CN106032538B - 一株代谢工程菌及其在利用多种底物生产香兰素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株代谢工程菌的构建方法与应用。本发明模拟天然香兰素合成途径，将相关基因转入大肠杆菌K12进行基因改造，使其成为具有香兰素合成能力的代谢工程大肠杆菌E‑GV。本发明公开了所述的代谢工程菌在催化多种廉价、易获取碳源包括葡萄糖、木糖、甘油和酪氨酸等生产香兰素中的应用。应用本发明的代谢工程大肠杆菌可以在48小时内将酪氨酸转化为97.2mg/l香兰素；在72小时内将葡萄糖、木糖和甘油分别转化为19.3mg/l，13.3mg/l和24.7mg/l香兰素。本发明中构建的代谢工程菌株具有转化底物廉价，可以利用酪氨酸、葡萄糖、甘油和木糖等廉价碳源为底物，降低了生产成本，操作简便，菌株传代稳定。具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及利用分子生物学技术，通过模拟天然香兰素合成途径来构建的一株大肠杆菌(以下简称代谢工程菌或者代谢工程大肠杆菌)，及应用此代谢工程菌转化多种廉价的底物酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖生产香兰素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
香兰素(Vanillin,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，又名香草醛，香荚兰素。香兰素主要存在于天然植物香荚兰中，香荚兰的豆荚中大约有2％干重的香兰素。香兰素被誉为“香料皇后”，是世界上产量最大，应用最为广泛的香料之一。香兰素具有独特香气，在食品、饮料、香精香料及医药领域中占据极为重要的地位。在化学工业中，香兰素还被用作镀锌槽的增白剂和锌电镀的活性剂，香兰素也是生产多巴和罂粟碱的基础原料。目前，全球对香兰素的年需求量已经超过了16,000吨。
植物提取法和化学合成法是香兰素生产最为常用的两种方法。化学合成法是利用丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等作为合成底物，其低廉的成本和简单的工艺使得这种方法生产的香兰素占据了绝大部分的市场(约90％)。然而，化学合成法会造成严重的环境污染，并且合成香兰素在纯度、香气和安全性等方面都远不及天然提取的香兰素，使得其价格远远低于天然香兰素。植物提取法是从香荚兰的豆荚中提取，种植区域的限制、气候的影响、高强度的体力劳动和较低的产率使得天然香兰素的产量远低于市场需求，导致天然香兰素价格及其昂贵，达到合成香兰素的300倍(高达4,000美元/公斤)。
美国FDA规定，植物或动物原料通过物理、酶法或微生物转化得到的产品被认为是天然的产品。因此，温和的反应条件、简单的提取步骤、快速高效生产过程和清洁无污染等优势使得生物合成法(微生物转化法)成为最具潜力的天然香兰素合成方法。目前，已经报道了链霉菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌和肠杆菌等微生物可以转化底物生成香兰素，这些底物包括了阿魏酸、丁香酚、木质素、异丁香酚和香兰酸等。1999年,Muheim和Lerch利用西唐链霉菌转化阿魏酸得到6.4g/L香兰素。2000年Rabenhorst等利用拟无枝菌酸转化阿魏酸,获得11.5g/L的香兰素。2007年,华栋梁等利用链霉菌转化阿魏酸,借助吸附树脂的作用,获得19.2g/L的香兰素。虽然利用阿魏酸等化合物作为底物，通过微生物发酵制备香兰素的技术已经得到广泛的研究和应用，但这些化合物较为昂贵，占据了生产成本的绝大部分。因此，寻求更为廉价的底物成为香兰素生物法制备的一个重要研究方向。
葡萄糖可由淀粉水解得到，价格低廉，原料充足。1998年Li等人利用基因重组的大肠杆菌将葡萄糖通过磷酸戊糖途径和莽草酸途径转化为香草酸，之后，香草酸在胞外经过粗糙脉孢菌中的芳醛脱氢酶还原，生成微量的香兰素。2009年Hansen等对两种常见的酵母菌株(粟酒裂殖酵母和酿酒酵母)进行代谢工程改造,分别向两个菌株中引入3个和4个不同来源的外源基因,同时对原始菌株中降解香兰素的基因进行敲除,改造后的菌株以葡萄糖为初始底物,可以获得65mg/L和45mg/L香兰素。显而易见，这种生物转化策略底物经济，代谢途径简单可控，很有实现工业化生产的可能。但是，Li等人的合成策略需要胞外纯酶的催化和添加昂贵的辅因子，步骤繁琐，并且产量较低，使得生产效率不高；Hansen等人的合成策略在酵母中进行，而酵母具有较强香兰素代谢能力，尽管敲除了香兰素代谢的相关基因，但醇脱氢酶依然导致了副反应的发生，使得产量降低和副产物的生成。此外，这两种方法都以脱氢莽草酸为前体，在一定层度上破坏了菌株自身的芳香氨基酸合成途径。植物中香兰素天然合成途径是以初级代谢产物酪氨酸为前体的，经过苯丙烷途径可以形成香兰素，微生物中并不存在这一合成途径。这条途径可以延伸微生物的芳香氨基酸合成途径，为香兰素的生物合成提供了一种新思路，然而对于这条合成途径的模拟以及在微生物中的重构还未见报道。此外，利用除葡萄糖以外的廉价碳源，如木糖和甘油来生产香兰素的研究也未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于构建一株转化底物廉价、操作简便、遗传稳定的，用于香兰素生产的代谢工程大肠杆菌。本发明所述的应用方法以廉价易获取碳源(如甘油、葡萄糖、木糖等)为底物，降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。
本发明的技术方案如下：
首先本发明提供了构建含有酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因元件的代谢工程大肠杆菌的方法。
