WO2016013844A1 - 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산 방법 - Google Patents

페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산 방법 Download PDF

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WO2016013844A1
WO2016013844A1 PCT/KR2015/007543 KR2015007543W WO2016013844A1 WO 2016013844 A1 WO2016013844 A1 WO 2016013844A1 KR 2015007543 W KR2015007543 W KR 2015007543W WO 2016013844 A1 WO2016013844 A1 WO 2016013844A1
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WO
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homoserine lactone
pet
phenylacetyl
gene
acid
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PCT/KR2015/007543
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English (en)
French (fr)
Inventor
홍영수
강선영
이재경
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한국생명공학연구원
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention relates to an expression vector, a transformant for biosynthesis of phenylacetyl homoserine lactone, and a method for producing phenylacetyl homoserine lactone using the same.
  • Homoserine lactone is a signaling material between microorganisms and is used for quorum-sensing signals among microorganisms, and is used as a biofilm formation or propagation suppression signal between microorganisms.
  • acyl-homoserine lactone AHL
  • AHL acyl-homoserine lactone
  • the synthesized acyl homoserine lactone freely diffuses through the cell membrane during bacterial growth and accumulates in the environment outside the cell.
  • homoserine lactones have different structures, each of which has different substituents depending on the strain, and generally has a lactone ring structure combined with various lengths of fatty acids.
  • New forms of photosynthetic bacteria such as Rhodopseudomonas palustris, nitrogen-fixed soil bacteria Bradyrhizobium sp., Or Silicibacter pomeroyi, have been linked to specific phenolic acid and lactone rings. It has been reported that homoserine lactones are produced.
  • homoserine lactone is a substance that is highly researched and utilized in plants and animals as a host, as well as a microorganism-microbial intermodulator, but it is difficult to produce materials at a commercial level in general microorganisms, which makes it difficult to develop related research.
  • the present inventors were studying a method for mass production of a useful substance, phenylacetyl homoserine lactone derivative, using a cheap medium, coenzyme A ligase enzyme, acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme, 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 Using caffeic acid O-methyltransferase, it was confirmed that mass production of phenylacetyl homoserine lactone derivatives through artificial biosynthetic pathway was completed.
  • an object of the present invention is to provide an expression vector for producing phenyl acetyl homoserine, a transformant using the gene encoding the enzyme, and to provide a method for producing a phenylacetyl homoserine lactone derivative using the same. .
  • the present invention provides a gene for phenylacetyl homoserine lactone production comprising a gene encoding coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl homoserine lactone biosynthetic enzyme (opRpaI).
  • a gene for phenylacetyl homoserine lactone production comprising a gene encoding coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl homoserine lactone biosynthetic enzyme (opRpaI).
  • 4CL2nt coenzyme A ligase enzyme
  • opRpaI acyl homoserine lactone biosynthetic enzyme
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production further comprising a gene (typ) encoding tyrosine ammonia lyase in the expression vector.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production further comprises 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 coding gene (sam5) in the expression vector.
  • the present invention also provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production further comprising a com gene encoding Caffeic acid O-methyltransferase (COMT).
  • a com gene encoding Caffeic acid O-methyltransferase (COMT).
  • the present invention also provides a transformant for the production of phenylacetyl homoserine lactone to which the expression vector is introduced.
  • the present invention provides a transformant, characterized in that the transformant is a tyrosine high production strain.
  • the present invention 1) culturing the transformant in the culture medium; And 2) obtaining phenylacetyl homoserine lactone from the culture solution of step 1); It provides a phenylacetyl homoserine lactone production method comprising a.
  • the present invention also provides a phenylacetyl homoserine lactone production method characterized in that the phenolic acid is added to the culture medium of step 1).
  • the present invention provides a method for producing phenylacetyl homoserine lactone, characterized in that methionine or S-Adenosyl methionine (SAM) is added to the culture medium of step 1).
  • SAM S-Adenosyl methionine
  • the present invention also comprises the steps of: (1) treating phenolic acid with coenzyme A ligase enzyme and acyl homoserine lactone biosynthetic enzyme; (2) culturing the treatment liquid of step (1); And (3) provides a method for producing a phenyl acetyl homoserine lactone derivative comprising the step of obtaining a phenyl acetyl homoserine lactone derivative in the culture of step (2).
  • the production method of the phenylacetyl homoserine lactone derivative of the present invention greatly increases the production amount of the phenylacetyl homoserine lactone derivative by using an E. coli expression system and in vitro enzymatic reaction and bioconversion, which have the advantage of culturing rapidly and in high concentration in a cheap medium. Since it is enhanced, it can be usefully used for mass production of phenylacetyl homoserine lactone derivatives.
  • Figure 1 shows the opRpaI expression vector (pET-opRpaI) inserting the opRpaI gene at the NdeI / XhoI position of the pET28a (+) vector and the 4CL2nt expression vector (pET-) inserting the 4CL2nt gene at the NdeI / XhoI position of the pET28a (+) vector. his4CL2nt) is shown.
  • Figure 2 shows the result of confirming the purified His-tagged opRpaI enzyme (26.7 kDa) and purified His-tagged 4CL2nt enzyme (61.5 kDa) through SDS-PAGE.
  • Figure 3 shows the results of enzyme reaction with 4-coumarin acid substrate of the opRpaI enzyme and coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) isolated by HPLC and LC / MS.
  • Figure 4 shows the results of the enzyme reaction with caffeic acid substrate of the separated opRpaI enzyme and coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) by HPLC and LC / MS.
  • Figure 5 shows the results of the enzyme reaction with the ferulic acid substrate of the opRpaI enzyme and coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) isolated by HPLC and LC / MS.
  • Figure 6 shows the results of the enzyme reaction with cinnamic acid substrate of the separated opRpaI enzyme and coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) by HPLC and LC / MS.
  • FIG. 7 shows a schematic of the production vector (pET-4R) for phenylacetyl homoserine lactone production containing coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) and opRpaI gene.
  • Figure 8 shows the results of HPLC analysis of the results of the respective phenylacetyl homoserine lactone production by the addition of phenolic acid in E. coli containing vector (pET-4R) for the production of phenyl acetyl homoserine lactone.
  • Peak 1 cinnamic acid; peak 2, p-coumarin acid; peak 3, caffeic acid; peak 4, ferulic acid; peak 5, cinnamoyl-homoserine lactone; peak 6, p-coumaryl-HSL; peak 7, caffe oil-homoserine lactone; peak 8, Peruvian-homoserine lactone.
  • Figure 9 shows the metabolic vector (pET-) for the production of 4-coumaryol-homoserine lactone (4-coumaryol-HSL) containing tyrosine ammonia lyase (opTAL), coenzyme A lyase enzyme (4CL2nt) and opRpaI gene.
  • pET- 4-coumaryol-homoserine lactone
  • opTAL tyrosine ammonia lyase
  • 4CL2nt coenzyme A lyase enzyme
  • opRpaI opRpaI gene
  • FIG. 10 shows the results of HPLC analysis of 4-coumaryl-homoserine lactone (4-coumaryol-HSL) produced in Escherichia coli containing an artificial metabolic vector (pET-opT4R) (*: coumaroyl-homoserine Lactones).
  • Figure 11 is an artificial metabolic vector (pET-opT54R) containing tyrosine ammonia lyase (opTAL), 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 coding gene (sam 5), coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) and opRpaI gene. The schematic diagram of the is shown.
  • FIG. 12 shows the results of HPLC analysis of caffeoyl-homoserine lactone (caffeoyl® HSL) production in Escherichia coli including the vector pET-opT54R (*: caffeoyl homoserine lactone).
  • Figure 13 shows tyrosine ammonia lyase (opTAL), 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 coding gene (sam 5), coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), caffeic acid O-methyltransferase (Caffeic acid O-methyltransferase,
  • the schematic diagram of the metabolic pathway vector (pET-opT54MR) containing the com gene and opRpaI gene encoding COMT) is shown.
  • Fig. 14 shows the results of HPLC analysis of the production of Peruroyl-homoserine lactone (Feruloyl® HSL) in E. coli containing the vector pET-opT54MR (*: ferroyl homoserine lactone).
  • 15 is a diagram showing the results of confirming the production amount of phenyl acetyl homoserine lactone derivatives according to the culture time of E. coli including pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR.
  • FIG. 16 HPLC analysis of production of 4-coumaroyl-homoserine lactone in general E. coli strain (pET-opT4R / C41) or tyrosine high producing strain (pET-opT4R / ⁇ COS1) comprising vector pET-opT4R
  • Figure 1 shows the results.
  • FIG. 17 shows cultures of normal E. coli strains (pET-opT4R / C41) or tyrosine high producing strains (pET-opT4R / ⁇ COS1) comprising pET-opT4R or Met (methionine) (pET-opT4R / ⁇ COS1) in its culture medium. + Met) or SAM (S-adenosyl methionine) (pET-opT4R / ⁇ COS1 + SAM) was added and cultured, followed by confirming the yield of comaroyl-homoserine lactone (p-coumaryol-HSL). It is also.
  • FIG. 18 shows cultures of normal E. coli strain (pET-opT54R / C41) or tyrosine high producing strain (pET-opT54R / ⁇ COS1) comprising pET-opT54R or Met (methionine) (pET-opT54R / ⁇ COS1) in its culture medium. + Met) or SAM (S-Adenosyl methionine) (pET-opT54R / ⁇ COS1 + SAM) was added and cultured, and the figure shows the result of confirming the production amount of caffeoyl-homoserine lactone (Caffeoyl-HSL).
  • FIG. 19 shows cultures of normal E. coli strain (pET-opT54MR / C41) or tyrosine high producing strain (pET-opT54MR / ⁇ COS1) containing pET-opT54MR or Met (methionine) (pET-opT54MR / ⁇ COS1) in its culture medium.
  • pET-opT54MR / C41 normal E. coli strain
  • pET-opT54MR / ⁇ COS1 tyrosine high producing strain
  • Met methionine
  • the present invention provides a phenylacetyl homoserine lactone comprising a gene encoding Coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl-homoserine lactone biosynthetic enzyme (opRpaI) Provide an expression vector.
  • a phenylacetyl homoserine lactone comprising a gene encoding Coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl-homoserine lactone biosynthetic enzyme (opRpaI) Provide an expression vector.
  • the expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production of the present invention can produce a large amount of phenylacetyl homoserine lactone by performing a series of metabolic processes through an artificial metabolic pathway according to bioconversion and gene recombination.
  • Phenylacetyl homoserine lactone of the present invention means a compound of formula (I), wherein Ra is hydrogen, methoxy or hydroxy, and Rb is hydrogen, methoxy or hydroxy.
  • the gene encoding the acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme is based on the amino acid sequence of the acylhomoserine lactone biosynthesis enzyme (RpaI) of Rhodopseudomonas palustris (SEQ ID NO: 1) to the tRNA ratio for each amino acid sequence in Escherichia coli. It is a gene produced using the best codon usage (codon usage) according.
  • the codon usage frequency may use a codon usage frequency provided by a Kazusa database (http://www.kazusa.or.jp).
  • the gene has a nucleotide sequence optimized for E.
  • coli expression preferably has a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2, or a functional equivalent thereof, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more polynucleotide sequences with sequence homology.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme is encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2.
  • the gene encoding the coenzyme A ligase enzyme is based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of 4-coumaroyl coenzyme A (4CL2) of tobacco (Nicotiana tabacum) according to the tRNA ratio for each amino acid sequence in E. coli It can be prepared using codon usage of. Codon usage was determined through E. coli expression optimization system, commissioned by Bioneer Co., Ltd. to improve gene expression in E. coli expression system.
  • the codon usage frequency may use a codon usage frequency provided by a Kazusa database (http://www.kazusa.or.jp).
  • the gene has a nucleotide sequence optimized for E.
  • coli expression preferably has a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, or a functional equivalent thereof, 90%, 91%, 92%, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more polynucleotide sequences with sequence homology.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the coenzyme A ligase enzyme is encoded by a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also includes a gene encoding coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme (opRpaI) and a gene encoding tyrosine ammonia lyase (opTAL)
  • 4CL2nt coenzyme A ligase enzyme
  • opRpaI acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme
  • opTAL tyrosine ammonia lyase
  • the gene of the expression vector is preferably linked sequentially in the order of opTAL-4CL2nt-opRpaI, in the present invention it was named pET-opT4R vector.
  • the gene encoding the tyrosine ammonia lyase is based on the amino acid sequence of tyrosine ammonia lyase (TAL) identified in actinomycetes Saccharothrix espanaensis (KCTC9392), which converts tyrosine into 4-coumaric acid.
  • TAL tyrosine ammonia lyase
  • KCTC9392 actinomycetes Saccharothrix espanaensis
  • the gene has a sequence optimized for E.
  • coli expression preferably has a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5, or a functional equivalent thereof, and 90%, 91%, 92%, 93 to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 It may be a polynucleotide sequence having%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the tyrosine ammonia lyase is encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 5.
  • the vector named pET-opT4R vector can effectively produce phenylacetyl homoserine lactone, preferably coumaroyl-homoserine lactone, via the metabolic pathway.
  • the present invention also provides a gene encoding coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme (opRpaI), a gene encoding tyrosine ammonia lyase (opTAL) and 4-coumarin acid 3-hydroxyl
  • 4CL2nt coenzyme A ligase enzyme
  • opRpaI acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme
  • opTAL tyrosine ammonia lyase
  • An expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production comprising the enzyme Sam5 (4-coumarate 3-hydroxylase Sam5) coding gene (sam 5) is provided.
  • the gene of the expression vector is preferably linked sequentially in the order of opTAL-Sam5-4CL2nt-opRpaI, in the present invention it was named pET-opT54R vector.
  • the 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 coding gene is a gene synthesized from 4-coumarin acid 3-hydroxylase Sam5 identified in Saccharothrix espanaensis that converts 4-coumarin acid to caffeic acid.
