CN110392737A

CN110392737A - 用产阿洛酮糖差向异构酶微生物生产阿洛酮糖的方法

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Publication number: CN110392737A
Application number: CN201780081682.5A
Authority: CN
Inventors: 李在勋; 权淳圭; 朴芙洙; 朴钟辰; 安信惠; 李尚熙; 韩恩珍
Original assignee: Samyang Corp
Current assignee: Samyang Corp
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: EP3564383A4; KR20180079217A; WO2018124833A1; KR102198203B1; CN110392737B; JP6975239B2; EP3564383A1; JP2020503019A; US20200080072A1; EP3564383B1

Abstract

本发明涉及培养具有高阿洛酮糖转化活性的菌株的方法和包括该方法的生产阿洛酮糖的方法，通过建立最佳C/N比优化分批培养和分批补料培养并确定是否需要金属离子，从而能够维持高阿洛酮糖转化活性和有效地大量生产阿洛酮糖。

Description

用产阿洛酮糖差向异构酶微生物生产阿洛酮糖的方法

技术领域

本发明涉及使用生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物有效生产阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(同名：阿洛酮糖)是异构化的糖，其是果糖(D-果糖)的3位碳上的羟基通过异构化反应而旋转，并且是在自然界例如葡萄干、无花果和小麦中微量存在的单糖。此外，D-阿洛酮糖(同名：阿洛酮糖)是一种新颖的甜味剂，可以解决现代人过量摄入高热量糖类引起的肥胖问题，并且甜味是一种类似于糖的天然甜味，甜度与糖相比是70&[Oshima H等人，2006]。在人体中，D-阿洛酮糖(同名：阿洛酮糖)的净能量增加是0.007kcal/g(糖为2.29kcal/g，果糖为1.76kcal/g)，它可以作为减肥食品的低热量甜味剂使用，它是一种能够克服由减少糖类所导致的味道退化现象的物质(Matsuo T等人，2002)。

另外，它具有抑制涉及肝脏中脂质合成的酶活性的功能，因此可以抑制腹部脂肪的积累，从而可以应用于各种功能性食品例如保健食品等，并且它具有抑制葡萄糖吸收的血糖抑制作用，因此可作为用于糖尿病患者的糖物质而使用(Matsuo T等人，2001，HayashiN等人，2010，Hossain A等人，2015，Hossain A等，2015)。具有这样的甜味特性和低热量、体脂肪蓄积抑制和糖类吸收抑制功能的阿洛酮糖是可以替代食品工业中糖所占据的广泛市场的物质，并且它是使得通过健康饮食能够预防肥胖导致的疾病的物质。

目前，用于工业生产阿洛酮糖的微生物的发展状况以来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，韩国，CJ)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis，日本，松谷)的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶重组酶为代表，并且目前它是GRAS认证的。

由于具有这种潜在经济价值的阿洛酮糖属于在自然界极少存在的单糖的稀有糖，因此需要有效地生产阿洛酮糖的方法以将其应用于食品工业。作为使用的生物催化剂，尚未开发和商业化，自行开发是必要的。当将重组酶用于此时，存在能够高效生产阿洛酮糖的优势，但是存在消耗大量成本和时间来证明安全性的缺点。另一方面，当使用经证实安全的天然菌株(具有可食用经验的非GMO菌株)时，在高浓度培养中重现天然菌株(具有可食用经验的非GMO菌株)的改善的阿洛酮糖生产能力是重要的因素。

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE酶)是代表性的阿洛酮糖差向异构酶，很难在保持高酶活性的同时以高浓度实际培养微生物细胞。因此，对于阿洛酮糖工业化所需的大规模生产，需要在保持DPE酶最大活性的同时以高浓度培养微生物细胞的技术和使用该技术生产阿洛酮糖的技术。

发明内容

技术问题

本发明的实施方式涉及培养具有高阿洛酮糖转化活性的微生物的方法。

本发明的另一种实施方式涉及增加或稳定具有阿洛酮糖转化活性的微生物的阿洛酮糖转化活性的方法。

本发明另外的实施方式涉及增加具有阿洛酮糖转化活性的微生物的阿洛酮糖差向异构酶的活性和/或表达的方法，或稳定维持酶活性的方法。

本发明的实施方式的目的是提供通过培养具有高阿洛酮糖转化活性的微生物而从果糖生产阿洛酮糖的方法。

本发明另外的实施方式提供了培养生产高阿洛酮糖差向异构酶的微生物的培养基组合物或生产阿洛酮糖的组合物。

技术方案

本发明提供了使用一种或多种选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的诱导物来培养能够生产差向异构酶的微生物从而诱导或稳定微生物的阿洛酮糖差向异构酶的方法，以及用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物，所述组合物包含微生物和诱导物。

此外，本发明通过建立培养最佳C/M比、优化其使用的分批、分批补料或连续培养过程以及金属离子要求有效建立了维持高阿洛酮糖转化活性和大量生产阿洛酮糖的条件，以便使用具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性的微生物(例如细杆菌属(Microbacteriumsp.)菌株)以及其他具有阿洛酮糖转化活性的非遗传修饰的(非GMO)菌株来获得高阿洛酮糖转化能力，从而完成本发明。

本发明的一种实施方式涉及诱导或稳定微生物的阿洛酮糖差向异构酶活性的方法，包括：在包含选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的一种或多种诱导物的培养基中培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的步骤。

本发明的一种实施方式涉及用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物，所述组合物包含：能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物；和一种或多种选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的物质，所述物质作为增加微生物的酶活性或表达的诱导物。

本发明另外一种实施方式提供了包括在特定培养条件下培养具有将果糖转化为阿洛酮糖的高活性的微生物的步骤的培养方法，或包括培养步骤和分离阿洛酮糖的步骤的生产阿洛酮糖的方法。

制备本发明的阿洛酮糖的方法的一种实施方式可包括：制备初始培养基的步骤；通过在初始培养基中培养生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物来获得培养溶液的步骤；以及使用培养的微生物或来源于微生物的阿洛酮糖异构酶由果糖底物转化为阿洛酮糖的步骤。

当使用根据本发明的用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物来培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物时，可以诱导或稳定阿洛酮糖差向异构酶的活性。酶活性是指通过每0.4g果糖底物使用2.5mg DCW的微生物细胞在80℃下反应1小时来获得的反应物的每单位微生物细胞DCW(单位细胞干重)的阿洛酮糖转化率(单位/g-DCW)。

当使用根据本发明的用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物来培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物时，酶(单位/g-DCW)可以为50至5000单位/g-DCW、100至3000单位/g-DCW，优选200至2000单位/g-DCW、300至2000单位/g-DCW、300至1500单位/g-DCW、或400至1500单位/g-DCW。此外，根据本发明的组合物或方法，能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物可具有上述范围内的酶活性并在30至40小时的培养时间内保持活性。