所述酪氨酸解氨酶基因能够与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交，并且编码具有酪氨酸解氨酶活性的蛋白质，优选地，其中所述酪氨酸解氨酶来源于西班牙糖丝菌。所述对香豆酸羟化酶基因能够与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，并且编码具有对香豆酸羟化酶活性的蛋白质，优选地，其中所述对香豆酸羟化酶来源于西班牙糖丝菌。所述咖啡酸甲基转移酶基因能够与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交，并且编码具有咖啡酸甲基转移酶活性的蛋白质，优选地，其中所述咖啡酸甲基转移酶来源于拟南芥。所述阿魏酰辅酶A合酶基因能够与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交，并且编码具有阿魏酰辅酶A合酶活性的蛋白质，优选地，其中所述阿魏酰辅酶A合酶来源于链霉菌V-1。所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因能够与SEQ ID NO.5的核苷酸序列杂交，并且编码具有烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶活性的蛋白质，优选地，其中所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶来源于链霉菌V-1。
代谢工程大肠杆菌E-GV的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用PCR技术，以西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis DSM 44229)基因组为模板，扩增得到命名为sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名为sam5的对香豆酸羟化酶基因(基因序列见序列表)；
(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NcoI和EcoRI；
(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(4)利用内切酶分别对步骤(1)和(3)中得到的sam5基因片段和pACYCDuet-sam8质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NdeI和XhoI；
(5)将步骤(4)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-sam8质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(6)根据大肠杆菌的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的咖啡酸甲基转移酶基因(comt)进行密码子优化，并在前端加上T7启动子序列(基因序列见序列表)，用重组PCR的方法进行合成，并纯化；
(7)利用内切酶分别对步骤(5)中得到的重组质粒和步骤(6)中得到的基因片段进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为SacI和NotI；
(8)将步骤(7)中双酶切后的基因片段和质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(9)利用PCR技术，以链霉菌(Streptomyces sp.)V-1(保藏号为CCTCC M 2015077)基因组为模板，扩增得到命名为fcs的阿魏酰辅酶A合酶基因和命名为ech的烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因(基因序列见序列表)；
(10)利用内切酶分别对步骤(9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NcoI和HindIII；
(11)将步骤(10)中双酶切后的所述基因片段和质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pETDuet-ech；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(12)利用内切酶分别对步骤(9)和(11)中得到的fcs基因片段和pETDuet-ech质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NdeI和XhoI；
(13)将步骤(12)中双酶切后的基因片段和pETDuet-ech质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pETDuet-fcs-ech；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(14)将步骤(8)和(13)中得到重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt和pETDuet-fcs-ech转化入酪氨酸高产菌株K12(pCOLADuet-tyrAfbr-aroGfbr-tktA-ppsA)，经过筛选和验证后获得代谢工程大肠杆菌，命名为E-GV。
步骤(1)中的扩增使用上游引物sam8-F：5′-catgccatgggcatgacgcaggtcgtggaacg-3′和sam5-F：5′-catgcatatgaccatcacgtcacctgc-3′，下游引物sam8-R：5′-catggaattcttatccgaaatccttcccgt-3′和sam5-R：5′-catgctcgagttaggtgccggggttgatca-3′。
上述步骤(9)中的扩增使用上游引物fcs-F：5′-catggaattccatatgcgcaaccagggtctgggc-3′和ech-F：5′-catgccatgggcatgagcacagcggtcggcaacggg-3′，下游引物fcs-R：5′-catgctcgagtcagccgaagcggcggcggacctcgcc-3′和ech-R：5′-catgaagcttctacttctccgggtcgaaggcgctcag-3′。
