WO2020075943A1 - 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법 - Google Patents

고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법 Download PDF

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김경진
안정호
서호균
이종언
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    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)

Definitions

  • the present invention relates to a mutant microorganism for producing succinic acid in which highly active malic acid dehydrogenase is introduced and a method for preparing succinic acid using the same, more specifically, it interacts with the pyrophosphate portion of NADH through a amide functional group in a main chain.
  • the present invention relates to a mutant microorganism for producing succinic acid having improved conversion activity from oxaloacetic acid to malic acid and a method for producing succinic acid using the gene encoding the malic acid dehydrogenase, wherein the functioning amino acid residue is glutamine (Gln).
  • Succinic acid is a dicarboxylic acid with 4 carbon atoms and is used as a precursor to compounds of industrial value such as 1,4-butanediol, ⁇ -butyrolactone, diethyl succinate, N- methyl-2-pyrollidone, tetrahydrofuran, and used as monomers for various polymers. It is also a useful compound.
  • succinic acid is highlighted, and many methods of producing succinic acid as a bio-based method using various microorganisms such as Actinobacillus succinogens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Escherichia coli, Mannheimia succiniciproducens, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica are being studied.
  • various microorganisms such as Actinobacillus succinogens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Escherichia coli, Mannheimia succiniciproducens, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica are being studied.
  • the improvement of the succinic acid production strain consisted of changing the metabolic flow of the succinic acid production strain, and its strategy was to enhance the flow to succinic acid by enhancing carbon metabolism and eliminating or reducing the production of byproducts. That is, succinic acid production is increased by introducing or enhancing a gene involved in the succinic acid metabolic flow or by deleting or weakening a gene inhibiting the succinic acid metabolic flow.
  • Malic acid dehydrogenase a gene involved in the flow of succinic acid metabolism, is an enzyme introduced to increase succinic acid production, and has already been studied to increase succinic acid production by introducing it.
  • MDH malic acid dehydrogenase
  • the present inventors searched for a method capable of significantly improving the productivity of succinic acid compared to the prior art, and focused on M. succiniciproducens in view of the fact that many studies on the reaction rate and structure for major enzymes involved in the production of succinic acid have not been made yet. Structural analysis of major enzymes of the containing lumen bacteria and succinic acid-producing microorganisms was conducted. As a result, in the present invention, the structure of Corynebacterium glutamicum and M. succiniciproducens MDH was first discovered to develop a highly productive succinic acid production strain by introducing MDH with a reduced substrate inhibitory action. It was confirmed that it is possible to develop and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a mutant microorganism having enhanced succinic acid production capacity, and to provide a method for maximizing succinic acid production capacity using the same.
  • the present invention is a mutant microorganism in which a gene encoding malic acid dehydrogenase is introduced into a microorganism having a succinic acid generating ability, wherein the malic acid dehydrogenase is a pyrophosphate portion of NADH through an amide functional group in the central chain. It provides a mutant microorganism characterized in that the amino acid residue interacting is glutamine (Gln).
  • the present invention also provides a method for producing succinic acid comprising the following steps.
  • 1 is a schematic diagram showing the metabolic flow to succinic acid.
  • 3 shows a graph of the rate of NADH conversion according to the NADH substrate concentration of Cg MDH and Ms MDH.
  • Figure 5 shows the substrate binding crystal structure of Cg MDH and Ms MDH showing each substrate and polypeptide chains in different colors.
  • Ms MDH on the left is Cg MDH on the right.
  • GOL stands for glycerol
  • MAL stands for malic acid ion.
  • FIG. 10 shows a graph of NADH conversion rates according to oxaloacetic acid substrate concentrations of Cg MDH, Ms MDH, and Ms MDH G11Q for pH 6.0, 7.0, and 8.0.
  • Information on the activity of Cg MDH and Ms MDH at pH 7.0 already provided in FIG. 3 is indicated by dotted lines.
  • Figure 11 shows M. succiniciproducens PALK (pMS3-msmdh) (A), PALK (pMS3-cgmdh) (B), PALK (pMS3-cgmdh Q20G ) (C), and PALK (pMS3-msmdh G11Q ) (D) strains. Growth and metabolite production curve of fed-batch culture using glucose as a single carbon source, growth and metabolite production curve of (E) fed-batch culture using M. succiniciproducens PALK (pMS3-cgmdh) strain as a carbon source with glucose and glycerol to be.
  • Figure 12 shows a single strain of M. succiniciproducens PALK (pMS3-scmdh2) (A), PALK (pMS3-scmdh3) (B), PALK (pMS3-ecmdh) (C), PALK (pMS3-zrmdh) (D) strains. It is a growth curve and a metabolite production curve of fed-batch culture used as a carbon source.
  • FIG. 13 shows that M. succiniciproducens PALKcgmdh strain is used as a single carbon source (A) with glycerol (C), M. succiniciproducens PALKmsmdh G11Q strain is glucose as a single carbon source (B), and is used with glycerol (D) Growth and metabolite production curves of fed-batch culture performed.
  • MDH was selected from among enzyme candidate groups for enhancing metabolic flow to succinic acid and consequently overproducing succinic acid.
  • MDH is encoded by the mdh gene, which is an enzyme based on oxaloacetic acid ( Figure 1).
  • MDH of the M. succiniciproducens strain ( Ms MDH) MDH of the C. glutamicum strain ( Cg ) to investigate the effects of MDH on the strains used for succinic acid production and to find the MDH that most effectively converts the oxaloacetic acid, the substrate of MDH, among them MDH
  • MDH of the E. coli strain Ec MDH
  • MDH of the A. succinogenes strain As MDH
  • NAD + / NADH-dependent MDH from pig heart forms an inactive conjugate with enol-type oxaloacetic acid, or inhibits the binding of NADH to the enzyme in cytoplasmic MDH from Phycomyces blackesleeanus and consequently makes the enzyme inoperable.
  • Known (De Arriaga et al ., Biochim. Biophys. Acta., 784: 158-163., 1984). It was shown that the enzyme activity of Ms MDH began to be inhibited from a relatively low concentration of oxaloacetic acid of 30 ⁇ M (FIG. 4), and this substrate inhibition was found to be higher than other MDHs (FIG. 4). Summarizing these results, it can be seen that Ms MDH is disadvantageous for succinic acid production, and Cg MDH is the most suitable enzyme for succinic acid production among the three MDHs.
  • Cg MDH shows better enzymatic activity than Ms MDH at the molecular level
  • the crystal structures of two enzymes were also investigated, and the structures of the substrate and the conjugate were also identified (FIG. 5).
  • Both Cg MDH and Ms MDH form homo dimers and belong to the NAD + / NADH dependent malate, lactate dehydrogenase superfamily (Fig. 5).
  • the N-terminus of Cg MDH and Ms MDH shows a Rossman fold consisting of 6 strands of ⁇ -sheets arranged next to ⁇ -helices, whereas the C-terminus forms ⁇ + ⁇ fold (FIG. 5).
  • the RMSD value of the C ⁇ -backbone reached 2.772.
  • structural differences that can affect the activity of the enzyme, especially around the active site, were found (FIGS. 6 and 7).
  • This difference also represents a large difference between the cytoplasmic MDH and the mitochondrial MDH.
  • the lengths of the central chains of the rings near the active site are different, but the emphasis here is on some of the key amino acid residues.
  • amino acid residues corresponding to Ala224, Leu101, and Gly11 located near the substrate binding site of Ms MDH correspond to Ser242, Gln117, and Gln20, respectively, in Cg MDH (FIGS. 6 and 7). It was expected that these structural differences were important to create a difference in the kinetics of Cg MDH and Ms MDH.
  • All the mutant MDH enzyme Cg (Cg Q20G MDH, MDH Q117L Cg, Cg MDH S242A) is an oxaloacetic acid conversion rate was decreased to less than half compared to the all the wild-type (Fig. 8).
  • Ms MDH L101Q also had less activity than Ms MDH, and it was confirmed that the activity of the mutant Ms MDH G11Q improved about three times (FIG. 8).
  • three enzymes, Cg MDH, Ms MDH, and Ms MDH G11Q were examined.
  • the substrate inhibitory action of the Ms MDH G11Q mutant enzyme was significantly reduced at all pHs compared to that of Ms MDH (FIG. 10).
  • Several dehydrogenases have been reported to inhibit or eliminate substrate inhibition through a single mutation of the active site (Chen et al ., Appl. Environ. Microb., 80: 3992-4002., 2014). It has been reported that the substrate inhibitory action of MDH affects the binding of NADH, and since the corresponding 11th position is also directly related to the binding of NADH (FIG. 7), probably the pyrophosphate portion of NADH interacting with 11 It is interpreted that it will be closely related to substrate inhibition.
  • Cg MDH has a significantly higher oxaloacetic acid reducing activity than Ms MDH at low pH, and predicts that the production of succinic acid will increase when Cg MDH is introduced instead of Ms MDH in the succinic acid producing strain.
  • Gly11 residue of Ms MDH was involved in severe substrate inhibitory action of the enzyme protein. Since the appropriate time corresponding Gly11 Ms MDH G11Q mutant enzymes modeled after the Gln20 of Cg MDH substituted once to Gly11 of Ms MDH into Gln in amino acid residues that was seen for the existing M.
  • Ms MDH G11Q mutant enzyme succiniciproducens superior activity than the wild-type enzyme, Ms MDH G11Q mutant enzyme
  • the amount of succinic acid will increase when it is introduced into a succinic acid producing strain instead of the existing Ms MDH.
  • the introduction of the mutant enzyme can be free from problems such as GMO because it does not introduce an external gene, but replaces only one amino acid from an existing enzyme.
  • MDHs with reduced substrate inhibitory action were introduced into the M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) strain based on in vitro studies.
  • the M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) strain is a strain obtained by deleting genes encoding lactic dehydrogenase, genes encoding phosphotransacetylase and genes encoding kinase acetate in the M. succiniciproducens wild type strain. It is a succinic acid-producing mutant microorganism having the property of producing only succinic acid at a high concentration while generating almost no other organic acids except succinic acid under conditions.
  • PALK succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), the outstanding improvement in all of the succinic acid production indicators (production concentration, yield, productivity) shown by PALK (pMS3-cgmdh), in addition to the improvement of the conversion from oxaloacetic acid to malic acid, also mitigation of substrate inhibition It can be said that lead to the improvement of succinic acid production.
  • MDHs reported in the literature to be effective for succinic acid production ( Ec MDH from E. coli , Zr MDH from Sygosaccharomyces rouxii , S . serevisiae effect derived MDH2 Sc and Sc MDH3) also was tested as in vivo.
  • strains of PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3-zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2), and PALK (pMS3-scmdh3) overexpressing the respective MDHs were constructed.
  • results of fed-batch fermentation for the four MDH overexpressing strains constructed above were 79.05, 76.11, 77.34, 75.15 g / L succinic acid 3.27, 3.15, 3.19, 3.1 g / L / h productivity and 1.29, 1.25, 1.16, It was produced in a yield of 1.13 mol / mol glucose.
  • MDH has improved succinic acid production capacity than non-overexpressed PALK (pMS3) strain, but it is lower than PALK (pMS3-cgmdh) over-expressing Cg MDH, and eventually Cg MDH among the MDH candidate groups actually has the greatest effect on succinic acid production. It proves that it gives.
  • PALK (pMS3-cgmdh Q20G ) strains and PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strains were used to confirm in vivo that the differences in substrate inhibition and activity of Cg MDH and Ms MDH identified in vitro are due to structural differences in enzymes.
  • PALK (pMS3-cgmdh Q20G ) strain 79.39 g / L succinic acid was produced with a yield and productivity of 1.00 mol / mol glucose and 3.27 g / L / h, respectively (FIG. 11; Table 1). .
  • the succinic acid production capacity was significantly reduced than that of the PALK (pMS3-cgmdh) strain, which is consistent with the in vitro results showing that glutamine at position 20 described above is an important part of CgMDH activity.
  • the genetic variation as shown in the present invention is commonly applicable for the construction of a succinic acid overproducing strain.
  • Basfia genus isolated from the rumen of the cow such as the Mannheimia genus
  • Mannheimia genus was originally named Mannheimia genus when isolated, but later separated into the Basfia genus, and the Mannheimia and Basfia strains have a size of 2,314,078 bp and 2,340,000 bp, which are almost the same.
  • the ratio of G and C in the base sequence is consistent with 42.5 mol% of both strains.
  • the overall gene has 95% homology, especially among 2,380 ORFs in Mannheimia and 2,363 ORFs in Basfia , 2006 ORFs. It should be noted that 2006 ORFs with this homology are known as key genomes. Since the 16S rRNA sequence is also a very similar strain such as 99.8% matching, this invention is collectively referred to as Mannheimia (Ahn et al ., Curr. Opin. Biotech., 42: 54-66., 2016; Scholten et. al ., WO2009 / 024294A1; Kuhnert et al ., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60:44., 2010). That is, in the present invention, the Mannheimia genus includes the Basfia genus, which has recently been found to be substantially the same genus.
  • Cg MDH which showed the best effect in the present invention
  • E. coli and C. glutamicum which are the most representative industrial succinic acid production strains excluding lumen bacteria, and the effect was confirmed.
  • E overexpressing Cg MDH in each strain The coli W3110 (p100pro99A-cgmdh) strain and the C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) strain showed significantly improved succinic acid production capacity compared to the conventional E. coli W3110 strain and the wild-type C. glutamicum strain (Table 2).
  • PALK (pMS3-cgmdh) and PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strains MDH naturally present in the M. succiniciproducens
  • PALK (KCTC10973BP) strain is PALK The (pMS3-cgmdh) strain and the PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strain did not significantly affect succinic acid overproduction .
  • succiniciproducens PALK (pMS3-cgmdh) strain and PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strain is also derived from Cg MDH and Ms MDH G11Q with reduced substrate inhibition.
  • the present invention is a mutant microorganism in which a gene encoding malic acid dehydrogenase is introduced into a microorganism having succinic acid generating ability in a consistent manner, wherein the malic acid dehydrogenase is located at the end of the first alpha helix and is an amide functional group of the central chain. It relates to a mutant microorganism characterized in that the amino acid residue that interacts with the pyrophosphate portion of NADH is glutamine (Gln).
  • the interaction means a bond in which the amide functional group of the central chain of malic acid dehydrogenase stabilizes the pyrophosphate portion of NADH through electrical attraction.
  • the malic acid dehydrogenase is i) Malic acid dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40; Or ii) a malic acid dehydrogenase in which the eleventh amino acid is substituted with glutamine in maleic acid dehydrogenase derived from S. chycinii discourseense represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the malic acid dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41, and ii) the malic acid dehydrogenase derived from the Manamiia succiniprodense.
  • the gene to be encoded may be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43, but is not limited thereto.
  • amino acid sequence substantially identical to an enzyme to be carried out in the present invention and a base sequence encoding the same fall within the scope of the present invention.
  • Substantially identical refers to proteins that share structural characteristics or have the same function as used in the present invention, including cases where the homology of the amino acid or nucleotide sequence is very high, and otherwise, regardless of the homology of the sequence.
  • the present invention may also include fragments of enzymes partially deleted or nucleotide sequences encoding the sequences other than those constituting the core of the present invention, and thus, the present invention is the same as those used in the present invention regardless of the length of the fragments. Both amino acid or nucleotide sequences having the same function are included.
  • Corynebacterium glutamicum-derived malic acid dehydrogenase may be represented by SEQ ID NO: 40 below.
  • a gene encoding malic acid dehydrogenase derived from Corynebacterium glutamicum may be represented by SEQ ID NO: 41.
  • the maleic acid dehydrogenase derived from S. prosense of Manamiia can be represented by SEQ ID NO: 42 below.
  • SEQ ID NO: 42 the maleic acid dehydrogenase derived from S. prosense of Manamiia.
  • a gene encoding malic acid dehydrogenase derived from S. chycinii may be represented by SEQ ID NO: 43 below.
  • the malic acid dehydrogenase in which the eleventh amino acid of the maleic acid dehydrogenase derived from Maniamia succiniprodense represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 is substituted with glutamine is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 You can.
  • the gene encoding malic acid dehydrogenase derived from S. chycinii accordingense represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44, may be represented by the base sequence of SEQ ID NO: 45.
  • the microorganism having the ability to produce succinic acid is the microorganism having the ability to produce succinic acid, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., Anaerobiospirillum sp. , E. coli , and Corynebacterium sp. May be selected from the group consisting of.
  • the microorganism having the ability to produce succinic acid may be characterized as Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP), a gene encoding a lactic acid dehydrogenase to a very similar Basfia genus Mannheimia succiniciproducens , encoding a phosphotransacetylase It may be a mutant strain of the genus Basfia that deleted the gene and the gene encoding the kinase acetate.
  • Mannheimia succiniciproducens PALK KCTC10973BP
  • a gene encoding a lactic acid dehydrogenase to a very similar Basfia genus Mannheimia succiniciproducens encoding a phosphotransacetylase It may be a mutant strain of the genus Basfia that deleted the gene and the gene encoding the kinase acetate.
