CN106947727B

CN106947727B - 一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法

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Publication number: CN106947727B
Application number: CN201710098063.9A
Authority: CN
Inventors: 吴艳; 王元彩; 李斌
Original assignee: Boton Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Boton Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: CN106947727A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本发明所述基因工程菌对3‑脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶编码基因，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3‑脱氢莽草酸，并增强了3‑脱氢莽草酸脱水酶基因、O‑甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3‑脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，从而增加香兰素的产量，同时减少香兰素的降解，使发酵液中香兰素的量增多，进而提高菌株发酵产香兰素的能力。实验表明，本发明所述基因工程菌利用葡萄糖或甘油为底物生产香兰素，香兰素产量明显提高。而且采用本发明的方法发酵产生的香兰素发酵液中无异香兰素杂质，便于后续分离。

Description

一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法，尤其是一种生产香兰素的基因工程菌及其构建方法与利用该菌株以葡萄糖、甘油等廉价碳源生产香兰素的方法。

背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，为白色或微黄色结晶，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成分。香兰素是目前世界上产量最大的合成香料。香兰素的合成方法主要有化学合成法和微生物转化法。其中化学合成法产率高，成本低，但存在着原料愈创木酚等有毒、环境污染较严重，产品不具备天然性等问题。

近年来，随着生物学，尤其是合成生物学的迅速发展，微生物法制备香料因反应条件温和，能保持食品的天然性而越来越受关注。利用微生物转化法生产天然香兰素方面的研究已取得了很多重要的研究成果，但仍存在许多科学问题需要深入的探索研究，而且高效益的工业化生产也亟待进一步的优化。现有的研究中，多以阿魏酸、丁香酚、异丁香酚等原料为底物，通过生物催化或生物转化法生产香兰素。然而这些原料存在成本高、来源复杂及毒性等不足之处。使用如葡萄糖等廉价的天然原料，开发合成天然香兰素的新途径，达到工业化生产需要的高产量，是现阶段生物法制备香兰素研究领域的瓶颈，亟待突破性的创新研究。

1998年Li等利用重组大肠杆菌以葡萄糖为底物经莽草酸途径生产香草酸，在体外由粗糙脉孢菌产生的芳香酸还原酶催化下，生产微量的香兰素，但该方法步骤繁琐。2009年Hansen等通过代谢工程方法改造粟酒裂殖酵母及酿酒酵母，改造后的菌株分别可以以葡萄糖为底物，可产生65mg/L及45mg/L香兰素，然而该方法一方面产生了异香兰素这一难以分离的副产物，另一方面由于酵母对香兰素降解能力较强及香兰素对菌体的毒性，需要将香兰素进一步衍生为葡糖苷-香兰素，不利于后续的应用。2015年，许平等利用代谢工程方法改造大肠杆菌，构建的菌株以酪氨酸为底物生产97.2mg/L香兰素，以葡萄糖、木糖和甘油等底物分别产生19.3mg/L、13.3mg/L和24.7mg/L香兰素，但该路径引入的外源基因较多，路线较长，效率有待提高。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术的缺陷，提供一种基因工程菌，所述菌株能够以葡萄糖、甘油等廉价底物发酵生产香兰素，可以获得香兰素的有效积累。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种基因工程菌，其中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被突变，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与香兰素代谢相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因表达被增强，并且/或者一个或多个与香兰素生产途径相关的基因表达被增强。

优选地，所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr、aroG^fbr或trpE^fbr中至少一个。所述突变基因aroF^fbr、aroG^fbr、trpE^fbr具有代谢终产物抗反馈抑制的特性。

更优选地，所述aroF^fbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸。

优选地，所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE。

优选地，所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK或yjgB中至少一个。

优选地，所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr和/或aroB。

优选地，所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ，O-甲基转移酶基因comt或香草酸还原酶基因car中至少一个。

其中，优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶来源于芽孢杆菌属(蜡状芽孢杆菌或苏云金杆菌)。更优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶基因与SEQ ID NO.1的核酸序列杂交，并且编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的蛋白质，其中所述3-脱氢莽草酸脱水酶来源于蜡状芽孢杆菌。

优选地，所述O-甲基转移酶来源于番茄、人、中国对虾、黄色黏球菌、甜椒或罗勒。更优选地，所述O-甲基转移酶基因与SEQ ID NO.3的核酸序列杂交，并且编码具有O-甲基转移酶活性的蛋白质，其中所述O-甲基转移酶来源于番茄。

优选地，所述香草酸还原酶来源于艾阿华诺卡氏菌或粗糙脉孢菌。更优选地，所述香草酸还原酶基因与SEQ ID NO.9的核酸序列杂交，并且编码具有香草酸还原酶活性的蛋白质，其中所述香草酸还原酶来源于艾阿华诺卡氏菌。

在一个实施方案中，所述的基因工程菌中被突变、被敲除或灭活、被增强的基因是组合表达在合适拷贝的表达载体上或整合在基因组上。

在一个优选实施方案中，所述的基因工程菌中所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr的148位脯氨酸突变成亮氨酸；所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE；所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB；所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr和aroB；所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为aroZ、comt和car。

在某一具体实施例中，所述的基因工程菌命名为CFFSH003，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016770。

本发明提供了一种重组载体，在pRSFDuet-1载体的多克隆位点插入3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ和O-甲基转移酶基因comt，该载体命名为pRSFDuet-aroZ-comt。优选的，所述3-脱氢莽草酸脱水酶基因来源于蜡状芽孢杆菌，所述O-甲基转移酶基因comt来源于番茄。

本发明还提供了一种重组载体，在pETDuet-1载体的多克隆位点插入香草酸还原酶基因car，该载体命名为pETDuet-car。优选的，所述香草酸还原酶基因car来源于艾阿华诺卡氏菌。

本发明还提供了一种重组载体，在pACYCDuet-1载体的多克隆位点插入aroB和aroF^fbr基因，命名为pACYCDuet-aroB-aorF^fbr。其中所述aroF^fbr是经突变的。

优选地，所述aroF^fbr基因中148位脯氨酸突变成亮氨酸。

本发明还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

A、敲除或失活菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株Ⅰ；并且/或者

B、敲除或失活菌株中一个或多个与香兰素代谢相关的基因，获得工程菌株Ⅱ；并且/或者

C、突变菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株Ⅲ；

D、增强菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因的表达，获得重组载体i；

E、增强菌株中一个或多个与香兰素生产相关的基因的表达，获得重组载体ii；

F、将含有步骤D的重组载体i和步骤E的重组载体ii转入步骤A工程菌株Ⅰ、步骤B工程菌株Ⅱ或步骤C工程菌株Ⅲ。

优选地，所述步骤A中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE。

优选地，所述步骤B中与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK或yjgB中至少一个。更优选的，步骤B中与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB。

优选地，所述步骤C中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr、aroG^fbr或trpE^fbr中至少一个。更优选的，步骤C中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr，其中所述aroF^fbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸。

优选地，所述步骤D中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr和/或aroB。更优选地，所述步骤D中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr和aroB，其中所述aroF^fbr为148位脯氨酸突变成亮氨酸。

优选地，所述步骤E中与香兰素生产途径相关的基因为3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroZ，O-甲基转移酶基因comt或香草酸还原酶基因car中至少一个。更优选地，为aroZ、comt和car。