  • the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15, or a functionally equivalent property thereof, and 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15 It may be a polynucleotide sequence having%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the 4-coumarin acid 3-hydroxyase Sam5 coding gene is a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 15.
  • the vector named pET-opT54R vector can effectively produce phenylacetyl homoserine lactone, preferably caffeoyl-homoserine lactone, via an metabolic pathway.
  • the present invention provides a gene encoding a coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt), a gene encoding an acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme (opRpaI), a gene encoding tyrosine ammonia lyase (opTAL), 4-coumarin acid 3-hydroxyl
  • a gene encoding a coenzyme A ligase enzyme (4CL2nt) a gene encoding an acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme (opRpaI), a gene encoding tyrosine ammonia lyase (opTAL), 4-coumarin acid 3-hydroxyl
  • An expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production comprising a com gene encoding an enzyme Sam5 coding gene (sam 5) and a caffeic acid O-methyltransferase (COMT) is provided.
  • the gene of the expression vector is preferably linked sequentially in the order of opTAL-Sam5-4CL2nt-com-opRpaI, in the present invention it was named pET-opT54MR vector.
  • Com which encodes the Caffeic acid O-methyltransferase is a caffeic acid O-methyl transition identified in Arabidopsis thaliana, which converts caffeic acid to ferulic acid. It may be a gene synthesized from an enzyme (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT), preferably a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 17, or a functional equivalent thereof, 90%, 91 of the base sequence of SEQ ID NO: 17 It may be a polynucleotide sequence having%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more sequence homology.
  • the present invention provides an expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the com gene encoding the Caffeic acid O-methyltransferase (COMT) is a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 17. .
  • the com gene encoding the Caffeic acid O-methyltransferase is a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 17. .
  • the vector named pET-opT54MR vector can effectively produce phenylacetyl homoserine lactone, preferably peruroloyl-homoserine lactone, via the metabolic pathway.
  • phenylacetyl homoserine lactone may include an analog thereof without limitation, and is preferably coumaroyl homoserine lactone represented by any one of the compounds of Formulas 2 to 5, caffeoyl-homoserine lactone , Peruroyl-homoserine lactone and cinnamoyl homoserine lactone may be at least one selected from the group consisting of:
  • Formula 2 is 4-coumaroyl-homoserine lactone
  • Formula 3 is caffeoyl-homoserine lactone
  • Formula 4 is Peruroyl-homoserine lactone
  • Formula 5 is cinnamoyl-homoserine lactone. to be.
  • Expression vectors of the invention can be prepared according to vector recombination methods known in the art.
  • the expression vector which can be used in the present invention is preferably any one used to express foreign proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • Recombinant vectors for prokaryotic cells are preferred, and in the case of eukaryotic recombinant vectors, recombinant vectors for yeast insects or mammalian cells can be used, but yeast recombinant vectors are preferred.
  • Commercially available prokaryotic vectors include, but are not limited to, pET vectors (Novagen, Inc., USA), pQE vectors (Qiagen, USA), and pGEX (Pharmacia Biotech Inc., USA).
  • Available expression vectors for eukaryotic cells include pCI Neo (Promega, USA), pMAMneo (Clontech, USA), pcDNA3 (InVitrogen, USA), pMClneo (Stratagene, USA), pXT1 (Stratagene, USA), pSG5 (Stratagene, USA) ), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) and lZD35 (ATCC 37565), and the like, and may include a promoter and terminator to receive expression control independently.
  • the present invention also provides a transformant for phenylacetyl homoserine lactone production, wherein the expression vector for phenylacetyl homoserine lactone production is introduced.
  • the transformant of the present invention may be any system capable of expressing an expression vector for producing phenylacetyl homoserine lactone derivatives, and preferably, an E. coli expression system is used.
  • transformation using an expression vector may be used in any method known in the art, and preferably, the expression vector is inserted into E. coli using a method of applying a thermal shock to activated cells produced by chemical treatment of E. coli. It is prepared as follows.
  • the transformant of the present invention is Escherichia coli C41 (DE3), and the artificial biosynthetic pathway of phenylacetyl homoserine lactone can be established by the expression vector introduced therefrom, from which phenyl acetyl homoserine lactone Can be produced in large quantities.
  • the transformant of the present invention may be a tyrosine high production variant strain ( ⁇ COS1).
  • the high tyrosine mutant strain is a feedback-inhibition of tyrAfbr [chorismate mutase / prephenate dehydrogenase gene (tyrA) consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 27.
  • aroGfbr [3-deoxy-D-arabino-haptulosonate-7-phosphate synthase gene (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP), consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 ) feedback-inhibition-resistant (fbr) gene] of synthase, aroG) may be inserted into a tyrR (Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor) regulatory region.
  • DAHP deoxy-D-arabino-haptulosonate-7-phosphate synthase gene
  • the tyrosine-producing mutant strain thus prepared may be preferably pET-opT4R / ⁇ COS1, pET-opT54R / ⁇ COS1, pET-opT54MR / ⁇ COS1 into which pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR are introduced. .
  • the present invention comprises the steps of 1) culturing the transformant for phenylacetyl homoserine lactone production in the culture medium; And 2) obtaining phenylacetyl homoserine lactone from the culture solution of step 1); It provides a phenylacetyl homoserine lactone production method comprising a.
  • the homoserine phenylacetyl homoserine lactone production method is a method for producing phenylacetyl homoserine lactone by adding phenolic acid as a substrate and bioconversion according to the type of transformant used and artificial metabolism constructed without the addition of phenolic acid
  • the route may include all methods of producing phenylacetyl homoserine lactone.
  • the present invention provides a phenylacetyl homoserine lactone production method, characterized in that phenolic acid is added to the culture medium of step 1).
  • phenolic acid can be used as a substrate for the production of phenylacetyl homoserine lactone derivatives, preferably 4-coumarinic acid, caffeic acid, ferulic acid, cinnamic acid, cinnapic acid can be used, more preferably 4-coumarin At least one selected from the group consisting of acid, caffeic acid, ferulic acid and cinnamic acid may be used.
  • the transformant of step 1) is preferably a transformant introduced pET-4R vector.
  • the transformant of step 1) is pET-opT4R, pET-opT54R, pET- It is preferable that opT54MR are each introduced transformants.
  • Culture of the transformant in step 1) is preferably a medium condition for growth of the transformant. For example, it cultures in LB, YT, M9 medium, etc.
  • Protein expression of the transformant cultured in step 1) can be induced by the respective protein induction method according to the expression vector type, such as IPTG treatment, and after the protein expression is induced, by further culturing the phenylacetyl homo Induces expression of serine lactones.
  • Further incubations include 3 g / L KH 2 PO 4 , 7.3 g / LK 2 HPO 4 , 8.4 g / L MOPS, 2 g / L NH 4 Cl, 0.5 g / L NaCl, 0.1 ml / L Trace elements, 5 g It is preferably incubated under modified synthetic medium (SM) medium conditions comprising / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g / L MgSO 4 , 15 g / L glucose.
  • SM synthetic medium
  • Obtaining phenyl acetyl homoserine lactone in step 2) may be obtained by separating the compound through HPLC or the like or by separating the compound by conventional methods known in the art.
  • the transformant of step 1) may be preferably Escherichia coli C41 (DE3), more preferably tyrosine high production mutant strain ( ⁇ COS1).
  • the present invention also provides a method for producing phenylacetyl homoserine lactone, characterized in that methionine or S-adenosyl methionine (SAM) is added to the culture medium of step 1).
  • SAM S-adenosyl methionine
  • the transformant By adding the methionine or S-adenosyl methionine to the medium, the transformant can produce a significantly increased amount of phenylacetyl homoserine lactone than that produced in normal E. coli and tyrosine high production variant strains. Thus, the addition of simple additives can lead to significant improvements in production efficiency.
  • the present invention comprises the steps of: 1) treating phenolic acid with coenzyme A ligase enzyme and acyl homoserine lactone biosynthesis enzyme; 2) culturing the treatment liquid of step 1); And 3) obtaining phenyl acetyl homoserine lactone from the culture medium of step 2).
  • Coenzyme A ligase enzyme in step 1) is an enzyme that can be identified in tobacco (Nicotiana tabacum) and the like and converts phenolic acid to phenyl coenzyme A. According to an embodiment of the invention said enzyme is 4-Coumarate CoA Ligase 2 from Nicotiana tabacum (4CL2nt).
  • the acyl homoserine lactone biosynthetic enzyme may be used as isolated from Rhodopseudomonas palustris (RpaI).
  • the reaction is preferably reacted at a temperature of 30 ° C. in a solution containing CoA, ATP and SAM (S-adenosyl methionine).
  • Obtaining phenyl acetyl homoserine lactone in step 3) may be obtained by separating the compound through HPLC or the like or by separating the compound by conventional methods known in the art.
  • the phenyl acetyl homoserine lactone derivative to be separated may preferably be a homoserine lactone derivative in which a phenolic acid and a lactone ring are bonded.
  • 4-coumaryl-homoserine lactone (Formula 2) using 4-coumarin acid as a substrate for the production of phenylacetyl homoserine lactone derivatives, caffeoyl-homoserine using caffeic acid It is possible to produce cinnamoyl-homoserine lactone (Formula 5) using lactone (Formula 3), ferulic acid using Peruroyl-homoserine lactone (Formula 4), and cinnamic acid.
  • Example 1-1 Acylhomoserine Genes encoding lactone biosynthesis enzymes ( opRpaI Gene) and coenzyme A Regaise enzyme( 4CL2nt Sequencing of genes)
  • coli A new gene (SEQ ID NO: 2) was determined using Bioneer's optimization program using the optimal codon usage according to the tRNA ratio for each sequence, and 4-coumaro of tobacco (Nicotiana tabacum) Based on the amino acid sequence of one coenzyme A (4CL2nt) (SEQ ID NO: 3), the protein optimal expression of a new gene using codon usage according to the tRNA ratio for each amino acid sequence in Escherichia coli of DNA2.0 SEQ ID NO: 4) was determined.
  • Example 1-1 On the basis of the nucleotide sequence determined in Example 1-1 (SEQ ID NO: 2), opRpaI gene synthesis was produced by BIO Co., Ltd. to have a restriction enzyme NdeI position in front of the nucleotide sequence and an XhoI position in the rear.
  • the prepared nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 7 Based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) determined by requesting DNA2.0 in Example 1-1, a 4CL2nt gene was synthesized to have a restriction enzyme NcoI position in front of the nucleotide sequence and a HindIII position in the rear. The prepared nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the opRpaI gene having restriction enzyme NdeI position in front of the base sequence and XhoI position in the back of the nucleotide sequence prepared by Bioneer was cut using restriction enzymes NdeI and XhoI, and the pET-28a (+) vector, which is an E. coli expression vector Recombinant vector pET-opRpaI was prepared by cleaving with restriction enzymes NdeI and XhoI and linking NdeI and XhoI sites of opRpaI with NdeI and XhoI sites of pET-28a (+) vector, the schematic diagram of which is shown in FIG. It was.
  • 4CL2nt-F and 4CL2nt-R primers were prepared using pET-4CL2-Nt vector containing 4CL2nt gene having restriction enzyme NcoI position in front of nucleotide sequence prepared by DNA2.0 and HindIII site in rear. PCR products were carried out in pairs to obtain PCR products. His4CL2nt TA vectors were prepared by inserting the PCR products into T-blunt vectors using the T-Blunt PCR Cloning method provided by Solgent. The E.
  • coli expression vector pET-28a (+) vector was digested using restriction enzymes NdeI and XhoI of the His4CL2nt TA vector, and the NdeI and XhoI sites and pET-28a (+) of 4CL2nt were digested with restriction enzymes NdeI and XhoI.
  • the recombinant vector pET-his4CL2nt was prepared by linking the NdeI and XhoI sites of the vector, a schematic diagram of which is shown in FIG.
  • FIG. 2 (a) using a pET-opRpaI vector, M represents the size marker, 1 represents the Ni-NTA resins passing solution, 2 represents the washing buffer (washing buffer) passing solution, 3 and 4
  • M represents the size marker
  • 1 represents the Ni-NTA resins passing solution
  • 2 represents the washing buffer (washing buffer) passing solution
  • 3 and 4 The SDS-PAGE results of the elution buffer solutions are shown respectively.
  • M represents the size marker
  • 4 represents the SDS-PAGE results of the elution buffer passage solution in Ni-NTA resins.
  • Example 1-3 In vitro opRpaI Enzymatic Phenylacetyl Confirmation of homoserine lactone compound synthesis
  • coenzyme A ligase enzyme 4CL2nt which was expressed and purified in the state of N-terminal His-tag soluble protein in Example 1-2, was used, and homoserine lactone in acyl coenzyme A was used.
  • acyl homoserine lactone synthase enzyme opRpaI purified by expressing in the state of N-terminal His-tag soluble protein in Example 1-2.
  • FIGS. 3 to 6 The results of the analysis using the standard of each of 4-coumarin acid, caffeic acid, ferulic acid and cinnamic acid as substrates are shown in FIGS. 3 to 6.
  • FIG. 3 is a result of using 4-coumarin acid as a substrate
  • FIG. 4 is a result of using caffeic acid as a substrate
  • FIG. 5 is a result of using ferulic acid as a substrate
  • FIG. 6 is a result of using cinnamic acid as a substrate.
  • Figures 3 to 6 * means newly formed phenyl acetyl homoserine lactone.
  • the opRpaI enzyme was added to each of the added substrate cinnamic acid, 4-coumarin acid, caffeic acid, ferulic acid, 4-coumaryl homoserine lactone, caffeoyl homoserine lactone, peruroloyl It was confirmed that phenylacetyl homoserine lactone compounds such as homoserine lactone can be produced.