  • succinic acid was prepared with improved productivity under anaerobic conditions by inoculating the constructed PALKcgmdh strain at a high concentration.
  • succinic acid was prepared with improved productivity under anaerobic conditions by inoculating the constructed PALKcgmdh strain at a high concentration.
  • fed-batch fermentation resulted in 134.25 g / L succinic acid of 1.32 mol / mol glucose and 10.32 g / L / respectively.
  • h yield and productivity (Fig. 14; Table 1).
  • the present invention is another aspect,
  • (B) relates to a method for producing succinic acid comprising the step of recovering the produced succinic acid.
  • the culture may be characterized by using i) glucose, ii) sucrose, iii) glycerol, iv) glucose and glycerol, or v) sucrose and glycerol as carbon sources, and the culture is accused It may be characterized in that it is carried out in miracle conditions, the culture may be characterized in that the initial concentration of the mutant microorganism is concentrated to OD600 15 to 25 and cultured, but is not limited thereto.
  • the inoculum method (hereinafter referred to as the 'Innocuum method') or the membrane cell recycling bioreactor (MCRB) method (hereinafter referred to as the 'MCRB method') injecting a high concentration of mutant microorganisms upon inoculation. It may be characterized by including the method performed.
  • the mutant microorganism may be characterized by culturing in a medium of pH 6.0-7.0, but is not limited thereto.
  • microorganisms of the genus Mannheimia which are succinic acid-producing microorganisms, are exemplified as host cells for substituting or overexpressing the gene according to the present invention. It will be obvious to those skilled in the art that a mutant microorganism can be obtained.
  • Ms MDH, Cg MDH, Ec MDH, Sc MDHc, Sc MDHm, Sc MDHp, Yl MDH overexpression vectors (pET30a: Ms MDH, pET30a: Cg MDH, pET30a: Ec MDH, pET30a: Sc MDHc, pET30a: Sc MDHm, pET30a: Construction of Sc MDHp, pET30a: Yl MDH and variant enzyme overexpression vectors (pET30a: Ms MDH G11Q , pET30a: Cg MDH Q20G , pET30a: Ms MDH L101Q , pET30a: Cg MDH Q117L , pET30a: Ms MDH A224S , pET30a: C S242A ) production
  • MDH of each succinic acid-producing microorganism was over-expressed in E. coli to produce each over-expression vector.
  • PCR was performed using genomic DNA of M. succiniciproducens, C. glutamicum, E. coli K12, and Y. lipolytica using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, respectively.
  • PCR product thus obtained was cut with NdeI and XhoI restriction enzymes, and then cloned into NdeI and XhoI sites of pET30a (Merck Millipore) to complete the overexpression vectors pET30a: Ms MDH, pET30a: Cg MDH, pET30a: Ec MDH, pET30a: Yl MDH. .
  • S. cerevisiae origin of three MDH (Sc MDHc, MDHm Sc, Sc MDHp) using the primers corresponding to the over-expression vector, each SEQ ID NO: 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14 to produce a both S. cerevisiae PCR was performed using the genome of as a template.
  • the PCR products thus obtained were cut with NdeI and XhoI restriction enzymes and cloned into NdeI and XhoI sites of pET30a to produce overexpression vectors pET30a: ScMDHc, pET30a: ScMDHm, and pET30a: ScMDHp.
  • SEQ ID NO: 10 5'-GCGCCTCGAGAGATGATGCAGATCTCGATGCAAC
  • SEQ ID NO: 13 5'-GCGCCATATGGTCAAAGTCGCAATTCTTGGCGCT
  • SEQ ID NO: 14 5'-GCGCCTCGAGTAGCTTGGAAGAGTCTAGGATGAA
  • Primers of SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, and 20, respectively, to construct vectors capable of overexpressing Ms MDH mutant enzymes (pET30a: Ms MDH G11Q , pET30a: Ms MDH L101Q , pET30a: Ms MDH A224S ), respectively.
  • PCR was performed using pET30a: Ms MDH as a template.
  • the PCR product thus obtained was transformed into E. coli and extracted by selectively growing in LB (Luria-Bertani) solid medium containing kanamycin.
  • Cg MDH mutant enzyme vector capable of overexpressing the respective SEQ ID NO: to produce a (pET30a: Cg MDH S242A Cg MDH Q20G, pET30a:: Cg MDH Q117L, pET30a) 21 and 22, 23 and 24, 25 and 26 PCR was performed using pET30a: Cg MDH as a template using primers.
  • the PCR product thus obtained was transformed into E. coli and selectively grown in LB solid medium containing kanamycin and extracted. Finally, sequencing was performed to confirm that the mutation was successful.
  • SEQ ID NO: 15 5'-CTAGGTGCCGCAGGCCAGATTGGTCAAGCGTTG
  • SEQ ID NO: 16 5'-CAACGCTTGACCAATCTGGCCTGCGGCACCTAG
  • SEQ ID NO: 17 5'-GGTATTATTCGTAGTCAGACCGAAAAAGTGGCG
  • SEQ ID NO: 18 5'-CGCCACTTTTTCGGTCTGACTACGAATAATACC
  • SEQ ID NO: 19 5'-GCGGGCGGCGGTTCTTCAACCTTATCTATGGCG
  • SEQ ID NO: 20 5'-CGCCATAGATAAGGTTGAAGAACCGCCGCCCGC
  • SEQ ID NO: 21 5'-ACCGGCGCAGCTGGTGGCATCTCTTATTCACTG
  • SEQ ID NO: 22 5'-CAGTGAATAAGAGATGCCACCAGCTGCGCCGGT
  • SEQ ID NO: 24 5'-CATTGATAGCTTTACCCAGAGGTCCGAAAATCTT
  • Ms MDH G11Q , Cg MDH Q20G , Ms MDH L101Q , Cg MDH Q117L , Cg MDH S242A mutant enzyme proteins
  • the overexpression vector prepared in Example 1 (pET30a: Ms MDH, pET30a: Cg MDH, pET30a: Ec MDH, pET30a: Yl MDH) was transformed into E. coli BL21 (DE3) -T1R to obtain 100 ⁇ g / mL kanamycin. After incubation at 37 ° C in the containing LB medium, expression was induced with IPTG when OD 600 reached 0.6. After induction of expression, cultured at 18 ° C. for 20 hours so that the corresponding enzyme proteins were expressed.
  • the cells were harvested by centrifuging the culture solution at 5,000 g for 15 minutes at 4 ° C., and then re-released in buffer A (40 mM Tris-HCl, pH 8.0) kept cold in ice to break the cells with sonic crushing. Cell debris was removed from the thus obtained cell debris through 11,000 g centrifugation for 1 hour. The finally obtained supernatant was bound to Ni-NTA agarose beads to selectively purify MDH proteins with histidine tags through affinity chromatography. After washing the rest of the non-specific binding proteins with buffer A containing imidazole at a low concentration of 20 mM, the target proteins were eluted using buffer A containing 300 mM imidazole.
  • buffer A 40 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • high purity MDH proteins For further purification to obtain high purity protein, more than 95% high purity MDH proteins could be obtained through ion exchange chromatography using HiTrap Q and size exclusion chromatography.
  • the above purified MDH proteins were diluted in the concentration of 3 nM described in Example 3 and used in the activity measurement.
  • Cg MDH and Ms MDH proteins were finally concentrated to 54 mg / mL and 42 mg / mL, respectively, to perform crystallization. Did.
  • MDH's oxaloacetic acid reducing activity a reducing power called NADH is consumed as a cofactor, and as a result, NAD + is generated.
  • NADH a reducing power
  • NAD + is generated.
  • the composition of the final reaction solution for comparative activity determination was as follows: 0.1 M Tris-Hcl (pH 8.0), 100 ⁇ M NADH, 100 ⁇ M oxaloacetic acid, finally 3 nM purified MDH ( Ms MDH, Cg MDH, Ec MDH, Yl MDH).
  • the composition of the final reaction solution for measuring the activity of the mutant enzymes was the same as that for comparative activity measurement.
  • the final reaction solution for comparison of kinetics activity was measured by changing the concentration of oxaloacetic acid and the concentration of NADH under the above conditions, and when measuring the kinetics of oxaloacetic acid, the concentration of NADH was 200 ⁇ M.
  • the concentration of oxaloacetic acid was fixed at 100 ⁇ M and measured.
  • the graph shows the concentration of oxaloacetic acid converted per minute ( ⁇ M) at an initial rate by calculating the amount of NADH that decreases during the initial reaction time after the enzyme is added as an extinction coefficient.
  • ⁇ M concentration of oxaloacetic acid converted per minute
  • crystallization was performed with the substrates NAD + and malic acid to obtain crystals under the same conditions.
  • Ms MDH X-ray diffraction experiments were performed by obtaining high quality crystals of 0.3 x 0.3 x 0.1 mm at 16% PEG3350 and 8% Tacsimate pH 6.0.
  • crystallization was performed with the substrate NAD + to obtain Ms MDH substrate binding crystals under the same conditions.
  • Ms MDH, Cg MDH, Cg MDH Q20G , Ms MDH G11Q overexpression vectors pMS3-msmdh, pMS3-cgmdh, pMS3-cgmdh Q20G , pMS3-msmdh G11Q
  • PALK pMS3-msmdh
  • PALK pMS3- cgmdh
  • MDH of each succinic acid-producing microorganism was over-expressed to investigate its effects, and over-expressed MDH based on structural analysis was used to construct each over-expression vector.
  • the genome of M. succiniciproducens was used as a template and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 (Jang et al ., Appl. Environ. Microb. 73 (17): 5411-5420., 2007) to complete the pMS3-msmdh vector.
  • the genome of C. glutamicum was used as a template and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-cgmdh vector.
  • PCR was performed using the Cg MDH Q20G gene fragment as a template and primers of SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-cgmdh Q20G vector.
  • PCR was performed using the Ms MDH G11Q gene fragment as a template and using the primers of SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • the resulting PCR product was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-msmdh G11Q vector.
  • SEQ ID NO: 27 5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGAATTCATGAAAGTTGCAGTTCTAG
  • SEQ ID NO: 28 5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTAACCGTTAATAAAATCTTCAC
  • SEQ ID NO: 29 5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAATTCCCCGCAGAAC
  • SEQ ID NO: 30 5'-GGATCCCCGGGTACCGAGCTTTAGAGCAAGTCGCGCAC
  • PALK succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) was spread on a BHI (Brain-Heart Infusion) solid medium, incubated at 39 ° C for 36 hours, and colonies were inoculated in 10 mL of BHI liquid medium. And cultured for 12 hours. The sufficiently grown cell culture solution was inoculated again in 1 mL of 100 mL of BHI liquid medium and cultured in a 39 ° C stationary incubator.
  • the bacterial culture solution is placed at 0 ⁇ 4 ° C for 20 minutes to prevent the cell growth from proceeding, and this is 4 ° C, 4,500 rpm Cells were obtained by centrifugation at 15 min. Then, the cells were resuspended with 200 mL of 10% glycerol solution at 4 ° C., and then centrifuged again under the same conditions as above, and the resuspension and centrifugation were performed three times while reducing the 10% glycerol solution in half. .
  • the resulting cell was resuspended in 10% glycerol solution of the same volume, dispensed, and stored at -80 ° C. Transformation of M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) into the vector by performing electroporation under the conditions of 2.5 kV, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ by mixing the obtained cell concentrate suspension and 4 types of overexpression vectors prepared in this example, respectively. Tried. Cells electroporated in this way were added to BHI liquid medium, recovered and cultured in a stationary incubator at 39 ° C for 1 hour, and all the culture solution was spread on a BHI solid medium containing 2.5 ⁇ g / mL of antibiotic ampicillin, followed by 48 hours in a stationary incubator at 39 ° C. The culture was abnormal. The introduction of the overexpression vector was confirmed by culturing the mutated strain formed in the medium in a BHI liquid medium containing antibiotics and electrophoresis of the vector obtained using the vector mini-prep.
  • Ec MDH, Zr MDH, Sc MDH2, Sc MDH3 overexpression vectors pMS3-ecmdh, pMS3-zrmdh, pMS3-scmdh2, pMS3-scmdh3 and PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3- zrmdh), PALK (pMS3 -scmdh2), production of PALK (pMS3-scmdh3) strain
  • each overexpression vector was constructed to overexpress MDHs reported in the prior literature to investigate their effects.
  • the genome of E.coli was used as a template and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 46 and 47.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-msmdh vector.
  • PCR was performed using the Zr mdh gene fragment as a template and primers of SEQ ID NOs: 48 and 49.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-cgmdh vector.
  • the Sc MDH2 overexpression vector pMS3-scmdh2 the Sc MDH2 gene fragment was used as a template and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 50 and 51.
  • the obtained PCR product was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-scmdh2 vector.
  • the Sc MDH3 overexpression vector pMS3-scmdh3 the Sc MDH3 gene fragment was used as a template and PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 52 and 53.
  • the PCR product thus obtained was cloned into EcoRI and KpnI sites in pMS3 to complete the pMS3-scmdh3 vector.
  • SEQ ID NO: 46 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTCGCAGTCCTC
  • SEQ ID NO: 47 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTACTTATTAACGAACTCTTCGC
  • SEQ ID NO: 48 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTTGCAATAGTCG
  • SEQ ID NO: 49 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTACAATTTAGCACCGAG
  • SEQ ID NO: 51 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTAAGATGATGCAGATCTCG
  • the cells were resuspended with 200 mL of 10% glycerol solution at 4 ° C., and then centrifuged again under the same conditions as above, and the resuspension and centrifugation were performed three times while reducing the 10% glycerol solution in half. .
  • the resulting cell was resuspended in 10% glycerol solution of the same volume, dispensed, and stored at -80 ° C. Transformation of M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) into the vector by performing electroporation under the conditions of 2.5 kV, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ by mixing the obtained cell concentrate suspension and 4 types of overexpression vectors prepared in this example, respectively. Tried.
  • SEQ ID NO: 54 5'- TCCTAGGTACAGTGCTAGCGATGAATTCCCCGCAGAAC
  • E. coli W3110 p100pro99A-cgmdh
  • C. glutamicum pEKEx1-cgmdh
  • E. coli W3110 was smeared on an LB solid medium, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and colonies were inoculated in 10 mL of LB liquid medium and cultured for 12 hours.
  • the fully grown cell culture solution was inoculated again in 1 mL of 100 mL of LB liquid medium and cultured in a 37 ° C incubator. After about 4 ⁇ 5 hours, when the cell growth is about 0.3 ⁇ 0.5 based on OD 600 , the bacterial culture solution is placed at 0 ⁇ 4 ° C for 20 minutes to prevent the cell growth from proceeding, and this is 4 ° C, 4,500 rpm Cells were obtained by centrifugation at 15 min.
  • the cells were resuspended with 200 mL of 10% glycerol solution at 4 ° C., and then centrifuged again under the same conditions as above, and the resuspension and centrifugation were performed three times while reducing the 10% glycerol solution in half. .
  • the resulting cell was resuspended in 10% glycerol solution of the same volume, dispensed, and stored at -80 ° C.
  • the obtained cell concentrate suspension and the overexpression vector p100pro99A-cgmdh prepared in this example were mixed, and electroporation was performed under conditions of 1.8 kV, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ to attempt transformation of E. coli W3110 with the vector. .
  • PALK KCTC10973BP
  • PALK KCTC10973BP
  • PALK pMS3-msmdh
  • PALK pMS3-msmdh
  • the genes encoding the MDH were deleted and Cg MDH and Ms MDH G11Q substitution vectors pINcgMDH and pINmsMDH G11Q were constructed in which Cg MDH and Ms MDH G11Q were encoded.
  • pSacHR06 containing the sacB gene was cut with XhoI and SacI . Since the genome of the M.
  • PALK succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) strain as a template for the front and rear sequences of the MDH coding gene present on the genome as a template
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 31 and 32 and SEQ ID NOs: 38 and 39, respectively.
  • the lox66-cat-lox77 cassette was obtained by performing PCR using primers of SEQ ID NOs: 36 and 37 as a template containing a chloramphenicol resistance gene.
  • the Cg MDH gene was obtained by performing PCR using the pMS3-cgmdh vector prepared in Example 5 as a template and using the primers of SEQ ID NOs: 33 and 35.
  • SEQ ID NO: 31 5'-TTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGCCTTATGTGGACCGAGAAGA
  • SEQ ID NO: 33 5'-CTATTCTGTTGGCTAATGCC
  • SEQ ID NO: 34 5'-TGTAGCCGCGTTCTAACGACTACGAATAATACCCGCAT
  • SEQ ID NO: 36 5'-CGTTAGAACGCGGCTACA
  • SEQ ID NO: 37 5'-ATAGGGAGACCGGCAGATC
  • SEQ ID NO: 38 5'-GATCTGCCGGTCTCCCTATTTAAGACTCCTTAATGTGGA
  • SEQ ID NO: 39 5'-GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCGCGTTAGTTGTTGAGTTAAT
  • M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) was spread on a BHI solid medium, incubated at 39 ° C. for 3 hours, and then colonies were inoculated in 10 mL of BHI liquid medium and cultured for 1 hour.