优选地，步骤D所述重组载体为pACYCDuet-aroB-aorF^fbr，步骤E所述重组载体为pRSFDuet-aroZ-comt和/或pETDuet-car。

本发明对大肠杆菌中3-脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶编码基因aroE，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3-脱氢莽草酸，并增强3-脱氢莽草酸脱水酶基因、O-甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3-脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，构建获得香兰素的生产菌株，可用于发酵法生产香兰素。本发明获得的基因工程菌能够以葡萄糖、甘油等廉价底物发酵生产香兰素，可以获得香兰素的有效积累。因此本发明提供了所述基因工程菌在生产香兰素中的应用。

本发明还提供了一种生产香兰素的方法，使用本发明所述基因工程菌作为发酵生产菌。

优选地，所述生产香兰素的方法，具体包括以下步骤：

(1)平板培养：将本发明所述基因工程菌接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB培养基固体平板上，37℃培养过夜；

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；

(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和IPTG的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液。

优选地，步骤(1)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL。

优选地，步骤(2)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL。

优选地，步骤(3)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL；IPTG的浓度为0.2mM。

优选地，步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。其中LB固体培养基另外添加2％琼脂。

优选地，步骤(3)中所述的发酵培养基为LB培养基、添加20g/L葡萄糖的LB培养基或WVP培养基。

其中，所述WVP培养基的配方为KH₂PO₄ 7.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.96g/L、MgSO₄ 0.24g/L、柠檬酸铵0.3g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、苯丙氨酸0.7g/L、酪氨酸0.7g/L、色氨酸0.7g/L、对氨基苯甲酸0.01g/L、2,3-二羟基苯甲酸0.01g/L、对羟基苯甲酸0.01g/L、(NH₄)₆(MO₇O₂₄)·4H₂O 0.0037g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0029g/L、H₃BO₃ 0.0247g/L、CuSO₄·5H₂O0.0025g/L、MnCl₂·4H₂O 0.0158g/L、葡萄糖或甘油20g/L。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本发明所述基因工程菌对大肠杆菌中3-脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶基因，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3-脱氢莽草酸，并增强了3-脱氢莽草酸脱水酶基因、O-甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3-脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，从而增加香兰素的产量，同时减少香兰素的降解，使发酵液中香兰素的量增多，进而提高菌株发酵产香兰素的能力。实验表明本发明所述基因工程菌可利用葡萄糖或甘油等廉价碳源为底物生产香兰素，经48小时发酵，以LB培养基、添加20g/L葡萄糖的LB培养基、添加20g/L葡萄糖的WVP培养基或添加20g/L甘油的WVP培养基，产生的香兰素最高产量分别为24.1mg/L，88.5mg/L，85.8mg/L，51.2mg/L。采用本发明的方法发酵产生的香兰素发酵液中无异香兰素杂质，便于后续分离，具有很好的应用前景。

生物保藏信息：

菌株大肠杆菌CFFSH003：分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2016年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2016770。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同基因敲除菌株对香兰素的降解情况测试。

具体实施方式

本发明公开了一种生产香兰素的代谢工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体培养基添加2％琼脂；在使用前进行高压蒸汽灭菌，121℃，20min。

实施例1：大肠杆菌BL21(DE3)中敲除莽草酸脱氢酶编码基因aroE

利用PCR Targeting技术，敲除大肠杆菌BL21(DE3)中莽草酸脱氢酶编码基因aroE，获得的菌株命名为WYV5。具体操作如下：

以BL21(DE3)菌株基因组为模板，分别利用引物对aroE_up_s、aroE_up_a和aroE_dw_s、aroE_dw_a扩增aroE基因上下游同源臂，同时以pKD3为模板，以引物对aroE-cm_s、aroE-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠PCR扩增获得aroE基因敲除片段aroE::cm，引物序列如下：

aroE_up_s：5′-AACGGAAGCCGTTTTCGGTG-3′；

aroE_up_a：5′-CATTATGTTACCCCTGTCGA-3′；

aroE-cm_s：5′-AATCCGCGATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；

aroE-cm_a：5′-ATTCTCGTCCCACTCTTCCCTGTCCGGAAACTGGATGGCCTGATTCACGCCATATGAATATCCTCCTTAG-3′；

aroE_dw_s：5′-GCGTGAATCAGGCCATCCAG-3′；

aroE_dw_a：5′-TCCACGGCTGCACCATTGGC-3′。

将pKD46质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆接种至LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mL LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL，L-阿拉伯糖10mM)，30℃，220rpm培养至A600 0.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μL10％甘油，加入10μL上述获得的aroE基因敲除片段aroE::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1mL无菌LB液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于LB固体平板(含氯霉素25μg/mL)。

长出的转化子以引物对aroE_up_s、cm_up_a进行菌落PCR鉴定。引物序列如下：

aroE_up_s：5′-AACGGAAGCCGTTTTCGGTG-3′；

cm_up_a：5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′。

能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换aroE基因，将其接种至LB培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pCP20，涂布LB平板(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗LB平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗LB平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pKD46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对aroE_up_s、aroE_dw_a进行PCR鉴定。引物序列如下：

aroE_up_s：5′-AACGGAAGCCGTTTTCGGTG-3′

aroE_dw_a：5′-TCCACGGCTGCACCATTGGC-3′

鉴定正确(PCR产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了aroE基因，命名为WYV5。

实施例2：可能的香兰素降解基因簇yqhC-yqhD-dkgA的敲除

利用PCR Targeting技术，对实施例1获得的菌株敲除可能的香兰素降解基因簇yqhC-yqhD-dkgA，获得的菌株命名为WYV18。具体操作如下：

以BL21(DE3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yqhC-dkgA_up_s、yqhC-dkgA_up_a和yqhC-dkgA_dw_s、yqhC-dkgA_dw_a扩增yqhC-yqhD-dkgA基因簇上下游同源臂，同时以pKD3为模板，以引物对yqhC-dkgA-cm_s、yqhC-dkgA-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠PCR扩增获得yqhC-yqhD-dkgA基因簇敲除片段yqhC-yqhD-dkgA::cm。引物序列如下：

yqhC-dkgA_up_s：5′-TTTTCTGCCTACGATTGC-3′；

yqhC-dkgA_up_a：5′-GGAAAATCGTCAGGCGTTAC-3′；

yqhC-dkgA-cm_s：5′-GTAACGCCTGACGATTTTCCCCGTTCCCGGTTGCTGTACCGGGAACGTATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；

yqhC-dkgA-cm_a：5′-TCTGAAAAGTCCGGTAGCGGAACATTACCGCCACCGGGAGAATTTGCATGCATATGAATATCCTCCTTAG-3′；

yqhC-dkgA_dw_s：5′-CATGCAAATTCTCCCGGTGG-3′；

yqhC-dkgA_dw_a：5′-TCAGTGTCTGCGTGGTCT-3′。

将pKD46质粒转化至实施例1得到的大肠杆菌WYV5，挑取单克隆接种至LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mL LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL，L-阿拉伯糖10mM)，30℃，220rpm培养至A600 0.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μL10％甘油，加入10μL上述获得的yqhC-yqhD-dkgA基因簇敲除片段yqhC-yqhD-dkgA::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1mL无菌LB液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于LB固体平板(含氯霉素25μg/mL)。长出的转化子以引物对yqhC-dkgA_up_s、cm_up_a进行菌落PCR鉴定，引物序列如下：

yqhC-dkgA_up_s：5′-TTTTCTGCCTACGATTGC-3′；

cm_up_a：5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′。

能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yqhC-yqhD-dkgA基因簇，将其接种至LB培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pCP20，涂布LB平板(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗LB平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗LB平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pKD46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yqhC-dkgA_up_s、yqhC-dkgA_dw_a进行PCR鉴定，引物序列如下：

yqhC-dkgA_up_s：5′-TTTTCTGCCTACGATTGC-3′；

yqhC-dkgA_dw_a：5′-TCAGTGTCTGCGTGGTCT-3′。

鉴定正确(PCR产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yqhC-yqhD-dkgA基因簇，命名为WYV18。

