CN112080453A - 一种合成d-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种合成D‑阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供一种能够利用D‑果糖合成D‑阿洛酮糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，具体是以枯草芽孢杆菌WB600为宿主菌，敲除了其基因组上的果糖激酶基因及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID的基因，得到枯草芽孢杆菌突变体，并进一步在宿主菌中游离表达来源于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶编码基因，获得重组枯草芽孢杆菌。本发明的基因工程菌实现了底物D‑果糖的充分利用，大大提高了生物合成D‑阿洛酮糖的产量，有利于D‑阿洛酮糖的工业化生产，具有广阔的应用前景。

Description

一种合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术和基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。可帮助制造商减少配方中的蔗糖，用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有潜在较大的应用价值。例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高血脂和动脉粥样硬化等疾病，D-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，进而有助于肺部药物给送。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质，2019年，FDA又宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此不需要在这两项类目中计算其添加量，无疑将帮助其在未来进一步扩张市场。

D-阿洛酮糖的制备方法主要有化学合成法和生物转化法，化学合成法主要是通过一些催化加氢、加成反应、Ferrier重排等反应来合成，但是这些化学合成方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、产率较低、副产物多和分离纯化困难等缺点。利用生物合成法生产D-阿洛酮糖，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，以D-果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。目前为止，已经筛选并鉴定了至少18种酮糖3-差向异构酶，它们对D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、L-核酮糖具有较高的底物特异性。

pKSV7温敏质粒无痕敲除技术是基于温敏型质粒而不是线性DNA的方法用于快速敲除枯草芽孢杆菌染色体上的目的基因。pKSV7该质粒的基因组中含有：1)仅一种正筛选标记的抗性基因，该抗性基因的启动子为双功能启动子；2)能在大肠杆菌中复制的复制子；3)能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子。该技术的原理是以出发菌枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板扩增得到待敲除基因的上下游同源臂，将上下游同源臂连接后，通过酶切位点的方式连接到pKSV7温敏质粒上构建同源重组载体；然后将重组载体导入WB600中，通过筛选得到带有抗性标记的重组菌，改变培养温度，筛选无抗性标记的重组菌。得到目的基因缺失的重组菌，并在DNA水平进行鉴定。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为枯草杆菌的一个属，是非致病菌且不含内毒素以及致热致敏蛋白，被FDA和中国农业农村部等部门批准为食品级安全菌株。枯草芽孢杆菌发酵技术历史悠久且研究充分，其表达系统没有明显密码子偏好性，具有很强的蛋白分泌功能，细胞壁组成简单，严格好氧性生长，培养条件简单且生长迅速，遗传背景研究比较清楚，并且具有良好的发酵基础。

专利申请(CN 108251468 A)公开了一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺，包括由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法、由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺和由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺。该生物法生产D-阿洛酮糖的工艺旨在重组细胞中表达3-差向异构酶；通过使用所表达的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖。本发明的生物法生产D-阿洛酮糖的工艺选用的3-差向异构酶具有活性高、耐高温、稳定性好的优点，根据该发明的生产D-阿洛酮糖的工艺可由D-果糖或廉价的原料如蔗糖或D-葡萄糖大规模且连续地制备D-阿洛酮糖。

专利申请(CN 111206009 A)利用食品级菌株枯草芽孢杆菌WB800为宿主菌，通过基因重组高效表达D-塔格糖3-差向异构酶，形成直接利用D-果糖产D-阿洛酮糖的细胞工厂。筛选获得的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌，经发酵工艺优化，D-阿洛酮糖产量达到4.56g/L，底物转化率56.26％，D-阿洛酮糖生产效率0.19g/L/h。