  • the sufficiently grown cell culture solution was inoculated with 1 mL of 100 mL of BHI liquid medium again, and cultured in a stationary incubator at 39 ° C. After 4 ⁇ 5 hours, when the cell growth is about 0.3 ⁇ 0.5 based on OD 600 , place the bacterial culture solution at 0 ⁇ 4 ° C for 2 minutes to prevent cell growth from progressing, and at 4 ° C and 4,500 rpm.
  • Cells were obtained by centrifugation for 15 minutes. Then, the cells were resuspended with 200 mL of 10% glycerol solution at 4 ° C., and then centrifuged again under the same conditions as above, and the resuspension and centrifugation were performed three times while reducing the 10% glycerol solution in half. . The resulting cell was resuspended in 10% glycerol solution of the same volume, dispensed, and stored at -80 ° C.
  • the obtained cell concentrate suspension and the gene removal vectors pINcgMDH and pINmsMDH G11Q prepared in this example were mixed, respectively, and electroporation was performed under the conditions of 2.5 kV, 25 ⁇ F, and 200 ⁇ to perform M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) as the vector.
  • the transformation was attempted. Cells electroporated in this way were added BHI liquid medium, recovered and cultured in a stationary incubator at 39 ° C. for 1 hour, and then, the culture solution was spread on a BHI solid medium containing 6.8 ⁇ g / mL antibiotic chloramphenicol, followed by 48 hours in a stationary incubator at 39 ° C. The culture was abnormal.
  • the mutant strain formed in the medium was cultured in a BHI liquid medium containing antibiotics, and genomic DNA of the culture strain was analyzed. PCR was performed using genomic DNA as a template for the isolated mutant strain, and then electrophoresis of the obtained PCR product was performed to confirm the deletion of the MDH gene of genomic DNA and the introduction of Cg MDH or Ms MDH G11Q .
  • PALK pMS3-msmdh
  • PALK pMS3-cgmdh
  • PALK pMS3-cgmdh Q20G
  • PALK pMS3-msmdh G11Q
  • the M. succiniciproducens PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3-cgmdh), PALK (pMS3-cgmdh Q20G ) and PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strains prepared in Example 5 were 20 mL MH5 medium (per liter, 2.5 g Yeast extract, 2.5 g polypeptone, 1 g NaCl, 0.02 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.2 g MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, and 8.709 g K 2 HPO 4 ) 10 g of separately sterilized glucose or glycerol as a carbon source After inoculating at a concentration of / L and incubating for 8 hours at 39 ° C under anaerobic conditions, the mixture was transferred to 270 mL of the same medium and cultured.
  • MH5 medium per liter, 2.5 g Yeast extract, 2.5 g polypeptone
  • the culture medium was mixed with 2.5 L of synthetic medium (per liter, 1 g NaCl, 2 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.02 g CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.2 g MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, 8.709 g K 2 HPO 4, 0.5 g cysteine, 0.5 g methionine, 0.5 g alanine, 0.5 g asparagine, 0.5 g aspartic acid, 0.5 g proline, 0.5 g serine, 0.005 g nicotinic acid, 0.005 g Ca-pantothenate, 0.005 g pyridoxine ⁇ HCl, 0.005 g thiamine, 0.005 g ascorbic acid and 0.005 g biotin) were inoculated in a microbial reactor (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., NJ, USA), and fermentation conditions were 18.2 g / L (100 mM
  • Samples were periodically collected from the bioreactor during the fermentation process, and the collected samples were centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, and the concentrations of various metabolites and succinic acids, glucose and glycerol in the supernatant were analyzed by liquid chromatography.
  • the PALK (pMS3-msmdh) strains yielded 79.07 g / L succinic acid and a yield of 1.23 mol / mol glucose and 3.26 g / L / h, respectively. Produced with productivity.
  • the PALK (pMS3-cgmdh) strain produced 87.23 g / L succinic acid with 1.29 mol / mol glucose and 3.6 g / L / h yield and productivity, respectively.
  • the PALK (pMS3-cgmdh Q20G ) strain produced 79.39 g / L succinic acid with a yield and productivity of 1.00 mol / mol glucose and 3.27 g / L / h, respectively. Finally, 84.19 g / L succinic acid was produced with a yield and productivity of 1.08 mol / mol glucose and 3.48 g / L / h, respectively, as a result of fed-batch fermentation of the PALK (pMS3-msmdh G11Q ) strain.
  • PALK pMS3- cgmdh
  • PALK pMS3-msmdh G11Q
  • PALK KCTC10973BP
  • PALK pMS3-ecmdh
  • PALK pMS3-zrmdh
  • PALK pMS3-scmdh2
  • PALK pMS3-scmdh3
  • PALK pMS3-ecmdh
  • PALK pMS3-zrmdh
  • PALK pMS3-scmdh2
  • PALK pMS3-scmdh3
  • PALK pMS3-scmdh3
  • Glucose sterilized separately as a carbon source was inoculated at a concentration of 10 g / L, and cultured for 8 hours at 39 ° C. under anaerobic conditions, and then transferred to 270 mL of the same medium and cultured.
  • Fermentation was performed by inoculating the above-described culture solution into a microbial reactor containing 2.5 L of synthetic medium as in Example 9, and the fermentation conditions were 18.2 g / L (100 mM) initial glucose concentration, and a temperature of 39 ° C and 200 rpm. It was fermented while supplying pure carbon dioxide at a rate of 0.2 vvm. During fermentation, pH was adjusted to 6.5 using 1.57 M ammonia water and 6.84 M magnesium hydroxide solution, and antibiotics were added 25 ⁇ g / mL kanamycin and 25 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the PALK (pMS3-ecmdh) strain produced 79.05 g / L succinic acid with a yield of 1.29 mol / mol glucose and 3.27 g / L / h, respectively, and productivity.
  • the PALK (pMS3-zrmdh) strain produced 76.11 g / L succinic acid with 1.25 mol / mol glucose and 3.15 g / L / h yield and productivity, respectively.
  • the PALK (pMS3-scmdh2) strain produced 77.34 g / L succinic acid with yield and productivity of 1.16 mol / mol glucose and 3.19 g / L / h, respectively.
  • the E. coli W3110 (p100pro99A-cgmdh) strain and the E. coli W3110 strain prepared in Example 7 were inoculated with 10 g LB medium separately sterilized as a carbon source at a concentration of 3 g / L and inoculated at 37 ° C. After incubation for 16 hours, the mixture was transferred to 100 mL of the same medium and cultured. The initial cell concentration was inoculated according to OD 600 standard 0.2 ⁇ 0.25, and carbon dioxide was sufficiently filled in the upper part of the flask, and incubated for 16 hours at 37 ° C under anaerobic conditions. As an antibiotic, ampicillin 25 ⁇ g / mL was added.
  • the produced C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) strain and wild-type C. glutamicum strain were inoculated in a 10 mL BHIS liquid medium, incubated at 30 ° C. for 18 hours, and then transferred to 100 mL of the same medium and cultured.
  • the initial cell concentration was inoculated according to OD 600 standard 0.2 ⁇ 0.25, and incubated in an aerobic environment for the initial 6 hours for cell growth, and then incubated for 10 hours at 30 ° C. under anaerobic conditions by sufficiently filling the top of the flask with carbon dioxide.
  • As an antibiotic 25 ⁇ g / mL kanamycin was added.
  • PALKcgmdh After inoculating M. succiniciproducens PALKcgmdh, PALKmsmdh G11Q prepared in Example 8 into sterilized glucose or glycerol separately as a carbon source in a 20 mL MH5 medium at a concentration of 10 g / L and incubating for 8 hours at 39 ° C under anaerobic conditions. , It was transferred to the same medium 270 mL and cultured.
  • Fermentation was carried out by inoculating the culture solution in a microbial reactor containing 2.5 L of synthetic medium as in Example 9, the fermentation conditions are 18.2 g / L (100 mM) initial glucose concentration, 4.6 g / L when using glycerol (50 mM) As an initial glycerol concentration, fermentation while supplying pure carbon dioxide at a rate of 0.2 vvm at a temperature of 39 ° C. and 200 rpm. During fermentation, pH was adjusted to 6.5 using 1.57 M ammonia water and 6.84 M magnesium hydroxide solution, and antibiotics were added 25 ⁇ g / mL kanamycin and 6.8 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • the PALKcgmdh strain produced 89.6 g / L succinic acid with a yield and productivity of 1.28 mol / mol glucose and 3.71 g / L / h, respectively, and PALKmsmdh
  • the G11Q strain produced 82.76 g / L succinic acid with 1.13 mol / mol glucose and 3.42 g / L / h yield and productivity, respectively.
  • the PALKcgmdh strain produced 101.18 g / L succinic acid with a yield of 1.37 mol / mol glucose and 4.18 g / L / h and productivity, respectively, and the PALKmsmdh G11Q strain had 92.5 g / L succinic acid Was produced with a yield and productivity of 1.28 mol / mol glucose and 3.82 g / L / h, respectively.
  • the PALKcgmdh strain reaches maximum productivity after 11-13 hours after inoculation, and it can be seen that the cell concentration at this time has increased to the maximum. Therefore, in order to maximize productivity, we first looked at the changes in productivity when the cell concentration was higher than the current level.
  • the cell pellet was resuspended in 200 mL of the same synthetic medium to obtain a high concentration of inoclulum. This was the same as the condition of Example 9 by inoculation, but as a result of culturing the initial glucose and glycerol by doubling the concentration, as shown in FIG. 14 and Table 1, the succinic acid productivity was 10.32 g / L / h and the highest productivity was 15.72 g It was found that / L / h increased more than 2 times compared to the original fermentation conditions.
  • the succinic acid-producing mutant microorganism according to the present invention expresses malic acid dehydrogenase having an amino acid residue glutamine (Gln) that interacts with the pyrophosphate portion of NADH through an amide functional group in the central chain, thereby significantly converting oxaloacetic acid to malic acid. Because of the increase, it is possible to produce high concentrations of succinic acid with the highest succinic acid productivity reported to date when culturing microorganisms under restricted media. In addition, advanced fermentation technology can be used to produce succinic acid with greater productivity and production concentration.
  • Gln amino acid residue glutamine

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Abstract

본 발명은 중심 사슬의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민 (Gln)인 것을 특징으로 하는 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환 활성이 향상된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 숙신산 생성 변이 미생물은 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환 활성이 현저히 증가되기 때문에 제한 배지 하에서 미생물을 배양시 현재까지 보고된 변이 미생물에 비해 가장 높은 숙신산 생산성으로 고농도의 숙신산을 생산할 수 있다. 더불어 심화된 발효 기술을 사용하여 더 뛰어난 생산성 및 생산 농도로 숙신산을 생산할 수 있다.

Description

고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
본 발명은 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 중심 사슬 (main-chain)의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민(Gln)인 것을 특징으로 하는 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환 활성이 향상된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법에 관한 것이다.
최근 대두되는 환경 문제로 인해 기존의 화석연료를 기반으로 하는 유용 화합물 생산을 대체하려는 노력이 많이 이루어지고 있다. 이에 따라 재생 가능한 바이오매스로부터 바이오 기반 숙신산을 생산하고자 하는 연구가 전 세계적으로 진행되었다. 숙신산은 탄소수 4개의 디카르복실산으로 1,4-butanediol, γ-butyrolactone, diethyl succinate, N-methyl-2-pyrollidone, tetrahydrofuran 등의 산업적 가치가 뛰어난 화합물의 전구체로 사용되며 다양한 폴리머의 단량체로 사용되기도 하는 유용 화합물이다. 숙신산의 이러한 중요성이 부각되며 Actinobacillus succinogens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Escherichia coli, Mannheimia succiniciproducens, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica 등의 다양한 미생물을 사용하여 숙신산을 바이오 기반으로 생산하는 방법이 많이 연구되고 있다.
숙신산 생산 균주 개량은 숙신산 생산 균주의 대사 흐름을 바꾸는 것으로 이루어졌으며 그 전략은 탄소 대사를 강화하고 부산물의 생성을 없애거나 줄임으로써 숙신산으로의 흐름을 증강하는 것이었다. 즉, 숙신산 대사 흐름에 관여하는 유전자를 도입 또는 강화하거나 숙신산 대사 흐름을 저해하는 유전자를 결손 또는 약화시킴으로써 숙신산 생산을 증가시키게 된다. 숙신산 대사 흐름에 관여하는 유전자로 말산 탈수소효소는 숙신산 생산을 증가시키기 위해 도입되는 효소로 이미 이를 도입하여 숙신산 생산을 증가시키는 연구가 진행된 바 있다. 예를 들어, 말산 탈수소효소 (MDH)는 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환을 촉진시키며 이 효소는 여러 대사회로들로부터 전해온 흐름을 숙신산 생산으로의 흐름으로 전환하는 중요한 역할을 가지고 있으며, A. thaliana 유래의 MDH (Kim et al., Biotechnology journal, 12(2), 1600701.), S. cerevisiae 유래의 MDH (US20110229945A1, US20120040422A1, US20150057425A1, US20130302866A1), R. delemar 유래의 MDH (US20140363862A1), E. coli 유래의 MDH (Wang et al., Bioprocess Biosyst Eng 2009, 32:737-745., Liang et al., Biotechnology letters, 33(12), 2439-2444.)를 미생물에 도입하여 숙신산의 생산량을 증가시키고자 하는 시도가 있었다. 그러나, 상기 미생물 유래의 MDH를 도입하여도 숙신산 생산성이 낮아 추가 균주 조작 또는 숙신산 생산 발효 공정의 최적화를 통해 숙신산의 생산성을 증가시키기 위한 시도가 있었으나 (Ahn et al., Curr. Opin. Biotechnol., 42: 54-66), 추가적인 개선의 필요가 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 숙신산 생산성을 종래에 비해 현저히 향상시킬 수 있는 방법을 모색하였고, 숙신산 생산에 관여하는 주요 효소들에 대한 반응 속도 및 구조 연구가 아직 많이 이루어지지 않았다는 점에 착안하여 M. succiniciproducens를 포함하는 루멘박테리아와 숙신산 생산 미생물들의 주요 효소들에 대한 구조 분석을 진행하였다. 그 결과, 본 발명에서는 기질 저해 작용이 완화된 MDH를 도입하여 고생산성의 숙신산 생산 균주를 개발하고자, 최초로 Corynebacterium glutamicum 및 M. succiniciproducens MDH의 구조를 밝혀냈으며 이들을 이용하는 경우 생산성을 극대화한 숙신산 생산 균주를 개발하는 것이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 숙신산 생성능이 강화된 변이 미생물을 제공하고, 이를 이용하여 숙신산 생성능을 극대화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 생성능을 가지는 미생물에 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 변이 미생물로, 상기 말산 탈수소효소는, 중심 사슬의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민(Gln)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 숙신산 제조방법을 제공한다.
(a) 상기 변이 미생물을 배양하여 숙신산을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 숙신산을 회수하는 단계.
도 1은 숙신산으로의 대사 흐름을 나타낸 모식도 이다.
도 2는 각 MDH의 NADH 전환 속도의 상대값을 나타낸다.
도 3은 CgMDH와 MsMDH의 NADH 기질 농도에 따른 NADH 전환 속도 그래프를 나타낸다.
도 4는 CgMDH와 MsMDH의 옥살로아세트산 기질 농도에 따른 NADH 전환 속도 그래프를 나타낸다.
도 5는 각 기질과 폴리펩타이드 사슬을 다른 색으로 보여준 CgMDH와 MsMDH의 기질 결합 결정 구조를 나타낸다.
도 6은 각 CgMDH와 MsMDH의 구조에서 활성 자리 부근의 아미노산 잔기의 비교를 나타낸다. 왼쪽이 MsMDH 오른쪽이 CgMDH이다. GOL은 글리세롤을 나타내며, MAL은 말산 이온을 나타낸다.
도 7은 각 CgMDH와 MsMDH의 구조에서 NAD+/NADH 결합 자리 부근의 아미노산 잔기의 비교를 나타낸다. 많은 MDH에서 보존된 덮개 구조를 다른 색으로 표현하였다.
도 8은 CgMDH와 MsMDH, 그리고 이들의 변이 효소들에 대한 NADH 전환 속도를 나타낸다.
도 9는 CgMDH와 MsMDH, 그리고 MsMDHG11Q 변이효소의 pH에 따른 NADH 전환속도를 각각 파란색, 빨간색, 노란색으로 나타낸다. BIS-Tris 버퍼를 사용한 조건은 사각형, Tris 버퍼를 사용한 조건은 동그라미, Glycine 버퍼를 사용한 조건은 세모로 표시하였다.
도 10은 pH 6.0, 7.0, 8.0에 대한 CgMDH, MsMDH, MsMDHG11Q의 옥살로아세트산 기질 농도에 따른 NADH 전환 속도 그래프를 나타낸다. 도3에서 이미 제공된 pH 7.0의 CgMDH와 MsMDH의 활성에 대한 정보는 점선으로 표시하였다.