  • Example 2-1 4CL2nt - opRpaI Recombinant vector containing genes ( pET -4R) production
  • the pET-his4CL2nt TA PCR product of Example 1-2 was digested with restriction enzymes NdeI and SpeI, and the pET-opRpaI TA product was digested with restriction enzymes SpeI and XhoI.
  • the pET-28a (+) vector was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, and the products of the two genes thus prepared were transformed into E. coli by linking with the vector.
  • the NdeI site of the pET-his4CL2nt TA PCR product was linked to the NdeI site of the cleaved pET-28a (+) vector
  • the SpeI site of the pET-his4CL2nt TA PCR product was linked to the SpeI site of the pET-opRpaI TA product.
  • Two genes synthesized by linking the XhoI site of the pET-opRpaI TA product and the XhoI site of the pET-28a (+) vector were inserted into one expression vector pET-28a (+).
  • the 4CL2nt and opRpaI genes of pET-4R thus produced were produced to be independently regulated with their respective T7 promoter and T7 terminator, which was named pET-4R.
  • a schematic diagram of the prepared vector is shown in FIG. 7.
  • Example 2-2 pET Synthesis of Homoserine Lactone Compounds from -4R Transgenic Microorganisms
  • PET-4R prepared in Example 2-1 was transformed into Escherichia coli to prepare pET-4R / C41, and each standard of cinnamic acid, 4-coumarin acid, caffeic acid, and ferulic acid was prepared in a medium containing E. coli. Each was incubated with 30 mg / L treatment.
  • Example 3-1 opTAL - 4CL2nt - opRpaI Recombinant vector containing genes ( pET -opT4R) production
  • the enzyme that converts tyrosine to 4-coumaric acid is based on the amino acid sequence of tyrosine ammonia lyase (TAL) identified in actinomycetes Saccharothrix espanaensis (KCTC9392), for each amino acid in Escherichia coli.
  • the base sequence (opTAL, SEQ ID NO: 5) was synthesized using the optimal codon usage according to the tRNA ratio.
  • the enzyme for converting 4-coumaric acid to 4-coumaroyl Coenzyme A is the base of the coenzyme A ligase enzyme (cinnamate / 4-coumarate: CoA ligase) identified in tobacco (Nicotiana tabacum).
  • the sequence (4CL2nt, SEQ ID NO: 4) was synthesized.
  • RpaI an enzyme converting 4-coumaroyl coenzyme A to 4-coumaroyl homoserine lactone compound, was synthesized and used as the base sequence (opRpaI, SEQ ID NO: 2).
  • pET-opT4R a vector was constructed in which three genes of opTAL, 4CL2nt and RpaI were sequentially linked, which was named pET-opT4R and a schematic diagram thereof is shown in FIG. 9. .
  • PCR reactions were performed using pET-opTAL vectors as template DNA with opTAL-F and pET-CPac primer pairs. PCR was performed with nPfu-special DNA polymerase for 28 cycles at 30 seconds at annealing at 60 ° C. for 2 minutes and 30 seconds at 72 ° C. for securing pET-opTAL TA PCR products.
  • a pET-his4CL2nt TA PCR product was obtained by performing a PCR reaction using the pET-his4CL2nt vector prepared in Example 1-2 as a template DNA using pET-NPac and pET-CSpe primer pairs.
  • a PCR was constructed to have a SpeI site 400bp ahead of the NdeI site, and the produced vector had a T7 promoter and RBS between the SpeI and NdeI sites, and the XhoI site after NdeI. It has a T7 terminator behind the XhoI seat.
  • the vector was cleaved with NdeI and XhoI, and the synthesized pGEM-opRpaI was cleaved with restriction enzymes NdeI and XhoI, and the NdeI and XhoI sites of the cleaved vector were linked with the NdeI and XhoI sites of the cleaved gene.
  • the truncated gene was linked with the vector.
  • pET-opTAL TA PCR products were digested with restriction enzymes NdeI and PacI
  • pET-his4CL2nt TA PCR products were digested with restriction enzymes PacI and SpeI
  • pET-opRpaI TA products were digested with restriction enzymes SpeI and XhoI.
  • the pET-28a (+) vector was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, and the PCR products of these three genes were linked with the vector.
  • the NdeI site of the pET-opTAL TA PCR product was linked to the NdeI site of the cleaved pET-28a (+) vector, and the PacI site of the pET-opTAL TA PCR product was connected to the PacI site of the pET-his4CL2nt TA PCR product.
  • the SpeI site of pET-his4CL2nt TA PCR product was linked to the SpeI site of pET-opRpaI TA product.
  • the three genes synthesized by linking the XhoI site of the pET-opRpaI TA product with the XhoI site of the pET-28a (+) vector were inserted into one expression vector pET-28a (+) to produce and transform pET-opT4R. .
  • C41 (DE3) cells were treated with CaCl2 to induce instability in the cell membrane structure to make DNA enter well, and thermal shock that instantaneously heats cells by adding pET-opT4R gene to C41 (DE3) Escherichia coli thus made PET-opT4R was transformed into E. coli using the method.
  • opTAL, 4CL2nt, and opRpaI genes of pET-opT4R thus prepared were designed to receive expression control independently with T7 promoter and T7 terminator, respectively, and the schematic diagram is shown in FIG. 9, and the base sequences of the primers used above are shown in Table 2. It was.
  • PET-opT4R / C41 Escherichia coli prepared in Example 3-1 was inoculated in 50 ml of LB medium (50 ⁇ g / l kanamycin) and incubated at 37 ° C. to DO 600 0.6, after 10 minutes of cold shock. Protein expression was induced with 1 mM IPTG. Thereafter, the cells were further incubated at 26 ° C. for 6 hours, cells were obtained and transferred to 30 ml SM (modified synthetic medium; added glucose 15 g / L; 50 ⁇ g / L Kan, 1 mM IPTG) medium and 25 at 26 ° C. Incubated for hours.
  • LB medium 50 ⁇ g / l kanamycin
  • a portion of the culture was filtered (Sartorius Minisart RC 4, 0.2 ⁇ m) and 20 ⁇ l of the solution was purified using CH 3 CN-H 2 O (JTBaker) using a SunFire TM C18 column (250 ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m; Waters, USA) column. , USA) (0.05% TFA; Sigma-Aldrich, USA) mobile phase was subjected to HPLC analysis for 25 minutes from 10% to 60% at a rate of 1 mL / min. 4-coumarin acid standard was purchased from Sigma (USA) and analyzed, and the analysis results are shown in FIG. 10.
  • Example 4-1 Caffe Oil-Homoserine Lactone Production opTAL - Sam5 - 4CL2nt - RpaI Recombinant vector containing genes ( pET - opT54R Production
  • pET-Sam5 vector was used as template DNA, and PCR amplification with pET-NPac and pET-CPac primer pairs to obtain a pET-Sam5 TA PCR product.
  • a PacI site was prepared by PCR to have a PacI site about 800bp ahead of the NdeI site, and the produced vector had a T7 promoter and RBS between PacI and NdeI sites, and a HindIII site after NdeI. It has a T7 terminator after HindIII.
  • the vector was cleaved with PacI
  • the pET-opT4R vector of Example 3-1 was cleaved with restriction enzyme PacI
  • the cleaved gene was linked with the vector.
  • the thus prepared vector was named pET-opT54R.
  • the pET-opT54R vector consists of opTAL, Sam5, 4CL2nt and opRpaI genes, and was constructed to have expression control independently with each T7 promoter and T7 terminator.
  • the produced vector was named pET-opT54R and a schematic diagram thereof is shown in FIG. 11.
  • Example 4-1 In order to confirm that the pET-opT54R prepared in Example 4-1 effectively produced the caffeoyl homoserine lactone compound from 4-coumarin acid through the metabolic pathway, E. coli was transformed with the pET-opT54R vector and the resulting material was Confirmed.
  • pET-opT54R was transformed into E. coli to prepare pET-opT54R / C41, and the prepared E. coli was cultured in the same manner as in Example 3-2. A portion of the culture was filtered (Sartorius Minisart RC 4, 0.2 um) and 20ul of the solution was analyzed by HPLC. HPLC analysis was performed using a SunFire TM C18 column (250 ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m; Waters, USA) column, CH 3 CN-H 2 O (JTBaker, USA) (0.05% TFA; Sigma-Aldrich, USA) The mobile phase was run for 25 minutes from 10% to 60% at a rate of 1 ml / min. Caffeic acid standard was purchased from Sigma (USA) and analyzed, and the results are shown in FIG. 12.
  • Example 5-1 Peruroyl homoserine lactone production in recombinant vector ( pET - opT54MR Production
  • pET-NSpe and pET-CSpe primer pairs were used, and PCR amplification using the pET-COM vector as template DNA, thereby obtaining a pET-COM TA PCR product.
  • the peptide was produced by PCR to have a SpeI site about 400bp ahead of the NdeI site, and the produced vector had a T7 promoter and RBS between the SpeI and NdeI sites, followed by the HindIII site after NdeI, It has a T7 terminator behind the HindIII site.
  • the vector was cleaved with SpeI
  • the pET-opT54R vector of Example 4-1 was digested with restriction enzyme SpeI
  • the cleaved gene was linked with the vector.
  • the thus constructed vector was named pET-opT54MR, which was composed of opTAL, Sam5, 4CL2nt, com and opRpaI genes, and was individually controlled to control expression through T7 promoter and T7 terminator.
  • the prepared vector was named pET-opT54MR vector, and a schematic diagram thereof is shown in FIG. 13.
  • PET-opT54MR prepared in Example 5-1 was transformed into E. coli to prepare pET-opT54MR / C41, and the prepared E. coli was cultured in the same manner as in Example 3-2, and the production product was analyzed. .
  • Ferulic acid standard was purchased from Sigma (USA) and analyzed, and the analysis results are shown in FIG. 14.
  • pET-opT54MR / C41 was incubated three times in the same manner as in the above culture conditions in order to confirm the production of Peruroyl homoserine lactone by pET-opT54MR / C41.
  • the amount produced according to the incubation time (1, 4, 15, 25, 40 hours) was measured, which was analyzed by HPLC and the results are shown in FIG. 15.
  • aroG 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) synthase
  • tyrA chorismate mutase / prephenate dehydrogenase gene
  • RBS and T7 promoters produced fragments containing both tyrAfbr and aroGfbr gene cassettes located in front of each gene: IF-N1 primer (SEQ ID NO: 19) and IF-C1 primer (SEQ ID NO: 20).
  • Other fragments containing FRT-neo-FRT were amplified using IF-FRT1 primer (SEQ ID NO: 21) and IF-FRT2 primer (SEQ ID NO: 22). The two fragments were linked between the SpeI sites of pUC19 using an In-fusion kit (Clontech Laboratories, Inc., USA) to prepare pUC-AGFRT.
  • 5.9-kb insert PCR product was generated using pUC-AGFRT as a template, and tyrRr primer (SEQ ID NO: 23) and Inf-tyrRfAG primer (SEQ ID NO: 24) were used.
  • the gene cassette was inserted between tyrR genes for gene insertional inactivation, and was performed by conventional methods using RED / ET recombination including the Quick & Easy E. coli Gene deletion kit (Gene Bridges). .
  • ⁇ COS1 Insertion inactivation tyrosine high production mutant strain constructed through the above process was confirmed by tyrA-F primer (SEQ ID NO: 25) and aroG-R primer (SEQ ID NO: 26).
  • Example 6-2 Increasing production of homoserine lactone using high tyrosine strains
  • the pET-opT4R, pET-opT54R, and pET-opT54MR prepared in Example prior to the tyrosine high production E. coli ⁇ COS1 prepared in Example 6-1 were introduced to pET-opT4R / ⁇ COS1, pET-opT54R / ⁇ COS1, pET -opT54MR / ⁇ COS1 was produced. Since the vectors are capable of producing 4-coumaroyl homoserine lactone, caffeoyl homoserine lactone, and peruroloyl homoserine lactone, respectively, it was confirmed whether their production is increased in the introduced ⁇ COS1.
  • the prepared E. coli were cultured and analyzed in the same manner as in Example 3-2, and the area value of each homoserine lactone compound peak was compared with that of 4-coumaroyl homoserine lactone standard at 300 nm wavelength of HPLC. The yield was measured.
  • the culture of pET-opT4R / ⁇ COS1 produced 4-coumaroyl homoserine lactone compound at 61 mg / L level, which is three times higher than pET-opT4R / C41. Therefore, it was confirmed that a large amount of 4-coumaroyl homoserine lactone compound can be produced in a tyrosine-producing strain.
  • the culture of pET-opT54R / ⁇ COS1 produced a caffeoyl homoserine lactone compound at a level of 30 mg / L, which is about 6 times higher than that of pET-opT54R / C41. Therefore, it was confirmed that a large amount of caffe oil homoserine lactone compound can be produced in a high tyrosine producing strain.
  • SAM S-adenosyl methionine
  • PET-opT4R / ⁇ COS1, pET-opT54R / ⁇ COS1, pET-opT54MR / ⁇ COS1 prepared in Example 6-2 were cultured three times in the same manner as in the above culture conditions, at which time SAM or methionine was added to the medium. Treated to 1 mM final concentration and incubated for 25 hours each. A portion of each culture was filtered (Sartorius Minisart RC 4, 0.2 ⁇ m) and 20 ⁇ l of the solution was used for HPLC analysis using a SunFire TM C18 column (250 ⁇ 4.6 mm, 5 ⁇ m; Waters, USA) column, CH3CN-H2O.
  • phenylacetyl homoserine lactone can be effectively produced using a vector including 4CL2nt and opRpaI gene, optionally opTAL, sam5, com.
  • the production of phenylacetyl homoserine lactone can be significantly increased by introducing the vector into the tyrosine-producing strain ⁇ COS1 or by simply adding S-adenosyl methionine or methionine to its culture medium.