实施例3：可能的香兰素降解基因yahK的敲除

利用PCR Targeting技术，对实施例2获得的菌株WYV18敲除可能的香兰素降解基因yahK，获得的菌株命名为WYV39。具体操作如下：

以BL21(DE3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yahK_up_s、yahK_up_a和yahK_dw_s、yahK_dw_a扩增yahK基因上下游同源臂，同时以pKD3为模板，以引物对yahk-cm_s、yahK-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠PCR扩增获得yahK基因敲除片段yahK::cm，引物序列如下：

yahK_up_s：5′-AGATGAACTGGCGAACCGGA-3′；

yahK_up_a：5′-GAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACACCATTGTGTTTACTCCTGATTAGC-3′；

yahk-cm_s：5′-GCTAATCAGGAGTAAACACAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTC-3′；

yahK-cm_a：5′-TGTTAAACCACAGGGTATTTATTAATTTTTTCACATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTA-3′；

yahK_dw_s：5′-TAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGTGAAAAAATTAATAAATACCCTGTGGTTTAACA-3′；

yahK_dw_a：5′-ATCCATGCGCAAGCGCCTGC-3′；

将pKD46质粒转化至实施例2获得的菌株WYV18，挑取单克隆接种至LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mL LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL，L-阿拉伯糖10mM)，30℃，220rpm培养至A600 0.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μL10％甘油，加入10μL上述获得的yahK基因敲除片段yahK::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1mL无菌LB液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于LB固体平板(含氯霉素25μg/mL)。长出的转化子以引物对yahK_up_s、cm_up_a进行菌落PCR鉴定，引物序列如下：

yahK_up_s：5′-AGATGAACTGGCGAACCGGA-3′；

cm_up_a：5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′。

能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yahK基因的菌落，将其接种至LB培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pCP20，涂布LB平板(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗LB平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗LB平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pKD46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yahK_up_s、yahK_dw_a进行PCR鉴定，引物序列如下：

yahK_up_s：5′-AGATGAACTGGCGAACCGGA-3′；

yahK_dw_a：5′-ATCCATGCGCAAGCGCCTGC-3′。

鉴定正确(PCR产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yahK基因，命名为WYV39。

实施例4：可能的香兰素降解基因yjgB的敲除

利用PCR Targeting技术，对实施例3获得的菌株WYV39敲除可能的香兰素降解基因yjgB，获得的菌株命名为WYV55。具体操作如下：

以BL21(DE3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yjgB_up_s、yjgB_up_a和yjgB_dw_s、yjgB_dw_a扩增yjgB基因上下游同源臂，同时以pKD3为模板，以引物对yjgB-cm_s、yjgB-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠PCR扩增获得yjgB基因敲除片段yjgB::cm，引物序列如下：

yjgB_up_s：5′-ACTGGACCGAATAAAGATC-3′；

yjgB_up_a：5′-TGTTTGGGAAGTGTAGAGC-3′；

yjgB-cm_s：5′-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；

yjgB-cm_a：5′-TATGTGCGAAAGAGGGCAGCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCACATATGAATATCCTCCTTAG-3′；

yjgB_dw_s：5′-TGAAAATCATTCGCAGCGCT-3′；

yjgB_dw_a：5′-TTCTGATGAGTCGCTATGA-3′。

将pKD46质粒转化至实施例3获得的菌株WYV39，挑取单克隆接种至LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mL LB液体培养基(含氨苄霉素100μg/mL，L-阿拉伯糖10mM)，30℃，220rpm培养至A600 0.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μL10％甘油，加入10μL上述获得的yjgB基因敲除片段yjgB::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1mL无菌LB液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于LB固体平板(含氯霉素25μg/mL)。长出的转化子以引物对yjgB_up_s、cm_up_a进行菌落PCR鉴定，引物序列如下：

yjgB_up_s：5′-ACTGGACCGAATAAAGATC-3′；

cm_up_a：5′-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3′。

能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yjgB基因的菌落，将其接种至LB培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pCP20，涂布LB平板(含氨苄霉素100μg/mL)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗LB平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗LB平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pCP20、pKD46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yjgB_up_s、yjgB_dw_a进行PCR鉴定，引物序列如下：

yjgB_up_s：5′-ACTGGACCGAATAAAGATC-3′；

yjgB_dw_a：5′-TTCTGATGAGTCGCTATGA-3′。

鉴定正确(PCR产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yjgB基因，命名为WYV55。

实施例5：测试基因敲除菌株香兰素降解情况

分别将实施例1-4中获得的不同基因敲除菌株，与对照菌株BL21(DE3)接种至LB培养基，37℃培养至A600～1.0左右后，加入终浓度0.5g/L香兰素，37℃继续培养，24h取培养液，通过HPLC检测培养液中香兰素、香草酸、香草醇浓度。根据测定的浓度计算香兰素、香草酸、香草醇的相对百分百含量，见附图1。结果显示，组合敲除了aroE、yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB等基因的工程菌中WYV55香兰素降解程度最低。

实施例6：重组质粒pRSFDuet-aroZ-comt的构建

1.扩增或合成3-脱氢莽草酸脱水酶基因(aroZ)片段

利用PCR技术，以蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 10876)基因组为模板，以引物对aroZ_s(5′-CGCGGATCCGATGAAATATTCGCTATGTAC-3′)、aroZ_a(5′-CCCAAGCTTTTACGAAGTTACTACTTC-3′)，扩增得到片段为3-脱氢莽草酸脱水酶基因Bc-aroZ，基因序列如SEQ ID No:1所示。

将得到的PCR产物用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，获得3-脱氢莽草酸脱水酶编码基因片段Bc-aroZ。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将苏云金杆菌(Bacillus thuringiensisYBT-1518)中编码3-脱氢莽草酸脱水酶的基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上BamHI酶切位点，下游加上HindIII酶切位点，获得片段Bt-aroZ(基因序列如SEQ ID No:2所示)。

2.重组质粒pRSFDuet-aroZ的构建

利用内切酶分别对步骤1中得到的3-脱氢莽草酸脱水酶编码基因片段Bc-aroZ或Bt-aroZ和pRSFDuet-1质粒进行双酶切；双酶切使用的内切酶为BamHI和HindIII(ThermoScientific)；酶切产物以DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。