本发明提供了一株代谢工程大肠杆菌E-GV，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015077，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli。保藏时间：2015年3月2日
本发明还提供了一种利用代谢工程大肠杆菌E-GV生产香兰素的方法，以酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖为底物，以代谢工程大肠杆菌E-GV菌株为生物催化剂。其步骤如下：
(1)斜面培养：将所述代谢工程大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上，37℃培养11-13小时；优选地，卡那霉素的浓度为100μg/mL；氯霉素的浓度为20μg/mL；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；
(2)种子培养：将步骤(1)培养菌株E-GV，接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，制得种子；优选地，卡那霉素的浓度为100μg/mL；氯霉素的浓度为20μg/mL；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；
(3)转化培养：将步骤(2)中得到的种子接种到同时含有卡那霉素、氯霉素、氨苄霉素和底物的LB或改良M9液体培养基中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入IPTG和底物，26℃诱导培养48-72小时，得到含香兰素的转化液；优选地，卡那霉素的浓度为100μg/mL；氯霉素的浓度为20μg/mL；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；IPTG终浓度为0.25mM；
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,pH 7.0；
上述步骤(3)中所述的改良M9培养基配方是：1g/L NH4Cl,6g/L Na2HPO4,3g/LKH2PO4,0.5g/L NaCl,2mmol MgSO4·7H2O,0.1mmol CaCl2·2H2O,0.03mg/L H3BO3,1mg/Lthiamine,0.94mg/L ZnCl2,0.5mg/L CoCl2,0.38mg/L CuCl2,1.6mg/L MnCl2,3.6mg/LFeCl2和0.5g/L酵母膏。
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，离心后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素；优选地，离心转速为5000转/分钟，离心时间为15分钟。
进一步，步骤(3)中在LB培养基中加入底物酪氨酸的初始浓度为2g/L，反应时间为48小时。
进一步，步骤(3)中在改良M9培养基中加入底物葡萄糖、甘油或木糖的初始浓度为10g/L，反应时间为72小时。
样品检测：将步骤(4)制得的香兰素粉末，用HPLC和LC-ESI-MS检测样品的纯度和结构。
本发明中构建的代谢工程菌株转化底物廉价，操作简便，菌株传代稳定。可以利用酪氨酸、葡萄糖、甘油和木糖等廉价碳源为底物，香兰素的最高产量分别为97.2mg/l，19.3mg/l，13.3mg/l和24.7mg/l，对应的反应周期为48-72小时。
附图说明
图1是本发明实施例3利用大肠杆菌E-GV转化酪氨酸生产香兰素中香兰素的浓度和重组菌株生长随时间变化图。
图2是本发明实施例3中香兰素的LC-ESI-MS检测图谱。
图3是本发明实施例4利用大肠杆菌E-GV转化葡萄糖生产香兰素中香兰素的浓度和重组菌株生长随时间变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
代谢工程大肠杆菌E-GV的构建：
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
(1)扩增酪氨酸解氨酶基因(sam8)和对香豆酸羟化酶基因(sam5)片段：
利用PCR技术，以西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis DSM 44229)基因组为模板，扩增得到命名为sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名为sam5的对香豆酸羟化酶基因(基因序列见序列表)；
PCR引物：sam8基因上游引物sam8-F：5′-catgccatgggcatgacgcaggtcgtggaacg-3′，下游引物sam8-R：5′-catggaattcttatccgaaatccttcccgt-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是NcoI和EcoRI的酶切位点。sam5基因上游引物sam5-F：5′-catgcatatgaccatcacgtcacctgc-3′，下游引物sam5-R：5′-catgctcgagttaggtgccggggttgatca-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是NdeI和XhoI的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。
(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NcoI和EcoRI；
将含有pACYCDuet-1质粒的大肠杆菌Trans1-T1按照1％接种量，接种至5mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒提取质粒，同时利用NEB的限制性内切酶NcoI和EcoRI进行双酶切。