도 11은 M. succiniciproducens PALK (pMS3-msmdh) (A), PALK (pMS3-cgmdh) (B), PALK (pMS3-cgmdhQ20G) (C), 및 PALK (pMS3-msmdhG11Q) (D) 균주를 글루코스를 단일 탄소원으로 이용한 유가식 배양의 성장 및 대사산물 생산 곡선이며, M. succiniciproducens PALK (pMS3-cgmdh) 균주를 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 이용한 (E) 유가식 배양의 성장 및 대사산물 생산 곡선이다.
도 12는 M. succiniciproducens PALK (pMS3-scmdh2) (A), PALK (pMS3-scmdh3) (B), PALK (pMS3-ecmdh) (C), PALK (pMS3-zrmdh) (D) 균주를 글루코스를 단일 탄소원으로 이용한 유가식 배양의 성장 및 대사산물 생산 곡선이다.
도 13은 M. succiniciproducens PALKcgmdh 균주를 글루코스를 단일 탄소원으로 이용해 (A) 글리세롤과 함께 이용해 (C), M. succiniciproducens PALKmsmdhG11Q 균주를 글루코스를 단일 탄소원으로 이용해 (B), 글리세롤과 함께 이용해 (D) 수행한 유가식 배양의 성장 및 대사산물 생산 곡선이다.
도 14는 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주 (A) 및 PALKcgmdh 균주 (B)의 접종량을 증가시킨 유가식 배양의 성장 및 대사산물 생산 곡선이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 숙신산으로의 대사 흐름을 강화하고 결과적으로 숙신산을 과생산하게 하기 위한 효소 후보군 중 MDH를 선정하였다. MDH는 mdh 유전자로 암호화 되어 있으며 이는 옥살로아세트산을 기질로 하는 효소이다 (도 1). 숙신산 생산에 사용되는 균주들이 가지는 MDH의 효과를 알아보고 이들 중 MDH의 기질인 옥살로아세트산을 가장 효과적으로 전환하는 MDH를 찾기 위해 M. succiniciproducens 균주의 MDH (MsMDH), C. glutamicum 균주의 MDH (CgMDH), E. coli 균주의 MDH (EcMDH), A. succinogenes 균주의 MDH (AsMDH), S. cerevisiae 균주의 세포질, 미토콘드리아, 퍼옥시좀 각각의 MDH (ScMDHc, ScMDHm, 그리고 ScMDHp), Y. lipolitica 균주의 MDH (YlMDH), 총 8 가지를 선택하였으며 이중 MsMDH, CgMDH, EcMDH 그리고 YlMDH만이 대장균에서 성공적으로 발현 및 정제되었다. 네 가지 MDH에 대해 옥살로아세트산과 NADH 100 μM을 각각 기질과 보조인자로 사용하여 각각의 활성을 비교해보았으며, 그 결과 CgMDH가 가장 높은 옥살로아세트산 환원 속도를 가지는 것으로 드러났다 (도 2). 이는 MsMDH의 5배에 달하는 활성이며 이어서 YlMDH와 EcMDH의 순으로 활성이 높았으며 이들 또한 MsMDH에 비해 2배 이상의 활성을 보이는 것으로 드러났다 (도 2). 흥미로운 점은 MsMDH가 자연적으로 숙신산을 생산하는 M. succiniciproducens의 MDH임에도 자연적으로 숙신산을 생산하는 박테리아가 아닌 C. glutamicum과 E. coli에서 유래한 CgMDH와 EcMDH가 더 좋은 활성을 보였다는 점이다. 이 결과는 MsMDH가 아닌 CgMDH와 EcMDH를 M. succiniciproducens에 도입하였을 때 더 효과적으로 숙신산을 생산할 수 있다는 가능성을 보여주는 것이다.
위 효소들의 활성에 관한 결과를 좀 더 자세히 살펴보기 위해 가장 활성이 높고 낮았던 두 MDH의 반응속도론적 분석을 진행하였다. Michaelis-Menten 모델에 기초하여 NADH 농도에 관한 초기속도 그래프를 표현하였으며 이는 다시 CgMDH가 MsMDH보다 월등하다는 것을 보여준다 (도 3). 하지만 옥살로아세트산의 농도에 관한 MDH 반응 속도 그래프는 두 MDH 모두, 특히 MsMDH에서, 일반적으로 포화가 되는 그래프를 띄지 않고 기질인 옥살로아세트산으로부터 저해작용을 받는 것으로 보이는 형태를 띄었다 (도 4). 이러한 기질 저해 작용 현상은 반세기 전부터 여러 탈수소 효소들에서 이미 보고된 바 있다 (Raval et al., Biochemistry., 2(2):220-224., 1963). 여러 탈수소 효소에서 제시된 기질 저해 작용의 기작으로는 입체성 다른 자리 억제, 공유 결합의 형성, 또는 효소와의 비생산적/흡착 결합체 생성 등이 있을 수 있다 (Chen et al., Appl. Environ. Microb., 80:3992-4002., 2014). 예를 들면, 돼지 심장 유래의 NAD+/NADH 의존성 MDH가 에놀형 옥살로아세트산과 불활성 결합체를 형성하거나, Phycomyces blackesleeanus 유래 세포질 MDH에서 NADH가 효소와 결합하는 것을 저해하며 결과적으로 효소가 작동하지 않도록 만든다고 알려진 바 있다 (De Arriaga et al., Biochim. Biophys. Acta., 784:158-163., 1984). MsMDH의 효소 활성은 30 μM의 상대적으로 낮은 옥살로아세트산 농도에서부터 저해되기 시작하는 것으로 나타났으며 (도 4), 이러한 기질 저해작용은 여타 MDH에 비해서도 높은 수준인 것으로 드러났다 (도 4). 이러한 결과들을 종합하면, MsMDH는 숙신산 생산에 불리하며, CgMDH가 이 세가지 MDH 중에서 숙신산 생산에 가장 적합한 효소라는 것을 알 수 있다.
분자수준에서 CgMDH가 MsMDH보다 좋은 효소활성을 보이는 이유를 알아내기 위해 두 가지 효소의 결정구조를 규명하였고 또한 기질과 결합체의 구조 또한 규명하였다 (도 5). CgMDH와 MsMDH 모두 호모 다이머를 형성하며 NAD+/NADH 의존성 malate, lactate dehydrogenase 상과에 속한다 (도 5). CgMDH와 MsMDH의 N-말단은 α-helices 옆 나란히 배열된 6 가닥의 β-sheet로 구성된 로스만 접힘을 보이는 반면 C-말단은 α+β fold를 형성한다 (도 5). 두 효소의 활성 부위는 각 말단의 특정 fold 사이에 존재하며 특히 NAD+/NADH 결합 부위는 로스만 접힘과 관련이 있다. 그러나 두 효소의 구조를 비교한 결과 Cα-backbone의 R.M.S.D. 값이 2.772에 이를 정도로 다소 큰 차이를 보였다. 이러한 구조 비교를 통해, 특히 활성 부위 주위에서 효소의 활성에 영향을 줄 수 있는 구조적 차이들을 발견하였다 (도 6, 7). 이러한 차이는 세포질의 MDH와 미토콘드리아의 MDH 간의 큰 차이를 대변하기도 한다. 상응 아미노산 잔기 외에 활성 부위 부근 고리들의 중심 사슬의 길이가 다르기도 하지만, 여기서는 몇몇 핵심 아미노산 잔기가 다르다는 것에 중점을 두었다. 예를 들어, MsMDH의 기질 결합 자리 부근에 위치하는 Ala224와 Leu101, 그리고 Gly11에 상응하는 아미노산 잔기가 CgMDH에서는 각각 Ser242, Gln117, 그리고 Gln20에 해당한다 (도 6, 7). 이러한 구조적 차이들이 중요하게 작용하여 CgMDH와 MsMDH의 반응속도론적 활성의 차이를 만들어 낸 것으로 예상하였다.
일반적으로, 활성이 강한 단백질의 핵심적인 구조적 특징을 타겟에 적용하여 효소 성능을 향상시키는 것이 가능하다. 따라서 상기 기질 결합 부위 부근의 핵심 아미노산 잔기들을 서로 치환하여 활성에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해, 각기 다른 변이효소들을 제작하였다 (MsMDHG11Q, CgMDHQ20G, MsMDHL101Q, CgMDHQ117L, MsMDHA224S, CgMDHS242A). 이들을 E. coli에서 발현시켜 봉입체로 발현된 MsMDHA224S를 제외한 모든 변이 효소들을 성공적으로 정제하였다. CgMDH의 모든 변이효소 (CgMDHQ20G, CgMDHQ117L, CgMDHS242A)는 그 야생형과 비교했을 때 모두 절반 이하로 옥살로아세트산 변환 속도가 감소하였다 (도 8). MsMDHL101Q 또한 MsMDH보다 활성이 줄어들었는데, 변이효소 MsMDHG11Q의 경우 활성이 세 배 가량 향상된 것을 확인하였다 (도 8). 해당 11번 부위의 아미노산 치환이 어떻게 효소 활성에 관여하였는지를 확인하기 위해서, CgMDH, MsMDH, MsMDHG11Q 세 효소를 검토하였다. 먼저 이들의 pH에 따른 활성을 측정하였더니, CgMDH의 최적 pH는 7.0 부근인 것으로 나타났고, MsMDH의 활성은 상대적으로 알칼리성일수록 증가하여 최적 pH가 9.0 부근인 것으로 나타났다 (도 9). 숙신산 생산에 있어서 최적의 pH는 6.5 정도로 상대적으로 산성을 띄기 때문에 (Hong et al., Nat. Biotechnol., 22:1275-1281., 2004), 이러한 조건적인 한계가 숙신산 생산에서 CgMDH보다 MsMDH가 불리하다는 것을 다시 한번 입증하는 셈이다. 또, 위 실험에서 활성이 증가하였던 MsMDHG11Q의 최적 pH는 8.0 부근으로 해당 변이에 의해 최적 pH가 낮아진 것으로 나타났다 (도 9). 추가적인 반응속도론적 활성을 비교하기 위해서 각각의 pH에서 기질 농도에 대한 반응 속도를 측정하였다 (도 10). 전반적으로 MsMDH 및 MsMDHG11Q 변이 효소의 결과에서 두드러지는 것처럼 pH가 낮을수록 강한 기질 저해 작용을 보인다는 것을 확인하였다 (도 10). 이러한 결과에 의해 MsMDH는 최적 pH 9.0에서 기질 저해 작용을 거의 받지 않았고 그 결과 이들 효소 중 가장 높은 활성을 나타냈다 (도 10). 그러나 가장 주목할 만한 것은 MsMDHG11Q 변이 효소의 기질 저해 작용이 MsMDH의 것에 비해 모든 pH에서 크게 감소하였다는 것이다 (도 10). 여러 탈수소 효소들에서 활성 부위의 단일 변이를 통해 기질 저해 작용이 저해되거나 해소되는 것이 보고된 바 있다 (Chen et al., Appl. Environ. Microb., 80:3992-4002., 2014). MDH의 기질 저해 작용이 NADH의 결합에 영향을 준다는 것이 보고된 바 있으며, 해당 11번 자리 또한 NADH의 결합에 직접적으로 관련이 있으므로 (도 7), 아마도 11번과 상호작용하는 NADH의 pyrophosphate 부분이 기질 저해에 밀접한 관련이 있을 것이라고 해석된다. 상기 in vitro 연구를 종합하면, CgMDH가 낮은 pH에서 MsMDH보다 월등히 높은 옥살로아세트산 환원 활성을 지니고 있으며, 숙신산 생산 균주에서 MsMDH대신 CgMDH를 도입했을 때 숙신산의 생산량이 더 증가할 것이라는 예측을 할 수 있었다. 단일 아미노산 잔기 변이를 통하여 어떤 구조적 차이가 이러한 활성의 차이를 가져왔는지 파악하였으며, 특히 MsMDH의 Gly11번 잔기가 해당 효소 단백질의 심각한 기질 저해 작용에 관여하였음을 알 수 있었다. 해당 Gly11번 아미노산 잔기에 상응하는 CgMDH의 Gln20을 본따 MsMDH의 Gly11번을 Gln으로 치환한 MsMDHG11Q 변이효소가 기존의 M. succiniciproducens 야생형 효소보다 월등한 활성을 보였기 때문에, MsMDHG11Q 변이효소 또한 기존의 MsMDH 대신 숙신산 생산 균주에 도입되었을 때 숙신산의 생산량이 증가할 것이라는 예측을 할 수 있었다. 해당 변이 효소의 도입은 외부 유전자를 도입한 것이 아니라 기존의 효소로부터 하나의 아미노산만을 치환한 것이기 때문에 GMO 등의 문제로부터 자유로울 수 있다.
실제로 기질저해작용이 완화된 MDH를 사용하여 숙신산 생산을 향상시키기 위해 in vitro 연구를 바탕으로 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주에 기존 MDH 보다 기질저해작용이 완화된 MDH들이 도입되었다. M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주는 M. succiniciproducens 야생형 균주에서 젖산 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 포스포트랜스아세틸화 효소를 암호화 하는 유전자 및 아세트산키나제를 암호화하는 유전자를 결실시켜 수득되는 균주로, 혐기적 조건에서 숙신산을 제외한 다른 유기산들은 거의 생성하지 않으면서 숙신산만을 고농도로 생산하는 특성을 가지는 숙신산 생성 변이 미생물이다. 기질저해작용이 완화된 MDH들을 도입하여 숙신산 생산이 향상됨을 확인하기 위해 고성능의 MDH를 도입 하기 전에 먼저 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주가 자연적으로 가진 MDH를 과발현한 균주가 개발되었다. 이렇게 개발된 PALK (pMS3-msmdh) 균주는 79.07 g/L의 숙신산을 각각 1.23 mol/mol 글루코스와 3.26 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 11; 표 1). MsMDH가 활성 테스트 중 가장 낮은 활성을 보였기에 MsMDH를 과발현한 상기의 균주는 균주 개량의 효과가 크지 않았고 약간의 숙신산 생산량 증가만을 보여주었다. In vitro 활성 테스트 과정에서 MDH 중 CgMDH가 가장 높은 활성과 낮은 기질저해작용을 보였기 때문에 CgMDH를 과발현한 균주가 개발되었으며, 상기 제작된 PALK (pMS3-cgmdh) 균주는 유가식 발효 결과 87.23 g/L의 숙신산을 각각 1.29 mol/mol 글루코스와 3.6 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 11; 표 1). 상기 PALK (pMS3), PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3-cgmdh)의 유가식 발효 결과는 in vitro 에서 MDH의 활성을 확인한 결과와 일치한다. 특히 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)에 비해 PALK (pMS3-cgmdh)가 보여준 모든 숙신산 생산 지표 (생산 농도, 수율, 생산성)에서의 뛰어난 향상은 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환 향상 외에도 기질저해작용의 완화가 숙신산 생산의 향상을 이끌었다고 할 수 있다.
현재까지 문헌에서 실제로 숙신산 증산을 위해 사용된 MDH 후보군중 CgMDH가 가장 뛰어남을 확인하기 위해 문헌에서 숙신산 증산에 효과가 있다고 보고된 MDH들 (E. coli 유래 EcMDH, Zygosaccharomyces rouxii 유래 ZrMDH, S. serevisiae 유래 ScMDH2 및 ScMDH3)의 효과 또한 in vivo로 검증하였다. 이를 위해 각각의 MDH들을 과발현 한 PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3-zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2), PALK (pMS3-scmdh3) 균주가 구축되었다. 상기 구축된 4종의 MDH 과발현 균주에 대한 유가식 발효 결과 각각 79.05, 76.11, 77.34, 75.15 g/L의 숙신산이 3.27, 3.15, 3.19, 3.1 g/L/h의 생산성과 1.29, 1.25, 1.16, 1.13 mol/mol 글루코스의 수율로 생산되었다. 이와 같은 결과는 MDH가 과발현 되지 않은 PALK (pMS3) 균주보다는 향상된 숙신산 생산능이지만 CgMDH를 과발현 한 PALK (pMS3-cgmdh) 보다는 낮은 수치이며 결국 MDH 후보군 중 CgMDH가 실제로 숙신산 생산에 가장 큰 영향을 준다는 것을 방증한다.
In vitro 에서 확인된 CgMDH와 MsMDH의 기질저해작용과 활성 차이가 효소의 구조적 차이에서 비롯한다는 것을 in vivo 상에서 확인하기 위해 PALK (pMS3-cgmdhQ20G) 균주와 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주가 구축되었다. 상기 구축된 PALK (pMS3-cgmdhQ20G) 균주의 유가식 발효 결과 79.39 g/L의 숙신산을 각각 1.00 mol/mol 글루코스와 3.27 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 11; 표 1). 숙신산 생산능은 PALK (pMS3-cgmdh) 균주보다 현저하게 감소하였으며 이는 상기 설명한 20번째 위치의 글루타민이 CgMDH의 활성에 있어서 중요한 부분임을 보이는 in vitro 결과와 일치한다.
상기 구축된 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 유가식 발효 결과 84.19 g/L의 숙신산을 각각 1.08 mol/mol 글루코스와 3.48 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 11; 표 1). PALK (pMS3-msmdh) 균주에 비해 증가한 숙신산 생산 농도와 생산성은 in vitro 결과와 동일하게 11번째 위치의 글라이신을 글루타민으로 바꾼 것이 효소의 활성을 높이고 기질저해작용을 완화시켰다는 것을 방증한다. 결국 이와 같은 in vivo 결과는 구조 분석에 바탕을 둔 효소 개량이 실제 숙신산 생산 향상에 도움을 줄 수 있다는 것을 보여준다.