将双酶切后的aroZ基因片段和pRSFDuet-1质粒片段用T4DNA连接酶(Takara)进行连接，22℃连接2h，构建重组质粒pRSFDuet-aroZ。

3.合成O-甲基转移酶基因(Sl-comt)片段

根据大肠杆菌的密码子偏好性将番茄Solanum lycopersicum中命名为comt的O-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Sl-comt(基因序列如SEQ IDNo:3所示)。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将人Homo sapiens中命名为comt的O-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Hs-comt(基因序列如SEQID No:4所示)。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将中国对虾Fenneropenaeus chinensis中命名为comt的O-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Fc-comt(基因序列如SEQ ID No:5所示)。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将黄色黏球菌Myxococcus xanthus中命名为comt的O-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Mx-comt(基因序列如SEQID No:6所示)。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将甜椒Capsicum annuum中命名为comt的O-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Ca-comt(基因序列如SEQ ID No:7所示)。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将罗勒Ocimum basilicum中命名为comt的O-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上NdeI酶切位点，下游加上XhoI酶切位点，获得片段Ob-comt(基因序列如SEQ ID No:8所示)。

4.重组质粒pRSFDuet-aroZ-comt的构建

利用内切酶分别对步骤2中得到的pRSFDuet-aroZ质粒和步骤3中合成的Sl-comt、Hs-comt、Fc-comt、Mx-comt、Ca-comt或Ob-comt片段进行双酶切；双酶切使用的内切酶为NdeI和XhoI(Thermo Scientific)；酶切产物以DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。双酶切后的基因片段和质粒片段用T4DNA连接酶(Takara)进行连接，22℃连接2h，构建重组质粒pRSFDuet-aroZ-comt。

实施例7：重组质粒pETDuet-car的构建

利用PCR技术，以艾阿华诺卡氏菌(Nocardia iowensis DSM 45197)基因组为模板，以引物对car_s(5′-CGCGGATCCGATGGCAGTGGATTCACCGGA-3′)、car_a(5′-CCCAAGCTTTCAGAGCAGCTGAAGCAGTT-3′)扩增得到香草酸还原酶基因Ni-car的片段，(基因序列如SEQ ID No:9所示)；将得到的PCR产物用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，获得Ni-car片段。

根据大肠杆菌的密码子偏好性将粗糙脉胞菌Neurospora crassa中可能的香草酸还原酶编码基因Nc-car进行密码子优化后，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上BamHI酶切位点，下游加上HindIII酶切位点，获得片段Nc-car(基因序列如SEQ ID No:10所示)。利用内切酶分别对获得的的Ni-car或Nc-car基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切；双酶切使用的内切酶为BamHI和HindIII(ThermoScientific)；酶切产物以DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。

双酶切后的Ni-car或Nc-car基因片段和pETDuet-1质粒片段用T4DNA连接酶(Takara)进行连接，构建重组质粒pETDuet-car。

实施例8：重组质粒pACYCDuet-aroB-aroF^fbr的构建

1.扩增3-脱氢奎尼酸合成酶基因(aroB)片段

利用PCR技术，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以引物对aroB_s(5′-CGCGGATCCGATGGAGAGGATTGTCGTTAC-3′)、aroB_a(5′-ACGCGTCGACTTACGCTGATTGACAATCG-3′)扩增得到3-脱氢奎尼酸合成酶基因aroB，将得到的PCR产物用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。

2.重组质粒pACYCDuet-aroB的构建

利用内切酶BamHI和SalI(ThermoScientific)分别对回收的aroB基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切；双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒片段用T4DNA连接酶(Takara)进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-aroB；

3.3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(aroF)片段的扩增和突变

利用PCR技术，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以引物对aroF_s(5′-CGGGGTACCATGCAAAAAGACGCGCTGAA-3′)、aroF_a(5′-CCGCTCGAGTTAAGCCACGCGAGCCGTCA-3′)扩增得到3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF。将aroF片段连接至pTG19-T载体(上海捷瑞生物工程有限公司)，构建质粒T-aroF。利用PCR技术，以质粒T-aroF为模板，以引物对aroF_m_s(5′-CTGAATAGCCCGCAATACCTGGGCGATCTG-3′)、aroF_m_a(5′-CAGGTATTGCGGGCTATTCAGATCTAACGC-3′)扩增得到携带P148L定点突变的aroF基因片段aroF^fbr的质粒，以DpnI消化去除未突变模板后，转化大肠杆菌DH5α感受态，获得携带aroF^fbr基因片段的质粒T-aroF^fbr；

4.重组质粒pACYCDuet-aroB-aroF^fbr的构建

利用内切酶KpnI和XhoI(ThermoScientific)分别对步骤3中得到的T-aroF^fbr质粒和步骤2中得到的重组质粒pACYCDuet-aroB进行双酶切；双酶切后的aroF^fbr基因片段和pACYCDuet-aroB质粒片段用T4DNA连接酶(Takara)进行连接，构建重组质粒pACYCDuet-aroB-aroF^fbr。

实施例9：香兰素生产菌的构建

将实施例6得到的重组质粒pRSFDuet-aroZ-comt 5μL，实施例7得到的重组质粒pETDuet-car 5μL，以及实施例8得到的重组质粒pACYCDuet-aroB-aroF^fbr5μL通过化学转化法转化至实施例4得到的工程菌WYV55感受态，涂布于LB平板(含氨苄霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL、氯霉素25μg/mL)，经过筛选和验证后获得用于生产香兰素的代谢工程大肠杆菌，其中产量最高的菌种CFFSH003，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016770。

实施例10：工程菌CFFSH003以LB培养基发酵生产香兰素

(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌CFFSH003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL；

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL；

(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和IPTG的LB培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL；IPTG的浓度为0.2mM；

其中，上述步骤(1)～(3)中所述的LB培养基配方是：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体培养基添加2％琼脂；

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min 60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min 90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为24.1mg/L。

实施例11：工程菌CFFSH003以添加20g/L葡萄糖的LB培养基发酵生产香兰素

(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和IPTG的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/mL；卡那霉素的浓度为50μg/mL；氯霉素的浓度为25μg/mL；IPTG的浓度为0.2mM；

其中，上述步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方是：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体培养基添加2％琼脂；

上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖20g/L。

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min 60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min 90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为88.5mg/L。

实施例12：工程菌CFFSH003以添加20g/L甘油的LB培养基发酵生产香兰素

上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，甘油20g/L。

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min 60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min 90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为61.7mg/L。

实施例13：工程菌CFFSH003以葡萄糖为碳源发酵生产香兰素

其中，上述步骤(1)～(2)中所述的LB培养基配方是：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体培养基是在LB培养基配方中添加2％琼脂；

上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：KH₂PO₄ 7.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.96g/L，MgSO₄ 0.24g/L，柠檬酸铵0.3g/L，一水合柠檬酸2.1g/L，苯丙氨酸0.7g/L，酪氨酸0.7g/L，色氨酸0.7g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/L，对羟基苯甲酸0.01g/L，(NH₄)₆(MO₇O₂₄)·4H₂O 0.0037g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0029g/L，H₃BO₃ 0.0247g/L，CuSO₄·5H₂O0.0025g/L，MnCl₂·4H₂O 0.0158g/L，葡萄糖20g/L。

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min 60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min 90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为85.8mg/L。

实施例14：工程菌CFFSH003以甘油为碳源发酵生产香兰素

上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：KH₂PO₄ 7.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.96g/L，MgSO₄ 0.24g/L，柠檬酸铵0.3g/L，一水合柠檬酸2.1g/L，苯丙氨酸0.7g/L，酪氨酸0.7g/L，色氨酸0.7g/L，对氨基苯甲酸0.01g/L，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/L，对羟基苯甲酸0.01g/L，(NH₄)₆(MO₇O₂₄)·4H₂O 0.0037g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0029g/L，H₃BO₃ 0.0247g/L，CuSO₄·5H₂O0.0025g/L，MnCl₂·4H₂O 0.0158g/L，甘油20g/L。