在使用根据本发明的微生物的培养来大规模制备阿洛酮糖的情况下，实现高浓度的微生物细胞培养是非常重要的，并且当在根据本发明的用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物中培养微生物时，为了优选的生产过程的经济可行性，可以培养用于生产阿洛酮糖的微生物细胞，使得培养溶液中的干微生物细胞浓度为4g(dcw)/L至400g(dcw)/L、5g(dcw)/L至400g(dcw)/L、10g(dcw)/L至300g(dcw)/L、15g(dcw)/L至300g(dcw)/L、20g(dcw)/L至300g(dcw)/L、20g(dcw)/L至200g(dcw)/L。

适用于本发明的微生物可以是能够生产阿洛酮糖差向异构酶(D-阿洛酮糖-3-差向异构酶)的微生物或具有由果糖底物转化的阿洛酮糖转化活性的微生物，具体地说，它涉及生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物，所述阿洛酮糖差向异构酶的表达和/或活性由阿洛酮糖和/或果糖诱导。

微生物优选是非遗传修饰的微生物，其包含编码阿洛酮糖差向异构酶的固有基因。

非遗传修饰的微生物可包括从自然界分离的野生型菌株或其中通过各种方法诱导突变的变体。非遗传修饰的微生物更合适，因为不存在通过基因操作引入外源基因的修饰菌株所具有的的稳定性问题。另外，制备变体的方法可以是由外部刺激如UV或NTG(例如热处理)诱导的随机突变。

适用于本发明的非遗传修饰微生物的实例可以是选自由细杆菌属菌株、剑菌属(Ensifer sp.)菌株、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)菌株、假单胞菌属(Pseudomonassp.)菌株、产氢红杆菌属(Rhodobacter sp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株组成的组中的一种或多种菌株，优选可以为选自由叶际细杆菌(Microbacteriumfoliorum)、氧化细杆菌(Microbacterium oxydans)、叶球形微杆菌(Microbacteriumphyllosphaerae)和粘着剑菌(Ensifer adhaerens)组成的组中的一种或多种菌株，但不限于此，出于工业目的，可以使用微生物作为包括GRAS(通常认为是安全的)菌株的安全性证明的菌株。例如，可以使用作为用于本发明的细杆菌属菌株的登录号为KCCM11774P的从食物中选择并分离的改良菌株的叶际细杆菌菌株，以及作为剑菌属菌株的登录号为KCCM11405P的从土壤中选择并分离的改良菌株的粘着剑菌菌株。

因此，在本发明的说明书中使用的术语“微生物”可以指例如选自由微生物的微生物细胞、微生物的培养物、微生物的裂解物和裂解液的上清液组成的组中的一种或多种，并且阿洛酮糖差向异构酶可以被包含在选自由微生物的微生物细胞、微生物的培养物、微生物的裂解物和裂解液的上清液组成的组中的一种或多种中。培养物包含由微生物生产的酶，并且它可以包含微生物或是不含微生物的无细胞形式。裂解物是指裂解微生物的裂解液或通过离心裂解液获得的上清液，裂解物包含由微生物生产的酶。

因此，本文中，具有阿洛酮糖转化活性的生物催化剂可以指“微生物”，例如，选自由微生物的微生物细胞、微生物的培养物、微生物的裂解物和裂解液的上清液组成的组中的一种或多种，它包含选自由微生物的微生物细胞、微生物的培养物、微生物的裂解物和裂解液的上清液组成的组中的一种或多种，或由其获得的阿洛酮糖差向异构酶。

本发明涉及使用选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的一种或多种作为用于增加能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的酶活性或表达的诱导物的用途。例如，它涉及诱导或稳定微生物的阿洛酮糖差向异构酶活性的方法，该方法包括使用诱导物作为单一碳源或与其他碳源一起使用培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的步骤。

在根据本发明的诱导或稳定阿洛酮糖差向异构酶活性的方法中，微生物可以在进一步包含除诱导物之外的碳源的培养基中培养。微生物可以在诱导物浓度(g/L)为0.001g/L至5g/L的范围内培养，并且微生物可以在培养基的pH变化值(ΔpH)为0.05至0.5的条件下培养。可以将诱导物添加到接种微生物的初始培养基中，或者可以间歇或连续地添加包含诱导物的另外的培养基。在另外的培养基中，碳源与有机氮源的比可以是20/1至1/1。另外，微生物可以在进一步包含选自由锰、钴、钙、镁、镍、铁和铝组成的组中的一种或多种金属离子的培养基中培养。

在此，诱导物为0.001g/L至5g/L、0.01g/L至5g/L、0.05g/L至5g/L、0.1g/L至5g/L、0.001g/L至3g/L、0.01g/L至3g/L、0.05g/L至3g/L、0.1g/L至3g/L、0.001至1.5g/L、0.01g/L至1.5g/L、0.05g/L至1.5g/L、或0.1g/L至1.5g/L。

此外，本发明涉及：用于培养生产阿洛酮糖的微生物的组合物，包含作为诱导物的选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的一种或多种物质；或用于生产阿洛酮糖的组合物，包含能够产生阿洛酮糖差向异构酶的微生物和作为诱导物的选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的一种或多种物质。

该组合物可包含碳源与有机氮源的比(C/N比)为10/1至1/1的用于培养微生物的初始培养基，或包含碳源与有机氮源的比(C/N比)为10/1至1/1的用于培养微生物的初始培养基和C/N比为20/1至1/1的另外的培养基。此外，该组合物可包含浓度为3g/L至30g/L的碳源。该组合物可以具有pH 6.0至7.5的范围，并且可以将组合物调节至pH变化值(ΔpH)为0.05至0.5的条件。用于培养的组合物可包含选自由锰、钴、钙、镁、镍、铁和铝组成的组中的一种或多种金属离子。

根据本发明的诱导物可以单独用作碳源，或者与其他碳源一起添加至培养基，以用于培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物。另外，根据本发明的诱导物可以被包含在接种和培养微生物的初始培养基、间歇地或连续地供应的另外的培养基(供给溶液)、或初始培养基和另外的培养基两者中。

为了以高产量生产阿洛酮糖，当培养基中阿洛酮糖的消耗率被人为地控制时，随着由于DPE酶活性增加而导致的培养基中阿洛酮糖浓度降低，阿洛酮糖的消耗率增加，因此很难接近实际阿洛酮糖消耗率，所以，当根据阿洛酮糖的消耗率另外人为地添加糖时，可能导致培养基中的糖积累。累积的糖可以有助于与微生物细胞产量比糖含量成比例的微生物细胞生长速率的增长，但是由于累积的剩余糖增加其导致DPE酶的活性迅速降低(参见图5a)。

另外，为了大量生产阿洛酮糖，优选高浓度培养用于生产阿洛酮糖的微生物，但随着高浓度微生物细胞培养的发展，阿洛酮糖差向异构酶的活性可以迅速降低。

因此，为了在培养期间增加酶的活性和表达以及阿洛酮糖转化活性并稳定地维持阿洛酮糖转化活性，可以在培养用于生产阿洛酮糖的微生物时添加诱导物，并且还可以优化诱导物条件，可以选择性地另外调节选自由有机氮源含量、金属离子浓度和pH范围组成的组中的一种或多种培养条件。