특히 본 발명에서 숙신산 증산의 방법으로 사용한 효소인 MDH의 경우에는 루멘 박테리아인 Mannheimia 속, Basfia 속, Actinobacillus 속, 및 Anaerobiospirillum 속은 물론이고 E. coli 및 Corynebacterium 속에서 모두 숙신산 생산에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 (Lee et al., WO2012/030130A2; Liang et al., Biotechnol. Lett., 33(12):2439-2444., 2011; Chen et al., Process. Biochem., 47:1250-1255., 2012) 상기 균주에서 본 발명에서 보여준 것과 같은 유전적 변이는 숙신산 과생산 균주 구축을 위해 공통적으로 적용가능하다. 특히 Mannheimia 속과 같이 소의 반추위에서 isolation 된 Basfia 속은 원래 isolation 될 때 Mannheimia 속으로 명명되었으나 후에 Basfia 속으로 분리되었고, Mannheimia와 Basfia 균주는 2,314,078 bp와 2,340,000 bp의 거의 비슷한 유전자 염기 서열의 크기를 가지고 있으며, 염기서열 중 G와 C의 비율이 두 균주 모두 42.5 mol%로 일치한다. 더불어 유전자 전반적으로는 95%의 상동성을 가지고 있으며, 특히 Mannheimia의 2,380개의 ORF와 Basfia의 2,363개의 ORF 중 2006개의 ORF는 상동성을 가지고 있다. 주목해야 할 점은 이렇게 상동성을 가지는 2006개의 ORF는 핵심 유전체로 알려져있다는 점이다. 16S rRNA 서열도 99.8% 일치하는 등의 매우 유사한 균주이므로 이 발명에서는 이를 모두 포함하여 Mannheimia 속으로 통칭한다 (Ahn et al., Curr. Opin. Biotech., 42:54-66., 2016; Scholten et al., WO2009/024294A1; Kuhnert et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60:44., 2010). 즉, 본 발명에 있어서, Mannheimia 속은 최근 실질적으로 동일한 속으로 밝혀진 Basfia 속을 포함한다.
실제로 본 발명에서 가장 좋은 효과를 보인 CgMDH를 루멘 박테리아를 제외한 가장 대표적인 산업적 숙신산 생산 균주인 E. coli 와 C. glutamicum에 도입하여 그 효과를 확인해본 결과, 각각의 균주에 CgMDH를 과발현 한 E. coli W3110 (p100pro99A-cgmdh) 균주와 C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) 균주는 그렇지 않은 기존의 E. coli W3110 균주와 야생형 C. glutamicum 균주에 비해 월등히 향상된 숙신산 생산능을 보여주었다 (표 2). 이와 같은 결과는 일반적인 바이오 기반 숙신산 생산 균주 전반에 숙신산 생산능 향상을 위해 동일하거나 유사한 방식의 CgMDH 과발현 기반 엔지니어링이 가능함을 시사한다.
마지막으로 M. succiniciproducens PALK (pMS3-cgmdh) 균주와 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 숙신산 생산 향상이 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 에 자연적으로 존재하는 MDH의 효과로부터 온 것이 아니라는 것을 확인하기 위해 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주 게놈상에 존재하는 MDH를 암호화하는 유전자를 결실하였으며 그 자리에 CgMDH와 MsMDHG11Q 를 암호화하는 유전자를 넣어 각각 PALKcgmdh 균주와 PALKmsmdhG11Q 균주를 구축하였다 (표 1). 더불어 플라스미드 상에서 발현된 유전자의 경우에는 플라스미드의 불안정성으로 인해 항생제를 통해 유지하여도 플라스미드를 잃어버릴 수 있다는 점이 알려져 있다 (Alonso-Gutierrez et al., Biotechnol. Bioeng., 115(4):1000-1013., 2018). 이러한 관점에서, 직접 유전자를 게놈상에 넣어주는 것이 더 안정적인 균주를 구축하는데 도움이 될 수 있고, 플라스미드를 유지하기 위한 값비싼 항생제를 이용하지 않아도 된다는 이점 때문에 실제 산업균주들에서는 이와 같은 방법이 많이 이용된다.
상기 구축된 PALKcgmdh 균주의 경우 유가식 발효 결과 89.6 g/L의 숙신산을 각각 1.28 mol/mol 글루코스와 3.71 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 13; 표 1). PALKmsmdhG11Q 균주의 경우 유가식 발효 결과 82.76 g/L의 숙신산을 각각 1.13 mol/mol 글루코스와 3.42 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 13; 표 1).
상기 PALKcgmdh 균주와 PALKmsmdhG11Q 균주의 숙신산 생산능을 PALK (pMS3-cgmdh) 균주와 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 생산능과 비교해보면 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주에 자연적으로 존재하는 MDH는 PALK (pMS3-cgmdh) 균주와 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 숙신산 과생산에 큰 영향을 주지 못한 것으로 나타났다. 결국 상기 M. succiniciproducens PALK (pMS3-cgmdh) 균주와 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 숙신산 생산 향상 효과 또한 기질 저해 작용이 완화된 CgMDH와 MsMDHG11Q로부터 비롯한 것임을 알 수 있다.
상기 구축된 PALKcgmdh 균주와 PALKmsmdhG11Q 균주의 숙신산 생산을 더욱 향상시키기 위해 제한배지 하에서 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 사용하여 유가식 발효를 진행하였다. 글리세롤의 경우 1 mol 기준 글루코스보다 2배의 환원 당량을 제공한다. 옥살로아세트산이 MDH를 통해 말산으로 전환되는데 1 mol의 NADH가 필요하기 때문에 글리세롤의 사용은 숙신산 생산에 도움이 될 수 있다고 알려져 있다 (Choi et al., Biotechnol. Bioeng., 113(10):2168-2177., 2016). PALKcgmdh 균주를 제한배지 하에서 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 사용하여 유가식 발효를 진행한 결과 101.18 g/L의 숙신산을 각각 1.37 mol/mol 글루코스 (수율 비교를 용이하게 하기 위해 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 사용한 경우, 두 탄소원의 탄소수를 계산에 포함하여 글루코스 기준으로 표기하였으며 이하에서는 이와 같은 경우 'mol/mol 글루코스'로 일정하게 표기함)와 4.18 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 13; 표 1). 이 결과는 동일한 배지와 탄소원 하에서 진행한 PALK (pMS3-cgmdh) 균주의 유가식 발효 결과와 유사하다 (도 11; 표 2). 이 결과는 듀얼 페이즈 발효과 같은 추가적인 복잡한 발효공법을 사용하지 않고 수행한 발효 결과 중 가장 높은 숙신산 생산성을 보여준다.
PALKmsmdhG11Q 균주의 경우 제한배지 하에서 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 사용하여 유가식 발효를 진행한 결과 92.5 g/L의 숙신산을 각각 1.28 mol/mol 글루코스와 3.82 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 13; 표 1). PALKcgmdh 균주 보다는 좋은 숙신산 생산능을 보여주지 못했지만, 이러한 결과는 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주와 비교하여 MDH의 기질저해작용을 완화시킴으로써 숙신산 생산능이 향상될 수 있다는 점을 보여주며, in vitro 결과와도 일치한다 (표 1).
따라서, 본 발명은 일관점에서 숙신산 생성능을 가지는 미생물에 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 변이 미생물로, 상기 말산 탈수소효소는, 첫번째 알파나선의 끝 부분에 위치하며 중심 사슬의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민(Gln)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물에 관한 것이다.
상기 상호작용이란, 말산 탈수소효소의 중심 사슬의 아마이드 작용기가 NADH의 피로인산 부분을 전기적인 인력을 통하여 안정화하는 결합을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 말산 탈수소효소는 i) 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 말산 탈수소 효소; 또는 ii) 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래 말산 탈수소효소에서 11번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 말산 탈수소 효소인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, i) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 41의 염기서열로 표시되고, ii) 상기 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
즉, 본 발명에서는 특정 아미노산 서열 및 염기 서열을 기재하였으나, 본 발명에서 실시하고자 하는 효소와 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기 서열이 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 실질적으로 동일하다는 것은, 아미노산 또는 염기서열의 상동성이 매우 높은 경우를 포함하고, 그 밖에도 서열의 상동성과는 무관하게 구조적 특징을 공유하거나 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵심을 구성하는 서열을 제외한 다른 서열이 일부 결실된 효소 또는 이를 코딩하는 염기서열의 단편도 본 발명에 포함될 수 있으며, 따라서 본 발명은 단편의 길이와는 무관하게 본 발명에서 사용된 것과 동일한 기능을 가지는 아미노산 또는 염기 서열을 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 말산 탈수소효소는 하기 서열번호 40으로 표시될 수 있다.
서열번호 40
MNSPQNVSTKKVTVTGAAGQISYSLLWRIANGEVFGTDTPVELKLLEIPQALGGAEGVAM
ELLDSAFPLLRNITITADANEAFDGANAAFLVGAKPRGKGEERADLLANNGKIFGPQGKA
INDNAADDIRVLVVGNPANTNALIASAAAPDVPASRFNAMMRLDHNRAISQLATKLGRGS
AEFNNIVVWGNHSATQFPDITYATVGGEKVTDLVDHDWYVEEFIPRVANRGAEIIEVRGK
SSAASAASSAIDHMRDWVQGTEAWSSAAIPSTGAYGIPEGIFVGLPTVSRNGEWEIVEGL
EISDFQRARIDANAQELQAEREAVRDLL
본 발명에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 하기 서열번호 41로 표시될 수 있다.
서열번호 41
ATGAATTCCCCGCAGAACGTCTCCACCAAGAAGGTCACCGTCACCGGCGCAGCTGGTCAAATCTCTTATTCACTGTTGTGGCGCATCGCCAACGGTGAAGTATTCGGCACCGACACCCCTGTAGAACTGAAACTTCTGGAGATCCCTCAGGCTCTTGGCGGGGCAGAGGGTGTGGCTATGGAACTTCTGGATTCTGCCTTCCCCCTCCTGCGAAACATCACCATCACCGCGGATGCCAATGAGGCATTCGACGGCGCTAATGCGGCGTTTTTGGTCGGTGCGAAGCCTCGCGGAAAAGGCGAAGAGCGCGCAGATTTGCTGGCTAACAACGGCAAGATTTTCGGACCTCAAGGTAAAGCTATCAATGACAACGCCGCAGATGACATTCGTGTCCTAGTTGTTGGAAACCCAGCGAACACCAACGCGTTGATTGCTTCAGCTGCGGCCCCAGATGTTCCAGCATCCCGCTTCAACGCAATGATGCGCCTTGATCACAACCGTGCGATCTCCCAGCTGGCCACCAAGCTTGGCCGTGGATCTGCGGAATTTAACAACATTGTGGTCTGGGGAAATCACTCCGCAACCCAGTTCCCAGACATCACCTACGCAACCGTTGGTGGAGAAAAGGTCACTGACCTGGTTGATCACGATTGGTATGTGGAGGAGTTCATTCCTCGCGTGGCTAACCGTGGCGCTGAAATCATTGAGGTCCGTGGAAAGTCTTCTGCAGCTTCTGCAGCATCCTCTGCGATTGATCACATGCGCGATTGGGTACAGGGCACCGAGGCGTGGTCCTCTGCGGCAATTCCTTCCACCGGTGCATACGGCATTCCTGAGGGCATTTTTGTCGGTCTGCCAACCGTATCCCGCAACGGTGAGTGGGAAATCGTTGAAGGCCTGGAGATTTCCGATTTCCAGCGCGCCCGCATCGACGCGAATGCTCAGGAATTGCAGGCCGAGCGCGAGGCAGTGCGCGACTTGCTCTAA
본 발명에 있어서, 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래의 말산 탈수소효소는 하기 서열번호 42로 표시될 수 있다. 본 발명에서는 하기 서열번호에서 11번째 아미노산을 Gly에서 Gln으로 치환하여 MDH의 옥살아세트산에 대한 말산 전환 효율을 개선하였다.
서열번호 42
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKLQLPAGSSLSLYDVAPVTPGVAKDLSHIPTDVVVEGFAGTDPSEALKGADIVLISAGVARKPGMTRADLFGVNAGIIRSLTEKVAEQCPKACVGIITNPVNAMVAIAAEVLKKAGVYDKRKLFGITTLDILRAETFIAELKGLDPTRVTIPVIGGHSGVTILPLLSQVQNVEWSSEEEIIALTHRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMAQAAARFALALVKASQGAKVVECAYVEGDGKYARFFAQPVRLGTEGVEEYLTLGKLSAFEEKALNAMLETLQGDIKSGEDFING
본 발명에 있어서, 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래의 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 하기 서열번호 43으로 표시될 수 있다.
서열번호 43
atgaaagttgcagttctaggtgccgcaggcggcattggtcaagcgttggctttattattaaagttacaattaccggctggttcatctttatctctgtatgatgtcgcacccgtcaccccgggtgttgctaaagatcttagccatatcccaacagatgttgtggttgaaggttttgccggtacggatccttcagaagcattaaaaggggcggatattgtgttaatttctgcgggtgtggcacgtaaaccgggcatgacacgtgcggatttattcggtgttaatgcgggtattattcgtagtctgaccgaaaaagtggcggaacaatgcccgaaagcctgtgtgggtattatcaccaacccggttaatgcgatggttgccattgcggccgaagtattgaaaaaagcgggtgtttacgacaaacgtaaattattcggcattactaccttagatattcttcgagcggaaacctttatcgccgaattaaaaggcttagatcctactcgggttacaattcctgttatcggcggtcattcgggtgtaaccattcttccgttattgtctcaagttcaaaatgttgaatggagcagtgaagaggaaatcattgctttaacgcatcgtatccaaaatgcaggtacggaagtggttgaagcaaaagcgggcggcggttctgcaaccttatctatggcgcaggcggcggcacgttttgcattagcattagtgaaagcctcgcaaggtgcgaaagttgttgaatgcgcttatgtggaaggcgacggcaaatatgcccgtttctttgcacaaccggttcgtttaggtacagaaggtgttgaagaatacttaaccctgggtaaattaagtgcatttgaagaaaaagcgttaaatgctatgttagaaactttacaaggtgacattaagtcaggtgaagattttattaacggttaa
본 발명에 있어서, 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래의 말산 탈수소효소의 11번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 말산 탈수소효소는 하기 서열번호 44의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
서열번호 44
MKVAVLGAAGQIGQALALLLKLQLPAGSSLSLYDVAPVTPGVAKDLSHIPTDVVVEGFAGTDPSEALKGADIVLISAGVARKPGMTRADLFGVNAGIIRSLTEKVAEQCPKACVGIITNPVNAMVAIAAEVLKKAGVYDKRKLFGITTLDILRAETFIAELKGLDPTRVTIPVIGGHSGVTILPLLSQVQNVEWSSEEEIIALTHRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMAQAAARFALALVKASQGAKVVECAYVEGDGKYARFFAQPVRLGTEGVEEYLTLGKLSAFEEKALNAMLETLQGDIKSGEDFING
본 발명에 있어서, 서열번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래의 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 하기 서열번호 45의 염기서열로 표시될 수 있다.
서열번호 45
atgaaagttgcagttctaggtgccgcaggccagattggtcaagcgttggctttattattaaagttacaattaccggctggttcatctttatctctgtatgatgtcgcacccgtcaccccgggtgttgctaaagatcttagccatatcccaacagatgttgtggttgaaggttttgccggtacggatccttcagaagcattaaaaggggcggatattgtgttaatttctgcgggtgtggcacgtaaaccgggcatgacacgtgcggatttattcggtgttaatgcgggtattattcgtagtctgaccgaaaaagtggcggaacaatgcccgaaagcctgtgtgggtattatcaccaacccggttaatgcgatggttgccattgcggccgaagtattgaaaaaagcgggtgtttacgacaaacgtaaattattcggcattactaccttagatattcttcgagcggaaacctttatcgccgaattaaaaggcttagatcctactcgggttacaattcctgttatcggcggtcattcgggtgtaaccattcttccgttattgtctcaagttcaaaatgttgaatggagcagtgaagaggaaatcattgctttaacgcatcgtatccaaaatgcaggtacggaagtggttgaagcaaaagcgggcggcggttctgcaaccttatctatggcgcaggcggcggcacgttttgcattagcattagtgaaagcctcgcaaggtgcgaaagttgttgaatgcgcttatgtggaaggcgacggcaaatatgcccgtttctttgcacaaccggttcgtttaggtacagaaggtgttgaagaatacttaaccctgggtaaattaagtgcatttgaagaaaaagcgttaaatgctatgttagaaactttacaaggtgacattaagtcaggtgaagattttattaacggttaa
본 발명에 있어서, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 맨하이미아 속 (Mannheimia sp.), 액티노바실러스 속 (Actinobacillus sp.), 언에어로바이오스피리륨 속 (Anaerobiospirillum sp.), 대장균 (E. coli), 및 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)인 것을 특징으로 할 수 있으며, Mannheimia succiniciproducens 매우 유사한 Basfia 속 균주에 젖산 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 포스포트랜스아세틸화 효소를 암호화 하는 유전자 및 아세트산키나제를 암호화하는 유전자를 결실시킨 Basfia 속 변이 균주일 수 있다.