(4)HPLC检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1mL，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(Agilent Technologies1290Infinity)进行香兰素浓度的测定。采用Agilent EclipsePlusC18RRHD(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相A为0.1％乙酸水溶液，流动相B为甲醇。流速为0.5mL/min，梯度洗脱程序为，0min 90％A+10％B，1.3min 90％A+10％B，1.7min，60％A+40％B，2.5min 60％A+40％B，2.8min 90％A+10％B，3.5min 90％A+10％B。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为51.2mg/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 波顿（上海）生物技术有限公司

<120> 一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法

<130> MP1623845

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 843

<212> DNA

<213> Bacillus cereus ATCC 10876

<400> 1

atgaaatatt cgctatgtac catttcattt cgtcatcaat taatttcatt tactgatatt 60

gttcaatttg catatgaaaa cggttttgaa ggaattgaat tgtgggggac tcatgcacaa 120

aatttgtata tacaagaacg cgaaacgaca gaacgagaat tgacttttct aaaggataaa 180

aacttagaaa ttacgatgat aagtgattac ttagatatat cattatcagc agattttgaa 240

aaaacgatag agaaaagtga acaacttgta gtactagcta attggtttaa tacgaataaa 300

attcgcacgt ttgctgggca aaaagggagc aaggacttct cggaacaaga gagaaaagag 360

tatgtgaagc gaatacgtaa gatttgtgat gtgtttgctc agcacaatat gtatgtgctg 420

ttagaaacac atcccaatac actaacggac acattgcctt ctactataga actattagaa 480

gaagtaaatc atccgaattt aaaaataaat cttgattttc ttcatatatg ggagtctggc 540

gcagatccaa tagacagttt ccatcgatta aagccgtgga cactacatta ccattttaag 600

aatatatctt cagcggatta tttgcatgtg tttgaaccta acaatgtata tgctgcagca 660

ggaagtcgta ttggtatggt tccgttattt gaaggtattg taaattatga tgagattatt 720

caggaagtga gaggtacgga tctttttgct tccttagaat ggtttggaca taattcaaaa 780

gagatattaa aagaagaaat gaaagtatta ataaatagaa aattagaagt agtaacttcg 840

taa 843

<210> 2

<211> 843

<212> DNA

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 2

atgaaatact ctctgtgcac catctctttc cgtcaccagc tgatctcttt caccgacatc 60

gttcagttcg cttacgaaaa cggtttcgaa ggtatcgaac tgtggggtac tcacgctcag 120

aacctgtaca tgcaggaacg tgaaaccacc gaacgtgaac tgaacttcct gaaagacaaa 180

aacctggaaa tcaccatgat ctctgactac ctggacatct ctctgtctgc tgacttcgaa 240

aaaaccatcg aaaaatctga acagctggtt gttctggcta actggttcaa caccaacaaa 300

atccgtacct tcgctggtca gaaaggttct aaagacttct ctgaacagga acgtaaagaa 360

tacgttaaac gtatccgtaa aatctgcgac gttttcgctc agcacaacat gtacgttctg 420

ctggaaaccc acccgaacac cctgaccgac accctgccgt ctaccatcga actgctggaa 480

gaagttaacc acccgaacct gaaaatcaac ctggacttcc tgcacatctg ggaatctggt 540

gctaacccga tcgactcttt ccaccgtctg aaaccgtgga ccctgcacta ccacttcaaa 600

aacatctctt ctgctgacta cctgcacgtt ttcgaaccga acaacgttta cgctgctgct 660

ggttctcgta tcggtatggt tccgctgttc gaaggtatcg ttaactacga cgaaatcatc 720

caggaagttc gtggtactga cctgttcgct tctctggaat ggttcggtca caactctaaa 780

gaaatcctga aagaagaaat gaaagttctg atcaaccgta aactggaagt tgttacctct 840

taa 843

<210> 3

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggttcta ccgctaacat ccagctggct acccagtctg aagacgaaga acgtaactgc 60

acctacgcta tgcagctgct gtcttcttct gttctgccgt tcgttctgca ctctaccatc 120

cagctggacg ttttcgacat cctggctaaa gacaaagctg ctaccaaact gtctgctctg 180

gaaatcgttt ctcacatgcc gaactgcaaa aacccggacg ctgctaccat gctggaccgt 240

atgctgtacg ttctggcttc ttactctctg ctggactgct ctgttgttga agaaggtaac 300

ggtgttaccg aacgtcgtta cggtctgtct cgtgttggta aattcttcgt tcgtgacgaa 360

gacggtgctt ctatgggtcc gctgctggct ctgctgcaag acaaagtttt catcaactct 420

tggttcgaac tgaaagacgc tgttctggaa ggtggtgttc cgttcgaccg tgttcacggt 480

gttcacgctt tcgaataccc gaaactggac ccgaaattca acgacgtttt caaccaggct 540

atgatcaacc acaccaccgt tgttatgaaa cgtatcctgg aaaactacaa aggtttcgaa 600

aacctgaaaa ccctggttga cgttggtggt ggtctgggtg ttaacctgaa aatgatcacc 660

tctaaatacc cgaccatcaa aggtaccaac ttcgacctgc cgcacgttgt tcagcacgct 720

ccgtcttacc caggtgttga ccacgttggt ggtgacatgt tcgaatctgt tccgcagggt 780

gacgctatct tcatgaaatg gatcttacac gactggtctg acggtcactg cctgaaactg 840

ctgaaaaact gccacaaagc tctgccggac aacggtaaag ttatcgttgt tgaagctaac 900

ctgccggtta aaccggacac cgacaccacc gttgttggtg tttctcagtg cgacctgatc 960

atgatggctc agaacccagg tggtaaagaa cgttctgaac aggaatttcg tgctctggct 1020

tctgaagctg gtttcaaagg tgttaacctg atctgctgcg tttgcaactt ctgggttatg 1080

gaattttaca aataa 1095

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggtgaca ccaaagaaca gcgtatcctg aaccacgttc tgcaacacgc tgaaccgggt 60

aacgctcagt ctgttctgga agctatcgac acctactgcg aacagaaaga atgggctatg 120

aacgttggtg acaaaaaagg taaaatcgtt gacgctgtta tccaggaaca ccagccgtct 180

gttctgctgg aactgggtgc ttactgcggt tactctgctg ttcgtatggc tcgtctgctg 240

tctccgggtg ctcgtctgat caccatcgaa atcaacccgg actgcgctgc tatcacccag 300

cgtatggttg acttcgctgg tgttaaagac aaagttaccc tggttgttgg tgcttctcag 360

gacatcatcc cgcagctgaa aaaaaaatac gacgttgaca ccctggacat ggttttcctg 420

gaccactgga aagaccgtta cctgccggac accctgctgc tggaagaatg cggtctgctg 480

cgtaaaggta ccgttctgct ggctgacaac gttatctgcc caggtgctcc ggacttcctg 540

gctcacgttc gtggttcttc ttgcttcgaa tgcacccact accagtcttt cctggaatac 600

cgtgaagttg ttgacggtct ggaaaaagct atctacaaag gtccgggttc tgaagctggt 660

ccgtaa 666

<210> 5

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtcttctc tgaaatctta cgacaacacc gacccgctgg ttcagtattg cgttaaccac 60