当使用细杆菌属菌株或剑菌属菌株作为本发明中使用的微生物时，使用阿洛酮糖和/或果糖作为诱导物，并且诱导物可以用作碳源而无需另外的碳源，或者可以使用另外的其他碳源，更优选使用阿洛酮糖作为碳源，这是因为当用阿洛酮糖培养时，对其它第三微生物的污染受到抑制，并且每个微生物细胞的阿洛酮糖产量高，并且阿洛酮糖差向异构酶活性高。

用于本发明的描述中的术语“初始培养基(initial culture medium/initialmedium)”是指在微生物培养中接种和培养微生物的培养基。

在本发明的描述中使用的术语“另外的培养基”是指在开始培养微生物之后除初始培养基之外另外向培养基中间歇或连续地供应的培养基。

在本发明的描述中使用的术语“培养物”是指通过在初始培养基、另外的培养基或其混合培养基中培养微生物而获得的培养物。

本文中，初始培养基的碳源与有机氮源的含量(g/L)之比(即C/N比)为10/1至10/10，优选为10/2至10/10，或10/3至10/10，10/5至10/10。当供应碳源和/或有机氮源以使C/N比在上述范围内时，可以诱导具有高表达和/或高活性的DPE酶，并且可以获得酶。本文中，对于术语“碳源与氮源的比”或“C/N比”，氮源是指有机氮源，更具体地，是指复合有机氮源，碳源是指微生物使用的常见碳源。但是，碳源也可以执行诱导物的功能。例如，当使用初始培养基进行分批培养时，在初始培养基的糖浓度低的情况下，在碳源(例如阿洛酮糖)几乎被消耗掉的培养后期，酶活性相对较高，但是在初始培养基的糖浓度较低的情况下，微生物细胞浓度太低，因此应考虑每个微生物细胞的产量，因此可以考虑酶活性和每单位微生物细胞的产量来适当选择碳源含量范围。

根据本发明，一种生产阿洛酮糖的方法包括制备其中碳源与有机氮源的比为10/1至1/1的初始培养基的步骤；在初始培养基中培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的步骤；和从果糖底物转化成阿洛酮糖的步骤，包括使获得自微生物的阿洛酮糖差向异构酶或微生物的培养溶液与果糖底物反应。

当使用用于生产微生物的初始培养基的碳源(例如阿洛酮糖)时，阿洛酮糖是执行诱导物功能的碳源，并且可以包含该碳源，使得碳源的初始浓度为3g/L至50g/L，优选5g/L至30g/L，优选5g/L至25g/L，更优选5g/L至20g/L、5g/L至15g/L或10g/L至20g/L。特别地，碳源(例如培养基中的阿洛酮糖)的初始浓度不会大大影响微生物细胞浓度增加的速率进而影响培养时间，但是会影响DPE酶的最大活性，因此，当包含低浓度的阿洛酮糖时，可以获得相对最高的DPE酶活性。

作为在根据本发明的培养基中使用的碳源，可以使用选自由阿洛酮糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成的组中的一种或多种，并且优选是阿洛酮糖和/或果糖。

作为用于有效培养用于本发明的生产方法的微生物的氮源，包括有机氮源，并且另外可以包括无机氮源。有机氮源可以是选自由动物、植物和微生物或其类似物组成的组中的一种或多种有机氮化合物，有机氮源的实例可以包括选自由酵母提取物、玉米浆、大豆胨、蛋白胨、大豆、大豆粕、棉籽粕、糖蜜、酪蛋白、牛肉提取物、麦芽提取物和胰蛋白胨等组成的组中的一种或多种，优选可以使用酵母提取物。

可以进行根据本发明的微生物培养，使得培养基的pH变化值为0.05至0.5。可以进行微生物培养，使得培养基的碳源浓度(g/L)维持在0g/L至5g/L，并且可以选择性地通过间歇或连续地供应包含诱导物的另外的培养基来进行微生物培养。

本发明的微生物培养可以通过选自由分批培养、分批补料培养和连续培养组成的组中的一种或多种方法进行，优选地，可以使用选自由分批补料培养和连续培养组成的组中的的一种或多种方法，以使培养溶液的碳源保持在低浓度。使用者根据微生物生长模式分析而设定糖的注入速率并注入糖的分批补料培养与分批培养相比可以导致生产率和产量提高。分批补料培养是通过首先设定适当的糖浓度并逐渐注入高浓度的糖从而以使用者所需的浓度获得产物的分批培养方法，从而保持培养溶液中的低浓度的糖。然后，根据糖的添加时间、添加方法和添加量，存在各种分批补料培养方法，并且它们可以根据每种条件影响微生物的生长速率或细胞内酶的生产量和酶活性等。例如，本文中通过分批补料培养或连续培养的微生物培养可以通过pH-stat进料方法进行。

已知pH-stat进料方法具有较小的糖浓度变化并与微生物的生长趋势相匹配，因此它已广泛用于培养需氧微生物。通过注意当碳源耗尽时DO(溶解氧)增加，D0静态具有以下优点：当DO增加时，通过注入碳源，细胞可以自动处于高浓度，但是因为DO探头传感器比pH传感器贵并且维护困难，对于大规模生产的培养，pH-stat更优选用于工业用途。

因此，pH-stat分批补料培养方法是利用随着微生物消耗糖类并代谢而发生的pH下降现象，并且目的是在维持最小糖浓度并且不降低微生物活性的范围内注入糖类。这是如下的一种方法，其中当设定所需的pH并且pH稍微增加时注入少量糖类，而当少量糖类被代谢时，pH稍微降低，而当所有糖类被消耗时，pH再次增加，从而重复再次注入糖类的循环。然而，通过常规pH-stat方法生产酶是开/关控制方法，当一次性供应并且在一定时间后使供应量变化时，它被连续供应直至pH值降低，并且酶活性可能降低。因此，优选地，当pH随着发酵进行而增加和下降时，用于本发明的生产方法的培养方法可以使用通过能够控制以一定量来以某种底物供应量控制细胞生长速率的方法而不是开/关控制方法(图1)。

本发明可以供应碳源，使得初始培养基或培养溶液的pH为pH 6.0至7.5，优选pH6.5至7.5，更优选pH 6.5至7.0，并且pH保持在上述pH范围内。当pH维持时，DPE酶活性可以保持较高而不会积累糖。