申请人所在实验室通过构建中华根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)来源的D-塔格糖3差向异构酶的重组大肠杆菌表达菌株，利用其进行全细胞催化D-果糖，采用分批补料式培养方式，使得D-果糖的转化率达到了42.5％，同时在此转化过程中476g/L的D-阿洛酮糖被生成，与其他来源相比，这是对D-果糖最大的转化率(参考文献：Zhu Z,Li C,Liu X,etal.Biochemical characterization and biocatalytic application of a novel D-tagatose 3-epimerase from Sinorhizobium sp.[J].RSC Advances,2019,20(9):2919-2927)。

目前生物合成制备D-阿洛酮糖大多数都聚焦于酶法转化，而酶的纯化程序复杂繁琐且大大的提高了D-阿洛酮糖的生产成本。应用基因工程菌发酵生产的研究相对较少，但是更有助于产业化生产D-阿洛酮糖。利用基因工程菌株发酵法生产D-阿洛酮糖可以有效降低D-阿洛酮糖的生产成本且具有以下优势：(1)有利于产物的积累；(2)实现底物的充分转化；(3)分离纯化相对简单甚至可以直接用作添加剂。枯草芽孢杆菌为非致病菌且不含内毒素以及致热致敏蛋白，被FDA和中国农业农村部等部门批准为食品级安全菌株，其作为生产D-阿洛酮糖的工程菌具有明显的优势。但是，枯草芽孢杆菌可以以D-果糖作为碳源满足自身生长，这也在一定程度上限制了其作为工程菌生产D-阿洛酮糖的能力。

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题，提供一种能够利用D-果糖合成D-阿洛酮糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。

本发明用以实现上述目的的技术方案概述如下：

以枯草芽孢杆菌WB600为宿主菌，敲除了其基因组上的果糖激酶基因及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID的基因，得到枯草芽孢杆菌突变体，并进一步在宿主菌中游离表达来源于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因，获得重组枯草芽孢杆菌。

进一步地是利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术对枯草芽孢杆菌基因组上的果糖激酶基因及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID进行基因敲除。

进一步地是利用质粒pMA5整合来源于球形节杆菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因，构建重组载体并转入宿主菌进行游离表达。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法：

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、枯草芽孢杆菌突变体的标识

采用“Δ”来表示枯草芽孢杆菌突变体中要敲除的基因。如ΔgmuE，表示要敲除的基因为gmuE。

在本发明中，小写斜体fruA表示PTS系统果糖特异性转运蛋白中的IIABC元件，小写斜体levG表示PTS系统果糖特异性转运蛋白中的IID元件，小写斜体gumE表示果糖激酶的编码基因。

3、敲除、敲入的各目标基因的NCBI记载的序列如下：

进一步详述本发明上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术敲除果糖激酶编码基因gmuE，获得枯草芽孢杆菌突变菌株WB600(ΔgmuE)；

2)以WB600(ΔgmuE)为出发菌株，利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术进一步敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID编码基因中的fruA、levG，获得枯草芽孢杆菌突变菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)；

3)以全基因合成的AgDAE-pET-28a质粒(苏州金唯智生物科技有限公司)为模板，PCR扩增D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因agdae，与质粒pMA5经相同双酶切后连接，构建重组质粒AgDAE-pMA5，转入枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)，即获得合成D-阿洛酮糖的重组基因工程菌WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5。

本发明的另一目的是提供利用上述基因工程菌全细胞生物催化D-果糖生产D-阿洛酮糖的用途。

在本发明一种实施方式中，所述基因工程菌接种于液体LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜，再按2％的接种量接种于液体LB培养基中，37℃振荡培养，组成型表达24-48h，离心、收集菌体，将菌体用0.8％的生理盐水清洗两次菌体，之后利用1×PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，重悬的菌液中添加500g/L果糖作为底物在60℃条件下进行催化生产D-阿洛酮糖。

本发明的有益效果：

1)本发明利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术对枯草芽孢杆菌WB600的果糖激酶、PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID进行基因敲除，得到阻断D-果糖代谢的突变体WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)，gmuE、fruA、levG三个基因全部敲除后，菌株已无法再利用D-果糖作为碳源进行生长，彻底阻断了D-的代谢途径，使其更好的作为底盘菌株生产D-阿洛酮糖。