tctctgcgtc tgaccgacgt tcagaaacgt ctgaacgacg ctaccctgca acaccgtcgt 120

gctgctatgc tgggtgctcc ggaagttctg caactgaacg ctaacatcat gcaggctatc 180

ggtgctaaaa aagttctgga catcggtgtt ttcaccggtg cttcttctct gtctgctgct 240

ctggctctgc cgccgaacgg taaagtttac gctctggaca tctctgaaga atttaccaac 300

atcggtaaac cgtactggga agaagctggt gtttctaaca aaatctctct gcacatcgct 360

ccggctgctg aaaccctgca aaaattcatc gacgctggtg aagctggtac cttcgactac 420

gctttcatcg acgctgacaa agaatcttac gaccgttact acgaactgtg cctgatcctg 480

ctgcgtccgg gtggtgttat cgctttcgac aacaccctgt gggacggtgc tgttatcgac 540

ccgaccgacc agaaaccggg taccctggct atccgtaaaa tgaacgaaaa actgaaagac 600

gaccagcgta tcaacatctc tttcctgcgt atcggtgacg gtctgtctct gtgcttcaaa 660

aaataa 666

<210> 6

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgatccacc acgttgaact gacccagtct gttctgcaat acatccgtga ctcttctgtt 60

cgtgacaacg acatcctgcg tgacctgcgt gaagaaacct ctaaactgcc gctgcgtacc 120

atgcagatcc cgccggaaca gggtcagctg ctgtctctgc tggttcgtct gatcggtgct 180

cgtaaaaccc tggaagttgg tgttttcacc ggttactcta ccctgtgcgc tgctctggct 240

ctgccggctg acggtcgtgt tatcgcttgc gacctgtctg aagaatgggt ttctatcgct 300

cgtcgttact ggcagcgtgc tggtgttgct gaccgtatcg aagttcgtct gggtgacgct 360

caccactctc tggaagctct ggttggttct gaacaccgtg gtaccttcga cctggctttc 420

atcgacgctg acaaagaatc ttacgacttc tactacgaac acgctctgcg tctggttcgt 480

ccgggtggtc tgatcatcct ggacaacacc ctgtggtctg gtaaagttgc tgacccgtct 540

gttgttggtg acccggaaac cgactctctg cgtcgtatca acgctaaact gctgaccgac 600

gaacgtgttg acctgtctat gctgccgatc gctgacggtc tgaccctggc tcgtaaacgt 660

taa 663

<210> 7

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgggttcta cctctaacat ccagctgccg acccagtctg aagaagaacg taactgcacc 60

tacgctatgc agctgctgtc ttcttctgtt ctgccgttcg ttctgcactc taccatccag 120

ctggacgttt tcgaaatcct ggctaaagac aaaaccacca aactgtctgc tctggaaatc 180

gtttctcaca tcccggactg caaaaacccg gacgctgcta ccatgctgga ccgtatgctg 240

tacgttctgg cttcttactc tctgctggac tgctctgtta tcgaagaaaa aaacggtgct 300

atgaaacgtg tttacggtct gtctggtgtt ggtaaattct tcgttcgtaa cgaagacggt 360

gcttctatgg gtccgctgct ggctctgctg caagacaaag ttttcatcca ctcttggttc 420

gaactgaaag acgctgttct ggaaggtgct gttccgttcg accgtgttca cggtgttcac 480

gctttcgaat acccgaaact ggacccgaaa ttcaacgacg ttttcaacaa agctatgatc 540

aaccacacca ccatcatcat gaaacgtatc ctggaaaact acaaaggttt cgaatctctg 600

aaatctctgg ttgacgttgg tggtggtctg ggtgttaacc tgaaaatgat cacctctaaa 660

tacccgacca tcaaaggtat caacttcgac ctgccgcacg ttgttcagca cgctccgtct 720

tacccaggtg ttgaaaacgt tggtggtgac atgttcgaat ctgttccgga aggtgacgct 780

atcttcatga aatggatctt acacgactgg tctgactctc actgcctgaa actgctgaaa 840

aactgctaca aagctctgcc ggacaacggt aaagttatcg ttgttgaagc taacctgccg 900

gttcagccgg acaccgacac caccgttgtt ggtgtttctc agtgcgacct gatcatgatg 960

gctcagaacc caggtggtaa agaacgttct gaacaggaat ttcgtgctct ggctaccgaa 1020

gctggtttca aaggtgttaa cctgatctgc tgcgtttgca acttctgggt tatggaattt 1080

cacaaataa 1089

<210> 8

<211> 1086

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgggttcag caactaatac accacaaatt aattcagatg aagaagaaaa cttcttattt 60

gcaatgcaat tggcatctgc ttcagttttg ccaatggttt tgaaatctgc tattgaattg 120

gacttgttag aattaattaa aaaatcaggt gcaggtgcat ttgtttctcc agttgatctg 180

gctgcacaat tgccaactac taatccagat gctcatgtta tgttagatag gattttgaga 240

ttattaactt cttatgctat tttggaatgt agattgaaaa ctttacctga tggtggtgtt 300

gaaaggttgt atggtttagc tccagtttgt aaatttttga ctaaaaacga agatggtgtt 360

tctatggctc cattaactct catgaatcaa gataaagttc tgatggaatc ttggtatcat 420

ttgtcagatg cagttgttga tggtggtatt cccttcaata aggcctatgg tatgactgct 480

tttgaatatc atggtactga tcctaggttt aacaaggttt ttaatcaagg tatgtcaaat 540

cattctacta ttacgatgaa gaagatatta gaaacatata caggttttga tggtttgaaa 600

acagttgttg atgttggtgg tggtacaggt gcaacattga atatgattgt ttctaaatat 660

ccatctatta aaggtattaa ttttgatttg ccacatgtta ttgaagatgc accttcttat 720

cctggtgttg aacatgttgg tggtgacatg tttgtttcag ttcctaaggg agatgctatt 780

tttatgaagt ggatttgtca tgattggtct gatgaacatt gtgttaaatt tttgaaaaat 840

tgttatgatg ctttgcctca aaatggtaaa gttattttgg cagaatgtgt tttaccagaa 900

gcacctgata caggtttggc tactaaaaat gttgttcata ttgatgttat tatgttagct 960

cataatcctg gtggtaaaga aaggacagaa aaagaatttc aaggtttagc taaagcagca 1020

ggttttaaac aattcaacaa agcgtgttgt gcatataata cttggattat ggaattattg 1080

aaataa 1086

<210> 9

<211> 3525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggcagtgg attcaccgga tgagcggcta cagcgccgca ttgcacagtt gtttgcagaa 60

