CN114703113A - 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用，所述重组拟无枝酸菌表达酪氨酸解氨酶基因tal、对香豆酸‑3‑羟化酶基因sam5和咖啡酸甲基转移酶基因com，缺失预苯酸脱水酶基因pheA。本发明通过将酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸‑3‑羟化酶基因和咖啡酸甲基转移酶基因插入拟无枝酸菌中，并缺失预苯酸脱水酶基因，实现以葡萄糖为原料生物合成香兰素，在摇瓶中实现将25g/L的葡萄糖转化为1.25g/L香兰素，其底物价格低廉，安全无害，且产量较高，具有显著的经济价值。

Description

一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，本发明涉及一株能以葡萄 糖为底物合成香兰素重组拟无枝酸菌，还涉及所述重组菌的构建方法及应 用。

【背景技术】

香兰素(Vanillin，4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，又称为香草醛，主要存 在于天然植物香荚兰中。它是世界上最重要的香料之一，广泛应用于食品、 药品、化妆品、农业等领域，可在食品中起到助香、增味的作用，也可作 为食品防腐剂使用；在医药方面，香兰素具有保健、医疗的作用，同时也 是合成多种药物的重要原料；香兰素在化妆品、香水等领域可作为调香剂， 在农业生产中也可作为农作物的催熟剂和增产剂，还可以用作导电剂、氧 化助剂、消泡剂等。目前我国的香兰素年消费量在2000-2500t。

目前在市场上供应的香兰素有三种，即：(1)从香子兰花荚中提取的 天然香兰素；(2)用化学合成法生产的香兰素；(3)用微生物转化法生产 的香兰素。由于天然提取法与化学合成法存在种种不足，致使人们越来越 重视微生物转化法生产香兰素，其中，丁香酚、异丁香酚和阿魏酸是该法 生产香兰素的主要底物。中国发明专利申请CN 202111434423.0得到的枯 草芽孢杆菌Imau 2-12可以生物转化阿魏酸生产香兰素，发酵获得的香兰 素含量大于30mg/L；CN 202110974830.4得到的霍氏肠杆菌DQ可有效利 用反式阿魏酸生产香兰素，在条件pH值10.8，接种量2％，温度33℃下 发酵，可得到6.69g/L香兰素；CN201911424942.1公开了一种以丁香酚 为底物发酵生成香兰素的方法，通过Penicilliumsimplicissimum OMK-68 和Bacillus sp.OMK-69混合发酵获得香兰素，效价高达35g/L，丁香酚质 量转化率为83.3％。虽然利用丁香酚、阿魏酸等化合物作为底物，通过微 生物发酵制备香兰素的技术已经得到广泛的研究，但丁香酚、异丁香酚毒 性大，阿魏酸价格高，寻求安全、廉价的原料作为转化香兰素的底物成为 一个重要研究方向。

葡萄糖价格低廉，原料充足，安全无毒。Li等[Li K,Frost J W.Synthesis ofvanillin from glucose.J Am Chem Soc,1998,120:10545～10546]在大肠 杆菌重组子(Escherichia coli KL7/p KL5.26A or KL7/pKL5.97A)的作用下 将葡萄糖转化成香草酸，然后经粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中分离得 到的芳醛脱氢酶还原生成香兰素，但其合成策略需要胞外纯酶的催化和辅 因子，步骤繁琐。Hansen等研究表明，进行代谢工程改造后的酵母菌株 (裂殖酵母和酿酒酵母)以葡萄糖为底物，可以获得65mg/L和45mg/L的香兰素，然而酵母具有较强香兰素代谢能力，使得产量降低和副产物的 生成。中国发明专利申请CN 201510122147.2构建了一种代谢工程大肠杆 菌，通过转入5个外源基因，经过苯丙烷途径生成香兰素，但其产量低， 且香兰素对大肠杆菌毒性大，不利于其积累。

拟无枝酸菌自身含有从阿魏酸转化成香兰素的途径和酪氨酸合成途 径，可减少转入外源基因的数量，且对香兰素耐受性强，目前没有报道有 关拟无枝酸菌从头合成香兰素的研究。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术方案，通过基因工程技术得到可从头合 成香兰素的拟无枝酸菌。

本发明提供一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌 表达酪氨酸解氨酶基因(tal)、对香豆酸-3-羟化酶基因(sam5)和咖啡酸 甲基转移酶基因(com)，缺失预苯酸脱水酶基因(pheA)。