2)本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、pKSV7温敏质粒无痕敲除技术，实现突变体不同方式的高效表达。

3)本发明选择了球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)来源的D-阿洛酮糖3差向异构酶基因，利用基因工程手段，克隆得到了D-阿洛酮糖3差向异构酶基因，应用到枯草芽孢杆菌中，本发明以敲除D-果糖分解代谢途径中的关键基因并且敲入了D-阿洛酮糖3差向异构酶基因的重组菌为生产菌株，利用本发明方法构建的生产D-阿洛酮糖的基因工程菌经发酵培养24-48h后，利用全细胞催化的方式催化D-果糖，使用高效液相色谱进行检测，枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5具备生产D-阿洛酮糖的能力，在60℃，D-阿洛酮糖的产量可达150g/L，是目前已报道的基因工程菌中合成D-阿洛酮糖能力较高的基因工程菌，有效地促进D-阿洛酮糖的合成。本发明的基因工程菌实现了底物D-果糖的充分利用，大大提高了生物合成D-阿洛酮糖的产量，有利于D-阿洛酮糖的工业化生产，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：菌株WB600、WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)的生长曲线比较。

图2：菌株WB600和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)利用D-果糖的能力比较。

图3：agdae基因的扩增结果。其中，M：DNA marker，1：PCR产物。

图4：D-阿洛酮糖和D-果糖的HPLC鉴定图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，实施方案中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建

1.1以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，敲除果糖激酶编码基因gmuE，获得突变菌株WB600(ΔgmuE)。

以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，敲除果糖激酶编码基因gmuE。以枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板，分别用两对引物ΔgmuE-A-F/R、ΔgmuE-B-F/R(如表1所示)扩增靶基因的上下游同源臂，所得两个PCR产物大小均为500bp。将两个片段进行重叠PCR得到线性目的片段，大小为1000bp，纯化回收PCR产物，-20℃保存备用。将纯化后的PCR扩增产物用BamHI和Not I双酶切，然后和经过同样双酶切后的pKSV7质粒连接，用T₄ DNA连接酶于16℃连接12h。利用化学转化法将重组质粒转入大肠杆菌，通过50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板筛选转化子。提取转化子并经菌落PCR验证，所得片段大小为1000bp，与预期一致。然后利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术对WB600进行基因敲除，制备枯草芽孢杆菌感受态细胞并将验证正确的同源重组质粒化学转化其中，菌液涂于50μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上，45℃倒置培养12h，挑取单菌落WB600(ΔgmuE-AB-pKSV7)于5mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，45℃，220rpm，培养12h；取10μL培养液转接到5mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中于45℃中继续培养，连续3次，进行菌落PCR验证。发生单交换后的菌株，其验证PCR产物的大小应为1400bp，条带大小均与预期大小相符，说明单交换成功。挑取单交换验证正确的单菌落WB600(ΔgmuE-AB-pKSV7)于5mL无抗生素LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养12h；取10μL培养液转接到5mL无抗生素LB液体培养基中于37℃中继续培养，连续3次，进行菌落PCR验证。发生双交换后的菌株，其验证引物间的大小应为1600bp，条带大小均与预期大小相符，说明双交换成功。将验证正确的菌落培养液进行稀释涂板(无抗性LB固体培养基平板)，37℃倒置培养12-16h至出现单菌落；挑取单菌落，进行双点板(含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板、无抗生素LB固体培养基平板)验证。最终获得在无抗性LB固体培养基平板上生长，且在含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板上不生长的菌落为最终目的基因缺失的重组菌WB600(ΔgmuE)。