在本发明的微生物培养中，当通过保持pH范围的方法供应碳源时，培养溶液中的pH变化值或差异值可以是0.5或更小、0.4或更小、0.3或更小、0.2或更小、或者0.1或更小，并且优选至少0.05或更大。例如，为了使培养溶液中的pH变化值保持在0.05至0.5，优选0.05至0.15，可以供应包含碳源的另外的培养基。在pH-stat进料方法中，供应碱性溶液如氢氧化钠或氨溶液，使其不降低至某一pH或更低。然后，当pH变化值小于0.05时，由于碱性溶液供应引起的pH上升幅度可能暂时增加大于0.05，这被认为是由于糖消耗导致的pH增加，并且添加过量的糖溶液，从而引起糖的积累，因此可能导致DPE酶活性降低。另一方面，当pH变化值大于0.5时，糖耗尽的状态延长，因此延迟了微生物细胞生长速率，因此可以抑制DPE酶活性。因此，当pH维持时，可以使酶活性最大化同时使糖积累时间最小化。

在本发明的微生物的培养步骤中，通过将培养物中碳源的浓度保持在0g/L至5g/L、0.001g/L至5g/L、0.01g/L至5g/L、0.05g/L至5g/L、0.1g/L至5g/L、0g/L至3g/L、0.001g/L至3g/L、0.01g/L至3g/L、0.05g/L至3g/L、0.1g/L至3g/L、0g/L至1.5g/L、0.001g/L至1.5g/L、0.01g/L至1.5g/L、0.05g/L至1.5g/L、0.1g/L至1.5g/L，优选为0.1g/L至1g/L，DPE酶可以保持高活性且没有糖积累，并且优选地，通过pH-stat进料方法可以将培养溶液中碳源的浓度保持在该范围内。在分批补料培养和连续培养中，优选在上述数值范围内实现碳源的浓度。

在本发明的微生物培养中，如以下等式1，f值定义为当碳源(例如糖类)以另外的培养基形式一次性供应时培养溶液中碳源浓度(g/L)的增加，即当包含碳源的另外的培养基一次性供应时，培养溶液中碳源浓度(g/L)的增加为0.2至0.5，优选0.25至0.3。

[等式1]

f＝(刚供应另外的培养基后培养溶液中的碳源浓度)-(刚供应另外的培养基之前培养溶液中的碳源浓度)

当f值小于0.5时，可以通过减少碳源的累积时间来防止间歇进料方法，并且可以保持DPE酶的高活性。此外，由于pH速率增加随着f值保持在0.25或更高以及进入高浓度培养而慢于通过添加碳源所致的pH速率下降，因此可以防止偏离pH-stat区段。

当在另外的培养基中使用酵母提取物作为氮源时，酵母提取物可以以10g/L至400g/L，优选20g/L至200g/L，更优选60g/L至100g/L的浓度被包含在另外的供应培养基中。通过包含上述范围内的酵母提取物，无论微生物细胞浓度如何，可以稳定地保持阿洛酮糖差向异构酶DPE酶的活性。

本发明的另外的培养基的碳源与有机氮源的比，即C/N比可以是20/1至1/1，优选10/1至2/1，更优选10/1至3/1，通过供应C/N比在上述范围内的碳源和/或氮源，即使在高浓度的微生物细胞中，DPE酶的活性也可以保持在最大值。碳源和氮源如初始培养基的碳源和氮源中所描述。

用于本发明的生产方法的初始培养基或另外的培养基可以进一步包含金属离子。在另一种实施方式中，可以将金属离子添加到碳源中，或者可以将金属离子添加到微生物和碳源的混合物中。在其他实施方式中，可以将金属离子添加到固定有产生DPE酶的微生物的载体中(在添加碳源前)，或者可以将金属离子添加到固定有微生物的载体和碳源的混合物中(添加碳源后)，或者可以在添加碳源时将金属离子以与碳源的混合物的形式添加或单独添加。

金属离子可以是选自由锰离子、钙离子、镁离子、镍离子、钴离子、铁离子和铝离子等组成的组中的一种或多种。金属离子可以作为辅酶，其通过增加果糖和DPE酶的结合能力来增加酶的活性。优选地，可以使用钴和/或锰离子，铜和锌可以导致活性降低。钴不允许作为食品添加剂，但锰已被批准作为食品添加剂。

当本发明的金属离子以包含在另外的培养基中的形式供应时，在另外的供应培养基中，金属离子的浓度可以为0.1mM至5mM、0.1mM至4mM、0.1mM至3mM，优选为0.5mM至2.5mM，根据金属离子的微生物细胞生长速率的差异是不显著的，但是当以低浓度或高浓度包含时，DPE酶活性最高，因此可以以优异的产量生产阿洛酮糖。

作为本发明的另一种实施方式，提供了用于培养生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的培养基组合物或含有该微生物的用于生产阿洛酮糖的组合物。

与生产阿洛酮糖的方法有关的项目可等同地应用于微生物培养基组合物或用于生产阿洛酮糖的组合物。

本发明涉及制备液体或粉末阿洛酮糖的方法，该方法通过对使用生物催化剂(阿洛酮糖转化酶(DPE酶)或生产阿洛酮糖转化酶的微生物的微生物细胞通过固定化反应由来自含有果糖的底物的含有阿洛酮糖的产物执行分离过程而进行，以生产根据本发明的培养方法制备的阿洛酮糖。

用于本发明的阿洛酮糖转化酶(DPE酶)或产生阿洛酮糖转化酶的微生物的微生物细胞可以作为包含在载体中的形式填充到用于固定化反应的柱子中。然后，在阿洛酮糖的大规模生产中始终保持阿洛酮糖转化酶的高活性在工业上是非常重要的，这是因为当阿洛酮糖转化酶的活性保持高稳定时，存在提高生产率并且生产速度变快的效果。

本文使用的载体可以产生长时间保持固定化菌株或由该菌株产生的酶的活性的环境，并且它可以是能够用于本领域已知的酶固定化的所有载体。例如，作为载体，可以使用海藻酸钠。海藻酸钠是一种海藻细胞壁中存在的天然胶状多糖，其由甘露糖醛酸(β-D-甘露糖醛酸)和古洛糖醛酸(α-L-古洛糖醛酸)组成，并且在含量方面通过产生β-1,4-键随机形成，菌株或酶被稳定地固定，因此可能有利于表现出优异的阿洛酮糖产量。

在一种实施方式中，为了进一步提高阿洛酮糖的产量，可以将海藻酸钠溶液(例如藻酸钠水溶液)用于菌株固定化。例如，通过使用注射泵和真空泵将获得的混合溶液滴加到约0.2M钙离子溶液中，在将该菌株的微生物细胞、包含由该菌株产生的酶的培养物或该菌株的裂解物添加并混合到体积为该菌株的微生物细胞、包含由该菌株产生的酶的培养物或该菌株的裂解物的1至2倍的海藻酸钠水溶液中，从而生成珠子，可以固定化该菌株的微生物细胞、包含由该菌株产生的酶的培养物或该菌株的裂解物。可以通过常规方法例如透析、沉淀、吸附、电泳、亲和色谱和离子交换色谱等方法从菌株、菌株培养物或菌株的裂解物中纯化酶。