본 발명에서는 숙신산 생산성을 더 향상시키기 위해 상기 구축된 PALKcgmdh 균주를 고농도로 접종하여 혐기조건하에서 향상된 생산성으로 숙신산을 제조하였다. 제한배지 하에서 초기 8.7 gDCW/L의 고농도의 세포를 접종하고 글루코스와 글리세롤을 함께 탄소원으로 사용하여 유가식 발효를 진행한 결과 134.25 g/L의 숙신산을 각각 1.32 mol/mol 글루코스와 10.32 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다 (도 14; 표 1). 이와 같은 결과는 유사한 방법을 사용한 E. coli 및 C. glutamicum 에서 보여준 숙신산 생산성보다도 우수한 결과이다. Litsanov et al 에 따르면, 개량된 C. glutamicum 을 이용해 12.5 gDCW/L 의 고농도의 세포를 접종하여 글루코스와 개미산을 이용하여 134 g/L의 숙신산을 2.53 g/L/h의 생산성으로 얻을 수 있었는데, 이는 M. succiniciproducens PALKcgmdh 균주가 8.7 gDCW/L의 더 낮은 양의 세포를 이용하여도 더욱 고농도의 숙신산을 고 생산성으로 제조할 수 있다는 점을 보여준다. 또한 Vemuri et al 에 따르면, E.coli 의 경우에도 세포가 고농도일 때 혐기 배양을 시작하는 유가식 발효 과정을 통해 99.2 g/L의 숙신산을 0.12 g/gDCW/h의 세포당 생산성으로 생산하였는데 이는 M. succiniciproducens PALKpMS3-cgmdh 균주의 경우 1.19 g/gDCW/h의 세포당 생산성으로 숙신산을 생산하는 것에 비하면 매우 낮은 수치라 할 수 있다 (Litsanov et al., Appl. Environ. Microbiol., 78(9):3325-37., 2012; Vemuri et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 28:325-332., 2002).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 상기 변이 미생물을 배양하여 숙신산을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 i) 글루코스, ii) 수크로스, iii) 글리세롤, iv)글루코스 및 글리세롤, 또는 v) 수크로스 및 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 배양은 혐기적 조건에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 배양은 변이 미생물의 초기 농도를 OD600 15 내지 25로 농축하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 변이 미생물의 초기 농도를 고농도로 농축시키는 방법으로는 접종시 고농도의 변이 미생물을 주입하는 이노큘럼 법 (이하 '이노큘럼 법') 또는 membrane cell recycling bioreactor (MCRB) 방법 (이하 'MCRB 법')으로 수행되는 방법을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 pH 6.0~7.0의 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 치환하거나 과발현하기 위하여 숙주세포로 숙신산 생성 미생물인 Mannheimia 속 미생물 만을 예시하였으나, 다른 종류의 숙신산 생성 미생물들을 사용하여도 본 발명과 유사한 숙신산 생산능을 가진 변이 미생물을 수득할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
[실시예 1]
MsMDH, CgMDH, EcMDH, ScMDHc, ScMDHm, ScMDHp, YlMDH 과발현 벡터 (pET30a:MsMDH, pET30a:CgMDH, pET30a:EcMDH, pET30a:ScMDHc, pET30a:ScMDHm, pET30a:ScMDHp, pET30a:YlMDH) 의 제작 및 변이 효소 과발현 벡터 (pET30a:MsMDHG11Q, pET30a:CgMDHQ20G, pET30a:MsMDHL101Q, pET30a:CgMDHQ117L, pET30a:MsMDHA224S, pET30a:CgMDHS242A) 제작
각 숙신산 생산 미생물의 MDH를 E. coli에서 과발현하여 단백질을 확보하기 위하여 각각의 과발현 벡터를 제작하였다. 서열번호 1과 2, 3과 4, 5와 6, 7과 8의 프라이머들을 사용하여 각각 M. succiniciproducens, C. glutamicum, E. coli K12, Y. lipolytica의 genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 NdeI과 XhoI 제한 효소로 자른 뒤 pET30a (Merck Millipore)의 NdeI과 XhoI 부위에 클로닝하여 과발현 벡터 pET30a:MsMDH, pET30a:CgMDH, pET30a:EcMDH, pET30a:YlMDH을 완성하였다.
서열번호 1: 5'-GCGCCATATGAATTCCCCGCAGAACGTCTCCACC
서열번호 2: 5'-GCGCCTCGAG GAGCAAGTCGCGCACTGCCTCGCGC
서열번호 3: 5'-GCGCCATATGAAAGTTGCAGTTCTAGGTGCCGCA
서열번호 4: 5'-GCGCCTCGAG ACCGTTAATAAAATCTTCACCTGAC
서열번호 5: 5'-GCGCCATATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCT
서열번호 6: 5'-GCGCCTCGAGCTTATTAACGAACTCTTCGCCCAG
서열번호 7: 5'-GCGCCATATGGTTAAAGCTGTCGTTGCCGGAGCC
서열번호 8: 5'-GCGCCTCGAGGTTGGCAGGAGGAGGGTTAACAAT
S. cerevisiae 유래의 세 MDH (ScMDHc, ScMDHm, ScMDHp)를 과발현하는 벡터를 제작하기 위해 각기 서열번호 9와 10, 11과 12, 13과 14에 해당하는 프라이머들을 사용하여 모두 S. cerevisiae의 게놈을 주형으로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 NdeI과 XhoI 제한 효소로 자른 뒤 pET30a의 NdeI과 XhoI 부위에 클로닝하여 과발현 벡터 pET30a:ScMDHc, pET30a:ScMDHm, pET30a:ScMDHp를 제작하였다.
서열번호 9: 5'-GCGCCATATGCCTCACTCAGTTACACCATCCATA
서열번호 10: 5'-GCGCCTCGAGAGATGATGCAGATCTCGATGCAAC
서열번호 11: 5'-GCGCCATATGTTGTCAAGAGTAGCTAAACGTGCG
서열번호 12: 5'-GCGCCTCGAGTTTACTAGCAACAAAGTTGACACC
서열번호 13: 5'-GCGCCATATGGTCAAAGTCGCAATTCTTGGCGCT
서열번호 14: 5'-GCGCCTCGAGTAGCTTGGAAGAGTCTAGGATGAA
MsMDH의 변이 효소를 과발현할 수 있는 벡터 (pET30a:MsMDHG11Q, pET30a:MsMDHL101Q, pET30a:MsMDHA224S)를 제작하기 위하여 각각 서열번호 15과 16, 17과 18, 19와 20의 프라이머들을 사용하여 pET30a:MsMDH를 주형으로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 E. coli 내로 형질 전환시켜 카나마이신 포함 LB (Luria-Bertani) 고체배지에서 선택적으로 자라게 하여 추출 하였다. 마찬가지로 CgMDH의 변이 효소를 과발현할 수 있는 벡터 (pET30a:CgMDHQ20G, pET30a:CgMDHQ117L, pET30a:CgMDHS242A)를 제작하기 위하여 각각 서열번호 21과 22, 23과 24, 25와 26의 프라이머들을 사용하여 pET30a:CgMDH를 주형으로 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 E. coli 내로 형질 전환시켜 카나마이신 포함 LB 고체배지에서 선택적으로 자라게 하여 추출하였다. 최종적으로 서열 분석을 하여 성공적으로 변이된 것을 확인하였다.
서열번호 15: 5'-CTAGGTGCCGCAGGCCAGATTGGTCAAGCGTTG
서열번호 16: 5'-CAACGCTTGACCAATCTGGCCTGCGGCACCTAG
서열번호 17: 5'-GGTATTATTCGTAGTCAGACCGAAAAAGTGGCG
서열번호 18: 5'-CGCCACTTTTTCGGTCTGACTACGAATAATACC
서열번호 19: 5'-GCGGGCGGCGGTTCTTCAACCTTATCTATGGCG
서열번호 20: 5'-CGCCATAGATAAGGTTGAAGAACCGCCGCCCGC
서열번호 21: 5'-ACCGGCGCAGCTGGTGGCATCTCTTATTCACTG
서열번호 22: 5'-CAGTGAATAAGAGATGCCACCAGCTGCGCCGGT
서열번호 23: 5'-AAGATTTTCGGACCTCTGGGTAAAGCTATCAATG
서열번호 24: 5'-CATTGATAGCTTTACCCAGAGGTCCGAAAATCTT
서열번호 25: 5'-GTCCGTGGAAAGTCTGCGGCAGCTTCTGCAGCA
서열번호 26: 5'-TGCTGCAGAAGCTGCCGCAGACTTTCCACGGAC
[실시예 2]
MsMDH, CgMDH, EcMDH, YlMDH 및 이들의 변이 효소 단백질(MsMDHG11Q, CgMDHQ20G, MsMDHL101Q, CgMDHQ117L, CgMDHS242A)의 발현 및 정제
실시예 1에서 제작한 과발현 벡터 (pET30a:MsMDH, pET30a:CgMDH, pET30a:EcMDH, pET30a:YlMDH)를 E. coli BL21(DE3)-T1R에 형질전환하여 100 μg/mL의 카나마이신을 함유한 LB 배지에서 37 ℃로 배양한 후, OD600이 0.6이 되었을 때 IPTG로 발현을 유도하였다. 발현 유도 이후, 추가적으로 해당 효소 단백질들이 발현이 되도록 18 ℃에서 20시간 배양하였다. 이러한 배양액을 4 ℃에서 5,000 g로 15분동안 원심분리하여 세포를 수확한 후, 얼음 속에서 차갑게 유지된 버퍼 A (40 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 다시 풀어서 음파 파쇄로 세포를 부수었다. 이렇게 확보된 세포 파쇄물에서 1시간 동안의 11,000 g 원심분리를 통해 세포 잔해를 제거하였다. 최종적으로 확보된 상층액을 Ni-NTA agarose beads에 결합시켜 친화성 크로마토그래피를 통해 히스티딘 꼬리표가 달려 있는 MDH 단백질들을 선택적으로 정제하였다. 낮은 20 mM의 농도의 imidazole이 함유된 버퍼 A로써 나머지 비 특이성 결합을 한 단백질들을 씻어준 후, 300 mM imidazole이 함유된 버퍼 A를 사용하여 목적 단백질들을 용출하였다. 고순도의 단백질을 확보하기 위한 추가적인 정제를 위해, HiTrap Q를 사용한 이온 교환 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 95% 이상의 고순도 MDH 단백질들을 확보할 수 있었다. 이상으로 정제된 MDH 단백질들을 실시예 3에서 기술된 3 nM 농도로 희석하여 활성 측정에서 사용하였고, CgMDH와 MsMDH 단백질들은 최종적으로 각각 54 mg/mL, 42 mg/mL로 농축하여 결정화를 수행하였다.
[실시예 3]
MsMDH, CgMDH, EcMDH, YlMDH, MsMDHG11Q, CgMDHQ20G, MsMDHL101Q, CgMDHQ117L, CgMDHS242A의 옥살로아세트산 환원 활성 측정
MDH의 옥살로아세트산 환원 활성에서는 보조인자로서 NADH라는 환원력이 소모되며 그 결과 NAD+가 생성된다. NADH의 340 nm에서의 독특한 흡광 성질을 이용하여 분광광도계법으로 MDH의 활성을 시간별로 측정할 수 있다. 비교 활성 측정을 위한 최종 반응 용액의 조성은 다음과 같이 구성하였다: 0.1 M Tris-Hcl (pH 8.0), 100 μM NADH, 100 μM 옥살로아세트산, 마지막으로 3 nM의 정제된 MDH (MsMDH, CgMDH, EcMDH, YlMDH). 변이 효소들 (MsMDHG11Q, CgMDHQ20G, MsMDHL101Q, CgMDHQ117L, CgMDHS242A)의 활성 측정을 위한 최종 반응 용액의 조성은 비교 활성 측정을 위한 조성과 동일하였다. 반응속도론적 활성 비교를 위한 최종 반응 용액에서는 상기의 조건에서 옥살로아세트산의 농도와 NADH의 농도에 변화를 주어 측정하였으며, 옥살로아세트산에 대한 반응속도론적 활성 측정 시에는 NADH의 농도를 200 μM로, NADH에 대한 반응속도론적 활성 측정 시에는 옥살로아세트산의 농도를 100 μM로 고정하여 측정하였다. 그래프 제도시에는 효소를 투입한 후 초기의 반응 시간 동안 감소하는 NADH의 양을 흡광 계수로서 계산하여 분당 전환되는 옥살로아세트산의 농도 (μM)를 초기 속도로 나타내었다. pH에 따른 활성 비교시에는 상기 최종 반응 용액의 조성 (0.1 M 버퍼, 200 μM NADH, 100 μM 옥살로아세트산, 3 nM의 MDH)를 사용하였고, pH 5.0~6.0에서는 BIS-tris 버퍼, pH 7.0~9.0에서는 Tris-HCl 버퍼, pH 10.0에서는 Glycine 버퍼를 각각 사용하였다.
[실시예 4]
CgMDH와 MsMDH의 결정화 및 구조 분석
정제된 단백질의 초기 결정화는 sitting-drop 증기-확산 방법을 이용하여 스크리닝 키트 (Hampton Research, CA, USA)를 사용해 20 ℃에서 수행하였다. 각각의 실험은 1.0 μL의 CgMDH 또는 MsMDH 단백질과 1.0 μL의 reservoir 용액을 섞어서 0.5 mL의 reservoir 용액에 대해 평형화시켜 수행되었다. CgMDH 결정이 몇 가지 결정화 스크리닝 조건에서 발견되었고 hanging-drop 증기-확산 방법을 이용하여 수차례의 최적화 과정을 거진 후에, 18% PEG3350, 0.2 M MgCl2 hexahydrate, 0.1 M HEPES 조건에서 가장 좋은 질의 결정이 나타났다. 기질 결합 구조를 결정하기 위해, 기질인 NAD+, 말산과 함께 결정화를 수행하여 같은 조건에서 결정을 확보하였다. MsMDH의 경우 16% PEG3350과 8% Tacsimate pH 6.0에서 0.3 x 0.3 x 0.1 mm 크기의 양질의 결정을 얻어 X-선 회절 실험을 수행할 수 있었다. 기질 결합 구조를 결정하기 위해, 기질인 NAD+와 함께 결정화를 수행하여 같은 조건에서 MsMDH 기질 결합 결정을 확보하였다. 결정의 저온 보호를 위해, reservoir 용액에 포함된 30% 글리세롤이 사용되었으며, 0.97934 Å 파장의 X-선 회절 이미지가 QUANTUM 270 CCD 검출기를 통해 포항 가속기 연구소 7 Å 빔라인에서 수집되었다. CgMDH와 NAD+, 말산 결합 CgMDH 결정, MsMDH와 NAD+ 결합 MsMDH 결정은 각각 1.95 Å, 2.00 Å, 2.30 Å, 1.98 Å의 해상도까지 회절하는 것을 확인하였다. 이러한 데이터는 HKL2000 프로그램을 통해 indexing, integration, scaling되었고, CgMDH와 MsMDH 데이터 각각은 molecular replacement 기법을 통하여 탐색 모델인 Mycobacterium tuberculosis MDH(PDB code 4TVO)와 Haemophilus influenzae MDH (PDB code 6AOO)의 구조를 통해 phasing되었다. 모델 구축은 WinCoot을 사용하여 수행하였고 refinement는 REFMAC5을 통해 수행하였다.
[실시예 5]
MsMDH, CgMDH, CgMDHQ20G, MsMDHG11Q 과발현 벡터 (pMS3-msmdh, pMS3-cgmdh, pMS3-cgmdhQ20G, pMS3-msmdhG11Q)의 제작 및 PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3- cgmdh), PALK (pMS3-cgmdhQ20G), PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 제작
각 숙신산 생성 미생물의 MDH를 과발현하여 그 효과를 알아보고, 구조 분석바탕으로 개량한 MDH를 과발현하여 그 효과를 알아보기 위해 각각의 과발현 벡터를 제작하였다. 먼저, MsMDH 과발현 벡터 pMS3-msmdh를 얻기 위해 M. succiniciproducens의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 27과 28의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3 (Jang et al., Appl. Environ. Microb. 73(17): 5411-5420., 2007)에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-msmdh 벡터를 완성하였다. CgMDH 과발현 벡터 pMS3-cgmdh를 얻기 위해 C. glutamicum의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 29과 30의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3 에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-cgmdh 벡터를 완성하였다. CgMDHQ20G 과발현 벡터 pMS3-cgmdhQ20G를 얻기 위해 CgMDHQ20G 유전자 조각을 주형으로 하고 서열번호 29과 30의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3 에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-cgmdhQ20G 벡터를 완성하였다. MsMDHG11Q 과발현 벡터 pMS3-msmdhG11Q를 얻기 위해 MsMDHG11Q 유전자 조각을 주형으로 하고 서열번호 27과 28의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-msmdhG11Q 벡터를 완성하였다.