扩增单个目的基因的反应体系如下：

ΔgmuE-A的退火温度是54℃,延伸时间与基因长度对应,以ΔgmuE-A为例,反应程序如下：

重叠PCR反应体系如下：

进行重叠PCR时,采用的退火温度均为54℃,延伸时间为1min。

菌落PCR鉴定反应体系如下：

酶切反应体系如下：

1.2以WB600(ΔgmuE)为出发菌株，进一步敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC编码基因fruA，获得重组菌株WB600(ΔgmuEΔfruA)

以枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuE)为出发菌株，敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC编码基因fruA。以枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuE)基因组为模板，分别用两对引物ΔfruA-A-F/R、ΔfruA-B-F/R(如表1所示)扩增靶基因的上下游同源臂，使用和1.1同样的方法获得重组菌株WB600(ΔgmuEΔfruA)。

1.3以WB600(ΔgmuEΔfruA)为出发菌株，敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IID编码基因levG，获得突变菌株WB600((ΔgmuEΔfruAΔlevG)

以枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuEΔfruA)为出发菌株，敲除PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IID编码基因levG。以枯草芽孢杆菌WB600(ΔgmuEΔfruA)基因组为模板，分别用两对引物ΔlevG-A-F/R、ΔlevG-B-F/R(如表1所示)扩增靶基因的上下游同源臂，使用和1.1同样的方法获得重组菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)。

1.4菌株生长曲线的测定

(1)分别挑取原始菌株WB600和敲除后的菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)的单菌落于5mL的LB液体培养基中，过夜培养。

(2)测定培养后菌液在OD₆₀₀的吸光值，并按照约2％接种量接种于50mL LB液体培养基中，测定初始OD₆₀₀值，确保初始值相同，每瓶做三个平行。

(3)将实验组与对照组均在37℃、220r/min的摇床上培养，每隔30min测定两个组的OD₆₀₀值，绘制菌株的生长曲线。

(4)分别测定出发菌株WB600与重组菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)在LB培养基中的生长曲线。结果如图1所示，与出发菌株WB600相比，菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)比出发菌株的生长速率略低，说明将三个基因全部敲除后对菌体生长影响不大。

1.5验证基因敲除重组菌对果糖的利用能力

D-果糖能够作为碳源被菌体利用，将枯草芽孢杆菌果糖激酶基因gmuE以及PTS系统中的fruA、levG基因敲除后，菌株不能对D-果糖进行磷酸化，则菌株无法再利用其生长。因此本发明测定了出发菌株WB600和菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)对D-果糖的利用情况，以D-果糖作为唯一碳源，37℃，220rmp/min摇瓶培养，每隔2小时检测菌的生长情况，结果如图2所示，WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)基本没有生长，说明敲除菌株已无法利用D-果糖作为碳源进行生长。实验表明，gmuE、fruA、levG基因全部敲除后，菌株利用D-果糖的途径已被阻断。

1.6构建重组基因工程菌WB600/AgDAE-pMA5和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5

进一步在菌株WB600和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)中游离表达来源于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)的D-阿洛酮糖3差向异构酶基因agdae，获得重组基因工程菌WB600/AgDAE-pMA5和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5。

以全基因合成的AgDAE-pET-28a质粒(苏州金唯智生物科技有限公司)为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增D-阿洛酮糖3差向异构酶基因agdae，PCR产物大小理论值为870bp。经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物大小与理论值一致，如图3所示。将agdae的PCR产物和质粒pMA5分别用NdeI和EcoRI进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用连接酶Solution I于16℃连接过夜。利用化学转化法将重组质粒AgDAE-pMA5分别转入枯草芽孢杆菌WB600和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)中，通过硫酸卡那霉素抗性平板筛选转化子。挑取转化子并提质粒进行双酶切验证，在1kb附近下方有条带，进一步进行PCR验证，条带大小也是870bp左右，与理论值一致。