本发明的另一个实例提供了使用含有酶或微生物细胞和载体的珠子，使用含果糖的底物生产阿洛酮糖的方法。

优选地，本发明的生产阿洛酮糖的方法可以通过将含有酶或微生物细胞的珠子填充到柱子中并使含果糖的底物溶液流过来进行，并且该方法可以由本领域技术人员根据所使用的酶或微生物细胞或固定化载体通过容易地选择合适的方法来进行。

在本发明的一种实施方式中，当将果糖溶液供应至以某种浓度填充包含阿洛酮糖差向异构酶的微生物细胞的填充柱时，通过固定化微生物细胞进行差向异构化反应，从而将果糖转化为阿洛酮糖。在使用分离柱等分离和纯化后，转化的阿洛酮糖可以以阿洛酮糖糖浆(液体)或粉末(固体)形式产生。

有益效果

本发明是使用微生物(例如产生DPE酶的菌株)以高产量生产阿洛酮糖的方法，该方法可以以高浓度培养微生物并且还稳定地保持酶活性并以高产量生产阿洛酮糖，因此，预计它将广泛用于功能性糖相关的保健功能食品和药物工业。

附图说明

图1示出了根据本发明的描述中描述的开/关控制方法和脉冲控制方法的培养方法。

图2a示出了根据碳源种类的剑菌属菌株的光学微生物细胞浓度和DPE酶活性。

图2b示出了根据碳源种类的细杆菌属菌株的光学微生物细胞浓度和DPE酶活性。

图3a示出了使用阿洛酮糖和果糖作为碳源的分批培养中的光学微生物细胞浓度。

图3b示出了使用阿洛酮糖和果糖作为碳源的分批培养中的剩余糖浓度。

图3c示出了使用阿洛酮糖和果糖作为碳源的分批培养中根据培养时间的DPE酶活性。

图4a示出了根据阿洛酮糖的初始浓度(10、15和20g/L)而不同的光学微生物细胞浓度。

图4b示出了根据阿洛酮糖的初始浓度(10、15和20g/L)的DPE酶活性。

图5a示出了在间歇糖供应方法中培养时的光学微生物细胞浓度和剩余糖浓度。

图5b示出了在间歇糖供应方法中培养时的DPE酶活性。

图5c示出了在间歇糖供应方法中培养时的阿洛酮糖消耗速率。

图6a示出了在pH-stat糖供应方法中培养时的光学微生物细胞浓度和剩余糖浓度。

图6b示出了在pH-stat糖供应方法中培养时的DPE酶活性。

图7a示出了根据酵母提取物浓度(20、40和80g/L)的光学微生物细胞浓度。

图7b示出了根据酵母提取物浓度(20、40和80g/L)的DPE酶活性。

图8a示出了根据锰离子浓度(0.5、1和2mM)的光学微生物细胞浓度。

图8b示出了根据锰离子浓度(0.5、1和2mM)的DPE酶活性。

具体实施方式

通过以下示例性实施例更详细地描述本发明，但本发明的范围不旨在受以下实施例的限制。

实施例1：培养基碳源种类对阿洛酮糖差向异构酶的影响

1.1所使用的微生物

在基因没有被人工操纵的阿洛酮糖生产率增强的突变菌株的培养中，培养基碳源可以影响DPE酶即阿洛酮糖差向异构酶的活性。本实施例中所用的微生物是通过加速自然进化改良的突变菌株，使用两种突变菌株叶际细杆菌(M.foliorum)和粘着剑菌(E.adhaerens)。

粘着剑菌突变菌株是从根际土壤中分离的革兰氏阴性杆菌，并包含DPE酶即阿洛酮糖差向异构酶，并且是韩国公开专利第10-2014-0122043号公开的登录号为KCCM11405P的粘着剑菌SYG29菌株，该菌株是来源于被选择并分离的土壤的改良菌株。

另外，叶际细杆菌菌株是非致病性的，并且是不形成孢子的被分类为生物安全等级1级的革兰氏阳性球菌，并包含DPE酶即阿洛酮糖差向异构酶，并且是来源于被选择并分离的食物的改良菌株，其通过使用以下方法分离。

使用1％(w/v)添加阿洛酮糖的矿物盐肉汤(KH₂PO₄ 2.4g/L、K₂HPO₄ 5.6g/L、(NH₄)2·SO₄ 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、酵母提取物1g/L)。选择食物(例如，西兰花、人参、食用花等)，收集每种食物1g并添加到MSP肉汤中，然后在30℃下培养24小时，从而进行富集。然后，收集100μL(微升)培养溶液并在琼脂培养基上涂布，然后在30℃下培养直至确认菌落。选择与琼脂培养基中形成的菌落形状和大小不同的菌落并接种MSP肉汤后，在30℃下振荡培养24小时并离心，从而仅收集微生物细胞。将收集的微生物细胞添加到100μl的50mMPIPES(哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸))缓冲液(pH 7.0)z中并悬浮，并使用超声处理器(ColepParmer)裂解以获得裂解物溶液。将裂解物溶液在12000rpm，4℃下离心10分钟后，收集上清液并作为粗酶使用，使用10mM果糖和阿洛酮糖作为底物，使粗酶在30℃下反应12小时。

通过薄层色谱(TLC)分析证实了是否在反应溶液中将阿洛酮糖转化为果糖。使用宽度为20cm，长度为10cm的硅胶(硅胶60F254(德国Merck))，固定床和移动床显影溶剂(其中乙腈和水以85:15的体积比混合)显影3次，每次10分钟，进行薄层色谱分析。

选择通过TLC分析确认阿洛酮糖转化为果糖的菌株并以0.1％(w/v)接种到添加阿洛酮糖的MS肉汤，并在30℃下进行24小时振荡培养，离心后，仅收集微生物细胞。收集的微生物细胞用0.85％(w/v)NaCl洗涤，然后添加到50mM PIPES缓冲液(pH7.0)(其中添加400g/L果糖和1mM锰离子)中并悬浮，并在70℃下反应1小时。

然后，将反应产物离心并收集上清，然后进行高效液相色谱(HPLC)分析。使用配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的HPLC(美国Agilent)的RID(折射率检测器，Agilent1260RID)进行液相色谱分析。作为移动床溶剂，使用水，温度为80℃，流速为0.6mL/min。获得的结果在图1中示出，在1500种菌株中选择产生阿洛酮糖最多的一种菌株，将其命名为叶际细杆菌SYG27B，并于2015年9月24日保藏于韩国微生物培养中心，登录号为KCCM11774P。

1.2培养条件

使用单糖、阿洛酮糖、果糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖作为实施例1.1的菌株的中碳源，根据下表1的种子培养基组成，混合培养基，并且为使所有菌株死亡，通过在121℃的温度下处理高温高压蒸汽灭菌15分钟，制备每种种子培养基。根据烧瓶培养方法，在30℃的温度和240rpm下进行培养。

[表1]