  • phenylacetyl homoserine lactone which is a useful substance, can be produced at low cost through bioconversion and artificial metabolic pathways. Since it can be mass-produced, it can be industrially useful.

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Abstract

본 발명은 페닐아세틸 호모세린 락톤의 대량 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 페닐아세틸 호모세린 락톤의 생산 방법은 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 가진 대장균 발현 시스템 및 In vitro 효소 반응과 생전환 시스템을 이용하여 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산량을 크게 증진시켰는바 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산 방법
본 발명은 페닐아세틸 호모세린 락톤의 생합성을 위한 발현 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 페닐아세틸 호모세린 락톤의 생산 방법에 관한 것이다.
호모세린 락톤은 미생물 간의 신호전달 물질이며 미생물 간의 상호 정족수 인식 (quorum-sensing signals)에 사용되는 물질로써, 미생물 간의 바이오 필름 형성이나 번식 억제 신호 등으로 사용되고 있다. 예를 들어, 대표적인 호모세린 락톤인 아실 호모세린 락톤 (acyl-homoserine lactone, AHL)은 아실 호모세린 락톤 합성 단백질에 의해 신호전달 물질로 합성된다. 합성된 아실 호모세린 락톤은 세균이 성장하는 과정에서 세포막을 통하여 자유롭게 확산되고, 세포 외부의 환경에 축적된다. 세균의 밀도가 높아져 세포 외부에 축적된 신호전달 물질이 일정 농도에 도달하면, 신호전달 물질은 다시 세포 내로 들어와 조절단백질과 결합하여 특정 유전자의 발현을 촉진함으로써 상기와 같은 바이오 필름 형성이나 번식 억제 신호 작용 등을 일으킨다. 또한 호모세린 락톤은 미생물뿐만 아니라 주변의 식물의 뿌리나 동물의 장내 혹은 피부에서 숙주와의 신호 전달에도 사용되고 있음이 보고되고 있다.
이러한 호모 세린 락톤은 균주에 따라 각각 일부 치환기 등이 상이한 다른 구조를 가지고 있으며, 일반적으로 다양한 길이 지질산 (fatty acid)과 결합된 락톤환 구조를 가진다. 최근 광합성 세균인 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 질소고정 토양균인 브레디라이조비움 속(Bradyrhizobium sp.) 또는 실리치박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi) 등에서 특정 페놀산과 락톤 고리가 결합된 새로운 형태의 호모세린 락톤이 생산된다고 보고되고 있다.
그러나, 일반적인 균주에서는 생존에 적합한 생합성 조절에 따라 이들 화합물의 생산량이 매우 극미하여, 이와 관련된 연구 개발에 있어 관련 화합물의 생산 및 그 이용이 부족한 실정이다. 즉, 호모세린 락톤은 미생물-미생물 간의 상호 조절 물질로써 뿐만 아니라 숙주인 식물 및 동물에서 연구 및 활용도가 높은 물질이나, 일반적인 미생물에 있어서는 상업적 수준으로 물질 생산이 어려워 관련 연구 개발에 어려움이 있다.
이러한 배경 하에, 비교적 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 가진 대장균을 이용하여 페놀산과 락톤 고리가 결합된 호모세린 락톤 유도체들을 상업적으로 대량 생산할 수 있는 연구 개발이 필요하다.
본 발명자들은 값싼 배지를 이용하여 유용물질인 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체를 대량 생산하는 방법을 연구하던 중, 코엔자임 에이 라이게이즈 효소, 아실 호모세린 락톤 생합성 효소, 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5, 카페인산 O-메틸전이효소를 이용하여, 인공 생합성 경로를 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체를 대량 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 상기 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 페닐 아세틸 호모세린 생산용 발현 벡터, 형질전환체를 제조하고, 이를 이용한 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 필요성을 해결하기 위하여, 본 발명은 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI) 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터에 티로신 암모니아 리아제를 암호화하는 유전자(opTAL)를 더 포함하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터에 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자(sam5)를 더 포함하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자를 더 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입된 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 형질 전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환체가 티로신 고생산 변이 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 상기 형질전환체를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계의 배양액으로부터 페닐아세틸 호모세린 락톤을 수득하는 단계; 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 1) 단계의 배양 배지에 페놀산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 1) 단계의 배양 배지에 메티오닌 (methionine) 또는 S-아데노실-메티오닌(S-Adenosyl methionine; SAM)을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 및 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 페놀산에 처리하는 단계; (2) 상기 (1) 단계의 처리액을 배양하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계의 배양액에서 페닐 아세틸 호모세린 락톤 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 페닐 아세틸 호모세린 락톤 유도체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산 방법은 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 가진 대장균 발현 시스템과 In vitro 효소반응과 생물전환을 이용하여 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산량을 크게 증진시켰으므로, 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 대량 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 pET28a(+) 벡터의 NdeI/XhoI 위치에 opRpaI 유전자를 삽입한 opRpaI 발현 벡터 (pET-opRpaI) 및 pET28a(+) 벡터의 NdeI/XhoI 위치에 4CL2nt 유전자를 삽입한 4CL2nt 발현 벡터 (pET-his4CL2nt)의 모식도를 나타낸다.
도 2는 정제된 His-tagged opRpaI 효소(26.7 kDa) 및 정제된 His-tagged 4CL2nt 효소(61.5 kDa)를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 분리된 opRpaI 효소와 코엔자임 에이 라이게이즈 효소(4CL2nt)의 4-쿠마린산 기질과 효소 반응 결과를 HPLC 및 LC/MS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 분리된 opRpaI 효소와 코엔자임 에이 라이게이즈 효소(4CL2nt)의 카페인산 기질과 효소 반응 결과를 HPLC 및 LC/MS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 분리된 opRpaI 효소와 코엔자임 에이 라이게이즈 효소(4CL2nt)의 페룰린산 기질과 효소 반응 결과를 HPLC 및 LC/MS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 분리된 opRpaI 효소와 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (4CL2nt)의 신나믹 산 기질과 효소 반응 결과를 HPLC 및 LC/MS로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (4CL2nt) 및 opRpaI 유전자를 함유하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산을 위한 생산용 벡터 (pET-4R)의 모식도를 나타낸다.
도 8은 페닐 아세틸 호모세린 락톤 생산을 위한 벡터 (pET-4R)을 포함하는 대장균에서 페놀산을 각각 첨가에 의한 각각의 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 결과를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸다.
A) 신나믹 산 표준품 (a) 과 신나믹산 첨가 배양액 (b); B) 4-쿠마린 산 표준품 (a) 과 4-쿠마린 산 첨가 배양액 (b); C) 카페인 산 표준품 (a) 과 카페인 산 첨가 배양액 (b); D) 페룰린 산 표준품 (a) 과 페룰린 산 첨가 배양액 (b);
Peak 1, 신나믹산; peak 2, p-쿠마린산; peak 3, 카페인산; peak 4, 페룰린산; peak 5, 신나모일-호모세린 락톤; peak 6, p-쿠마로일-HSL; peak 7, 카페오일-호모세린락톤; peak 8, 페루로일-호모세린락톤.
도 9은 티로신 암모니아 리아제(opTAL), 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (4CL2nt) 및 opRpaI 유전자를 함유하는 4-쿠마로일-호모세린 락톤 (4-coumaryol-HSL) 생산용 인공대사경로 벡터 (pET-opT4R)의 모식도를 나타낸다.
도 10은 인공대사경로 벡터 (pET-opT4R)을 포함하는 대장균에서 생산한 4-쿠마로일-호모세린 락톤 (4-coumaryol-HSL)의 HPLC 분석 결과를 나타낸다(*: 쿠마로일-호모세린 락톤).
도 11 은 티로신 암모니아 리아제(opTAL), 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자(sam 5), 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (4CL2nt) 및 opRpaI 유전자를 함유하는 인공대사경로 벡터 (pET-opT54R)의 모식도를 나타낸다.
도 12는 벡터 pET-opT54R을 포함하는 대장균에서 카페오일-호모세린 락톤 (caffeoyl?HSL) 생산 결과를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸다 (*: 카페오일 호모세린 락톤).
도 13는 티로신 암모니아 리아제(opTAL), 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자(sam 5), 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (4CL2nt), 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자 및 opRpaI 유전자를 함유하는 인공대사경로 벡터 (pET-opT54MR)의 모식도를 나타낸다.
도 14은 벡터 pET-opT54MR을 포함하는 대장균에서 페루로일-호모세린 락톤 (Feruloyl?HSL) 생산 결과를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸다 (*:페루로일 호모세린 락톤).
도 15는 pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR를 포함하는 대장균의 배양 시간에 따른 페닐 아세틸 호모세린 락톤 유도체들의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 벡터 pET-opT4R을 포함하는 일반 대장균 균주 (pET-opT4R/C41) 또는 티로신 고생산 균주(pET-opT4R/△COS1) 에서의 4-쿠마로일-호모세린락톤의 생산을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 pET-opT4R을 포함하는 일반 대장균 균주 (pET-opT4R/C41) 또는 티로신 고생산 균주(pET-opT4R/△COS1)를 배양하거나 이의 배양 배지에 Met (메티오닌) (pET-opT4R/△COS1+Met) 또는 SAM(S-아데노실 메티오닌)(pET-opT4R /△COS1+SAM) 을 첨가하여 배양한 후, 쿠마로일-호모세린 락톤(p-coumaryol-HSL)의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18는 pET-opT54R을 포함하는 일반 대장균 균주 (pET-opT54R/C41) 또는 티로신 고생산 균주(pET-opT54R/△COS1)를 배양하거나 이의 배양 배지에 Met (메티오닌)(pET-opT54R/△COS1+Met) 또는 SAM(S-Adenosyl methionine) (pET-opT54R/△COS1+SAM)를 첨가하여 배양한 후, 카페오일-호모세린 락톤(Caffeoyl -HSL)의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 pET-opT54MR을 포함하는 일반 대장균 균주 (pET-opT54MR/C41) 또는 티로신 고생산 균주(pET-opT54MR/△COS1)를 배양하거나 이의 배양 배지에 Met (메티오닌)(pET-opT54MR/△COS1+Met) 또는 SAM(S-Adenosyl methionine) (pET-opT54MR/△COS1+SAM)를 첨가하여 배양한 후, 페루로일-호모세린 락톤(Feruloy-HSL)의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 코엔자임 에이 라이게이즈(Coenzyme A ligase) 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤(acyl-homoserine lactone) 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI) 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터는 생물 전환 및 유전자 재조합에 따른 인공 대사 경로를 통하여 일련의 대사 과정이 수행되게 함으로써 페닐아세틸 호모세린 락톤을 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 페닐아세틸 호모세린 락톤은 하기 화학식 1의 화합물을 의미하며, 여기에서 Ra는 수소, 메톡시 또는 하이드록시이며, 및 Rb는 수소, 메톡시 또는 하이드록시이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000001
상기 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자는 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)의 아실호모세린 락톤 생합성 효소 (RpaI)의 아미노산 서열(서열번호 1)을 토대로 대장균에서 아미노산 서열 각각에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도 (codon usage)를 사용하여 제조되는 유전자이다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 코돈 사용 빈도는 카즈사 데이터 베이스(kazusa database; http://www.kazusa.or.jp)에서 제공하는 코돈 사용빈도를 사용할 수 있다. 상기 유전자는 대장균 발현에 최적화된 염기서열을 가지며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 기능적으로 동등한 성질을 가지며, 서열번호 2의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 아실 호모세린 락톤 생합성 효소가 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
상기 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자는 담배(Nicotiana tabacum)의 4-쿠마로일 코엔자임 A (4CL2)의 아미노산 서열(서열번호 3)을 토대로 대장균에서 아미노산 서열 각각에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도 (codon usage)를 사용하여 제조될 수 있다. 대장균 발현 시스템에서 유전자 발현 향상을 위해 (주)바이오니아에 의뢰하여 대장균 발현 최적화 시스템을 통해 코돈 사용빈도 (codon usage)는 결정하였다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 코돈 사용 빈도는 카즈사 데이터 베이스(kazusa database; http://www.kazusa.or.jp)에서 제공하는 코돈 사용빈도를 사용할 수 있다. 상기 유전자는 대장균 발현에 최적화된 염기서열을 가지며, 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 기능적으로 동등한 성질을 가지며, 서열번호 4의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 코엔자임 에이 라이게이즈 효소가 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI) 및 티로신 암모니아 리아제(tyrosine ammonia lyase)를 암호화하는 유전자(opTAL)를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 발현벡터의 유전자는 opTAL-4CL2nt-opRpaI 순서로 순차적으로 연결되는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 이를 pET-opT4R 벡터로 명명하였다.
상기 티로신 암모니아 리아제를 암호화하는 유전자는 티로신(Tyrosine)을 4-쿠마릭산(4-coumaric acid)으로 변환하는 방선균 Saccharothrix espanaensis (KCTC9392)에서 확인된 티로신 암모니아 리아제(TAL)의 아미노산 서열을 기초로 하여, 대장균에서 각각의 아미노산에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도(codon usage)를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 유전자는 대장균 발현에 최적화된 서열을 가지며, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 기능적으로 동등한 성질을 가지며, 서열번호 5의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 티로신 암모니아 리아제가 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
상기 pET-opT4R 벡터로 명명된 벡터는 인공대사 경로를 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤, 바람직하게는 쿠마로일-호모세린 락톤을 효과적으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명은 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI), 티로신 암모니아 리아제를 암호화하는 유전자(opTAL) 및 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5(4-coumarate 3-hydroxylase Sam5) 암호화 유전자(sam 5) 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 발현벡터의 유전자는 opTAL-Sam5-4CL2nt-opRpaI 순서로 순차적으로 연결되는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 이를 pET-opT54R 벡터로 명명하였다.