在本发明中，酪氨酸解氨酶基因(tal)来源于拟无枝酸菌 (Amycolatopsissp.CB00013)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；对香 豆酸-3-羟化酶基因(sam5)来源于西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；咖啡酸甲基转移酶基 因(com)来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；预苯酸脱水酶基因(pheA)来源于拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.HM-141)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供上述重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步 骤：

(1)构建含有强启动子permE的质粒

合成强启动子permE，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，将合成的基 因序列用XbaI/EcoRI酶切，酶切片段连接到pKC1139质粒的XbaI/EcoRI 位点，得到质粒pKC1139-permE；

(2)构建pheA基因缺陷型拟无枝酸菌

以pheA-U-FOR/pheA-U-REV和pheA-D-FOR/pheA-D-REV为引物， 以拟无枝酸菌基因组为模板，PCR扩增pheA基因的上下游同源臂，所得 上游同源臂片段通过连接到pKC1139质粒的BamHI\NsiI位点，下游同源 臂片段连接到pKC1139质粒的NsiI\SpeI位点，构建得到质粒pKC1139- pheA；

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA转化到拟无枝酸菌 HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突 变株传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即 为敲除pheA基因的基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142；

(3)构建整合tal基因的拟无枝酸菌

优化并合成拟无枝酸菌tal基因片段，将所得tal基因片段连接到 pKC1139-pheA质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal；

再将pKC1139-pheA-tal转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉 素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗性 平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为整合tal基因的拟无枝 酸菌；

(4)构建整合tal、sam5基因的拟无枝酸菌HM-144

优化并合成西班牙糖丝菌sam5基因片段，将sam5基因片段连接到 pKC1139-pheA-tal质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5；

将pKC1139-pheA-tal-sam5转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉 霉素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗 性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为整合tal、sam5基因 的拟无枝酸菌；

(5)构建整合tal、sam5和com基因的拟无枝酸菌HM-145

优化并合成拟南芥com基因片段，将com基因片段连接到pKC1139- pheA-tal-sam5质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5-com；

将得到的pKC1139-pheA-tal-sam5-com转化到拟无枝酸菌HM-141 中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株；将筛选出来的阳性突变株传代 培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为表达酪 氨酸解氨酶基因tal、对香豆酸-3-羟化酶基因sam5和咖啡酸甲基转移酶 基因com并缺失预苯酸脱水酶基因pheA的重组拟无枝酸菌。

在上述构建方法中，步骤(2)的拟无枝酸菌HM-141，该菌株已于 2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏编号为CGMCC No.22871；该拟无枝酸菌也被记载于中国发明专 利申请CN 2021109397312。本领域技术人员也可以以其他拟无枝酸菌株 作为出发菌株，构含有tal、sam5和com基因的pheA缺陷型重组拟无枝酸菌。

根据一种可选的实施方式，在步骤(4)中，所述阿伯拉霉素抗性筛 选是将拟无枝酸菌涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素GYM固体培养基中， 在30℃培养4d至长出单菌落，所得单菌落即为阳性突变株。其中，所述 GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物 10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。

基于此，本发明还提供重组拟无枝酸菌在产香兰素中的应用。特别地， 以葡萄糖为底物发酵生产香兰素。

作为一种特别优选的实施方式，将上述工程菌株接种于50mL种子培 养基M1中，在30℃、200rpm条件下培养72h；

将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有50ml发酵培养基M1 的250ml锥形瓶中，在37℃、搅拌转速200rpm条件下发酵培养72h，用 HPLC的方法测定香兰素的含量为1.25g/L；

所述M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L， 磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节 pH为7.2。

经测定，发酵停止后，所得培养基中的香兰素的含量为1.25g/L。

本发明通过将酪氨酸解氨酶基因(tal)、对香豆酸-3-羟化酶基因(sam5) 和咖啡酸甲基转移酶基因(com)插入拟无枝酸菌中，并缺失预苯酸脱水 酶基因(pheA)，实现以葡萄糖为原料生物合成香兰素。在摇瓶发酵实验 中，采用含有25g/L的葡萄糖的M1培养基，最终转化获得1.25g/L香兰 素。其底物价格低廉，安全无害，且产量较高，具有显著的经济价值。

【附图说明】

图1是拟无枝酸菌全合成通路图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比， 用于解释比例的“：”均为质量比。