서열번호 27: 5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGAATTCATGAAAGTTGCAGTTCTAG
서열번호 28: 5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTAACCGTTAATAAAATCTTCAC
서열번호 29: 5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAATTCCCCGCAGAAC
서열번호 30: 5'-GGATCCCCGGGTACCGAGCTTTAGAGCAAGTCGCGCAC
상기와 같이 제작된 pMS3-msmdh, pMS3-cgmdh, pMS3-cgmdhQ20G, pMS3-msmdhG11Q를 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)에 도입함으로서 최종적으로 각각 PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3-cgmdh), PALK (pMS3-cgmdhQ20G), PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주를 완성하였다. 상기와 같이 과발현 벡터를 도입하기 위해, M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 BHI (Brain-Heart Infusion) 고체배지에 도말하여, 36시간동안 39 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 BHI 액체배지 10 mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 세포배양액을 다시 BHI 액체배지 100 mL에 1mL 접종하여 39 ℃ 정치 배양기에서 배양하였다. 약 4~5시간 후, 세포성장이 OD600기준으로 0.3~0.5 정도가 되었을 때, 상기세균배양액을 0~4 ℃에 20분간 두어 세포성장이 더 이상 진행되지 않도록 막고, 이를 4 ℃, 4,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음 4 ℃의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 셀을 재현탁 한 후, 다시 상기와 같은 조건에서 원심분리하였으며, 이러한 재현탁과 원심분리를 10% 글리세롤 용액을 반으로 줄여가면서 총 3회 수행하였다. 최종 얻어진 셀은 같은 부피의 10% 글리세롤 용액으로 재현탁하고 분주하여 -80 ℃에 보관하였다. 상기 수득된 세포 농축현탁액과 본 실시예에서 제작한 과발현 벡터 4종을 각각 혼합하여, 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω의 조건으로 electroporation을 수행하여 상기 벡터로 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)의 형질전환을 시도하였다. 이렇게 electroporation 된 셀들은 BHI 액체배지를 가하여, 39℃ 정치배양기에서 1시간 동안 회복배양한 후, 배양액을 모두 항생제 암피실린 2.5 μg/mL를 함유하는 BHI 고체 배지에 도말하여, 39 ℃ 정치 배양기에서 48시간 이상 배양하였다. 상기 배지에서 형성된 변이균주를 항생제가 함유된 BHI 액체배지에서 배양하고, 벡터 mini-prep을 이용하여 얻은 벡터를 전기영동함으로서 과발현 벡터의 도입을 확인하였다.
[실시예 6]
EcMDH, ZrMDH, ScMDH2, ScMDH3 과발현 벡터 (pMS3-ecmdh, pMS3-zrmdh, pMS3-scmdh2, pMS3-scmdh3)의 제작 및 PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3- zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2), PALK (pMS3-scmdh3) 균주의 제작
선행 문헌에서 보고된 MDH를 과발현하여 그 효과를 알아보기 위해 각각의 과발현 벡터를 제작하였다. 먼저, EcMDH 과발현 벡터 pMS3-ecmdh를 얻기 위해 E.coli의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 46와 47의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-msmdh 벡터를 완성하였다. ZrMDH 과발현 벡터 pMS3-zrmdh를 얻기 위해 Zrmdh 유전자 조각을 주형으로 하고 서열번호 48과 49의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3 에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-cgmdh 벡터를 완성하였다. ScMDH2 과발현 벡터 pMS3-scmdh2를 얻기 위해 ScMDH2 유전자 조각을 주형으로 하고 서열번호 50과 51의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3 에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-scmdh2 벡터를 완성하였다. ScMDH3 과발현 벡터 pMS3-scmdh3를 얻기 위해 ScMDH3 유전자 조각을 주형으로 하고 서열번호 52와 53의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pMS3에 EcoRI과 KpnI 부위에 클로닝하여 pMS3-scmdh3 벡터를 완성하였다.
서열번호 46: 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTCGCAGTCCTC
서열번호 47: 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTACTTATTAACGAACTCTTCGC
서열번호 48: 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTTGCAATAGTCG
서열번호 49: 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTACAATTTAGCACCGAG
서열번호 50: 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGCCTCACTCAGTTACAC
서열번호 51: 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTAAGATGATGCAGATCTCG
서열번호 52: 5'- TATCAACTCTACTGGGGAGGATGGTCAAAGTCGCAATTC
서열번호 53: 5'- TCTAGAGGATCCCCGGGTACTCATAGCTTGGAAGAGTC
상기와 같이 제작된 pMS3-ecmdh, pMS3-zrmdh, pMS3-scmdh2, pMS3-scmdh3를 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)에 도입함으로서 최종적으로 각각 PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3-zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2), PALK (pMS3-scmdh3) 균주를 완성하였다. 상기와 같이 과발현 벡터를 도입하기 위해, 실시예 5에서와 유사하게 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 BHI 고체배지에 도말하여, 36시간동안 39 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 BHI 액체배지 10 mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 세포배양액을 다시 BHI 액체배지 100 mL에 1mL 접종하여 39 ℃ 정치 배양기에서 배양하였다. 약 4~5시간 후, 세포성장이 OD600기준으로 0.3~0.5 정도가 되었을 때, 상기세균배양액을 0~4 ℃에 20분간 두어 세포성장이 더 이상 진행되지 않도록 막고, 이를 4 ℃, 4,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음 4 ℃의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 셀을 재현탁 한 후, 다시 상기와 같은 조건에서 원심분리하였으며, 이러한 재현탁과 원심분리를 10% 글리세롤 용액을 반으로 줄여가면서 총 3회 수행하였다. 최종 얻어진 셀은 같은 부피의 10% 글리세롤 용액으로 재현탁하고 분주하여 -80 ℃에 보관하였다. 상기 수득된 세포 농축현탁액과 본 실시예에서 제작한 과발현 벡터 4종을 각각 혼합하여, 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω의 조건으로 electroporation을 수행하여 상기 벡터로 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)의 형질전환을 시도하였다. 이렇게 electroporation 된 셀들은 BHI 액체배지를 가하여, 39℃ 정치배양기에서 1시간 동안 회복배양한 후, 배양액을 모두 항생제 암피실린 2.5 μg/mL를 함유하는 BHI 고체 배지에 도말하여, 39 ℃ 정치 배양기에서 48시간 이상 배양하였다. 상기 배지에서 형성된 변이균주를 항생제가 함유된 BHI 액체배지에서 배양하고, 벡터 mini-prep을 이용하여 얻은 벡터를 전기영동함으로서 과발현 벡터의 도입을 확인하였다.
[실시예 7]
E. coli 및 C. glutamicum 용 CgMDH 과발현 벡터 (p100pro99A-cgmdh, pEKEx1-cgmdh)의 제작 및 E.coli W3110 (p100pro99A-cgmdh), C. glutamicum (pEKEx1- cgmdh) 균주의 제작
CgMDH의 과발현 효과를 대표적인 숙신산 생산 균주인 E. coli 와 C. glutamicum 에서 알아보기 위해 각 균주 용 CgMDH 과발현 벡터를 제작하였다. 먼저, E. coli 용 과발현 벡터 p100pro99A-cgmdh 를 얻기 위해 C. glutamicum 의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 54와 55의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 p100pro99A (Bang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 115(40): E9271-E9279., 2018)의 EcoRI과 PstI 부위에 클로닝하여 p100pro99A-cgmdh 벡터를 완성하였다. C. glutamicum 용 과발현 벡터 pEKEx1-cgmdh를 얻기 위해 C. glutamicum 의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 56과 57의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 pEKEx1 (Cho et al., Metab. Eng. 42: 157-167., 2017) 의 EcoRI과 PstI 부위에 클로닝하여 pEKEx1-cgmdh 벡터를 완성하였다.
서열번호 54: 5'- TCCTAGGTACAGTGCTAGCGATGAATTCCCCGCAGAAC
서열번호 55: 5'- GCCAAGCTTGCATGCCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
서열번호 56: 5'- CAATTTCACACAGGAAACAGATGAATTCCCCGCAGAAC
서열번호 57: 5'- AACAGCCAAGCTTGGCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
상기와 같이 제작된 p100pro99A-cgmdh, pEKEx1-cgmdh 벡터를 각각 E. coli W3110과 야생형 C. glutamicum에 도입함으로서 최종적으로 각각 E. coli W3110 (p100pro99A-cgmdh), C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) 균주를 완성하였다. 상기와 같이 과발현 벡터를 도입하기 위해, E. coli W3110를 LB 고체배지에 도말하여, 24시간동안 37 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 LB 액체배지 10 mL에 접종하여, 12시간 배양하였다. 충분히 자란 세포배양액을 다시 LB 액체배지 100 mL에 1mL 접종하여 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4~5시간 후, 세포성장이 OD600기준으로 0.3~0.5 정도가 되었을 때, 상기세균배양액을 0~4 ℃에 20분간 두어 세포성장이 더 이상 진행되지 않도록 막고, 이를 4 ℃, 4,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음 4 ℃의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 셀을 재현탁 한 후, 다시 상기와 같은 조건에서 원심분리하였으며, 이러한 재현탁과 원심분리를 10% 글리세롤 용액을 반으로 줄여가면서 총 3회 수행하였다. 최종 얻어진 셀은 같은 부피의 10% 글리세롤 용액으로 재현탁하고 분주하여 -80 ℃에 보관하였다. 상기 수득된 세포 농축현탁액과 본 실시예에서 제작한 과발현 벡터 p100pro99A-cgmdh을 혼합하여, 1.8 kV, 25 μF, 200 Ω의 조건으로 electroporation을 수행하여 상기 벡터로 E. coli W3110의 형질전환을 시도하였다. 이렇게 electroporation 된 셀들은 LB 액체배지를 가하여, 37℃ 배양기에서 1시간 동안 회복배양한 후, 배양액을 모두 항생제 암피실린 25 μg/mL를 함유하는 LB 고체 배지에 도말하여, 37 ℃ 배양기에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 배지에서 형성된 변이균주를 항생제가 함유된 LB 액체배지에서 배양하고, 벡터 mini-prep을 이용하여 얻은 벡터를 전기영동함으로서 과발현 벡터의 도입을 확인하였다. 유사한 방법으로 C. glutamicum을 BHIS (리터당 37 g BHI, D-sorbitol 91 g) 고체배지에 도말하여, 24시간동안 30 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 BHIS 액체배지 10 mL에 접종하여, 18시간 배양하였다. 충분히 자란 세포배양액을 다시 BHIS 액체배지 100 mL에 1mL 접종하여 30 ℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4~5시간 후, 세포성장이 OD600기준으로 0.3~0.5 정도가 되었을 때, 상기 설명한 E. coli W3110의 경우와 동일하게 세포 농축현탁액을 제작하여 -80 ℃에 보관하였다. 상기 수득된 세포 농축현탁액과 본 실시예에서 제작한 과발현 벡터 pEKEx1-cgmdh을 혼합하여, 1.8 kV, 25 μF, 200 Ω의 조건으로 electroporation을 수행하여 상기 벡터로 C. glutamicum의 형질전환을 시도하였다. 이렇게 electroporation 된 셀들은 BHIS 액체배지를 가하여, 30℃ 배양기에서 2시간 동안 회복배양한 후, 배양액을 모두 항생제 카나마이신 25 μg/mL를 함유하는 BHIS 고체 배지에 도말하여, 30 ℃ 배양기에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 배지에서 형성된 변이균주를 항생제가 함유된 BHIS 액체배지에서 배양하고, 벡터 mini-prep을 이용하여 얻은 벡터를 전기영동함으로서 과발현 벡터의 도입을 확인하였다.
[실시예 8]
CgMDH, MsMDHG11Q 치환 벡터 (pINcgMDH, pINmsMDHG11Q)의 제작 및 PALKcgmdh, PALKmsmdhG11Q 균주의 제작
숙신산 생산 균주에 자연적으로 존재하는 MDH가 PALK (pMS3-cgmdh) 균주와 PALK (pMS3-msmdh) 균주의 숙신산 생산 향상에 어떠한 영향을 주었는지 확인하기 위해 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주 게놈상에 존재하는 MDH를 암호화하는 유전자를 결실하고 그 자리에 CgMDH와 MsMDHG11Q 를 암호화하는 유전자를 넣어주는 CgMDH, MsMDHG11Q 치환 벡터 pINcgMDH와 pINmsMDHG11Q를 제작하였다. pINcgMDH 제작을 위해 sacB 유전자를 포함하는 pSacHR06을 XhoI과 SacI으로 절단하였다. 이후 게놈상에 존재하는 MDH 암호화 유전자의 앞, 뒤 서열을 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 31와 32, 서열번호 38와 39의 프라이머들을 사용해 각각 PCR을 수행하였다. lox66-cat-lox77 카세트는 클로람페니콜 저항성 유전자를 포함하는 벡터를 주형으로 하고 서열번호 36과 37의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 얻었다. CgMDH 유전자는 실시예 5에서 제작한 pMS3-cgmdh 벡터를 주형으로 하고 서열번호 33과 35번의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 획득했다. 이렇게 얻은 선형 pSacHR06, MDH 암호화 유전자 앞, 뒤 서열 각 1 kb, lox66-cat-lox77 카세트, CgMDH 유전자 조각을 Gibson assembly (Gibson et al., Nat. Methods., 6(5):343., 2009)를 통해 합하여 pINcgMDH를 얻을 수 있었다. pINmsMDHG11Q에 필요한 MsMDHG11Q유전자 조각은pMS3-msmdhG11Q를 주형으로 하고 서열번호 33과 34의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하여 얻었다. 이렇게 얻은 선형 pSacHR06, MDH 암호화 유전자 앞, 뒤 서열 각 1 kb, lox66-cat-lox77 카세트, MsMDHG11Q유전자 조각을 Gibson assembly를 통해 합하여 pINmsMDHG11Q를 얻었다. 상기와 같이 제작된 pINcgMDH, pINmsMDHG11Q를 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)에 도입함으로서 최종적으로 각각 PALKcgmdh, PALKmsmdhG11Q 균주를 제작하였다.
서열번호 31: 5'-TTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGCCTTATGTGGACCGAGAAGA
서열번호 32: 5'-GGCATTAGCCAACAGAATAGCTGACCGAAAAAGTGGCGGA
서열번호 33: 5'-CTATTCTGTTGGCTAATGCC
서열번호 34: 5'-TGTAGCCGCGTTCTAACGACTACGAATAATACCCGCAT
서열번호 35: 5'-TGTAGCCGCGTTCTAACGTCGACTCTAGAGGATCCCCG
서열번호 36: 5'-CGTTAGAACGCGGCTACA
서열번호 37: 5'-ATAGGGAGACCGGCAGATC
서열번호 38: 5'-GATCTGCCGGTCTCCCTATTTAAGACTCCTTAATGTGGA
서열번호 39: 5'-GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCGCGTTAGTTGTTGAGTTAAT
즉, 실시예 5에서와 유사하게 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)를 BHI 고체배지에 도말하여, 3시간 동안 39 ℃에서 배양한 후, 콜로니를 BHI 액체배지 10 mL에 접종하여, 1시간 배양하였다. 충분히 자란 세포배양액을 다시 BHI 액체배지 100 mL에 1mL 접종하여 39 ℃ 정치 배양기에서 배양하였다. 4~5시간 후, 세포성장이 OD600기준으로 0.3~0.5 정도가 되었을 때, 상기세균배양액을 0~4 ℃에 2분간 두어 세포성장이 더 이상 진행되지 않도록 막고, 이를 4 ℃, 4,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음 4 ℃의 10% 글리세롤 용액 200 mL로 셀을 재현탁 한 후, 다시 상기와 같은 조건에서 원심분리하였으며, 이러한 재현탁과 원심분리를 10% 글리세롤 용액을 반으로 줄여가면서 총 3회 수행하였다. 최종 얻어진셀은 같은 부피의 10% 글리세롤 용액으로 재현탁하고 분주하여 -80 ℃에 보관하였다.
상기 수득된 세포 농축현탁액과 본 실시예에서 제작한 유전자 제거벡터 pINcgMDH, pINmsMDHG11Q 를 각각 혼합하여, 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω의 조건으로 electroporation을 수행하여 상기 벡터로 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)의 형질전환을 시도하였다. 이렇게 electroporation 된 셀들은 BHI 액체배지를 가하여, 39 ℃ 정치배양기에서 1시간 동안 회복배양한 후, 배양액을 모두 항생제 클로람페니콜 6.8 μg/mL를 함유하는 BHI 고체배지에 도말하여, 39 ℃ 정치 배양기에서 48시간 이상 배양하였다. 이중교차 (double crossover)가 일어난 콜로니를 선별하기 위하여, 형성된 콜로니를 클로람페니콜 (6.8 μg/mL)과 100 g/L의 수크로스를 함유한 BHI 고체배지에 도말한 다음, 24시간 동안 배양한 후 형성된 콜로니를 동일한 고체배지에 다시 도말하였다.