PCR反应体系(50μL)如下：

目的基因与载体的双酶切体系(50μL)如下：

目的基因与载体双酶切验证体系(10μL)如下：

SolutionⅠ连接体系如下：

表1：实验所用引物列表

实施例2：重组基因工程菌用于合成D-阿洛酮糖

分别挑取枯草芽孢杆菌WB600、重组枯草芽孢杆菌WB600/AgDAE-pMA5和WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5单菌落接种于5mL含有50μg/mL硫酸卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜。再按2％的接种量，将过夜培养物接种于50mL的含有50μg/mL硫酸卡那霉素的液体LB培养基中。37℃、220r/min振荡培养24-48h，进行组成型表达。取组成型表达后的菌体离心、收集沉淀，将菌体用0.8％的生理盐水清洗两次，之后利用1×PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，向重悬菌液中添加500g/L果糖作为底物在60℃下进行催化反应，反应20小时后，收集转化后的上清液，通过HPLC-ELSD法对其进行分析，结果如表2所示，最终计算得到重组菌WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5的D-阿洛酮糖的转化率为30％左右，D-阿洛酮糖的产量达到150g/L,相比重组菌WB600/AgDAE-pMA5提升了1.76倍，说明重组菌株WB600(ΔgmuEΔfruAΔlevG)/AgDAE-pMA5能够较为有效地转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。

表2：重组菌对于D-阿洛酮糖的合成量及转化率

D-阿洛酮糖的检测方法如下：

(1)检测条件

用高效液相色谱分析底物与产物的含量变化。将1mL反应液煮沸5min后12000r/min离心1min去除沉淀，取上清液稀释合适浓度过0.22μm滤膜处理到液相小瓶中，采用HPLC对产物进行定量分析，测定条件为：

色谱仪：Agilent1260；

检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)

进样：Agilent自动进样器；进样量20μL；

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,AgelaTechnologies,China)；柱温40℃；

流动相：75％乙腈；流速1mL/min。

结果如图4所示，底物D-果糖和产物D-阿洛酮糖在柱子中得到很好的保留和分离。

(2)标准曲线的绘制

精确称取D-阿洛酮糖、D-果糖各5.0mg置于5mL的EP管中，加入5mL蒸馏水溶解，精确吸取100、200、400、600、800、1000μL的溶液到1.5mL的EP管中，加蒸馏水稀释至1mL，然后过0.22μm滤膜处理，加入到液相瓶中进行检测，以溶液浓度的对数值为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1908