实施例中使用到的菌株和质粒见表1，合成的引物序列见表2。

表1本发明所用的菌种和质粒

表2本发明涉及的引物

本发明涉及以下培养基：

LB培养基含有：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L。

GYM培养基含有：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L。

GYM固体培养基含有：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物 10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。

M1培养基含有：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L，磷 酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH 为7.2。

以下实施例中使用的接合转移实验包括以下步骤：

(1)将拟无枝酸菌HM-141(或其他拟无枝酸菌工程菌株)在GYM 固体培养基上进行活化，在30℃培养3-4d至长出菌落，然后接种菌株到 50mL GYM液体培养基中在30℃、200rpm培养2d。

(2)将构建好的质粒热激转入E.coli ET12567(pUZ8002)菌株，涂 布于含有25μg/mL氯霉素、25μg/mL卡那霉素和50μg/mL阿伯拉霉素抗 性的LB固体平板，在37℃培养12h至长出单菌落，接种单菌落于含有 抗性的4mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养，然后按照1％的 接种量接种于20mL LB中在37℃、200rpm培养4-5h至OD₆₀₀为0.4-0.6。

(3)分别取拟无枝酸菌HM-141菌液2mL及携带目标质粒的E.coli ET12567(pUZ8002)菌液1mL，5000g离心1min，用无抗LB清洗两遍， 加入100μL无抗LB培养基，将拟无枝酸菌HM-141和E.coli ET12567 (pUZ8002)按体积比7:1混合，将混合好的菌液取30μL点在无抗GYM 固体培养基上30℃，14h正置培养。

(4)将长出的菌斑刮下，涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL 萘啶酮酸溶液GYM固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，然后 对单菌落进行PCR验证。

实施例1：构建pheA基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142

(1)构建含有强启动子permE的质粒

合成在拟无枝酸菌中使用的强启动子permE，其基因序列如SEQ ID NO:5所示。将合成的permE基因序列用XbaI/EcoRI进行酶切，酶切片段 连接到pKC1139质粒的XbaI/EcoRI位点，得到质粒pKC1139-permE。

(2)构建pheA基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142

以pheA-U-FOR/pheA-U-REV和pheA-D-FOR/pheA-D-REV为引物， 以拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.ATCC39116基因组为模板，PCR扩增pheA 基因(蛋白序列号：WP_020416411.1)的上下游同源臂。所得上游同源臂 片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的BamHI\NsiI位点,下 游同源臂片段通过Assembly试剂盒连接到pKC1139质粒的NsiI\SpeI位 点，构建得到质粒pKC1139-pheA。

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA转化到拟无枝酸菌 HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株。将筛选出来的阳性突 变株37℃传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的 菌株即为敲除pheA基因的基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142。

实施例2：构建整合tal基因的拟无枝酸菌HM-143

在NCBI上找到拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.CB00013的tal基因序 列(蛋白序列号：OKK01409.1)，送生工进行密码子优化后合成tal基因 片段。通过Assembly试剂盒将tal基因片段连接到pKC1139-pheA质粒 的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal。

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA-tal转化到拟无枝 酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株。将筛选出来的阳 性突变株37℃传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不 长的菌株即为整合tal基因的拟无枝酸菌HM-143。

实施例3：构建整合tal、sam5基因的拟无枝酸菌HM-144

在NCBI上找到西班牙糖丝菌Saccharothrix espanaensis的sam5基因 序列(基因序列号：MW403920.1)，送生工进行密码子优化后合成sam5 基因片段。通过Assembly试剂盒将sam5基因片段连接到pKC1139-pheA -tal质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5。

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA-tal-sam5转化到拟 无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株。将筛选出来 的阳性突变株37℃传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平 板不长的菌株即为整合tal、sam5基因的拟无枝酸菌HM-144。

实施例4：构建整合tal、sam5和com基因的拟无枝酸菌HM-145

在NCBI上找到拟南芥(Arabidopsis thaliana)的com基因序列(基 因序列号：NM_124796.4)，送生工进行密码子优化后合成com基因片段。 通过Assembly试剂盒将com基因片段连接到pKC1139-pheA-tal-sam5质 粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5-com。

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA-tal-sam5-com转 化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株。将筛 选出来的阳性突变株37℃传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素 抗性平板不长的菌株即为整合tal、sam5和com基因的拟无枝酸菌HM- 145。