(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行回收，用T4DNA连接酶(购买自New EnglandBiolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pACYCDuet-sam8。
(4)将步骤(1)中得到的sam5基因片段和步骤(3)中得到的pACYCDuet-sam8质粒分别利用NEB的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。将酶切后的sam5基因片段和pACYCDuet-sam8质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。
(5)将步骤(4)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-sam8质粒用连接酶进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；用T4DNA连接酶(购买自New England Biolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5。
(6)合成咖啡酸甲基转移酶基因(comt)片段：
用软件JCat，根据大肠杆菌的密码子偏好性将拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的咖啡酸甲基转移酶comt基因进行密码子优化，并在前端加上T7启动子和SacI酶切位点，末端加上NotI酶切位点。用软件DNAWorks设计引物，用重组PCR的方法进行基因合成，并用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit对DNA片段进行切胶回收。
(7)将步骤(6)中得到的comt基因片段和步骤(5)中得到的pACYCDuet-sam8-sam5质粒分别利用NEB的限制性内切酶SacI和NotI进行双酶切。
(8)将步骤(7)中酶切后的comt基因片段和pACYCDuet-sam8-sam5质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收，用T4DNA连接酶(购买自New England Biolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt。
(9)利用PCR技术，以链霉菌(Streptomyces sp.)V-1(保藏号为CCTCC M 2015077)基因组为模板，扩增得到命名为fcs的阿魏酰辅酶A合酶基因和命名为ech的烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因(基因序列见序列表)；
PCR引物：fcs基因上游引物fcs-F：5′-catggaattccatatgcgcaaccagggtctgggc-3′，下游引物fcs-R：5′-catgctcgagtcagccgaagcggcggcggacctcgcc-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是NdeI和XhoI的酶切位点。ech基因上游引物ech-F：5′-catgccatgggcatgagcacagcggtcggcaacggg-3′，下游引物ech-R：5′-catgaagcttctacttctccgggtcgaaggcgctcag-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是NcoI和HindIII的酶切位点。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。
(10)将含有pETDuet-1质粒的大肠杆菌Trans1-T1按照1％接种量，接种至5mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒。
利用内切酶分别对步骤(9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为NcoI和HindIII；将酶切后的ech基因片段和pETDuet-1质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行切胶回收。
(11)将步骤(10)中回收的ech基因片段和质粒用T4DNA连接酶(购买自NewEngland Biolabs公司)进行连接，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pETDuet-ech。
(12)将步骤(9)中得到的fcs基因片段和步骤(11)中得到的pETDuet-ech质粒分别利用NEB的限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切。将酶切后的fcs基因片段和pETDuet-ech质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行回收。
(13)将步骤(12)中回收的fcs基因片段和质粒用T4DNA连接酶(购买自NewEngland Biolabs公司)进行连接，反应时间为10h，获得连接后的重组质粒pETDuet-fcs-ech。
(14)将5μL步骤(8)中得到的重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt和5μL步骤(13)中得到重组质粒pETDuet-fcs-ech通过热激的方法转化入酪氨酸高产菌株K12(pCOLADuet-tyrAfbr-aroGfbr-tktA-ppsA)感受态细胞中。将热激后的菌液涂布到含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养12小时。在平板上挑取单菌落至5mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中，30℃摇床中培养，摇床转速为200转/分钟；将培养后的菌液进行PCR扩增验证，获得代谢工程大肠杆菌E-GV。