gatgagcagg tcaaggccgc acgtccgctc gaagcggtga gcgcggcggt gagcgcgccc 120

ggtatgcggc tggcgcagat cgccgccact gttatggcgg gttacgccga ccgcccggcc 180

gccgggcagc gtgcgttcga actgaacacc gacgacgcga cgggccgcac ctcgctgcgg 240

ttacttcccc gattcgagac catcacctat cgcgaactgt ggcagcgagt cggcgaggtt 300

gccgcggcct ggcatcatga tcccgagaac cccttgcgcg caggtgattt cgtcgccctg 360

ctcggcttca ccagcatcga ctacgccacc ctcgacctgg ccgatatcca cctcggcgcg 420

gttaccgtgc cgttgcaggc cagcgcggcg gtgtcccagc tgatcgctat cctcaccgag 480

acttcgccgc ggctgctcgc ctcgaccccg gagcacctcg atgcggcggt cgagtgccta 540

ctcgcgggca ccacaccgga acgactggtg gtcttcgact accaccccga ggacgacgac 600

cagcgtgcgg ccttcgaatc cgcccgccgc cgccttgccg acgcgggcag cttggtgatc 660

gtcgaaacgc tcgatgccgt gcgtgcccgg ggccgcgact taccggccgc gccactgttc 720

gttcccgaca ccgacgacga cccgctggcc ctgctgatct acacctccgg cagcaccgga 780

acgccgaagg gcgcgatgta caccaatcgg ttggccgcca cgatgtggca ggggaactcg 840

atgctgcagg ggaactcgca acgggtcggg atcaatctca actacatgcc gatgagccac 900

atcgccggtc gcatatcgct gttcggcgtg ctcgctcgcg gtggcaccgc atacttcgcg 960

gccaagagcg acatgtcgac actgttcgaa gacatcggct tggtacgtcc caccgagatc 1020

ttcttcgtcc cgcgcgtgtg cgacatggtc ttccagcgct atcagagcga gctggaccgg 1080

cgctcggtgg cgggcgccga cctggacacg ctcgatcggg aagtgaaagc cgacctccgg 1140

cagaactacc tcggtgggcg cttcctggtg gcggtcgtcg gcagcgcgcc gctggccgcg 1200

gagatgaaga cgttcatgga gtccgtcctc gatctgccac tgcacgacgg gtacgggtcg 1260

accgaggcgg gcgcaagcgt gctgctcgac aaccagatcc agcggccgcc ggtgctcgat 1320

tacaagctcg tcgacgtgcc cgaactgggt tacttccgca ccgaccggcc gcatccgcgc 1380

ggtgagctgt tgttgaaggc ggagaccacg attccgggct actacaagcg gcccgaggtc 1440

accgcggaga tcttcgacga ggacggcttc tacaagaccg gcgatatcgt ggccgagctc 1500

gagcacgatc ggctggtcta tgtcgaccgt cgcaacaatg tgctcaaact gtcgcagggc 1560

gagttcgtga ccgtcgccca tctcgaggcc gtgttcgcca gcagcccgct gatccggcag 1620

atcttcatct acggcagcag cgaacgttcc tatctgctcg cggtgatcgt ccccaccgac 1680

gacgcgctgc gcggccgcga caccgccacc ttgaaatcgg cactggccga atcgattcag 1740

cgcatcgcca aggacgcgaa cctgcagccc tacgagattc cgcgcgattt cctgatcgag 1800

accgagccgt tcaccatcgc caacggactg ctctccggca tcgcgaagct gctgcgcccc 1860

aatctgaagg aacgctacgg cgctcagctg gagcagatgt acaccgatct cgcgacaggc 1920

caggccgatg agctgctcgc cctgcgccgc gaagccgccg acctgccggt gctcgaaacc 1980

gtcagccggg cagcgaaagc gatgctcggc gtcgcctccg ccgatatgcg tcccgacgcg 2040

cacttcaccg acctgggcgg cgattccctt tccgcgctgt cgttctcgaa cctgctgcac 2100

gagatcttcg gggtcgaggt gccggtgggt gtcgtcgtca gcccggcgaa cgagctgcgc 2160

gatctggcga attacattga ggcggaacgc aactcgggcg cgaagcgtcc caccttcacc 2220

tcggtgcacg gcggcggttc cgagatccgc gccgccgatc tgaccctcga caagttcatc 2280

gatgcccgca ccctggccgc cgccgacagc attccgcacg cgccggtgcc agcgcagacg 2340

gtgctgctga ccggcgcgaa cggctacctc ggccggttcc tgtgcctgga atggctggag 2400

cggctggaca agacgggtgg cacgctgatc tgcgtcgtgc gcggtagtga cgcggccgcg 2460

gcccgtaaac ggctggactc ggcgttcgac agcggcgatc ccggcctgct cgagcactac 2520

cagcaactgg ccgcacggac cctggaagtc ctcgccggtg atatcggcga cccgaatctc 2580

ggtctggacg acgcgacttg gcagcggttg gccgaaaccg tcgacctgat cgtccatccc 2640

gccgcgttgg tcaaccacgt ccttccctac acccagctgt tcggccccaa tgtcgtcggc 2700

accgccgaaa tcgtccggtt ggcgatcacg gcgcggcgca agccggtcac ctacctgtcg 2760

accgtcggag tggccgacca ggtcgacccg gcggagtatc aggaggacag cgacgtccgc 2820

gagatgagcg cggtgcgcgt cgtgcgcgag agttacgcca acggctacgg caacagcaag 2880

tgggcggggg aggtcctgct gcgcgaagca cacgatctgt gtggcttgcc ggtcgcggtg 2940

ttccgttcgg acatgatcct ggcgcacagc cggtacgcgg gtcagctcaa cgtccaggac 3000

gtgttcaccc ggctgatcct cagcctggtc gccaccggca tcgcgccgta ctcgttctac 3060

cgaaccgacg cggacggcaa ccggcagcgg gcccactatg acggcttgcc ggcggacttc 3120

acggcggcgg cgatcaccgc gctcggcatc caagccaccg aaggcttccg gacctacgac 3180

gtgctcaatc cgtacgacga tggcatctcc ctcgatgaat tcgtcgactg gctcgtcgaa 3240

tccggccacc cgatccagcg catcaccgac tacagcgact ggttccaccg tttcgagacg 3300

gcgatccgcg cgctgccgga aaagcaacgc caggcctcgg tgctgccgtt gctggacgcc 3360

taccgcaacc cctgcccggc ggtccgcggc gcgatactcc cggccaagga gttccaagcg 3420

gcggtgcaaa cagccaaaat cggtccggaa caggacatcc cgcatttgtc cgcgccactg 3480

atcgataagt acgtcagcga tctggaactg cttcagctgc tctga 3525

<210> 10

<211> 3159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgtctcagc agcagaaccc gccgtacggt cgtcgtctga tcctggacat catcaaagaa 60