实施例5：出发菌株拟无枝酸菌HM-141与实施例1-4的拟无枝酸菌 HM-142、HM-143、HM-144、HM-145菌株的发酵对比

分别用拟无枝酸菌HM-141、实施例1-4的拟无枝酸菌HM-142、HM- 143、HM-144、HM-145菌株进行发酵实验。实验方法如下：

分别接种上述菌株于50mL种子培养基M1中，在30℃、200rpm培 养72h，将种子液按照5％的接种量接种到含有50ml发酵培养基M1的 250ml锥形瓶中，在37℃、搅拌转速200rpm条件下发酵培养72h。停止 发酵后，测定各培养基内的剩余成分。

所述M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.8g/L， 磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节 pH为7.2。

酪氨酸含量测定方法：参照文献(王钦,曾伟主,周景文.大肠杆菌酪氨 酸转运系统基因敲除对酪氨酸生产的影响[J].生物工程学 报,2019,35(07):1247-1255)进行。

对香豆酸、咖啡酸含量测定方法：参照文献(张伟.产对香豆酸及其 衍生物的酿酒酵母菌株的构建与优化[D].天津大学,2017.)进行。

香兰素含量测定方法：参照中国发明专利申请CN113789292A(孟永 宏,强珊,郭建琦,牛永洁,杨璐.高产香兰素的基因缺陷型拟无枝酸菌、其构 建方法及应用2021-12-14.)进行。

葡萄糖含量测定方法：使用葡萄糖测定仪检测发酵液中葡萄糖浓度。 将25μL的1％标准葡萄糖溶液标准品注入反应池，仪器自动定标，多次 反复至指示灯不闪烁。将发酵样品稀释100倍，用微量注射器将25μL待 测样品注入反应池，仪器自动完成测定过程。发酵结果如下表3所示。

表3拟无枝酸菌及其工程菌株的发酵实验结果

以上结果可以看出，本发明的pheA基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142 提高了葡萄糖合成酪氨酸的含量，从拟无枝酸菌HM-141的1.45g/L酪氨 酸提升到3.07g/L，提升了112％。拟无枝酸菌HM-143成功表达tal基因， 实现葡萄糖合成对香豆酸，对香豆酸含量达到2.05g/L；拟无枝酸菌HM- 144成功表达tal、sam5基因，实现葡萄糖合成咖啡酸，咖啡酸含量达到 1.73g/L；拟无枝酸菌HM-145成功表达tal、sam5和com基因，实现了 葡萄糖合成香兰素，将25g/L的葡萄糖转化为1.25g/L香兰素。

序列表

<110> 陕西海斯夫生物工程有限公司

<120> 一株重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 来源于拟无枝酸菌的酪氨酸解氨酶基因tal(Amycolatopsis sp. CB00013)