상기 배지에서 형성된 변이균주를 항생제가 함유된 BHI 액체배지에서 배양하고, 배양 균주의 게놈 DNA를 분석하였다. 상기분리된 변이균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동함으로서, 게놈 DNA의 MDH 유전자 결실 및, CgMDH 혹은 MsMDHG11Q의 도입 여부를 확인하였다.
[실시예 9]
M. succiniciproducens PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3-cgmdh), PALK (pMS3-cgmdhQ20G), 및 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주를 이용한 숙신산 생산
상기 실시예 5에서 제작된 M. succiniciproducens PALK (pMS3-msmdh), PALK (pMS3-cgmdh), PALK (pMS3-cgmdhQ20G) 및 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주는 20 mL MH5 배지 (리터당, 2.5 g yeast extract, 2.5 g polypeptone, 1 g NaCl, 0.02 g CaCl2·2H2O, 0.2 g MgCl2·6H2O, 및 8.709 g K2HPO4)에 탄소원으로 따로 멸균처리된 글루코스 또는 글리세롤을 10 g/L의 농도로 맞추어 접종하여 혐기조건으로 39 ℃에서 8시간 배양한 후, 이를 다시 같은 배지 270 mL로 옮겨서 배양하였다. 발효는 상기의 배양액을 2.5 L의 합성배지 (리터당, 1 g NaCl, 2 g (NH4)2HPO4, 0.02 g CaCl2·2H2O, 0.2 g MgCl2·6H2O, 8.709 g K2HPO4, 0.5 g cysteine, 0.5 g methionine, 0.5 g alanine, 0.5 g asparagine, 0.5 g aspartic acid, 0.5 g proline, 0.5 g serine, 0.005 g nicotinic acid, 0.005 g Ca-pantothenate, 0.005 g pyridoxine·HCl, 0.005 g thiamine, 0.005 g ascorbic acid 및 0.005 g biotin) 를 함유한 미생물 반응기 (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific Co., NJ, USA)에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 18.2 g/L (100 mM) 초기 글루코스 농도, 글리세롤 사용시에는 4.6 g/L (50 mM) 초기 글리세롤 농도로, 온도 39 ℃ 200 rpm 조건에서 0.2 vvm (이산화탄소부피/배양기내 조업부피 (working volume)/분)의 속도로 순수 이산화탄소를 공급해 주면서 발효시켰다. 발효 중 pH는 1.57 M 암모니아수 및 6.84 M magnesium hydroxide solution을 사용하여 6.5로 조정하였으며, 항생제는 카나마이신 25 μg/mL와 암피실린 25 μg/mL를 첨가하였다. 고농도의 숙신산 생산을 위하여 탄소원이 완전히 소모되었을 경우에는, 필요시 900 g/L의 글루코스 및 글리세롤 용액을 반연속적으로 첨가하였다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였으며, 미리 측정한 분광광도계의 흡광도와 건조세포의 중량 검증선을 이용하여 세포농도를 계산하였다. 발효과정 중 생물반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액의 각종 대사산물 및 숙신산 농도, 글루코스와 글리세롤 농도를 액체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과 도 11 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 탄소원으로 글루코스만을 사용했을 경우 PALK (pMS3-msmdh) 균주는 79.07 g/L의 숙신산을 각각 1.23 mol/mol 글루코스와 3.26 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. PALK (pMS3-cgmdh) 균주는 87.23 g/L의 숙신산을 각각 1.29 mol/mol 글루코스와 3.6 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였으며. PALK (pMS3-cgmdhQ20G) 균주는 79.39 g/L의 숙신산을 각각 1.00 mol/mol 글루코스와 3.27 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. 마지막으로, PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주의 유가식 발효 결과 84.19 g/L의 숙신산을 각각 1.08 mol/mol 글루코스와 3.48 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. 결과적으로 PALK (pMS3- cgmdh) 균주가 가장 훌륭한 숙신산 생산능을 보였으며, 단백질 구조 분석을 통한 개량 단백질 과발현 균주인 PALK (pMS3-msmdhG11Q) 균주 또한 기존의 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주에 비해 향상된 숙신산 생산능을 가지는 것을 보여준다.
[실시예 10]
M. succiniciproducens PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3-zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2), 및 PALK (pMS3-scmdh3) 균주를 이용한 숙신산 생산
상기 실시예 6에서 제작된 M. succiniciproducens PALK (pMS3-ecmdh), PALK (pMS3-zrmdh), PALK (pMS3-scmdh2) 및 PALK (pMS3-scmdh3) 균주는 실시예 9 에서와 같이 20 mL MH5 배지에 탄소원으로 따로 멸균처리된 글루코스를 10 g/L의 농도로 맞추어 접종하여 혐기조건으로 39 ℃에서 8시간 배양한 후, 이를 다시 같은 배지 270 mL로 옮겨서 배양하였다. 발효는 상기의 배양액을 실시예 9에서와 같은 2.5 L의 합성배지를 함유한 미생물 반응기에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 18.2 g/L (100 mM) 초기 글루코스 농도로, 온도 39 ℃ 200 rpm 조건에서 0.2 vvm의 속도로 순수 이산화탄소를 공급해 주면서 발효시켰다. 발효 중 pH는 1.57 M 암모니아수 및 6.84 M magnesium hydroxide solution을 사용하여 6.5로 조정하였으며, 항생제는 카나마이신 25 μg/mL와 암피실린 25 μg/mL를 첨가하였다. 고농도의 숙신산 생산을 위하여 탄소원이 완전히 소모되었을 경우에는, 필요시 900 g/L의 글루코스 용액을 반연속적으로 첨가하였다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였으며, 미리 측정한 분광광도계의 흡광도와 건조세포의 중량 검증선을 이용하여 세포농도를 계산하였다. 발효과정 중 생물반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액의 각종 대사산물 및 숙신산 농도, 글루코스와 글리세롤 농도를 액체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과 도 12 및 표 1에 나타낸 바와 같이, PALK (pMS3-ecmdh) 균주는 79.05 g/L의 숙신산을 각각 1.29 mol/mol 글루코스와 3.27 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. PALK (pMS3-zrmdh) 균주는 76.11 g/L의 숙신산을 각각 1.25 mol/mol 글루코스와 3.15 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였으며. PALK (pMS3-scmdh2) 균주는 77.34 g/L의 숙신산을 각각 1.16 mol/mol 글루코스와 3.19 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. 마지막으로, PALK (pMS3-scmdh3) 균주의 유가식 발효 결과 75.15 g/L의 숙신산을 각각 1.13 mol/mol 글루코스와 3.1 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다. 이와 같은 결과는 실시예 9에서 보여준 것과 같이 MDH가 과발현 되지 않은 기존의 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주에 비해서는 향상된 숙신산 생산능을 보여주지만 CgMDH가 과발현 된 PALK (pMS3- cgmdh) 균주보다는 낮은 수치로, 다르게 말해 문헌상 보고된 MDH들에 비해 CgMDH가 숙신산 생산에 가장 주요한 역할을 한다는 것을 방증한다.
[실시예 11]
E. coli W3110, C. glutamicum 및 각각의 균주에 CgMDH가 과발현 된 E.coli W3110 (p100pro99A-cgmdh), C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) 균주를 이용한 숙신산 생산
상기 실시예 7에서 제작된 E. coli W3110 (p100pro99A-cgmdh) 균주와 E. coli W3110 균주는 10 mL LB 배지에 탄소원으로 따로 멸균처리된 글루코스를 3 g/L의 농도로 맞추어 접종하여 37 ℃에서 16시간 배양한 후 이를 다시 같은 배지 100 mL 로 옮겨서 배양하였다. 초기 세포 농도는 OD600 기준 0.2~0.25에 맞추어 접종하였으며 플라스크의 윗부분에 이산화탄소를 충분히 충전하여 혐기 조건 37 ℃에서 16시간동안 배양하였다. 항생제는 암피실린 25 μg/mL를 첨가하였다. 그 결과 표 2와 같이 CgMDH가 과발현 된 E. coli W3110 (p100pro99A-cgmdh) 균주는 기존 E. coli W3110 균주가 0.14 g/L의 숙신산 생산을 보여주었던 것에 비해 월등히 향상된 0.431 g/L의 숙신산 생산을 보여주었다.
상기 제작된 C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) 균주와 야생형 C. glutamicum 균주는 10 mL BHIS 액체 배지에 접종하여 30 ℃에서 18시간 배양한 후 이를 다시 같은 배지 100 mL 로 옮겨서 배양하였다. 초기 세포 농도는 OD600 기준 0.2~0.25에 맞추어 접종하였으며 세포 성장을 위해 초기 6시간동안 호기 환경에서 배양한 후 플라스크의 윗부분에 이산화탄소를 충분히 충전하여 혐기 조건 30 ℃에서 10시간동안 배양하였다. 항생제는 카나마이신 25 μg/mL을 첨가하였다. 혐기 환경으로 전환함과 동시에 isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside를 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 첨가하여 인덕션 하였다. 그 결과 표 2와 같이 CgMDH가 과발현 된 C. glutamicum (pEKEx1-cgmdh) 균주는 기존 C. glutamicum 균주가 0.08 g/L의 숙신산 생산을 보여주었던 것에 비해 월등히 향상된 0.69 g/L의 숙신산 생산을 보여주었다. 이와 같은 결과를 통해 CgMDH가 일반적인 숙신산 생산 균주에 과발현되었을 때에도 숙신산 생산능 향상에 긍정적인 효과를 줄 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 12]
M. succiniciproducens PALKcgmdh, PALKmsmdhG11Q 균주를 이용한 숙신산 생산
상기 실시예 8에서 제작된 M. succiniciproducens PALKcgmdh, PALKmsmdhG11Q 를 20 mL MH5 배지에 탄소원으로 따로 멸균처리된 글루코스 또는 글리세롤을 10 g/L의 농도로 맞추어 접종하여 혐기조건으로 39 ℃에서 8시간 배양한 후, 이를 다시 같은 배지 270 mL로 옮겨서 배양하였다. 발효는 상기의 배양액을 실시예 9에서와 같이 2.5 L의 합성배지를 함유한 미생물 반응기에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 18.2 g/L (100 mM) 초기 글루코스 농도, 글리세롤 사용시에는 4.6 g/L (50 mM) 초기 글리세롤 농도로, 온도 39 ℃, 200 rpm 조건에서 0.2 vvm의 속도로 순수 이산화탄소를 공급해 주면서 발효시켰다. 발효 중 pH는 1.57 M 암모니아수 및 6.84 M magnesium hydroxide solution을 사용하여 6.5로 조정하였으며, 항생제는 카나마이신 25 μg/mL와 클로람페니콜 6.8 μg/mL를 첨가하였다. 고농도의 숙신산 생산을 위하여 탄소원이 완전히 소모되었을 경우에는, 필요시 900 g/L의 글루코스 및 글리세롤 용액을 반연속적으로 첨가하였다. 배양액내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였으며, 미리 측정한 분광광도계의 흡광도와 건조세포의 중량 검증선을 이용하여 세포농도를 계산하였다. 발효과정 중 생물반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액의 각종 대사산물 및 숙신산 농도, 글루코스와 글리세롤 농도를 액체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과 도 13 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 탄소원으로 글루코스만을 사용했을 경우 PALKcgmdh 균주는 89.6 g/L의 숙신산을 각각 1.28 mol/mol 글루코스와 3.71 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였으며 PALKmsmdhG11Q 균주는 82.76 g/L의 숙신산을 각각 1.13 mol/mol 글루코스와 3.42 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다.
탄소원으로 글루코스와 글리세롤을 동시에 사용하였을 경우 PALKcgmdh 균주는 101.18 g/L의 숙신산을 각각 1.37 mol/mol 글루코스와 4.18 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였으며 PALKmsmdhG11Q 균주는 92.5 g/L의 숙신산을 각각 1.28 mol/mol 글루코스와 3.82 g/L/h의 수율과 생산성으로 생산하였다.
[실시예 13]
M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주와 PALKcgmdh 균주를 이용한 숙신산 생산성 향상
본 실시예에서는 M. succiniciproducens PALKcgmdh 균주를 이용한 숙신산 생산성 향상 방법을 확인하였다.
도 13의 (C)에서 알 수 있듯이 PALKcgmdh 균주는 접종 후 11~13시간이 지난 후 최대 생산성에 도달하고 있으며, 이때의 세포농도가 최대로 증가한 것을 알 수 있다. 따라서 생산성을 최대화시키기 위해 현재 수준보다 세포농도를 더 높였을 때 생산성의 변화가 어떠한지 먼저 살펴보았다.
실시예 9에서와 같은 배양조건에서 PALKcgmdh 균주의 초기세포농도를 OD600 = 19.3 (8.7 gDCW/L) 수준으로 높였을 때, 숙신산 생산성은 어떻게 변화하는지 살펴보고자, 실시예 9에서와 같이 2.5 L의 합성배지를 함유한 미생물 반응기에 접종하여 수행하였으며, 접종시 발효 조건은 18.2 g/L (100 mM) 초기 글루코스 농도, 글리세롤 사용시에는 4.6 g/L (50 mM) 초기 글리세롤 농도로, 온도 39 ℃, 200 rpm 조건에서 0.2 vvm의 속도로 순수 이산화탄소를 공급해 주면서 발효시켰다. 발효 중 pH는 1.57 M 암모니아수 및 6.84 M magnesium hydroxide solution을 사용하여 6.5로 조정하였으며, 항생제는 카나마이신 25 μg/mL와 클로람페니콜 6.8 μg/mL를 첨가하였다. 고농도의 숙신산 생산을 위하여 탄소원이 완전히 소모되었을 경우에는, 필요시 900 g/L의 글루코스 및 글리세롤 용액을 반연속적으로 첨가하였다. PALKcgmdh를 11시간 발효시켜 세포농도가 최고점에 거의 다다랐을 때 배양을 끝내고, 배양액을 4 ℃ 에서 6,000 rpm으로 10분간 원심분리 함으로서 세포 펠렛을 수득하였다. 세포 펠렛을 동일한 합성배지 200 mL에 재현탁하여, 고농도의 inoclulum을 얻을 수 있었다. 이를 접종하여 실시예 9의 조건과 동일하지만, 초기 글루코스 및 글리세롤의 농도를 2배하여 배양한 결과 도 14 및 표 1에 나타난 바와 같이, 숙신산 생산성이 10.32 g/L/h 및 최고 생산성은 15.72 g/L/h 로 원래 발효조건에 비해 2배 이상 증가했음을 알 수 있었다.
이러한 생산성 향상이 균주 개량의 효과임을 다시 한번 확인하기 위해 M. succiniciproducens PALK (KCTC10973BP) 균주 또한 같은 방법으로 초기세포농도를 OD600 = 21.1 (9.52 gDCW/L) 수준으로 높였을 때 숙신산 생산성이 8.93 g/L/h 및 최고 생산성은 12.4 g/L/h 로 확인되었다. 이를 통해, 고농도의 세포를 접종한 발효 방법이 생산성을 비약적으로 증가시키지만 M. succiniciproducens PALKcgmdh 균주가 더 우수한 숙신산 생산성 및 생산량을 보여주었음을 알 수 있다.
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Figure PCTKR2019005247-appb-I000001
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Figure PCTKR2019005247-appb-I000003
Figure PCTKR2019005247-appb-I000004
Figure PCTKR2019005247-appb-I000005
Figure PCTKR2019005247-appb-T000002
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 숙신산 생성 변이 미생물은 중심 사슬의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민(Gln)인 말산 탈수소효소가 발현되어 옥살로아세트산에서 말산으로의 전환 활성이 현저히 증가되기 때문에, 제한 배지 하에서 미생물을 배양시 현재까지 보고된 가장 높은 숙신산 생산성으로 고농도의 숙신산을 생산할 수 있다. 더불어 심화된 발효 기술을 사용하여 더 뛰어난 생산성 및 생산 농도로 숙신산을 생산할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (8)

  1. 숙신산 생성능을 가지는 미생물에 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 변이 미생물로, 상기 말산 탈수소효소는, 중심 사슬의 아마이드 작용기를 통해 NADH의 피로인산 부분과 상호작용하는 아미노산 잔기가 글루타민(Gln)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 말산 탈수소효소는 i) 서열번호 40의 아미노산 서열로 표시되는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 말산 탈수소 효소; 또는 ii) 서열번호 42의 아미노산 서열로 표시되는 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래 말산 탈수소효소에서 11번째 아미노산이 글루타민으로 치환된 말산 탈수소 효소인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, i) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 41의 염기서열로 표시되고, ii) 상기 맨하이미아 숙시니프로두센스 유래 말산 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 43의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 맨하이미아 속 (Mannheimia sp.), 액티노바실러스 속 (Actinobacillus sp.), 언에어로바이오스피리륨 속 (Anaerobiospirillum sp.), 대장균 (E. coli), 및 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 Mannheimia succiniciproducens PALK (KCTC10973BP)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  6. 다음 단계를 포함하는 숙신산 제조방법:
    (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양하여 숙신산을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 숙신산을 회수하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양은 i) 글루코스; ii) 수크로스; iii) 글리세롤; iv) 글루코스 및 글리세롤; 또는 v) 수크로스 및 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 숙신산 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 배양은 혐기적 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 숙신산 제조방법.
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