cgtgctctga acgaaccgaa ccgtgaatgg gtttctgttc cgcgttcttc tgacccgaaa 120

gacggttgga aaatcctgac ctacctggac gcttacaacg gtatcaaccg tgttgctcac 180

aaactgaccc aggtttgcgg tgctgctgct ccgggttctt tcccgaccgt tgcttacatc 240

ggtccgaacg acgttcgtta cctggttttc gctctgggtg ctgttaaagc tggttacaaa 300

gctctgttca tctctacccg taactctgct gaagctcagg ttaacctgtt cgaactgacc 360

aactgcaacg ttctggtttt cgaccagtct tacaaagcta ccgttcagcc gtggctgcac 420

gaacgtgaaa tgaccgctat cctggctctg ccggctgacg aatggttccc ggctgaccag 480

gaagacttcc cgtacaacaa aaccttcgaa gaagctgaat gggacccgct gatggttctg 540

cacacctctg gttctaccgg tttcccgaaa ccgatcgttg ctcgtcaggg tatgctggct 600

gttgctgacc agttccacaa cctgccgccg cgtgaagacg gtaaactgat gtggatcgtt 660

gaaatgtcta aacgtgctaa acgtctgatg cacccgatgc cgctgttcca cgctgctggt 720

atgtacatct ctatgctgat gatccactac tgggacaccc cgggtgctct gggtatcggt 780

gaacgtccgc tgtcttctga cctggttctg gactacatcg aatacgctga cgttgaaggt 840

atgatcctgc cgccggctat cctggaagaa ctgtctcgtg acgaaaaagc tatccagtct 900

ctgcaaaaac tgaacttcgt ttctttcggt ggtggtaacc tggctccgga agctggtgac 960

cgtctggttg aaaacaacgt taccctgtgc aacctgatct ctgctaccga atttaccccg 1020

ttcccgttct actggcagta cgaccagaaa ctgtggcgtt acttcaactt cgacaccgac 1080

ctgttcggta tcgactggcg tctgcacgac ggtgaatcta cctacgaaca ggttatcgtt 1140

cgtaaagaca aacacccggg tctgcaaggt ttcttctaca ccttcccgga ctcttctgaa 1200

tactctacca aagacctgta caaacgtcac ccgacccacg aagacttctg gatctaccag 1260

ggtcgtgctg acaacatcat cgttttctct aacggtgaaa aactgaaccc gatcaccatc 1320

gaagaaaccc tgcaaggtca cccgaaagtt atgggtgctg ttgttgttgg taccaaccgt 1380

ttccagccgg ctctgatcat cgaaccggtt gaacacccgg aaaccgaaga aggtcgtaaa 1440

gctctgctgg acgaaatctg gccgaccgtt gttcgtgtta acaaagaaac cgttgctcac 1500

ggtcagatcg gtcgtcagta catggctctg tctaccccgg gtaaaccgtt cctgcgtgct 1560

ggtaaaggta ccgttctgcg tccgggtacc atcaacatgt acaaagctga aatcgacaaa 1620

atctacgaag acgctgaaaa aggtgttgct accgacgaag ttccgaaact ggacctgtct 1680

tcttctgacg ctctgatcgt ttctatcgaa aaactgttcg aaacctctct gaacgctccg 1740

aaactggaag ctgacaccga cttcttcacc gctggtgttg actctatgca ggttatcacc 1800

gcttctcgtc tgatccgtgc tggtctggct gctgctggtg ttaacatcga agctagtgct 1860

ctggctaccc gtgttatcta cggtaacccg accccgaaac gtctggctga ctacctgctg 1920

tctatcgtta acaaagactc taaccagggt accctggaca acgaacacca cgttatggaa 1980

gctctggttg aaaaatacac ccgtgacctg ccgaccccga aacagaacaa accggctccg 2040

gctgacgaag gtcaggttgt tgttatcacc ggtaccaccg gtggtatcgg ttcttacctg 2100

atcgacatct gctcttcttc ttctcgtgtt tctaaaatca tctgcctgaa ccgttctgaa 2160

gacggtaaag ctcgtcagac cgcttcttct tctggtcgtg gtctgtctac cgacttctct 2220

aaatgcgaat tttaccacgc tgacatgtct cgtgctgacc tgggtctggg tccggaagtt 2280

tactctcgtc tgctgtctga agttgaccgt gttatccaca accagtggcc ggttaacttc 2340

aacatcgctg ttgaatcttt cgaaccgcac atccgtggtt gccgtaacct ggttgacttc 2400

tcttacaaag ctgacaaaaa cgttccgatc gttttcgttt cttctatcgg taccgttgac 2460

cgttggcacg acgaagaccg tatcgttccg gaagctagtc tggacgacct gtctctggct 2520

gctggtggtt acggtcagtc taaactggtt tcttctctga tcttcgacaa agctgctgaa 2580

gtttctggtg ttccgaccga agttgttcgt gttggtcagg ttgctggtcc gtcttctgaa 2640

aaaggttact ggaacaaaca ggaatggctg ccgtctatcg ttgcttcttc tgcttacctg 2700

ggtgttctgc cggactctct gggtcagatg accaccatcg actggacccc gatcgaagct 2760

atcgctaaac tgctgctgga agtttctggt gttatcgaca acgttccgct ggacaaaatc 2820

aacggttact tccacggtgt taacccggaa cgtacctctt ggtctgctct ggctccggct 2880

gttcaggaat actacggtga ccgtatccag aaaatcgttc cgctggacga atggctggaa 2940

gctctggaaa aatctcagga aaaagctgaa gacgttaccc gtaacccggg tatcaaactg 3000

atcgacacct accgtacctg gtctgaaggt tacaaaaaag gtaccaaatt cgttccgctg 3060

gacatgaccc gtaccaaaga atactctaaa accatgcgtg aaatgcacgc tgttaccccg 3120

gaactgatga aaaactggtg ccgtcagtgg aacttctaa 3159

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，所述菌株中一个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被突变，并且一个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且多个与香兰素代谢相关的基因被敲除或失活，并且多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因表达被增强，并且多个与香兰素生产途径相关的基因表达被增强；所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr的148位脯氨酸突变成亮氨酸；所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroE；所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB；所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroF^fbr和aroB；所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为aroZ、comt和car；所述基因工程菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016770。

2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、敲除或失活菌株中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因aroE，获得工程菌株Ⅰ；并且

B、敲除或失活菌株中与香兰素代谢相关的基因yqhC、yqhD、dkgA、yahK和yjgB，获得工程菌株Ⅱ；并且

C、突变菌株中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因aroF^fbr，获得工程菌株Ⅲ；所述aroF^fbr为148位脯氨酸突变成亮氨酸；

D、增强菌株中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因aroF^fbr和aroB的表达，获得重组载体ⅰ；

E、增强菌株中与香兰素生产相关的基因aroZ、comt和car的表达，获得重组载体ⅱ；

F、将步骤D的重组载体ⅰ和步骤E的重组载体ⅱ转入步骤C工程菌株Ⅲ。

3.权利要求1所述基因工程菌在生产香兰素中的应用。

4.一种生产香兰素的方法，其特征在于，使用权利要求1所述基因工程菌作为发酵生产菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）平板培养：将权利要求1或2所述基因工程菌接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB培养基固体平板上，37℃培养过夜；

（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；

（3）发酵培养：将步骤（2）中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和IPTG的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的发酵培养基为LB培养基、添加20g/L葡萄糖或20g/L甘油的LB培养基或WVP培养基；其中WVP培养基的配方为：KH₂PO₄7.5 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.96 g/L、MgSO₄ 0.24 g/L、柠檬酸铵 0.3 g/L、一水合柠檬酸 2.1 g/L、苯丙氨酸 0.7 g/L、酪氨酸 0.7 g/L、色氨酸 0.7 g/L、对氨基苯甲酸 0.01 g/L、2,3-二羟基苯甲酸0.01 g/L、对羟基苯甲酸0.01 g/L、(NH₄)₆ (MO₇O₂₄)·4H₂O 0.0037 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0029 g/L、H₃BO₃ 0.0247 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.0025 g/L、MnCl₂·4H₂O0.0158 g/L、葡萄糖或甘油20g/L。