<400> 1

atgtccgccc agctggacgc gcgcttcctg gacggcgcgg acgacctggc gaccggccag 60

cacctgggcc acggcttcga cgtcgtgggc cacgtggcgg tcacggtcca gggcggcgac 120

ccgcgcgcgc acctggtcgt ccacggcctg cggagccgcg cccagccgtt cgtgcccgcg 180

ggggacgtgg accgcctcca cggcggccag cagctgcacc gggaggacct cctggtcgtc 240

ctggaggacc cggcccgcgt cgcccgcggc gacgaggcgc acgccgacga cgtcctggtc 300

gtgccgatcg gccggaacgc cctccgggcc ggcggcgcgg accgcccggt cctccgggac 360

cagcggggcc ggcgcgtcct gcgctccggc gaggcggccg tggagccgcg cgtcgcgcgc 420

gacgaggagc tccggcagcc ggtcgggaag gtgaccgtgc agcagccggt cggcctgccg 480

ctgcgggagc acccggagct cggccagcgg gaccggcacg aggtgcacgg cgagcgggac 540

cggctggcgg tcgaggtccg ccccgtggag gacctcctcg ccctcgagga gcagcgcgtc 600

gtcggcggcc gggtcgacct ggacgtggag ctggtgctcc gcgtcgtgga gcgcgtgccg 660

gaccgcgccg acgagctccg cgaccgcgcc cagggcatcg gcctcctcca ggtggacctg 720

cgggccctgc acacgctgtt cgtgcagttc gccgtggcgg cggccctcgt cgcggccgtc 780

cgcgacttcg cgtcgcagat ccggatgctg gacgggcagc aggcggcgct gcaccagcgg 840

ccccacgtcg gccggggcgt ggacctggcc ctgatgcgca cgcggcacgt cgtcgccttc 900

cgccaggaac gggcgggccg gacggcccag ggcctcgacc accagtgccg cgatgacctg 960

cgggtgctgc acctgggcca ccgcccggtc gacgacgagc ggacggaagc cggccacccc 1020

cgcggcgccg tggaccagcg gcaggcgttc ctcgaggccc agttccagcg gctcgacgtg 1080

caggccgcgg agcacctgac cgggcgccac ctgctgccgg tcgcccagga cgtcccgctg 1140

gccgacgagc gggaccggga cggccgcaag cggcgccagg tgaccgcgcg tgccgagcgg 1200

ccggacctgc gcgacggcgg ccgggacgcc gaggtggaag tccagggcga acccttcgag 1260

cacctgcggc cgcaccggcg gatccccctc ggggagcggg tgcaggcggg cggggacgac 1320

ggcccgcggc tggtgttcgg tgagcagcgg accgacgccg gcgcggtcgc cgcgcaccag 1380

gtgggcctgc agctgcacct gctgctgggc ggcgaccagc acgtcgacca cctggccgtg 1440

accggcggcg acccggtgga cggcgacttg ctcgccgacg acctgctcga gccgcggccg 1500

gccttcctgc gcgcgctcca gcacgggcgg cgccacccgg ccggccggcc cctgctgggc 1560

caccggaccg agatccggga cgcgcaggcc ttcgcggtcg agggcgaccg catgctgtgc 1620

ctgtcgccgt cccac 1635

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 来源西班牙糖丝菌的香豆酸-3-羟化酶基因sam5(Saccharothrixespanaensis)

<400> 2

atgacgatca cgtcgccggc gccggcgggc cggctgaaca acgtgcggcc gatgaccggg 60

gaggagtacc tcgagtcgct gcgggacggc cgcgaggtgt acatctacgg cgagcgcgtc 120

gacgacgtga ccacgcacct ggccttccgg aacagcgtcc gctcgatcgc ccgcctgtac 180

gacgtcctgc acgacccggc ctccgagggc gtcctgcggg tcccgaccga caccggcaac 240

gggggcttca cccacccgtt cttcaagacc gcgcgctcct cggaggacct ggtcgccgcg 300

cgggaggcga tcgtcggctg gcagcggctg gtgtacggct ggatgggccg caccccggac 360

tacaaggcgg cgttcttcgg caccctcgac gcgaacgccg agttctacgg ccccttcgag 420

gccaacgccc ggcgctggta ccgcgacgcc caggagcggg tcctctactt caaccacgcg 480

atcgtgcacc ccccggtcga ccgggaccgc ccggccgacc ggacggccga catctgcgtg 540

cacgtcgaag aggagaccga ctccgggctc atcgtgagcg gggccaaggt ggtcgcgacg 600

ggctccgcga tgacgaacgc caacctgatc gcccactacg gcctcccggt ccgggacaag 660

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ggcgaggtcc tcaactggcg ggacgtgttc tggggcctgt ccgacgcgat ggccaagtcg 1080

