转化的主要酶活性,用于Reb E到Reb D的转化的活性较少或没有活性。
根据当前披露,通过C1m2和C1m3酶的作用水解Reb E以产生Reb M。在进行的每次测量中,产生了化合物连同当前披露将预测的生物合成途径中的内容。
5.通过酶促反应,甜菊苷到Reb D4的生物转化
为证实甜菊苷到莱鲍迪苷D4的体外转化,使用甜菊苷作为甜菊醇糖苷底物测定HV1、C1m2和C1m3酶。反应系统含有50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)、3mM MgCl2、1mg/ml甜菊苷、1mM UDP-葡萄糖、HV1和C1m2或C1m3。在37℃进行反应,并通过添加1-丁醇终止反应。将这些样品用1-丁醇提取三次。将合并的级分干燥并溶于80%甲醇中,用于高效液相色谱(HPLC)分析。如上所述进行HPLC分析。
如图7所示,HV1与C1m2或C1m3的组合可以将甜菊苷转化为Reb D4。在反应中,通过HV1酶可以将甜菊苷转化为Reb E,然后通过C1m2或C1m3酶可以将产生的Reb E转化为RebD4。为在相关的反应中鉴定Reb D4化合物,通过LC-MS、使用SynergyHydro-RP柱分析样品。如图8所示,产生的化合物(保留时间为9.1min)具有与Reb D4相同的分子量。还可以在相同的保留时间处检测Reb E底物。这些结果提供了支持反应中Reb D4产生的证据。
根据当前披露,开发了两种UGT突变体,当将这两种突变体置于生物转化系统中时,允许从Reb E产生Reb D4。证实了通过Reb D4从甜菊苷到Reb M的整个生物合成途径(图9)。如先前所述,可以通过HV1酶将甜菊苷转化为Reb E,然后可以通过如本文所述的C1m2或C1m3酶将Reb E转化为Reb D4。最后,通过来自UGT76G1、CP1和CR1的酶中的一种可以将RebD4转化为Reb M。
鉴定UGT突变体用于将Reb E转化为Reb D4。基于结构建模分析,针对将Reb E转化为Reb D4的能力,筛选CP1酶(其本身是UGT76G1的循环版本)的一些突变体变化。发现两种突变体具有这种能力,它们已被鉴定为C1m2和C1m3。
如上所述,建立LC-MS方法以鉴定Reb D4产生。如HPLC谱所示,Reb E和Reb D4的保留时间非常接近。通过大多数现存的HPLC方法,难以区分反应中的Reb E和Reb D4。为证实Reb E到Reb D4的转化,通过LC-MS分析对产生的化合物进行分析。在通过C1m2和C1m3酶两者进行的Reb E的生物转化中可以检测Reb D4化合物。
如上所述,建立酶促测定以确认Reb D4产生。为证实在相关反应中Reb D4的产生,进行β-葡糖苷酶测定以区分Reb D4、Reb E和Reb D甜菊醇糖苷。在该测定中,β-葡糖苷酶可以水解甜菊醇糖苷以去除一个或多个葡萄糖基团。GXT6具有特异性酶活性以水解Reb D4、Red E和Reb D。因此,进行酶促测定以区分在当前披露的反应中存在的三种化合物。酶促测定后,在相关反应中证实了Reb D4的存在,支持了用于从Reb E合成Reb D4的C1m2和C1m3的酶活性。
目的序列:
序列:
UGT76G1序列:
UGT76G1序列氨基酸序列:(SEQ ID NO:1)
UGT76G1序列DNA序列:(SEQ ID NO:2)
CP1序列:
CP1序列氨基酸:(SEQ ID NO:3)
CP1序列DNA序列:(SEQ ID NO:4)
GXT6:氨基酸,来自链霉菌属物种GXT6(SEQ ID NO:5)
GXT6:大肠杆菌(SEQ ID NO:6)的DNA密码子优化
C1m2:突变体酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)
C1m2:突变体酶的DNA序列(SEQ ID NO:8)
C1m3:突变体酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
C1m3:突变体酶的DNA序列(SEQ ID NO:10)
HV1:氨基酸序列(SEQ ID NO:11)
HV1:DNA序列(SEQ ID NO:12)
CR1:氨基酸序列(SEQ ID NO:13)
CR1:DNA序列(SEQ ID NO:14)
工业实用性声明/技术领域
本披露适用于食品、饲料、饮料和药理学工业。本披露总体上涉及用于生物合成产生甜菊醇糖苷的方法(例如,通过修饰的微生物菌株)。