상기 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자는 4-쿠마린산을 카페인산으로 변환하는 사카로트릭스 에스파낸시스(Saccharothrix espanaensis)에서 확인된 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 로부터 합성된 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 기능적으로 동등한 성질을 가지며, 서열번호 15의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자가 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
상기 pET-opT54R 벡터로 명명된 벡터는 인공대사 경로를 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤, 바람직하게는 카페오일-호모세린 락톤을 효과적으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명은 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI), 티로신 암모니아 리아제를 암호화하는 유전자(opTAL), 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자(sam 5) 및 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 발현벡터의 유전자는 opTAL-Sam5-4CL2nt-com-opRpaI 순서로 순차적으로 연결되는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 이를 pET-opT54MR 벡터로 명명하였다.
상기 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 는 카페인산을 페룰린산 (ferulic acid)으로 변환하는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 확인된 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)로부터 합성된 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 기능적으로 동등한 성질을 가지며, 서열번호 17의 염기 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자가 서열번호 17로 표시되는 폴리뉴클레오티드인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터를 제공한다.
상기 pET-opT54MR 벡터로 명명된 벡터는 인공대사 경로를 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤, 바람직하게는 페루로일-호모세린 락톤을 효과적으로 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 페닐아세틸 호모세린 락톤은 이의 유사체를 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 2 내지 화학식 5의 화합물 중 어느 하나로 표시되는 쿠마로일 호모세린 락톤, 카페오일-호모세린 락톤, 페루로일-호모세린 락톤 및 신나모일 호모세린 락톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000005
상기 화학식 2는 4-쿠마로일-호모세린 락톤이며, 상기 화학식 3은 카페오일-호모세린 락톤이며, 상기 화학식 4는 페루로일-호모세린 락톤이며, 상기 화학식 5는 신나모일-호모세린 락톤이다.
본 발명의 발현 벡터는 당업계에 알려진 벡터 재조합 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 발현 벡터는 바람직하게 원핵세포 또는 진핵세포에서 외래단백질을 발현시키기 위해 사용되는 것이라면 어떤 것이라도 사용 가능하다. 원핵세포용 재조합 벡터가 바람직하고, 진핵세포용 재조합 벡터의 경우, 효모용 곤충용 또는 포유 동물 세포용 재조합 벡터의 사용이 가능하나 효모용 재조합 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 상업적으로 이용 가능한 원핵세포용 벡터로는 pET 벡터(Novagen, Inc., USA), pQE 벡터(Qiagen, USA) 및 pGEX(Pharmacia Biotech Inc., USA) 등이 존재하나 이에 제한되는 것은 아니고, 상업적으로 이용가능한 진핵세포용 발현벡터로는 pCI Neo(Promega, USA), pMAMneo(Clontech, USA), pcDNA3(InVitrogen, USA), pMClneo(Stratagene, USA), pXT1(Stratagene, USA), pSG5(Stratagene, USA), EBO-pSV2-neo(ATCC 37593), pBPV-1(8-2)(ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt(ATCC 37199), pRSVneo(ATCC 37198), pSV2-dhfr(ATCC 37146), pUCTag(ATCC 37460) 및 lZD35(ATCC 37565) 등 일 수 있으며, 독립적으로 발현 조절을 받을 수 있도록 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터가 도입된 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질 전환체는 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체 생산용 발현 벡터를 발현시킬 수 있는 시스템이라면 어느 것이라도 무방하며, 바람직하게는 대장균 발현 시스템을 사용한다. 본 발명에 있어서 발현 벡터를 이용한 형질전환은 당업계에 알려진 어떠한 방법이라도 사용하여도 무방하며, 바람직하게는 대장균에 화학적 처리를 하여 만든 활성화 세포에 열충격을 가하는 방법을 이용하여 발현 벡터를 대장균에 삽입함에 따라 제조한다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 본 발명의 형질 전환체는 대장균 C41(DE3)이며, 도입된 발현 벡터에 의하여 페닐아세틸 호모세린 락톤의 인공적 생합성 경로가 구축될 수 있고, 이로부터 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 대량으로 생산할 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 형질 전환체는 티로신 고생산 변이 균주(△COS1)일 수 있다.
상기 티로신 고생산 변이 균주는 서열번호 27 로 표시되는 염기서열로 이루어진 tyrAfbr[코리스믹산 뮤타제/프리페닉산 탈수소효소 유전자(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase gene, tyrA)의 피드백-저해-저항성(feedback-inhibition-resistant, fbr) 유전자]; 및 서열번호 28 로 표시되는 염기서열로 이루어진 aroGfbr[3-디옥시-D-아라비노-햅튤로소내이트-7-인산염합성효소 유전자(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP) synthase, aroG)의 피드백-저해-저항성(feedbackinhibition-resistant, fbr) 유전자]가 tyrR(Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor) 조절유전자 부위에 삽입된 것일 수 있다.
이와 같이 제조되는 티로신 고생산 변이 균주는 바람직하게는 pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR가 도입된 pET-opT4R/△COS1, pET-opT54R/△COS1, pET-opT54MR/△COS1일 수 있다.
상기 티로신 고생산 변이 균주를 이용하면, 일반 대장균에 페닐아세틸 호모세린 락톤 발현용 벡터를 도입한 생산능과 비교하여 더 많은 양의 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산할 수 있어 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 형질전환체를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계의 배양액으로부터 페닐아세틸 호모세린 락톤을 수득하는 단계; 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법을 제공한다.
상기 호모세린 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법은 이용되는 형질전환체의 종류에 따라, 페놀산을 기질로 첨가하고 이를 생전환하여 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법 및 페날산 추가 없이 구축된 인공대사 경로를 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법을 모두 포함할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 1) 단계의 배양 배지에 페놀산을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 페놀산은 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체 생산의 기질로 사용될 수 있으며, 바람직하게 4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산, 신나믹산, 신나픽산이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게 4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산 및 신나믹산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 생산방법이 생전환을 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법의 경우, 상기 1) 단계의 형질전환체는 pET-4R 벡터가 도입된 형질전환체인 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일 구현예에서, 상기 생산방법이 인공대사 경로 구축을 통해 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법인 경우, 상기 1) 단계의 형질전환체는 pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR이 각각 도입된 형질전환체인 것이 바람직하다.
상기 1) 단계에서 형질전환체의 배양은 형질전환체의 생장을 위한 배지 조건이 바람직하다. 예를 들어, LB, YT, M9 배지 등에서 배양한다.
상기 1) 단계에서 배양된 형질 전환체의 단백질 발현은 IPTG 처리 등의 발현벡터 종류에 따른 각각의 단백질 유도방법으로 유도할 수 있으며, 단백질 발현이 유도된 후에, 추가로 배양을 수행함으로써 페닐아세틸 호모세린 락톤의 발현을 유도한다. 추가 배양은 예컨대 3 g/L KH2PO4 , 7.3 g/L K2HPO4, 8.4 g/L MOPS, 2 g/L NH4Cl, 0.5 g/L NaCl, 0.1 ml/L Trace elements, 5 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L MgSO4, 15 g/L 글루코오스를 포함하는 SM (modified synthetic medium) 배지 조건 하에 배양하는 것이 바람직하다.
상기 2) 단계에서 페닐 아세틸 호모세린 락톤의 수득은 HPLC 등을 통해 화합물을 분리하거나 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 화합물을 분리하여 수득할 수 있다.
상기 1) 단계의 형질전환체는 바람직하게는 대장균 C41(DE3)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 티로신 고생산 변이 균주(△COS1) 일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 1) 단계의 배양 배지에 메티오닌 (methionine) 또는 S-아데노실 메티오닌(S-Adenosyl methionine; SAM)을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법을 제공한다.
상기 메티오닌 또는 S-아데노실 메티오닌이 배지에 첨가됨으로써, 형질전환체는 일반 대장균 및 티로신 고생산 변이 균주에서 생산되는 것보다 현저하게 증가된 양의 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생산할 수 있다. 따라서 단순한 첨가물의 추가를 통해 현저한 생산 효율의 개선을 가져 올 수 있다.
또한 본 발명은 1) 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 및 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 페놀산에 처리하는 단계; 2) 상기 1) 단계의 처리액을 배양하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계의 배양액에서 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 수득하는 단계를 포함하는 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 1) 단계에서 코엔자임 에이 라이게이즈 효소는 담배(Nicotiana tabacum) 등에서 확인될 수 있는 효소이며 페놀산을 페닐 코엔자임 A로 전환한다. 본 발명의 실시양태에 따르면 상기 효소는 4-Coumarate CoA Ligase 2 from Nicotiana tabacum(4CL2nt)이다.
본 발명의 실시양태에 따르면 아실 호모세린 락톤 생합성 효소는 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)에서 분리된 것 (RpaI)을 사용할 수 있다.
상기 2) 단계에서 반응은 CoA, ATP 및 SAM (S-adenosyl methionine)을 포함하는 용액에서 30℃ 온도로 반응하는 것이 바람직하다.
상기 3) 단계에서 페닐 아세틸 호모세린 락톤의 수득은 HPLC 등을 통해 화합물을 분리하거나 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 화합물을 분리하여 수득할 수 있다. 분리되는 페닐 아세틸 호모세린 락톤 유도체는 바람직하게 페놀산과 락톤 고리가 결합된 호모세린 락톤 유도체일 수 있다. 본 발명의 실시양태에 따르면, 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체 생산을 위한 기질로 4-쿠마린산을 사용하여 4-쿠마로일-호모세린 락톤 (화학식 2), 카페인산을 사용하여 카페오일-호모세린 락톤(화학식 3), 페룰린산을 사용하여 페루로일-호모세린 락톤(화학식 4), 신나믹 산을 사용하여 신나모일-호모세린 락톤(화학식 5)을 생산할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 1] in vitro에서 opRpaI 유전자의 호모세린 락톤 합성 활성 확인
실시예 1-1. 아실호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자( opRpaI 유전자) 및 코엔자임 A 라이게이즈 효소( 4CL2nt 유전자)의 염기 서열 결정
대장균에 대하여 밝혀진 코돈 사용 빈도를 기초로 대장균 발현 시스템에서 유전자 발현 향상을 위해 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)의 아실호모세린 락톤 생합성 효소 (opRpaI)의 아미노산 서열(서열번호 1)을 토대로 대장균에서 아미노산 서열 각각에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도 (codon usage)를 사용한 (주) 바이오니아의 최적화 프로그램을 이용하여 신규 유전자(서열번호 2)를 결정하였고, 담배(Nicotiana tabacum)의 4-쿠마로일 코엔자임 A (4CL2nt)의 아미노산 서열 (서열번호 3) 을 토대로 미국 DNA2.0 사의 대장균에서 아미노산 서열 각각에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도 (codon usage)를 사용하여 단백질 최적 발현 신규 유전자(서열번호 4)를 결정하였다.
실시예 1-2. 4CL2nt 및 opRpaI 유전자를 포함하는 재조합 벡터 제작
실시예 1-1에서 결정한 염기서열(서열번호 2)을 기초로 상기 염기 서열 앞 쪽에 제한효소 NdeI 위치와 뒤쪽에 XhoI 위치를 가지도록 opRpaI 유전자 합성을 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였다. 제조된 염기 서열은 서열번호 6에 나타내었다.
실시예 1-1에서 DNA2.0에 의뢰하여 결정한 염기서열(서열번호 4)을 기초로 상기 염기 서열 앞 쪽에 제한효소 NcoI 위치와 뒤쪽에 HindIII 위치를 가지도록 4CL2nt 유전자을 합성하여 제작하였다. 제조된 염기 서열은 서열번호 7에 나타내었다.
(주) 바이오니아에 의뢰하여 제조된 염기 서열 앞 쪽에 제한효소 NdeI 위치와 뒤쪽에 XhoI 위치를 가지는 opRpaI 유전자를 제한효소 NdeI 및 XhoI를 이용하여 절단하였고, 대장균 발현 벡터인 pET-28a(+) 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI로 절단하여 opRpaI 의 NdeI 및 XhoI 자리와 pET-28a(+) 벡터의 NdeI 및 XhoI 자리를 연결함으로써 재조합 벡터 pET-opRpaI을 제작하였으며, 이의 모식도는 도 1의 (a)에 나타내었다.
또한, DNA2.0에 의뢰하여 제조된 염기 서열 앞 쪽에 제한효소 NcoI 위치와 뒤쪽에 HindIII 자리를 가지는 4CL2nt 유전자를 포함하는 pET-4CL2-Nt 벡터를 주형 DNA로 이용하여 4CL2nt-F 및 4CL2nt-R 프라이머 쌍으로 PCR 반응을 수행하여 PCR 산물을 확보하였고, 솔젠트 회사에서 제공하는 T-Blunt PCR Cloning 방법을 이용하여 T-blunt vector에 상기 PCR 산물을 삽입하여 His4CL2nt TA 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 His4CL2nt TA 벡터의 제한효소 NdeI 및 XhoI 을 이용하여 절단하였고, 대장균 발현 벡터인 pET-28a(+) 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI 로 절단하여 4CL2nt 의 NdeI 및 XhoI 자리와 pET-28a(+) 벡터의 NdeI 및 XhoI 자리를 연결함으로써 재조합 벡터 pET-his4CL2nt을 제작하였으며, 이의 모식도는 도 1의 (b)에 나타내었다.
상기 제조된 벡터를 이용해서 아실호모세린 락톤 생합성 유전자 및 4-쿠마로일 코엔자임 A 라이게이즈 유전자의 발현을 확인하여 분리하였으며, SDS-PAGE를 도 2에 나타내었다.