ccgaacagct gggtcggtgg ctcggtgcag cccaacctca actacgggct ggcgtaccgc 1140

acgttcatgg gcgtcggcta cccgcgcatc aaggagatca tccagcagac cctgggctcg 1200

ggcctgatct acctgaactc gtcggcggcg gactggaaga acccggacgt ccgcccctac 1260

ctggaccgct acctgcgggg ctcccgcggg atccaggcga tcgaccgggt gaagctcctc 1320

aagctgctgt gggacgccgt ggggaccgag ttcgccgggc ggcacgagct ctacgagcgg 1380

aactacgggg gcgaccacga gggcatccgg gtgcagaccc tccaggcgta ccaggccaac 1440

gggcaggccg cggccctgaa gggcttcgcg gagcagtgca tgagcgagta cgacctggac 1500

ggctggaccc gcccggacct gatcaacccc ggcacctga 1539

<210> 3

<211> 1092

<212> DNA

<213> 来源于拟南芥的咖啡酸甲基转移酶基因com(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

atgggcagca cggcggagac ccagctgacc ccggtccagg tgacggacga cgaggccgcc 60

ctgttcgcca tgcagctcgc gagcgcgtcg gtcctgccga tggcgctgaa gtccgccctc 120

gagctggacc tgctggagat catggccaag aacgggtcgc ccatgagccc gaccgagatc 180

gcctcgaagc tgccgacgaa gaacccggag gccccggtca tgctcgaccg gatcctgcgc 240

ctgctcacgt cgtacagcgt cctgacctgc tccaaccgca agctctcggg cgacggcgtc 300

gagcggatct acgggctggg gccggtctgc aagtacctga cgaagaacga ggacggcgtg 360

tcgatcgccg cgctgtgcct gatgaaccag gacaaggtcc tcatggagtc gtggtaccac 420

ctgaaggacg ccatcctgga cggcggcatc ccgttcaaca aggcctacgg catgtcggcc 480

ttcgagtacc acggcaccga cccgcgcttc aacaaggtgt tcaacaacgg catgtcgaac 540

cactccacca tcaccatgaa gaagatcctc gagacctaca agggcttcga gggcctcacg 600

tcgctcgtgg acgtcggcgg cggcatcggc gccacgctga agatgatcgt gtccaagtac 660

ccgaacctga agggcatcaa cttcgacctg ccgcacgtca tcgaggacgc gccctcgcat 720

ccgggcatcg agcacgtcgg gggcgacatg ttcgtgtccg tcccgaaggg cgacgccatc 780

ttcatgaagt ggatctgcca cgactggagc gacgagcact gcgtgaagtt cctgaagaac 840

tgctacgagt cgctgccgga ggacggcaag gtgatcctcg cggagtgcat cctgccggag 900

accccggact cgtccctgtc gaccaagcag gtcgtccacg tcgactgcat catgctggcg 960

cacaatccgg gcggcaagga gcggacggag aaggagttcg aggccctggc caaggcgtcc 1020

ggcttcaagg gcatcaaggt cgtctgcgac gcgttcggcg tgaacctgat cgagctgctg 1080

aagaagctgt ga 1092

<210> 5

<211> 915

<212> DNA

<213> 来源于拟无枝酸菌的预苯酸脱水酶基因pheA(Amycolatopsis sp. )

<400> 5

gtgtcacgga tcgcatattt cgggccggtc gggacgttca ccgagcaggc ggcgcgcact 60

ttcacgacgg cgggggacga actcgtcgcc gccgagacga ttccgaaggc gctggacgcc 120

gttcggcgcg gtgaagcgga tgcggcgtgc gtgccggtcg aaaactccgt cgagggcgcg 180

gttcccgcga cgctggacag cctcgccgtc ggcgagccgt tgatcggtgt tgcggaagcc 240

ttgctgccag tgcacttcag cgtcctcacg cgggacgacg tcggcgaaat ccgtactgtg 300

gcgagccatc cgcacgcgct cgcgcaggtc cggaagtggc tggaggacaa cctgcccggc 360

gcccgcgcgg tggcggccgg ctcgaccgcg gcggccgcgg tcgccgtgca ggcaggggag 420

ttcgacgccg ccgtgaccgc gccggtcgcc gtcgagcact acccgctgaa ggtgctggcg 480

acggaggtcg ccgacgtccg ggacgcccgc acccggttcc tgctgatgcg gcggcccccg 540

gtgacgttgc cggagccgac cggcgccgac cgcacctcga tcgtcgccgc ggccgccaac 600

cgcaccggcg cgctcgccga actgctcacc gagctcgcga cccgcggcat caacctgacc 660

cgcctggacg cccgcccgaa caagcagaac ttcggcgagt accggttctt catcgacttc 720

gagggacacg tcgccgagcc gcgcatcgcc gacgcgctcg ccgcgctgcg ccgccgctgc 780

cgggatgtcc ggttcctcgg ctcgttcgcc cgggccgacg gggtgacggc gaccatcgaa 840

ccggccgccc gcaacgaaga cttcaccgac gccgcggact gggtcgccgc ggtgcagaga 900

ggggagcagg cgtga 915

<210> 5

<211> 357

<212> DNA

<213> perme基因(Unknown)