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Claims (44)
1.一种突变体CP1酶,该突变体CP1酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
2.一种重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
3.一种核酸,该核酸包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
4.一种核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:8具有至少90%同一性的核苷酸序列。
5.一种突变体CP1酶,该突变体CP1酶包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
6.一种重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:9具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.一种核酸,该核酸包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
8.一种核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:10具有至少90%同一性的核苷酸序列。
9.一种突变体HV1酶,该突变体HV1酶包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
10.一种重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:11具有至少90%同一性的氨基酸序列。
11.一种核酸,该核酸包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
12.一种核酸,该核酸包含与SEQ ID NO:12具有至少90%同一性的核苷酸序列。
13.一种宿主细胞,该宿主细胞包含能够产生C1m2酶的载体,该C1m2酶具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
14.如权利要求13所述的宿主细胞,其中该宿主细胞选自下组,该组由以下组成:细菌、酵母、丝状真菌、蓝细菌藻类和植物细胞。
15.如权利要求13所述的宿主细胞,其中该宿主细胞选自下组,该组由以下组成:埃希氏杆菌属;沙门氏菌属;芽孢杆菌属;不动杆菌属;链霉菌属;棒状杆菌属;甲基弯曲菌;甲基单胞菌;红球菌属;假单胞菌属;红杆菌属;集胞藻属;酵母属;接合酵母属;克鲁维酵母菌属;假丝酵母属;汉逊酵母属;德巴利氏酵母属;毛霉菌属;毕赤酵母属;球拟酵母属;曲霉属;Arthrobotlys;短杆菌属;微杆菌属;节细菌属;柠檬酸杆菌属;埃希氏杆菌属;克雷白氏杆菌属;泛菌属;沙门氏菌棒状杆菌;梭菌属;和丙酮丁醇梭菌。
16.如权利要求13所述的宿主细胞,其中该宿主细胞是从选自下组的植物分离的细胞,该组由以下组成:大豆;油菜籽;向日葵;棉花;玉米;烟草;苜蓿;小麦;大麦;燕麦;高粱;稻;西兰花;花椰菜;卷心菜;欧洲防风草;甜瓜;胡萝卜;芹菜;香芹菜;番茄;马铃薯;草莓;花生;葡萄;草籽作物;甜菜;甘蔗;豆类;豌豆;黑麦;亚麻;阔叶树;针叶树;饲草;拟南芥;稻(水稻);野大麦;风倾草(柳枝稷);短柄草属物种;芸苔属物种;和海甘蓝。
17.一种产生甜菊醇糖苷组合物的方法,该方法包括将底物与重组多肽一起孵育,该重组多肽包含与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的方法,其中该重组多肽是与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性的UDP-糖基转移酶。
19.如权利要求17所述的方法,其中该底物选自下组,该组由以下组成:甜菊苷或莱鲍迪苷E及其组合。
20.如权利要求17所述的方法,其中通过该方法产生的甜菊醇糖苷化合物是莱鲍迪苷D4,使得该甜菊醇糖苷组合物包含莱鲍迪苷D4。
21.一种甜味剂,该甜味剂包含通过如权利要求20所述的方法产生的甜菊醇糖苷组合物。