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis WB600

<400> 1

gtgaaaataa ctgagctttt aacgaagcat acgataaagc ttaatattga gagcaaagaa 60

aaagaaaatg ttattgacga aatggtcact gttcttgata aggctggaaa gttaaatgac 120

cgacaagcct ataaagaagc cattttaaat cgcgaaagcc aaagctccac gggtatcggt 180

gaaggaatcg ctatccccca tgcgaaaacg gcaagcgtta tcaacccggc gatcgcgttc 240

ggacgttcaa aagacggcgt cgattatgaa tcattagacg gccagccggc tcacttagtg 300

ttcatgatcg cggcgactga aggcgcaaac aacactcacc ttgaagcatt gtcaagactt 360

tcaacgctgt taatgcgtga agaaatccgt aagcagctcc ttgaagctga gtctgaagat 420

gccatcatcg acattattaa tcagcacgat aaagatgatg acgaagagga agaggaagaa 480

gaagcggcac cagcacctgc cggaaaaggg aaaattttag cggttactgc atgcccgaca 540

ggtattgccc atacattcat ggctgcggat gcccttaaag aaaaagcgaa agagcttggt 600

gtggaaatta aggtcgaaac aaatgggtca agcggcatta agcacaagct cactgcccaa 660

gaaatcgaag atgcacctgc aatcattgtc gcagcggaca agcaggttga aatggaacgt 720

tttaaaggca agcgcgtact tcaagttcct gtaacggcgg gtatcagacg tccgcaagag 780

cttatcgaaa aagcgatgaa tcaagatgcg ccgatttatc aaggcagcgg cggcggttca 840

gcagcttcaa atgatgatga agaagcgaaa ggcaagtctg gaagcggtat cggaaacacg 900

ttttataagc acctgatgag cggtgtcagc aacatgcttc cgttcgtagt cggcggcggt 960

attctcgttg cgatttcatt cttctgggga attcactctg ctgatccgaa tgatcctagc 1020

tacaacacgt ttgcagcagc attaaacttt atcggcggcg acaatgcatt aaaactcatt 1080

gttgcagttc tggccggttt cattgcgatg agtattgcag atcgtcctgg ttttgcgcct 1140

ggtatggtcg gcggatttat ggcaactcaa gcgaatgctg gattcttagg cggcttaatt 1200

gccggattcc ttgccggtta tgtcgtgatt ttactgaaaa aagtatttac gtttatccct 1260

cagtcacttg atggattaaa acctgttttg atttacccgc tgttcggtat ttttatcact 1320

ggcgtattaa tgcaatttgt cgtcaataca cctgtagcgg catttatgaa tttcttaaca 1380

aactggcttg aaagccttgg tactggaaac cttgtgttaa tgggtattat cttgggcggc 1440

atgatggcga tcgatatggg cggtccgctt aataaagcag cctttacgtt cggtatcgcc 1500

atgatcgatg caggcaacta tgcgcctcat gcagcaatca tggccggcgg tatggttcct 1560

ccgcttggta tcgcacttgc aacaaccatt ttcagaaaca aattcactca gcgtgaccgt 1620

gaagctggta ttacatgcta tttcatggga gctgctttcg taacagaggg agcgatccca 1680

tttgctgcgg ctgatccgct tcgcgtcata ccagctgctg tagtcggtgc agctgttgcc 1740

ggcggattaa ctgaattctt ccgagtaacg cttccggcgc ctcatggagg agtattcgta 1800

gctttcatta caaaccatcc gatgctttac cttttaagta tcgtgatcgg tgctgtcgtg 1860

atggcaatta tcctcggtat cgtcaaaaaa cctgttacag aaaaataa 1908

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis WB600

<400> 2

atggagaaag aaaaacgatt aacgaagaaa gaaattttca gcatgtttat tcgttcaaat 60

tttttactcg gttcctttaa cttcgaacgt gtgcaggcaa tgggatattg ttatgtcatg 120

ataccggcga tcaaaaaatt gtacggtccc ggagcgaaaa gaaacgaagc cttacagcgg 180

catttggaat ggtttaatac acatccgtgg ctgacagcgc ctatatttgg cgtgacggca 240

gccatggaag aagaaatggc gaacaataaa ggaattgacg gaaaagcgat aagcggaatg 300

aaaatcggtt tgatgggacc aatagcgggc gtaggcgatc caattttttg gggaacgatt 360

cgtcctgtct tagctgcgct aggagcctcc cttgctttag gaggaaacat tgccggtcct 420

ttgctattct ttttcttgct gaatgccata agattaagca caaaatatta cggattaaag 480

tatggctatg tgaaaggaat ggagattctt caggatttag cggggaatcg cattcaaaag 540

cttacagagg gcgcttcgat tctcgggtta tttgttatgg gggctctcgt gtccaaatgg 600

accaccatca acattccaat cgttgtatcc aggattaagg atgaaagcgg aaaagtagat 660

gttcaaacgg tacaaaacgt gctagatagc attatgccgg gggcgctgcc tctcggatta 720