培养基来源	初级种子培养
		碳源(g/L)	5
MgSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O(g/L)	0.5
		酵母提取物(g/L)	2
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(g/L)	7
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(g/L)	0.5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(g/L)	0.5
		FeSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O(mg/L)	6
MnSO<sub>4</sub>-4H<sub>2</sub>O(mg/L)	4
		生物素(mg/L)	0.2
硫胺素-HCl(mg/L)	0.2
		烟酰胺(mg/L)	-
消泡剂(mL)	-

1.3酶活性测量

为了测量实施例1.2的培养菌株的阿洛酮糖差向异构酶活性，在收集0.1ml至1ml培养溶液后，通过离心分离微生物细胞和培养溶液，除去培养上清液以收集微生物细胞。基于每个样品的光学微生物细胞密度(OD，600nm)，计算微生物干细胞质量，并且基于微生物干细胞质量与底物溶液体积之比为2.5mg/ml，与微生物干细胞质量比较，计算要添加的高浓度果糖底物溶液体积并添加。本文中，高浓度果糖底物溶液是指使用50mM PIPES缓冲液(pH7.0)作为溶剂添加400g/L果糖和1mM锰金属离子的溶液。

在相同条件下将每个样品在70℃的温度下固定1小时后，通过离心分离微生物细胞和反应上清液以终止反应。对于HPLC分析，在用蒸馏水以低于2％的固体含量稀释反应上清液后，将其通过0.2μm过滤器并分析。使用BIORAD Aminex HPX-87C柱(移动床DW，流速0.6mL/min，温度90℃，RT40分钟)进行HPLC分析，制备阿洛酮糖和果糖标准溶液，并通过做出标准校准曲线限定对应于HPLC面积的每个浓度。通过分析每单位时间从果糖生产的阿洛酮糖的浓度，比较每个样品的酶活性程度，结果在图2a和图2b中示出。

酶活性是指使用2mg DCW(单位/g-DCW)的微生物细胞在80℃下反应一小时的每单位DCW微生物细胞的阿洛酮糖转化率。

鉴于图2a中所示的剑菌属菌株和图2b中所示的细杆菌属菌株的微生物细胞浓度和酶活性，尤其是细杆菌属菌株在用果糖培养时具有最高的微生物浓度，剑菌菌株在用甘露糖培养时具有最高的微生物浓度，它们对其他单糖碳源显示出相似的微生物细胞浓度。然而，在DPE酶活性的情况下，两种菌株在用阿洛酮糖培养时显示出相对非常高的活性。这意味着，阿洛酮糖直接影响DPE酶高活性表达。证实了，细杆菌属菌株的微生物细胞的生长速率和活性高于剑菌属菌株，以下实施例使用细杆菌属菌株进行。

实施例2：使用果糖和阿洛酮糖分批培养微生物

在叶际细杆菌的培养中，当使用果糖或阿洛酮糖作为碳源时，与其他碳源相比，与实施例1的结果相同，可诱导高微生物浓度或高DPE酶活性。由于双侧反应酶，DPE酶可以直接使用果糖和阿洛酮糖作为底物，当使用果糖或阿洛酮糖作为培养基碳源时，它可以对高活性DPE酶表达有效。因此，当使用作为培养基碳源的DPE酶底物果糖和阿洛酮糖时，比较高活性DPE酶表达和微生物细胞生长。

对于高浓度培养叶际细杆菌，用表1的组成制备每种种子培养基，然后通过在121℃的温度下进行高温和高压蒸汽灭菌处理超过15分钟来制备每种种子培养基。考虑到价格竞争力和生产率，如下表2选择每种种子培养基和主培养基(初始培养基)的组成，并且为了增加DPE酶活性，用果糖和阿洛酮糖诱导DPE酶。

[表2]

培养基来源	初级种子培养	次级种子培养	主培养
				阿洛酮糖或果糖(g/L)	5	5	10
MgSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O(g/L)	0.5	0.5	1.5
				酵母提取物(g/L)	2	2	4
(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(g/L)	7	7	7
				KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(g/L)	0.5	0.5	0.5
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(g/L)	0.5	0.5	0.5
				FeSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O(mg/L)	6	6	12
MnSO<sub>4</sub>-4H<sub>2</sub>O(mg/L)	4	4	8
				生物素(mg/L)	0.2	0.2	0.2
硫胺素-HCl(mg/L)	0.2	0.2	0.2
				烟酰胺(mg/L)	-	-	10
消泡剂(mL)	-	-	0.5

对于种子制备，将在-70℃温度下储存的叶际细杆菌母株接种于3ml种子培养基中，在30℃温度下进行初级种子培养24小时，然后接种于100ml种子培养基中，在30℃下进行次级种子培养24小时。最后使用5L发酵罐将次级种子培养基接种在2L主培养物生产培养基中，并在30℃下培养。使用0.2μm空气过滤器将供应至发酵罐的空气用作抗菌剂，并根据表3的发酵罐培养条件进行培养。

[表3]

培养步骤	初级种子培养	次级种子培养	主培养
				培养设备	试管	烧瓶	5L发酵罐
培养量	0.003L	0.1L	2L
				接种体积	3％(v/v)	6％(v/v)	5％(v/v)
培养时间	24小时	24小时	30至40小时
				RPM	200	200	500至800
空气(vvm)	-	-	2

*vvm(每分钟每体积液体的空气体积)：L/min

*培养温度：30℃

用实施例1.3的方法，通过果糖和阿洛酮糖含量分析，比较每个样品的酶活性程度，结果在图3a至图3c中示出。

如图3a所示，比较分批培养中相应的微生物细胞产量，阿洛酮糖OD600为2.88/(1g/L阿洛酮糖)，果糖OD600为1.13/(1g/L果糖)，使用相同浓度的糖类，阿洛酮糖可以有效地产生2.5倍的微生物细胞，因此用阿洛酮糖培养更经济。另外，考虑到剩余的糖分析结果，阿洛酮糖降低的同时显示出对数函数的趋势，并且果糖降低的同时显示出线性函数趋势(图3b)。这种趋势意味着由于阿洛酮糖与果糖相比不易在微生物细胞中摄取而发生的结果，并且意味着在为微生物细胞的存活而诱导高活性DPE酶表达期间糖难以被摄取，随着DPE酶活性在某种水平上增强，阿洛酮糖消耗速率增加。因此，由于阿洛酮糖可以比果糖更有效地诱导高活性DPE酶表达，使用阿洛酮糖作为碳源进行以下实施例。

实施例3：根据阿洛酮糖初始浓度分批培养微生物

为了确认最佳阿洛酮糖初始培养基中碳源的浓度，将初始阿洛酮糖浓度选择为10g/L、15g/L和20g/L，并且如实施例2进行发酵。此外，如同在实施例1.3中进行的活性测量方法，进行果糖的生物转化反应，通过HPLC测量阿洛酮糖生产所获得的结果和活性比较在图4a和图4b中示出。