도 2의 (a)는 pET-opRpaI 벡터를 이용한 것으로, M은 size marker를 나타내며, 1은 Ni-NTA resins 통과 용액을 나타내며, 2는 워싱버퍼(washing buffer) 통과 용액을 나타내며, 3 및 4는 각각 용출 버퍼 (elution buffer) 용액의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
또한 도 2의 (b)는 pET-his4CL2nt 벡터를 이용한 것으로, M은 size marker를 나타내며, 4는 Ni-NTA resins에서 용출 버퍼 (elution buffer) 통과 용액의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
실시예 1-3. In vitro에서 opRpaI 효소의 페닐아세틸 호모세린 락톤 화합물 합성 확인
페놀산을 아실 코엔자임 에이로 변환시키기 위해 실시예 1-2에서 N-terminal His-tag된 soluble protein 상태로 발현하여 정제한 코엔자임 에이 라이게이즈 효소인 4CL2nt를 사용하였고, 아실 코엔자임 에이에서 호모세린 락톤 화합물로 변환시키기 위해 마찬가지로 실시예 1-2에서 N-terminal His-tag된 soluble protein 상태로 발현하여 정제한 아실 호모세린 락톤 신세이즈 효소인 opRpaI를 사용하였다.
Sigma(USA)에서 구입한 4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산 및 신나믹산 각각의 표준품을 기질로 사용하여, 4CL2nt 및 opRpaI 두 효소를 함께 표 1의 기재한 반응조건으로 30℃에서 1시간 동안 반응하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000006
이 반응액과 동일한 양의 에틸아세테이트를 넣어서 추출하고 12000 rpm에서 2분간 원심분리를 수행하여 상등액 에틸아세테이트 층을 농축하였다. 상기 농축한 추출물을 메탄올에 녹인 후 용액 20ul를 하기의 조건 하에 HPLC를 이용하여 분석하였다. 모든 반응 추출물은 YMC J'sphere ODS-H80, 150x4.6 ㎜ I.D. 컬럼을 이용하여 CH3CN-H2O(0.05%TFA) 이동상을 1 ㎖/min의 속도로 10%에서 100%까지 25분동안 HPLC 분석을 수행하였다.
4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산 및 신나믹산 각각의 표준품을 기질로 사용하여 분석한 결과는 도 3 내지 도 6에 나타내었다. 도 3은 4-쿠마린산을 기질로 사용한 결과이며, 도 4는 카페인산을 기질로 사용한 결과이며, 도 5는 페룰린산을 기질로 사용한 결과이며, 도 6은 신나믹산를 기질로 한 결과이다. 도 3 내지 6에서 *는 새로 형성된 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 의미한다.
도 3에 나타낸 바와 같이 4-쿠마린산을 기질로 사용한 각각의 반응액에서 4-쿠마린산보다 빠른 시간대(Rt, 8.0분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였으며, LC/MS 분석 결과 화학식 2와 동일한 분자량 (m/z 248.14 [M+H]+)을 확인하였으며, 분석 결과를 통해 opRpaI 효소가 하기 화학식 2로 표시되는 4-쿠마로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000007
또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 카페인산을 기질로 사용한 반응액에서는 카페인산보다 빠른 시간대(Rt, 7.0분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였고, LC/MS 분석 결과 화학식 2와 동일한 분자량 (m/z 264.00 [M+H]+)을 확인하였으며, 분석 결과를 통해 opRpaI 효소가 하기 화학식 3으로 표시되는 카페오일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000008
또한 도 5에 나타낸 바와 같이, 페룰린산을 기질로 사용한 반응액에서는 페룰린산보다 빠른 시간대(Rt, 8.2분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였고, LC/MS 분석 결과 화학식 3과 동일한 분자량 (m/z 278.19 [M+H]+)을 확인하였으며, 분석 결과를 통해 opRpaI 효소가 하기 화학식 4로 표시되는 페루로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000009
또한 도 6에 나타내는 바와 같이, 신나믹산를 기질로 사용한 반응액에서는 신나믹산보다 빠른 시간대(Rt, 11.0분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였고, LC/MS 분석 결과 화학식 5와 동일한 분자량 (m/z 232.06 [M+H]+)을 확인하였으며, 상기 결과를 통해 opRpaI 효소가 하기 화학식 5로 표시되는 신나모일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000010
상기 분석 결과를 통해서, In vitro에서 opRpaI 효소가 각각의 첨가된 기질 신나믹산, 4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산으로부터, 4-쿠마로일 호모세린락톤, 카페오일 호모세린 락톤, 페루로일 호모세린 락톤과 같은 페닐아세틸 호모세린 락톤 화합물을 생성할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2] pET -4R 형질전환 미생물의 카페오일-호모세린 락톤 및 페루로일-호모세린 락톤 생산
실시예 2-1. 4CL2nt - opRpaI 유전자를 포함하는 재조합 벡터 ( pET -4R) 제작
실시예 1-2의 pET-his4CL2nt TA PCR 산물을 제한효소 NdeI 및 SpeI으로 절단하였고, pET-opRpaI TA 산물은 제한효소 SpeI 및 XhoI로 절단하였다. 또한 pET-28a(+) 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI로 절단한 후, 준비된 상기 두 유전자의 산물을 벡터와 연결하여 대장균에 형질전환하였다.
이때, 절단된 pET-28a(+) 벡터의 NdeI 자리에 pET-his4CL2nt TA PCR 산물의 NdeI 자리를 연결하였으며, pET-his4CL2nt TA PCR 산물의 SpeI 자리와 pET-opRpaI TA 산물의 SpeI 자리를 연결하였다. 그리고 pET-opRpaI TA 산물의 XhoI자리와 pET-28a(+) 벡터의 XhoI 자리를 연결함으로써 합성한 두 유전자를 하나의 발현 벡터 pET-28a(+)에 삽입하였다.
이렇게 제작된 pET-4R의 4CL2nt 및 opRpaI 유전자는 각각의 T7 프로모터와 T7 터미네이터를 가져 독립적으로 발현 조절을 받도록 제작하였으며, 이를 pET-4R로 명명하였다. 제조된 벡터의 모식도를 도 7에 나타내었다.
실시예 2-2. pET -4R 형질전환 미생물의 호모세린 락톤 화합물 합성
실시예 2-1에서 제조된 pET-4R을 대장균에 형질전환하여 pET-4R/C41을 제조하고, 상기 대장균을 함유하는 배지에 신나믹산, 4-쿠마린산, 카페인산, 및 페룰린산 각각의 표준품을 각각 30mg/L 처리하여 배양하였다.
상기 배양액의 일부를 여과 (Sartorius Minisart RC 4, 0.2um)하여 그 용액 20ul를 HPLC 분석하였다. 보다 구체적으로 YMC J'sphere ODS-H80, 150x4.6 ㎜ I.D.,(YMC, 일본) 컬럼을 이용하여 HPLC 분석을 수행하였으며, CH3CN-H2O(J.T.Baker,USA) (0.05%TFA;Sigma-Aldrich,USA) 이동상을 1 ㎖/min의 속도로 10%에서 100%까지, 25분간 수행하였다. 신나믹산, 4-쿠마린산, 카페인산, 및 페룰린산 각각의 표준품은 Sigma(USA)에서 구입해서 분석하였고, 분석 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, pET-4R로 형질전환된 대장균주 pET-4R/C41의 배양액에서 첨가한 페놀릭산보다 빠른 시간대에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크들을 확인하였다. LC/MS 분석 결과, 신나믹산을 첨가한 경우 화학식 5과 동일한 분자량 (m/z 232 [M+H]+)을 확인하였으며, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 화학식 5으로 표시되는 신나모일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다 (도 8A). 4-쿠마린산을 첨가한 경우 화학식 2과 동일한 분자량 (m/z 248 [M+H]+)을 확인하였으며, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 화학식 2으로 표시되는 쿠마로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다 (도 8B). 카페인산을 첨가한 경우 화학식 3과 동일한 분자량 (m/z 264 [M+H]+)을 확인하였으며, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 화학식 3으로 표시되는 카페오일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다 (도 8C). 페룰린산을 첨가한 경우 화학식 4과 동일한 분자량 (m/z 278 [M+H]+)을 확인하였으며, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 화학식 4으로 표시되는 페루로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다 (도 8D).
또한 상기 형질전환된 균주에서 30mg/L 의 신나믹산, 4-쿠마린산, 카페인산, 및 페룰린산 각각을 기질로서 첨가하여 36시간 배양 후 HPLC를 실시하여 pET-4R/C41에 의한 전환율을 평가하였다. 이와 같은 결과를 통해, pET-4R/C41이 기질을 각각 신나모일-호모세린 락톤, 쿠마로일-호모세린 락톤, 카페오일-호모세린 락톤, 페루로일-호모세린 락톤인 호모세린 락톤 화합물으로 생전환을 통해 각각 34, 47, 72, 46%의 전환율로 전환할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 3] 4- 쿠마로일 호모세린 락톤 생합성 인공대사경로 제작
실시예 3-1. opTAL - 4CL2nt - opRpaI 유전자를 포함하는 재조합 벡터 ( pET -opT4R) 제작
티로신(Tyrosine)을 4-쿠마릭산(4-coumaric acid)으로 변환하는 효소는 방선균 Saccharothrix espanaensis (KCTC9392)에서 확인된 티로신 암모니아 리아제(TAL)의 아미노산 서열을 기초로 하여, 대장균에서 각각의 아미노산에 대한 tRNA 비율에 따른 최적의 코돈 사용빈도(codon usage)을 사용하여 염기서열(opTAL, 서열번호 5)을 합성하였다. 또한 4-쿠마릭산을 4-쿠마로일 코엔자임 A(4-coumaroyl Coenzyme A)로 변환하는 효소는 담배(Nicotiana tabacum) 확인된 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 (cinnamate/4-coumarate: CoA ligase)의 염기서열(4CL2nt, 서열번호 4)을 합성하였다. 또한 4-쿠마로일 코엔자임 A에서 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물로 변환하는 효소인 RpaI 상기한 염기서열(opRpaI, 서열번호 2)을 합성하여 사용하였다.
4-쿠마로일 호모세린 락톤 생산을 위한 모듈화된 인공경로 구축을 위해 opTAL, 4CL2nt 및 RpaI의 세 유전자를 순차적으로 연결한 벡터를 제조하였으며 이를 pET-opT4R로 명명하고 이의 모식도를 도 9에 나타내었다.
구체적으로, opTAL-F 및 pET-CPac 프라이머 쌍으로 pET-opTAL 벡터를 주형 DNA로 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 nPfu-special DNA polymerase로 Annealing 60℃에서 30 초, Extention 72℃에서 2 분 30초로 28 사이클을 수행하여 pET-opTAL TA PCR 산물을 확보하였다.
또한 pET-NPac 및 pET-CSpe 프라이머 쌍으로 실시예 1-2에서 제작한 pET-his4CL2nt 벡터를 주형 DNA로 이용하여 상기와 같이 PCR 반응을 수행하여 pET-his4CL2nt TA PCR 산물을 얻었다.
또한 pET28a(+) 벡터를 기반으로 NdeI 자리보다 400bp 정도 앞에 SpeI 자리를 가지도록 PCR을 통해 제작하였고, 제작된 벡터는 SpeI 와 NdeI 자리 사이에 T7 프로모터와 RBS를 갖고, NdeI 뒤에 XhoI 자리를 가지며, XhoI 자리 뒤에 T7 터미네이터를 가지고 있다. 상기 벡터는 NdeI 및 XhoI 으로 절단하였고, 합성한 pGEM-opRpaI을 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, 상기 절단된 벡터의 NdeI 및 XhoI 자리와 상기 절단된 유전자의 NdeI 및 XhoI 자리를 연결하였다. 상기 절단된 유전자를 벡터와 연결하였다.
pET-opTAL TA PCR 산물은 제한효소 NdeI 및 PacI으로 절단하였고, pET-his4CL2nt TA PCR 산물은 제한효소 PacI 및 SpeI으로 절단하였으며, pET-opRpaI TA 산물은 제한효소 SpeI 및 XhoI로 절단하였다. 또한 pET-28a(+) 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI로 절단한 후, 준비된 상기 세 유전자의 PCR 산물을 벡터와 연결하였다.
이때, 절단된 pET-28a(+) 벡터의 NdeI 자리에 pET-opTAL TA PCR 산물의 NdeI 자리를 연결하였고 pET-opTAL TA PCR 산물의 PacI 자리와 pET-his4CL2nt TA PCR 산물의 PacI 자리를 연결하였으며, pET-his4CL2nt TA PCR 산물의 SpeI 자리와 pET-opRpaI TA 산물의 SpeI 자리를 연결하였다. 그리고 pET-opRpaI TA 산물의 XhoI자리와 pET-28a(+) 벡터의 XhoI 자리를 연결함으로써 합성한 세 유전자를 하나의 발현 벡터 pET-28a(+)에 삽입하여 pET-opT4R을 제작하여 형질전환하였다. 구체적으로 C41(DE3) cell에 CaCl2 처리를 하여 세포막 구조에 불안정을 야기하여 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 제작하였고, 이렇게 만들어진 C41(DE3) 대장균에 pET-opT4R 유전자를 첨가하여 세포에 순간적으로 열을 가하는 열충격 방법을 이용하여 pET-opT4R 을 대장균에 형질전환하였다.
이렇게 제작된 pET-opT4R의 opTAL, 4CL2nt 및 opRpaI 유전자는 각각 T7 프로모터와 T7 터미네이터를 가져 독립적으로 발현 조절을 받도록 제작되었으며, 모식도는 도 9와 같고, 상기에서 사용한 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000011
실시예 3-2. pET - opT4R 형질전환 미생물의 4- 쿠마로일 호모세린 락톤 화합물 합성
상기 실시예 3-1의 제조된 pET-opT4R/C41 대장균을 LB 배지(50㎍/l kanamycin) 50 ml에 접종하여 37℃에서 DO6000.6까지 배양하였고, 10분 간 저온 충격(cold shock) 이후 1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 그 후, 26 ℃에서 6시간 동안 추가로 배양하고, 세포를 수득하여 30 ml SM (modified synthetic medium; added glucose 15 g/ℓ; 50 ㎍/ℓ Kan, 1 mM IPTG) 배지에 옮기고 26℃에서 25시간 동안 배양하였다.