acgttattgg tggcatggat gcttcgcaaa ggggtgaatc cacttctcat tatttgcggc 780

atctttgtca tcgggattct cgggtattgg gctggattct tagcataa 828

<210> 3

<211> 900

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis WB600

<400> 3

atgcttggcg gtattgaagc aggcggcaca aagtttgttt gtgctgtcgg tagagaagat 60

ggaacgatca ttgacaggat agaattcccc acaaagatgc cggatgaaac gatagagaaa 120

gtaattcaat attttagcca attttcatta caggcaatcg gcatcggctc ctttggtccc 180

gttgataacg ataaaaccag tcaaacatac ggtaccatta cggccacgcc gaaagcgggc 240

tggagacact atcccttttt gcaaaccgtt aagaacgaaa tgaagatccc agtcggattt 300

agtacagatg tcaacgctgc ggcgctgggt gaattccttt tcggtgaagc gaagggtctt 360

gacagctgcc tgtatataac gattggcact ggcatcggag cgggggctat tgtagagggg 420

aggctccttc aggggctgtc acacccagag atgggccata tttatatccg gaggcacccg 480

gatgacgtat accaagggaa gtgcccttat catggagatt gctttgaagg cttagcttca 540

ggccccgcta tcgaagcccg ctgggggaaa aaagccgcgg atttatcaga tatagcacaa 600

gtctgggaac tggaagggta ctatattgcc caagcactgg ctcagtatat tttgatcctt 660

gcacctaaaa aaatcattct tggcggcggc gtcatgcaac agaaacaagt gttttcttat 720

atctatcaat atgtaccaaa aatcatgaac agctacttag atttttctga attatcagat 780

gatataagtg attatattgt acctccacgt ttaggcagta acgccggaat catcggcacg 840

ctagttttag cgcatcaggc cttacaagca gaggcagcat ccggggaggt gcgatcatga 900

<210> 4

<211> 870

<212> DNA

<213> Arthrobacter globiformis M30

<400> 4

atgaaaattg gttgccatgg cctggtttgg accggccact tcgacgctga aggcattcgc 60

tactccgtcc agaaaaccag ggaagccggt ttcgacctcg ttgagttccc gctcatggat 120

ccgttctcct tcgatgtgca gacggccaag tccgcactgg ccgaacatgg gctggcggcc 180

tcggcatctc tgggactctc ggacgccact gacgtaagca gcgaagatcc cgccgtcgtg 240

aaggcagggg aggagctgct caaccgcgcc gtggatgttc tggccgaact gggtgcgacg 300

gatttctgcg gcgtgattta tagcgccatg aagaagtaca tggagccggc aactgctgcc 360

gggctggcca acagcaaggc agccgtcggg cgggtcgcgg accgggcatc ggatctgggg 420

atcaatgttt cgctagaggt cgtcaacagg tacgaaacca acgtactgaa caccggacgt 480

caggcccttg cctacttgga ggagctcaac cggccgaacc tgggcatcca cctggacact 540

taccacatga acattgagga atcggacatg ttctccccga tcctggacac cgcggaggcc 600

ctgcggtacg tccatatcgg cgaaagccac cgcggctacc tcggcacggg aagcgttgac 660

ttcgacactt tcttcaaggc cctcggccgc atcggctatg acggacccgt tgtcttcgaa 720

tcgttctcct cctccgtcgt ggcaccggat ctgagccgga tgctcggcat ctggcgcaac 780

ctgtgggccg acaacgagga actgggtgcg cacgcgaatg ccttcatccg cgacaagctc 840

accgcgatca agaccatcga actgcactaa 870

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以枯草芽孢杆菌WB600为宿主菌，敲除了其基因组上的果糖激酶基因gmuE及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID的基因fruA、levG，并进一步在宿主菌中游离表达来源于球形节杆菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因agdae，获得重组枯草芽孢杆菌。

2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，利用pKSV7温敏质粒无痕敲除技术对枯草芽孢杆菌基因组上的果糖激酶基因gmuE及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID的基因fruA、levG进行敲除。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，利用质粒pMA5整合来源于球形节杆菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因agdae，构建重组载体并转入宿主菌进行游离表达。

4.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶编码基因agdae的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1-4所述枯草芽孢杆菌基因工程菌用于催化D-果糖生产D-阿洛酮糖的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，利用所述枯草芽孢杆菌基因工程菌全细胞生物催化D-果糖生产D-阿洛酮糖。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌以500g/L果糖作为底物在60℃条件下进行催化生产D-阿洛酮糖。

Images