如图4a和图4b中所示，确认了无论初始阿洛酮糖的浓度如何，微生物细胞浓度相对于培养时间的增加速率是相似的，并且确认当初始阿洛酮糖浓度低时，最大DPE酶活性升高。因此，选择10g/L的初始阿洛酮糖浓度作为最佳浓度，并进行以下实施例。

实施例4：微生物的分批补料高浓度培养物

4-1.分析根据间歇糖供应方法的活性

为了确认间歇糖供给方法的有效性，在每个固定时间以1.5至2.5g/L/小时的速率供应糖类，如实施例2进行发酵。另外，如图在实施例1.3中进行的活性测量方法，进行果糖的生物转化反应，通过HPLC测量阿洛酮糖生产所获得的结果和活性比较在图5a至图5c中示出。

如图5c所示，当阿洛酮糖的消耗率被人为地控制时，由于DPE酶活性增加，随着培养基中阿洛酮糖浓度降低，阿洛酮糖的消耗率增加，因此很难接近实际阿洛酮糖消耗率，这可能导致如图5a的糖的积累。累积的糖可以有助于与微生物细胞产量比糖含量成比例的微生物细胞生长速率的增长，但是由于累积的剩余糖增加导致DPE酶的活性迅速降低。

4.2分析根据pH-stat方法的活性

为了证实pH-stat糖类供应方法的有效性，如实施例2进行发酵。f值定义为当碳源以另外的培养基形式一次性添加时培养溶液(发酵罐)中的碳源浓度(g/L)的增加，调节添加碳源的时间使得f值为0.25。另外的培养基即进料溶液的组成为阿洛酮糖400g/L、酵母提取物40g/L和MnCl₂ 1mM。根据pH-stat基本原理，当pH超过6.95时，供应糖类，从而降低pH，并且通过9％氨水和糖溶液控制pH在6.8-6.95的pH范围内。另外，与实施例1.3中进行的测量方法相同，测量活性，通过比较活性而获得的结果在图6a、图6b和表4中示出。在表4中，微生物细胞质量(DCW)可以通过将OD₆₀₀值应用于等式2中，当微生物细胞浓度由OD₆₀₀表示时，OD₆₀₀值1对应于0.35DCW/L(g-DCW/L)＝0.35×OD₆₀₀)。

[等式2]

DCW(g)/L＝0.35(g/L)×OD值

[表4]

如图6a所示，在分批培养后18小时进行pH-stat，并且与间歇进料方法不同，糖浓度始终保持在0g/L至1g/L的范围内。另外，与通过间歇进料法培养的微生物细胞的最大活性为约500U/g相比，通过pH-stat法培养的微生物细胞的最大活性为约650U/g，并且增加了1.3倍。这意味着当存在痕量的阿洛酮糖时，可以增加阿洛酮糖差向异构酶的活性。

然而，由于高微生物细胞培养进展为OD₆₀₀为30或更高，导致阿洛酮糖差向异构酶的活性迅速降低的结果。这是在pH-stat过程中发生的结果，并且确认可以通过调节f值、pH值和进料溶液的组成来解决。

当f值太大时，碳源(即糖类)积累的时间延长，最后变得接近间歇进料方法，并且可能导致DPE酶活性降低。另一方面，当f值太小时，由于通过添加碳源降低pH的速率慢于根据高浓度培养物的进入而增加pH的速率，它可能会脱离pH-stat范围，并且可能无法控制pH-stat。如在图6a中所见，由于糖没有积累并保持在一定水平，它没有脱离pH-stat范围并且稳定地进行，因此很难看出f值是一个大问题。已确认，当pH值低时，可以获得DPE酶的高活性，但必须使pH上限值高于添加的氨水，因此本发酵罐中的最小值ΔpH＝0.15是优选的。因此，控制其他变量、进料溶液的组成以保持高浓度培养物中的高活性。

实施例5：根据另外的培养基组成建立维持活性的条件

如实施例4中所述，通过控制另外的培养基(进料溶液)的组成，建立了表达高活性DPE酶的高浓度菌株培养条件。通过建立适合于高浓度微生物细胞培养的另外的培养基(进料溶液)的组成，如下建立在高微生物细胞浓度下保持最大活性的条件。

5.1分析根据有机氮源浓度的活性

当酵母提取物作为复合有机氮源添加到糖供应溶液中时，它可以有助于提高微生物细胞生长速率和酶活性。因此，通过将糖供应溶液中的酵母提取物浓度控制为20、40和80g/L，如实施例2进行发酵。pH-stat条件与实施例4相同。但是，通过使用酵母提取物作为变量，另外的培养基(进料溶液)的组成为阿洛酮糖400g/L和MnCl₂ 0.5mM。另外，使用实施例2中进行的活性测定方法比较酶活性(单位/g-DCW)得到的结果示于图7a和图7b及表5中。

[表5]

培养时间(小时)	20g/L	40g/L	80g/L
				16	577	531	394
23.5	849	674	586
				25.5	756	453	524
30.5	648	407	578
				40	604	357	594

如图7a和图7b，随着作为另外的培养基(进料溶液)中的复合有机氮源的酵母提取物的浓度增加，DPE酶活性被稳定地保持。当有机氮源的浓度低时，在pH-stat开始时，DPE酶活性最高，但随着微生物细胞浓度升高，DPE酶活性迅速降低。已经确认，需要建立通过高浓度微生物细胞培养稳定地保持活性而不降低活性的条件以用于阿洛酮糖工业化。

5.2分析根据锰离子浓度的活性

由于显示出比实施例5.1中的低浓度酵母提取物更低的活性，对于高活性和高浓度培养，分析了根据使用金属离子即锰离子的活性，所述金属离子可以作为一种辅酶，通过增加果糖和DPE酶的结合能力来增加酶的活性。

阿洛酮糖400g/L和酵母提取物80g/L在糖供应溶液中，将锰浓度调节至0.5、1.0和2.0mM，如实施例2进行发酵，与实施例4相同地进行pH-stat条件。另外，使用实施例2中进行的活性测定方法比较酶活性(单位/g-DCW)所得到的结果示于图8a和图8b及表6中。

[表6]

培养时间(小时)	0.5mM	1.0mM	2.0mM
				16.5	394	415	389
18.5	598	649	634
				21	552	711	654
23	586	751	660
				25	524	703	630
28	588	715	674
				30	578	745	641
40	594	748	617

如图8a和图8b所示，无论另外的培养基(进料溶液)中的锰离子浓度如何，由于适当的C/N比，活性均稳定地保持，并且微生物细胞生长速率的差异不显著。确认了，当使用1mM锰时，培养21小时后DPE酶活性超过约700U/g，并且与低浓度0.5mM或高浓度2mM相比，显示出最高的DPE酶活性。因此，确认了，使酶活性保持在约700U/g以上的锰离子浓度为1mM。