상기 배양액의 일부를 filtering (Sartorius Minisart RC 4, 0.2um)하여 그 용액 20ul를 SunFire™ C18 column (250 × 4.6 mm, 5 μm; Waters, USA) 컬럼을 이용하여 CH3CN-H2O(J.T.Baker, USA) (0.05%TFA; Sigma-Aldrich, USA)이동상을 1 ㎖/min의 속도로 10%에서 60%까지 25분간 HPLC 분석을 수행하였다. 4-쿠마린산 표준품은 Sigma(USA)에서 구입하여 분석하고, 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, pET-opT4R로 형질전환된 대장균주 pET-opT4R/C41의 배양액에서는 4-쿠마린산보다 빠른 시간대 (Rt, 12.2분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크가 나타났다. LC/MS 분석 결과 이는 화학식 2와 동일한 분자량 (m/z 248.11 [M+H]+)을 가진 물질임을 확인하였으며, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 4-쿠마린산으로부터 상기 화학식 2로 표시되는 4-쿠마로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
pET-opT4R로 형질전환된 대장균주 pET-opT4R/C41가 4-쿠마로일-호모세린 락톤 화합물을 과량 생산할 수 있는지 여부를 추가적으로 확인하였다. pET-opT4R/C41을 상기와 동일한 배양 조건으로 3회 배양하였다. 이 후 배양 시간 (1, 4, 15, 25, 40시간)에 따라 생산되는 양을 HPLC로 측정하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이 pET-opT4R/C41는 40시간 배양액에서 최대 16 mg/L 의 높은 수준으로 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[ 실시예 4] 생합성 인공대사경로를 통한 카페오일-호모세린 락톤의 생산
실시예 4-1. 카페오일-호모세린 락톤 생산을 위한 opTAL - Sam5 - 4CL2nt - RpaI 유전자를 포함하는 재조합 벡터 ( pET - opT54R ) 제작
카페오일-호모세린 락톤을 생합성 인공대사 경로를 통해 생산하기 위하여, 모듈화된 인공경로를 구축하였다. 보다 구체적으로 4-쿠마린산을 카페인산으로 변환하는 사카로트릭스 에스파낸시스(Saccharothrix espanaensis)에서 확인된 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 (4-coumarate 3-hydroxylase Sam5)를 암호화하는 유전자(서열번호 15)를 앞서 제작한 벡터 pET-opT4R에 추가적으로 도입하였다. 제한효소 서열을 포함하는 합성 Sam5 염기서열을 서열번호 16에 나타내었다. 최종적으로 opTAL, Sam5, 4CL2nt, opRpaI의 4가지 유전자가 순차적으로 연결한 벡터를 구축하였다.
구체적으로, pET-Sam5 벡터를 주형 DNA로 이용하였으며, pET-NPac 및 pET-CPac 프라이머 쌍으로 PCR 증폭하여 pET-Sam5 TA PCR 산물을 얻었다. 또한 pET28a(+) 벡터를 기반으로 NdeI 자리보다 약 800bp 정도 앞에 PacI 자리를 가지도록 PCR을 통해 제작하였고, 제작된 벡터는 PacI 와 NdeI 자리 사이에 T7 프로모터와 RBS를 갖고, NdeI 뒤에 HindⅢ 자리를 가지며, HindⅢ 자리 뒤에 T7 터미네이터를 가지고 있다. 상기 벡터를 PacI으로 절단하였고, 실시예 3-1의 pET-opT4R 벡터를 제한효소 PacI으로 절단한 후, 상기 절단된 유전자를 벡터와 연결하였다. 이렇게 제조된 벡터를 pET-opT54R로 명명하였다. pET-opT54R 벡터는 opTAL, Sam5, 4CL2nt 및 opRpaI 유전자를 구성으로 하며, 각각의 T7 프로모터와 T7 터미네이터를 가져 독립적으로 발현 조절을 받도록 제작하였다. 제작된 벡터를 pET-opT54R로 명명하고 이의 모식도를 도 11 에 나타내었다.
실시예 4-2. pET - opT54R 형질전환 미생물의 카페오일 호모세린 락톤 화합물 합성 확인
실시예 4-1에서 제조된 pET-opT54R 이 4-쿠마린산으로부터 카페오일 호모세린 락톤 화합물을 인공대사 경로를 통해 효과적으로 생산하는지 확인하기 위하여, 상기 pET-opT54R 벡터로 대장균을 형질전환하고 생성 물질을 확인하였다.
pET-opT54R을 대장균에 형질전환하여 pET-opT54R/C41을 제조하고, 제조된 상기 대장균을 실시예 3-2에서와 같은 방법으로 배양하였다. 상기 배양액의 일부를 여과 (Sartorius Minisart RC 4, 0.2um)하여 그 용액 20ul를 HPLC 분석하였다. HPLC 분석은 SunFire™ C18 column (250 × 4.6 mm, 5 μm; Waters, USA) 컬럼을 이용하여 수행하였으며, CH3CN-H2O(J.T.Baker, USA) (0.05%TFA; Sigma-Aldrich, USA) 이동상을 1 ㎖/min의 속도로 10%에서 60%까지 25분간 수행하였다. 카페인산 표준품은 Sigma(USA)에서 구입하여 분석하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, pET-opT54R로 형질전환된 대장균주 pET-opT54R/C41의 배양액에서 카페인산 보다 빠른 시간대(Rt, 9.9분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였다. 이를 LC/MS로 분석한 결과 화학식 3과 동일한 분자량(m/z 264.34 [M+H]+)을 확인하였다. 즉 이를 통해 상기 형질전환된 균주가 화학식 3로 표시되는 카페오일-호모세린 락톤 화합물을 인공 대사 경로를 통해 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
형질전환 균주에 의한 카페오일 호모세린 락톤 생성량을 확인하기 위하여, pET-opT54R/C41을 상기 배양조건과 동일하게 세번 배양하였다. 배양 시간 (1, 4, 15, 25, 40시간)에 따른 생산양을 HPLC을 통해 측정하였으며 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 15시간 배양액에서 최대 5mg/L 수준으로 카페오일 호모세린 락톤 화합물이 효과적으로 생산되는 것을 확인하였다.
[ 실시예 5] 생합성 인공대사경로를 통한 페루로일 호모세린 락톤의 생산
실시예 5-1. 페루로일 호모세린 락톤 생산을 재조합 벡터 ( pET - opT54MR ) 제작
페루로일 호모세린 락톤을 생합성 인공대사 경로를 통해 생산하기 위하여, 모듈화된 인공경로를 구축하였다. 보다 구체적으로, 페루로일-호모세린 락톤 생산을 위한 모듈화된 인공경로 구축을 위해 카페인산을 페룰린산 (ferulic acid)으로 변환하는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 확인된 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자(서열번호 17)를 사용하였다. 제한효소 자리를 포함하는 com 염기서열을 서열번호 18에 나타내었다. 최종적으로 opTAL, Sam5, 4CL2nt, com, RpaI로 구성된 다섯개의 유전자를 순차적으로 연결한 벡터를 제조하였다.
보다 구체적으로, pET-NSpe 및 pET-CSpe 프라이머 쌍으로 하고, pET-COM 벡터를 주형 DNA로 이용하여 PCR 증폭하였으며, 이를 통해 pET-COM TA PCR 산물을 얻었다. 또한 pET28a(+) 벡터를 기반으로 NdeI 자리보다 400bp 정도 앞에 SpeI 자리를 가지도록 PCR을 통해 제작하였고, 제작된 벡터는 SpeI 와 NdeI 자리 사이에 T7 프로모터와 RBS를 갖고, NdeI 뒤에 HindIII 자리를 가지며, HindIII 자리 뒤에 T7 터미네이터를 가지고 있다. 상기 벡터를 SpeI으로 절단하였고, 실시예 4-1의 pET-opT54R 벡터를 제한효소 SpeI으로 절단한 후, 상기 절단된 유전자를 벡터와 연결하였다. 이렇게 제작된 벡터를 pET-opT54MR로 명명하였으며, 이는 opTAL, Sam5, 4CL2nt, com 및 opRpaI 유전자를 구성으로 하고, 각각의 T7 프로모터와 T7 터미네이터를 통해 독립적으로 발현 조절을 받도록 하였다. 제조된 벡터를 pET-opT54MR 벡터로 명명하였으며, 이의 모식도를 도 13에 나타내었다.
실시예 5-2. pET - opT54MR 형질전환 미생물의 페루로일 호모세린 락톤 화합물 합성 확인
실시예 5-1에서 제조된 pET-opT54MR을 대장균에 형질전환하여 pET-opT54MR/C41을 제조하고, 제조된 상기 대장균을 실시예 3-2에서와 같은 방법으로 배양하고 생산 산물의 분석을 수행하였다. 페룰린산 표준품은 Sigma(USA)에서 구입하여 분석하였으며, 분석 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, pET-opT54MR로 형질전환된 대장균주 pET-opT54MR/C41의 배양액에서 페룰린산보다 빠른 시간대(Rt, 12.7분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였다. 이를 LC/MS 로 분석한 결과 화학식 4와 동일한 분자량 (m/z 278.47 [M+H]+)을 확인하였다. 즉, 이를 통해서 상기 형질전환된 균주가 상기 화학식 4로 표시되는 페루로일-호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
또한, pET-opT54MR/C41 에 의한 페루로일 호모세린 락톤 생산량을 확인하기 위해 pET-opT54MR/C41을 상기 배양조건과 동일하게 세 번 배양하였다. 배양 시간 (1, 4, 15, 25, 40시간)에 따라 생산되는 양을 측정하였으며, 이를 HPLC로 분석하고 그 결과를 도 15 에 나타내었다.
도 15 나타낸 바와 같이, pET-opT54MR/C41 은 25시간 배양액에서 최대 5.6 mg/L 수준으로 페루로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다.
[ 실시예 6] 티로신 고생산 균주에 의한 페닐 아세틸 호모세린 락톤 생산성 증가
실시예 6-1. 티로신 고생산 균주의 제작
티로신을 고생산 균주를 제조하기 위하여, tyrR 유전자 부위에 aroG(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP) synthase) 및 tyrA(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase gene) 피드백-억제 저항성(feedback-inhibition resistance, fbr) 유전자를 직접 도입시켰다.
aroGfbr 및 tyrAfbr의 유전자 디자인은 Lutke-Eversloh(Appl Environ Microbiol 2005, 71:7224-7228) 및 Stephanopoulos (Appl Microbiol Biotechnol 2007, 75:103-110)에 기술된 방법에 따랐고, 이전에 만든 구조를 이용하였다(Kang SY et al., Microb Cell Fact 2012, 11:153). pET-AG(Kang SY et al., Microb Cell Fact 2012, 11:153) 및 FRT-neo-FRT 단편(Gene Bridges)을 생산하기 위해 tyrAfbr, aroGfbr 및 FRT-neo-FRT 단편을 주형으로 이용하였다.
RBS 및 T7 프로모터가 각 유전자의 앞에 위치한 tyrAfbr 및 aroGfbr 유전자 카세트를 모두 포함하는 단편을 제작하였다: IF-N1 프라이머(서열번호 19) 및 IF-C1 프라이머(서열번호 20). FRT-neo-FRT을 포함하는 다른 단편은 IF-FRT1 프라이머(서열번호 21) 및 IF-FRT2 프라이머(서열번호 22)를 이용하여 증폭하였다. 상기 두 단편을 In-fusion kit (Clontech Laboratories, Inc., USA)을 이용하여 pUC19의 SpeI 부위 사이에 연결하여, pUC-AGFRT를 제작하였다. pUC-AGFRT를 주형으로 이용하여 5.9-kb 삽입 PCR 산물을 생성하였으며, tyrRr 프라이머 (서열번호 23) 및 Inf-tyrRfAG 프라이머(서열번호 24)를 사용하였다. 상기 유전자 카세트를 유전자 삽입 불활성화(gene insertional inactivation)를 위하여 tyrR 유전자 사이에 삽입하였으며, Quick & Easy E. coli Gene deletion kit (Gene Bridges)를 포함하는 RED/ET 재조합을 이용하여 종래 방법으로 수행하였다.
유전자 삽입 불활성화가 제대로 수행되었는지 확인하기 위하여, FLP 재조합 효소 발현 플라스미드인 707-FLPe (Gene Bridges)와 함께 세포를 변형하여 카나마이신 선택 마커를 염색체에서 제거하였다. 상기와 같은 공정을 통해 구축된 삽입 불활성화 티로신 고생산 돌연변이 균주(이하, “△COS1”)는 tyrA-F 프라이머(서열번호 25) 및 aroG-R 프라이머 (서열번호 26)로 확인하였다.
티로신 고생산 균주에 사용된 프라이머의 서열을 하기 표 3에 정리하여 나타내었다.
[표 3]
Figure PCTKR2015007543-appb-I000012
실시예 6-2. 티로신 고생산 균주를 이용한 호모세린 락톤의 생산 증가
실시예 6-1에서 제조된 티로신 고생산 대장균 △COS1에 앞서 실시예에서 제조된 pET-opT4R, pET-opT54R, pET-opT54MR을 도입하여 pET-opT4R/△COS1, pET-opT54R/△COS1, pET-opT54MR/△COS1를 제작하였다. 상기 벡터들은 각각 4-쿠마로일 호모세린 락톤, 카페오일 호모세린 락톤, 페루로일 호모세린 락톤을 생산할 수 있는 벡터이므로, 이들이 도입된 △COS1 에서 이들의 생산량이 증가되는지 여부를 확인하였다.
제조된 상기 대장균들을 실시예 3-2에서와 같은 방법으로 배양하고 분석하였으며, 각 호모세린 락톤 화합물 피크의 면적값을 HPLC의 300nm 파장에서 4-쿠마로일 호모세린 락톤 표준품의 면적 값에 대비하여 생산량을 측정하였다.