(15)代谢工程大肠杆菌E-GV的保存：将步骤(14)获得的代谢工程大肠杆菌E-GV接种于含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，置于30℃摇床中振荡培养过夜，摇床转速为200转/分钟；在无菌操作下，取过夜培养物1mL加入到灭菌的1.5mL离心管中，5000转/分钟离心3min。丢弃上清，用灭菌的15％甘油溶液将菌体沉淀重悬，制备成为甘油保藏管，于-20℃冰箱中可保存半年至一年。每隔半年，取出甘油保藏管中保存的代谢工程大肠杆菌E-GV进行活化，并重新保存甘油保藏管。
实施例2
利用实施例1制得的代谢工程大肠杆菌E-GV转化酪氨酸生产香兰素
本实施例中所用的菌株为代谢工程大肠杆菌E-GV(保藏编号为CCTCC M2015077)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
本实施例使用大肠杆菌E-GV生产香兰素的步骤如下：
(1)斜面培养：将代谢工程大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)，37℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株E-GV，用接种环接种到5mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入0.2mM IPTG和初始浓度为2g/L的酪氨酸，26℃诱导培养48小时，得到含香兰素的转化液；
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的香兰素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，鉴定结果如图2所示，确定所得样品为香兰素。用HPLC检测，图1为转化培养中香兰素浓度随时间的变化图，香兰素的最高产量为97.2mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟，95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为5.5分钟。
实施例3
利用代谢工程大肠杆菌E-GV转化葡萄糖生产香兰素
本实施例中所用的菌株为代谢工程大肠杆菌E-GV(保藏编号为CCTCC M2015077)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
改良M9培养基：1g/L NH4Cl,6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,2mmolMgSO4·7H2O,0.1mmol CaCl2·2H2O,0.03mg/L H3BO3,1mg/L thiamine,0.94mg/L ZnCl2,0.5mg/L CoCl2,0.38mg/L CuCl2,1.6mg/L MnCl2,3.6mg/L FeCl2和0.5g/L酵母膏。
本实施例使用代谢工程大肠杆菌E-GV生产香兰素的步骤如下：
(1)斜面培养：将代谢工程大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)，37℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株E-GV，用接种环接种到5mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL改良M9培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入0.2mM IPTG和初始浓度为10g/L的葡萄糖，26℃诱导培养72小时，得到含香兰素的转化液；
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的香兰素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，确定所得样品为香兰素。用HPLC检测，图3为转化培养中香兰素浓度随时间的变化图，香兰素的最高产量为19.3mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为5.5分钟。
实施例4
利用代谢工程大肠杆菌E-GV转化木糖生产香兰素
本实施例中所用的菌株为代谢工程大肠杆菌E-GV(保藏编号为CCTCC M2015077)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
改良M9培养基：1g/L NH4Cl,6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,2mmolMgSO4·7H2O,0.1mmol CaCl2·2H2O,0.03mg/L H3BO3,1mg/L thiamine,0.94mg/L ZnCl2,0.5mg/L CoCl2,0.38mg/L CuCl2,1.6mg/L MnCl2,3.6mg/L FeCl2和0.5g/L酵母膏。
本实施例使用代谢工程大肠杆菌E-GV生产香兰素的步骤如下：
(1)斜面培养：将大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)，37℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株E-GV，用接种环接种到5mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL改良M9培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入0.2mM IPTG和初始浓度为10g/L的木糖，26℃诱导培养72小时，得到含香兰素的转化液；
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的香兰素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，确定所得样品为香兰素。用HPLC检测，香兰素的最高产量为13.3mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为5.5分钟。