<400> 5

tctagaagcc cgacccgagc acgcgccggc acgcctggtc gatgtcggac cggagttcga 60

ggtacgcggc ttgcaggtcc aggaagggga cgtccatgcg agtgtccgtt cgagtggcgg 120

cttgcgcccg atgctagtcg cggttgatcg gcgatcgcag gtgcacgcgg tcgatcttga 180

cggctggcga gaggtgcggg gaggatctga ccgacgcggt ccacacgtgg caccgcgatg 240

ctgttgtggg cacaatcgtg ccggttggta ggatccaagg aggcaacaag atgcataaaa 300

tctccaaaaa aaaaggctcc aaaaggagcc tttaattgta tcggtactag tgaattc 357

Claims (7)

1.一株重组拟无枝酸菌，其特征在于所述重组拟无枝酸菌表达酪氨酸解氨酶基因tal、对香豆酸-3-羟化酶基因sam5和咖啡酸甲基转移酶基因com，并缺失预苯酸脱水酶基因pheA。

2.根据权利要求1所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于酪氨酸解氨酶基因tal来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；对香豆酸-3-羟化酶基因sam5来源于西班牙糖丝菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；咖啡酸甲基转移酶基因com来源于拟南芥，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；预苯酸脱水酶基因pheA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有强启动子permE的质粒

合成强启动子permE，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，将合成的基因序列用XbaI/EcoRI酶切，酶切片段连接到pKC1139质粒的XbaI/EcoRI位点，得到质粒pKC1139-permE；

(2)构建pheA基因缺陷型拟无枝酸菌

以pheA-U-FOR/pheA-U-REV和pheA-D-FOR/pheA-D-REV为引物，以拟无枝酸菌基因组为模板，PCR扩增pheA基因的上下游同源臂，所得上游同源臂片段通过连接到pKC1139质粒的BamHI\NsiI位点，下游同源臂片段连接到pKC1139质粒的NsiI\SpeI位点，构建得到质粒pKC1139-pheA；

利用接合转移实验方法，将得到的pKC1139-pheA转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为敲除pheA基因的基因缺陷型拟无枝酸菌HM-142；

(3)构建整合tal基因的拟无枝酸菌

优化并合成拟无枝酸菌tal基因片段，将所得tal基因片段连接到pKC1139-pheA质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal；

再将pKC1139-pheA-tal转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为整合tal基因的拟无枝酸菌；

(4)构建整合tal、sam5基因的拟无枝酸菌HM-144

优化并合成西班牙糖丝菌sam5基因片段，将sam5基因片段连接到pKC1139-pheA-tal质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5；

将pKC1139-pheA-tal-sam5转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株，将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为整合tal、sam5基因的拟无枝酸菌；

(5)构建整合tal、sam5和com基因的拟无枝酸菌HM-145

优化并合成拟南芥com基因片段，将com基因片段连接到pKC1139-pheA-tal-sam5质粒的NsiI位点，得到质粒pKC1139-pheA-tal-sam5-com；

将得到的pKC1139-pheA-tal-sam5-com转化到拟无枝酸菌HM-141中，经阿伯拉霉素抗性筛选出阳性突变株；将筛选出来的阳性突变株传代培养，在无抗性平板上生长且阿伯拉霉素抗性平板不长的菌株即为表达酪氨酸解氨酶基因tal、对香豆酸-3-羟化酶基因sam5和咖啡酸甲基转移酶基因com并缺失预苯酸脱水酶基因pheA的重组拟无枝酸菌。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于所述阿伯拉霉素抗性筛选是将拟无枝酸菌涂布于含有50μg/mL阿伯拉霉素GYM固体培养基中，在30℃培养4d至长出单菌落，所得单菌落即为阳性突变株；

其中，所述GYM固体培养基配方为：葡萄糖4g/L、酵母提取物4g/L、麦芽提取物10g/L、碳酸钙2g/L、琼脂粉20g/L。

5.权利要求1或2所述的重组拟无枝酸菌在产香兰素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组拟无枝酸菌以葡萄糖为底物发酵生产香兰素。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将所述重组拟无枝酸菌接种于50mL种子培养基M1中，在30℃、200rpm条件下培养72h，得到种子液；

然后将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有50ml发酵培养基M1的250ml锥形瓶中，在37℃、搅拌转速200rpm条件下发酵培养72h；

所述M1培养基配方为：葡萄糖25g/L，酵母浸粉8g/L，氯化钠0.8g/L，磷酸二氢钾5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.05g/L，其余为水，调节pH为7.2。

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