4-쿠마로일 호모세린 락톤 생산
도 16에 나타낸 바와 같이, pET-opT4R/△COS1의 배양액에서 실시예 3-2의 pET-opT4R/C41의 배양에서 생산된 4-쿠마로일 호모세린 락톤 피크와 동일한 시간대 (Rt, 12.2분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였다. 이를 통해서 pET-opT4R/△COS1가 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다. 이와 같이 생산된 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물의 생산량을 pET-opT4R/C41 대장균에서의 생산량과 비교하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, pET-opT4R/△COS1 의 배양액에서는 61 mg/L 수준으로 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하였으며, 이는 pET-opT4R/C41 보다 3배 이상의 높은 생산량이다. 따라서 티로신 고생산 균주에서 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물을 다량 생산할 수 있음을 확인하였다.
카페오일 호모세린 락톤 생산
유사하게 pET-opT54R/△COS1의 배양액에서는 실시예 4-2의 pET-opT54R/C41의 배양에서 생산된 카페오일 호모세린 락톤 피크와 동일한 시간대 (Rt, 9.9분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였다. 이를 통해서 pET-opT54R/△COS1가 카페오일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다. 이와 같이 생산된 카페오일 호모세린 락톤 화합물의 생산량을 pET-opT54R/C41 대장균에서의 생산량과 비교하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, pET-opT54R/△COS1의 배양액에서는 30 mg/L 수준으로 카페오일 호모세린 락톤 화합물을 생산하였으며, 이는 pET-opT54R/C41보다 약 6배 이상의 높은 생산량이다. 따라서 티로신 고생산 균주에서 카페오일 호모세린 락톤 화합물을 다량 생산할 수 있음을 확인하였다.
페루로일 호모세린 락톤 생산
또한 pET-opT54MR/△COS1의 배양액에서 실시예 5-2의 pET-opT54MR/C41의 배양에서 생산된 페루로일 호모세린 락톤 피크와 동일한 시간대 (Rt, 12.7분)에 동일한 UV 스펙트럼을 가진 피크를 확인하였다. 이를 통해서 pET-opT54MR/△COS1가 페루로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다. 하지만, 도 19에 나타낸 바와 같이, pET-opT54MR/△COS1의 배양액에서 특이하게도 극미량의 페루로일 호모세린 락톤 화합물을 생산하는 것을 확인하였다. 하지만 대사경로 중간체인 쿠마로익 산의 생산량은 현저히 증가되어 있어 대사흐름의 문제로 최종산물인 페루로일 호모세린 락톤 화합물생산이 pET-opT54MR/C41 보다 줄어든 것으로 판단된다.
실시예 7. 메티오닌 ( methionine ) 및 SAM(S- Adenosyl methionine )의 첨가 에 의한 호모세린 락톤 생산성 증가
실시예 6-2에서 제조된 pET-opT4R/△COS1, pET-opT54R/△COS1, pET-opT54MR/△COS1의 배양 배지에 S-아데노실 메티오닌(SAM) 또는 메티오닌을 첨가하고 생성되는 페닐아세틸 호모세린 락톤의 생산성을 비교하였다.
실시예 6-2에서 제조된 pET-opT4R/△COS1, pET-opT54R/△COS1, pET-opT54MR/△COS1을 상기 배양조건과 동일하게 세 번 배양을 실시하였고, 이 때 배지에 SAM 또는 메티오닌을 1 mM 최종농도로 처리하고 각각 25시간 동안 배양하였다. 상기 각 배양액의 일부를 filtering (Sartorius Minisart RC 4, 0.2um)하여 그 용액 20ul를 SunFire™ C18 column (250 × 4.6 mm, 5 μm; Waters, USA) 컬럼을 이용한 HPLC 분석에 이용하였으며, CH3CN-H2O(J.T.Baker,USA) (0.05%TFA;Sigma-Aldrich, USA) 이동상을 1 ㎖/min의 속도로 10%에서 60%까지 25분간 분석하였다. 4-쿠마로일 호모세린 락톤, 카페오일 호모세린 락톤, 페루로일 호모세린 락톤의 생산량을 비교하기 위해 상기 배양액의 300nm의 파장에서 보여지는 4-쿠마로일 호모세린 락톤 화합물 피크의 면적값을 4-쿠마로일 호모세린 락톤 표준품의 면적 값에 대비하여 정량하였다.
4-쿠마로일 호모세린 락톤 생산성 증가
도 17에 나타낸 바와 같이, SAM 을 첨가한 배양액에서는 93 mg/L의 4-쿠마로일 호모세린 락톤이 생산되었다. 이는 SAM을 첨가하지 않은 pET-opT4R/C41의 배양액에 비해 약 6.2배 증가한 것이다. 또한 이는 SAM 을 첨가하지 않은 pET-opT4R/△COS1의 배양액에 비해서도 약 2.3배 증가한 생산량이다. 메티오닌(Met)을 첨가한 배양액에서는 143 mg/L의 4-쿠마로일 호모세린 락톤이 생산된 것을 확인하였다. 이는 SAM을 첨가한 배양액보다 생산량이 1.5배 더 증가한 것으로 가장 높은 4-쿠마로일 호모세린 락톤 생산을 나타내었다.
카페오일 호모세린 락톤 생산성 증가
도 18에 나타낸 바와 같이, SAM을 첨가한 배양에서는 51mg/L의 카페오일 호모세린 락톤이 생산됨을 확인하였다. 이는 SAM 또는 메티오닌을 첨가하지 않은 pET-opT54R/C41의 배양액에 비해 약 12.8배 증가한 양이며, pET-opT54R/△COS1 배양액에 비해 약 1.7배 증가한 양이다. 메티오닌(Met)을 첨가한 배양액에서는 50 mg/L의 카페오일 호모세린 락톤이 생산되어 SAM을 첨가한 배양액과 비슷한 생산량의 증가를 나타내었다.
페루로일 호모세린 락톤 생산성 증가
실시예 6에서 확인한 바와 같이, 티로신 고생산 균주인 pET-opT54MR/△COS1에서는 오히려 페루로일 호모세린 락톤의 최종 생산량이 pET-opT54MR/C41보다 낮게 나타났다. 그러나 도 19에 나타낸 바와 같이, SAM 또는 메티오닌(Met)을 첨가한 배지에서는 pET-opT54MR/△COS1에 의한 페루로일 호모세린 락톤의 생산량이 현저히 증가하였다. 특히 메티오닌을 첨가한 배양액에서는 약 10 mg/L의 페루로일 호모세린 락톤이 생산되어 pET-opT54MR/C41의 배양액에 비해 약 1.7배 가량 페루로일 호모세린 락톤의 생산량이 증가하였다.
상기와 같은 결과를 통해, 4CL2nt 및 opRpaI 유전자, 선택적으로 opTAL, sam5, com를 포함하는 벡터를 이용하여 페닐아세틸 호모세린 락톤을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 상기 벡터를 티로신 고생산 균주 △COS1 로 도입하거나 이의 배양 배지에 S-아데노실 메티오닌 또는 메티오닌을 단순 첨가함으로써 페닐아세틸 호모세린 락톤의 생산을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법에 따르면, 유용물질인 페닐아세틸 호모세린 락톤을 생물 전환 및 인공 대사 경로를 통해 낮은 비용으로 대량 생산 가능하므로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 코엔자임 에이 라이게이즈 효소를 암호화하는 유전자(4CL2nt), 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 암호화하는 유전자 (opRpaI) 를 포함하는 화학식 1의 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000013
    상기 화학식 1에서 Ra는 수소, 메톡시 또는 하이드록시이며, 및 Rb는 수소, 메톡시 또는 하이드록시임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아실 호모세린 락톤 생합성 효소는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코엔자임 에이 라이게이즈 효소는 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 티로신 암모니아 리아제를 암호화하는 유전자(opTAL)를 더 포함하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 유전자가 opTAL-4CL2nt-opRpaI 순서로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 상기 티로신 암모니아 리아제는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자(sam 5)를 더 포함하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 유전자가 opTAL-Sam5-4CL2nt-opRpaI 순서로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 상기 4-쿠마린산 3-수산화효소 Sam5 암호화 유전자는 서열번호 15로 표시되는 폴리뉴클레오티드인, 벡터.
  10. 제7항에 있어서, 카페인산 O-메틸전이효소 (Caffeic acid O-methyltransferase, COMT)를 암호화하는 com 유전자를 더 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 com 유전자는 서열번호 17로 표시되는 폴리뉴클레오티드인, 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 유전자가 opTAL-Sam5-4CL2nt-com-opRpaI 순서로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페닐아세틸 호모세린 락톤은 화학식2 내지 5로 표시되는 쿠마로일 호모세린 락톤, 카페오일-호모세린 락톤, 페루로일-호모세린 락톤 및 신나모일 호모세린 락톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 발현 벡터:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000014
    ,
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000015
    ,
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000016
    ,
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000017
    .
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 발현 벡터가 도입된, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산용 형질전환체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 형질전환체는 티로신 고생산 변이 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 티로신 고생산 변이 균주는 서열번호 27 로 표시되는 염기서열로 이루어진 tyrAfbr[코리스믹산 뮤타제/프리페닉산 탈수소효소 유전자(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase gene, tyrA)의 피드백-저해-저항성(feedback-inhibition-resistant, fbr) 유전자]; 및 서열번호 28 로 표시되는 염기서열로 이루어진 aroGfbr[3-디옥시-D-아라비노-햅튤로소내이트-7-인산염합성효소 유전자(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate(DAHP) synthase, aroG)의 피드백-저해-저항성(feedbackinhibition-resistant, fbr) 유전자]가 tyrR(Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor) 조절유전자 부위에 삽입된 것인, 형질전환체.
  17. 1) 제14항의 형질전환체를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    2) 상기 1) 단계의 배양액으로부터 페닐아세틸 호모세린 락톤을 수득하는 단계; 를 포함하는 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 1) 단계의 배양 배지에 페놀산을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 페놀산은 4-쿠마린산, 카페인산, 페룰린산 및 신나믹산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 1) 단계의 형질전환체는 티로신 고생산 변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 1) 단계의 배양 배지에 메티오닌 (methionine) 또는 S-아데노실 메티오닌(S-Adenosyl methionine, SAM)을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 페닐아세틸 호모세린 락톤은 4-쿠마로일 호모세린 락톤, 카페오일-호모세린 락톤 및 페루로일-호모세린 락톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 페닐아세틸 호모세린 락톤 생산 방법.
  23. 1) 코엔자임 에이 라이게이즈 효소 및 아실 호모세린 락톤 생합성 효소를 페놀산에 처리하는 단계;
    2) 상기 1) 단계의 처리액을 배양하는 단계; 및
    3) 상기 2) 단계의 배양액에서 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 수득하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 페닐 아세틸 호모세린 락톤을 생산하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015007543-appb-I000018
    상기 화학식 1에서 Ra는 수소, 메톡시 또는 하이드록시이며, 및 Rb는 수소, 메톡시 또는 하이드록시임.
PCT/KR2015/007543 2014-07-21 2015-07-21 페닐아세틸 호모세린 락톤 유도체의 생산 방법 WO2016013844A1 (ko)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110876380A (zh) * 2019-10-30 2020-03-13 湖南省植物保护研究所 对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用
WO2021119436A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of using inducible signaling for tunable dyanmics in microbial communities
CN114703113A (zh) * 2022-03-29 2022-07-05 陕西海斯夫生物工程有限公司 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479732B1 (en) * 1999-04-23 2002-11-12 Mitsubishi Paper Mills, Limited cDNA of 4-coumarate: coenzyme a ligase and process for modifying lignin in plants
US20030119162A1 (en) * 2001-07-05 2003-06-26 Churchill Mair E.A. Structural basis of quorum sensing signal generation and methods and therapeutic agents derived therefrom

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101381048B1 (ko) 2010-10-20 2014-04-14 씨제이제일제당 (주) Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479732B1 (en) * 1999-04-23 2002-11-12 Mitsubishi Paper Mills, Limited cDNA of 4-coumarate: coenzyme a ligase and process for modifying lignin in plants
US20030119162A1 (en) * 2001-07-05 2003-06-26 Churchill Mair E.A. Structural basis of quorum sensing signal generation and methods and therapeutic agents derived therefrom

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHLGREN, N. A. ET AL.: "Aryl-homoserine lactone quorum sensing in stem-nodulating photosynthetic bradyrhizobia", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 108, no. 17, 26 April 2011 (2011-04-26), pages 7183 - 7188 *
KANG, SUN-YOUNG ET AL.: "Artificial biosynthesis of the p-coumaroyl-homoserine- lactone in Escherichia coli", KMB 2015 42ND ANNUAL MEETING & INTERNATIONAL SYMPOSIUM, 24 June 2015 (2015-06-24), pages 439 *
LINDEMANN, A. ET AL.: "Isovaleryl-homoserine lactone, an unusual branched-chain quorum-sensing signal from the soybean symbiont Bradyrhizobium japonicum", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 108, no. 40, 4 October 2011 (2011-10-04), pages 16765 - 16770 *
SCHAEFER, A. L. ET AL.: "A new class of homoserine lactone quorum-sensing signals", NATURE, vol. 454, no. 7204, 31 July 2008 (2008-07-31), pages 595 - 599 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110876380A (zh) * 2019-10-30 2020-03-13 湖南省植物保护研究所 对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用
CN110876380B (zh) * 2019-10-30 2021-08-20 湖南省植物保护研究所 对-香豆酰高丝氨酸内酯在防治烟草花叶病毒病中的应用
WO2021119436A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods of using inducible signaling for tunable dyanmics in microbial communities
CN114703113A (zh) * 2022-03-29 2022-07-05 陕西海斯夫生物工程有限公司 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用
CN114703113B (zh) * 2022-03-29 2022-10-11 陕西海斯夫生物工程有限公司 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用

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