22.一种产生莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括将底物与重组多肽一起孵育,该重组多肽包含与SEQ ID NO 7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
23.如权利要求22所述的方法,其中该底物选自下组,该组由以下组成:Reb E、甜菊苷、及其组合。
24.如权利要求23所述的方法,该方法进一步包括:将重组蔗糖合酶与底物和重组多肽一起孵育。
25.一种用于从莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括:
制备包含莱鲍迪苷E、选自下组的底物、和C1m2的反应混合物,该组由以下组成:蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖);以及
将该反应混合物孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4,
其中将葡萄糖与莱鲍迪苷E共价偶联以产生莱鲍迪苷D4。
26.如权利要求25所述的方法,该方法进一步包括将蔗糖合酶添加至该反应混合物中。
27.如权利要求26所述的方法,其中该蔗糖合酶选自下组,该组由以下组成:拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。
28.如权利要求27所述的方法,其中该蔗糖合酶是拟南芥蔗糖合酶1。
29.一种用于从莱鲍迪苷E合成莱鲍迪苷D4的方法,该方法包括:
制备包含莱鲍迪苷E、选自下组的底物、和C1m3的反应混合物,该组由以下组成:蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖);以及
将该反应混合物孵育足够的时间以产生莱鲍迪苷D4,
其中将葡萄糖与莱鲍迪苷E共价偶联以产生莱鲍迪苷D4。
30.如权利要求29所述的方法,该方法进一步包括将蔗糖合酶添加至该反应混合物中。
31.如权利要求30所述的方法,其中该蔗糖合酶选自下组,该组由以下组成:拟南芥蔗糖合酶1、拟南芥蔗糖合酶3和绿豆蔗糖合酶。
32.如权利要求31所述的方法,其中该蔗糖合酶是拟南芥蔗糖合酶1。
33.如权利要求29所述的方法,其中产生的所述Reb D4纯度高于70%。
34.如权利要求29所述的方法,该方法进一步包括将HV1酶添加至该反应混合物中。
35.如权利要求25所述的方法,该方法进一步包括将HV1酶添加至该反应混合物中。
36.一种GXT6酶,该GXT6酶包含SEQ ID NO:5。
37.一种核酸,该核酸包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
38.一种重组多肽,该重组多肽包含与SEQ ID NO:5具有至少90%同一性的氨基酸序列。
39.一种CP1酶,该CP1酶包含SEQ ID NO:3。
40.一种核酸,该核酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
41.一种宿主细胞,该宿主细胞包含能够产生C1m3酶的载体,该Clm3酶具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
42.如权利要求41所述的宿主细胞,其中该宿主细胞选自下组,该组由以下组成:细菌、酵母、丝状真菌、蓝细菌藻类和植物细胞。
43.如权利要求41所述的宿主细胞,其中该宿主细胞选自下组,该组由以下组成:埃希氏杆菌属;沙门氏菌属;芽孢杆菌属;不动杆菌属;链霉菌属;棒状杆菌属;甲基弯曲菌;甲基单胞菌;红球菌属;假单胞菌属;红杆菌属;集胞藻属;酵母属;接合酵母属;克鲁维酵母菌属;假丝酵母属;汉逊酵母属;德巴利氏酵母属;毛霉菌属;毕赤酵母属;球拟酵母属;曲霉属;Arthrobotlys;短杆菌属;微杆菌属;节细菌属;柠檬酸杆菌属;埃希氏杆菌属;克雷白氏杆菌属;泛菌属;沙门氏菌棒状杆菌;梭菌属;和丙酮丁醇梭菌。
44.如权利要求41所述的宿主细胞,其中该宿主细胞是从选自下组的植物分离的细胞,该组由以下组成:大豆;油菜籽;向日葵;棉花;玉米;烟草;苜蓿;小麦;大麦;燕麦;高粱;稻;西兰花;花椰菜;卷心菜;欧洲防风草;甜瓜;胡萝卜;芹菜;香芹菜;番茄;马铃薯;草莓;花生;葡萄;草籽作物;甜菜;甘蔗;豆类;豌豆;黑麦;亚麻;阔叶树;针叶树;饲草;拟南芥;稻(水稻);野大麦;风倾草(柳枝稷);短柄草属物种;芸苔属物种;和海甘蓝。
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