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(邮编)110-725

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PCT/RO/134表

Claims

1.一种生产阿洛酮糖的方法，包括：

制备初始培养基的步骤，其中碳源与有机氮源的比(C/N比)为10/1至1/1；

培养能够在所述初始培养基中生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的步骤；和

从果糖底物转化为阿洛酮糖的步骤，包括使培养的微生物、微生物培养溶液、或从微生物或微生物培养溶液中获得的阿洛酮糖差向异构酶与果糖底物反应。

2.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述初始培养基的碳源是选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述培养步骤分批、分批补料或连续地进行。

4.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述培养步骤在所述培养基的pH变化值为0.05至0.5的条件下进行。

5.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，在所述培养步骤中，供应包含碳源的另外的培养基，使得培养基的碳源浓度维持在0g/L至5g/L。

6.根据权利要求5所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，间歇或连续地供应C/N比为20/1至1/1的另外的培养基。

7.根据权利要求5所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，f值定义为当碳源以另外的培养基的形式一次性添加时培养溶液中碳源浓度(g/L)的增加，所述f值为0.2至0.5。

8.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，通过在初始培养基、另外的培养基和其混合培养基中包含金属离子来供应浓度为0.1mM至5mM的所述金属离子。

9.根据权利要求8所述的生产阿洛酮糖的方法，还包括供应包含选自由锰、钴、钙、镁、镍、铁和铝组成的组中的一种或多种金属离子的另外的培养基的步骤。

10.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述有机氮源是选自由酵母提取物、玉米浆、大豆胨、蛋白胨、大豆、大豆粕、棉籽粕、糖蜜、酪蛋白、牛肉提取物、麦芽提取物和胰蛋白胨等组成的组中的一种或多种。

11.根据权利要求5所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述供应另外的培养基以pH-stat进料方法进行。

12.根据权利要求11所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述pH-stat进料方法供应包含碳源的另外的培养基，使得培养溶液中的pH变化值为0.05至0.5。

13.根据权利要求11所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述pH-stat进料方法通过供应C/N比为20/1至1/1的另外的培养基来进行。

14.根据权利要求11所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述pH-stat进料方法通过供应包含碳源的另外的培养基进行，并且其中，f值定义为当碳源以另外的培养基形式添加时培养溶液中碳源浓度(g/L)的变化值，所述f值为0.2至0.5。

15.根据权利要求11所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述pH-stat进料方法通过供应包含碳源的另外的培养基来进行，使得培养溶液中的碳源浓度(g/L)维持在0g/L至5g/L。

16.根据权利要求1所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述微生物是非遗传修饰的微生物，所述非遗传修饰的微生物包含编码阿洛酮糖差向异构酶的固有基因。

17.根据权利要求16所述的生产阿洛酮糖的方法，其中，所述微生物是选自由细杆菌属(Microbacterium sp.)菌株、剑菌属(Ensifer sp.)菌株、土壤杆菌属(Agrobacteriumsp.)菌株、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株、产氢红杆菌属(Rhodobacter sp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株组成的组中的一种或多种。

18.一种用于生产阿洛酮糖，培养生产阿洛酮糖差向异构酶的菌株，并且增加高浓度微生物细胞中阿洛酮糖异构酶的活性的组合物，其中，在培养基组合物中碳源与有机氮源的比(C/N比)为20/1至1/1。

19.一种用于生产阿洛酮糖的微生物的培养组合物，包含：

能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物；和

选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的至少一种，作为增加微生物的酶的活性或表达的诱导物。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述诱导物的浓度为0.001g/L至5g/L。

21.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述培养组合物包含用于培养微生物的初始培养基，其中碳源与有机氮源的比(C/N比)为10/0至1/1。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述碳源的浓度为3g/L至30g/L。

23.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述培养组合物包含碳源与氮源比(C/N比)为10/1至1/1的用于培养微生物的初始培养基，以及C/N比为20/1至1/1的另外的培养基。

24.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述培养组合物包含选自由酵母提取物、玉米浆、大豆胨、蛋白胨、大豆、大豆粕、棉籽粕、糖蜜、酪蛋白、牛肉提取物、麦芽提取物和胰蛋白胨等组成的组中的一种或多种有机氮源。

25.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述培养组合物的pH范围为6.0至7.5。

26.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述培养组合物包含选自由锰、钴、钙、镁、镍、铁和铝组成的组中的一种或多种金属离子。

27.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述微生物是非遗传修饰的微生物，所述非遗传修饰的微生物包含编码阿洛酮糖差向异构酶的固有基因。

28.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述微生物是选自由细杆菌属菌株、剑菌属菌株、土壤杆菌属菌株、假单胞菌属菌株、产氢红杆菌属菌株和棒状杆菌属菌株组成的组中的一种或多种菌株。

29.一种诱导或稳定微生物的阿洛酮糖差向异构酶活性的方法，包括在包含选自由阿洛酮糖和果糖组成的组中的一种或多种诱导物的培养基中培养能够生产阿洛酮糖差向异构酶的微生物的步骤。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述诱导物是增加微生物的酶的活性或表达的诱导物。

31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述培养在除了所述诱导物之外还包含碳源的培养基中进行。

32.根据权利要求29所述的方法，其中，在所述诱导物的浓度(g/L)为0.001g/L至5g/L的范围内培养微生物。

33.根据权利要求29所述的方法，其中，在pH变化值为0.05至0.5的条件下培养微生物。

34.根据权利要求29所述的方法，其中，通过添加包含所述诱导物的另外的培养基来间歇或连续地培养微生物。

35.根据权利要求29所述的方法，其中，通过添加碳源与有机氮源的比(C/N比)为20/1至1/1的另外的培养基来间歇或连续地培养微生物。

36.根据权利要求34所述的方法，其中，f值定义为当碳源以另外的培养基的形式一次性添加时培养溶液中碳源浓度(g/L)的增加，所述f值为0.2至0.5。

37.根据权利要求29所述的方法，其中，在碳源与有机氮源的比例(C/N比)为10/1至1/1的初始培养基中接种和培养微生物。

38.根据权利要求29所述的方法，其中，所述微生物是非遗传修饰的微生物，所述非遗传修饰的微生物包含编码阿洛酮糖差向异构酶的固有基因。

39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述微生物是选自由细杆菌属菌株、剑菌属菌株、土壤杆菌属菌株、假单胞菌属菌株、产氢红杆菌属菌株和棒状杆菌属菌株组成的组中的一种或多种。

40.根据权利要求29所述的方法，其中，培养微生物的步骤在培养基中进行，所述培养基还包含选自由锰、钴、钙、镁、镍、铁和铝组成的组中的一种或多种金属离子。

41.根据权利要求29所述的方法，其中，所述培养基包含选自由酵母提取物、玉米浆、大豆胨、蛋白胨、大豆、大豆粕、棉籽粕、糖蜜、酪蛋白、牛肉提取物、麦芽提取物和胰蛋白胨等组成的组中的一种或多种有机氮源。