实施例5
利用代谢工程大肠杆菌E-GV转化甘油生产香兰素
本实施例中所用的菌株为代谢工程大肠杆菌E-GV(保藏编号为CCTCC M2015077)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH 7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
改良M9培养基：1g/L NH4Cl,6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,2mmolMgSO4·7H2O,0.1mmol CaCl2·2H2O,0.03mg/L H3BO3,1mg/L thiamine,0.94mg/L ZnCl2,0.5mg/L CoCl2,0.38mg/L CuCl2,1.6mg/L MnCl2,3.6mg/L FeCl2和0.5g/L酵母膏。
本实施例使用代谢工程大肠杆菌E-GV生产香兰素的步骤如下：
(1)斜面培养：将大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)，37℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株E-GV，用接种环接种到5mL LB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中进行菌株活化，37℃过夜培养，制得种子；
(3)转化培养：按照1％(体积比)接种量将步骤(2)中得到的种子接种到50mL改良M9培养基(含有100μg/mL卡那霉素、20μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素)中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入0.2mM IPTG和初始浓度为10g/L的甘油，26℃诱导培养72小时，得到含香兰素的转化液；
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，5000转/分钟离心15分钟后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素；
(5)样品检测：将步骤(4)制得的香兰素粉末，用LC-ESI-MS鉴定样品结构，确定所得样品为香兰素。用HPLC检测，香兰素的最高产量为24.7mg/l；
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm)，流动相A为水(含1％三氟乙酸)，流动相B为乙腈(含1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱程序为：0分钟，95％流动相A+5％流动相B；8分钟，20％流动相A+80％流动相B；10分钟，80％流动相A+20％流动相B；11分钟,95％流动相A+5％流动相B。紫外检测器波长为310nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为5.5分钟。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种代谢工程大肠杆菌E-GV，保藏编号为CCTCC M 2015077，保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.一种利用权利要求1的代谢工程大肠杆菌生产香兰素的方法，其特征在于分别以酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖为底物，以代谢工程大肠杆菌E-GV菌株为生物催化剂，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将保藏编号为CCTCC M 2015077的代谢工程大肠杆菌E-GV接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB固体培养基斜面上，37℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养菌株E-GV，接种到含有卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，制得种子；
(3)转化培养：将步骤(2)中得到的种子接种到同时含有卡那霉素、氯霉素、氨苄霉素和底物的LB或改良M9液体培养基中，37℃培养3-5小时至OD600达到0.5-0.6，加入IPTG和底物，26℃诱导培养48～72小时，得到含香兰素的转化液；
其中：上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L,pH 7.0；
上述步骤(3)中所述的改良M9培养基配方是：1g/L NH4Cl,6g/L Na2HPO4,3g/L KH2PO4,0.5g/L NaCl,2mmol MgSO4·7H2O,0.1mmol CaCl2·2H2O,0.03mg/L H3BO3,1mg/Lthiamine,0.94mg/L ZnCl2,0.5mg/L CoCl2,0.38mg/L CuCl2,1.6mg/L MnCl2,3.6mg/LFeCl2和0.5g/L酵母膏；
(4)香兰素的提取：将步骤(3)中制得的转化液用盐酸调节pH至2以下，加入等体积乙酸丁酯，混匀后室温静置1.5-2.5小时，离心后将上层液体进行旋转蒸发，得到的粉末即为香兰素。
3.根据权利要求2所述的生产香兰素的方法，其特征在于所述步骤(3)中在LB培养基中加入底物酪氨酸的初始浓度为2g/L，反应时间为48小时。
4.根据权利要求2所述的生产香兰素的方法，其特征在于所述步骤(3)中在改良M9培养基中加入底物葡萄糖、甘油或木糖的初始浓度为10g/L，反应时间为72小时。
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