CN105602879A

CN105602879A - 一株高效分泌d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用

Info

Publication number: CN105602879A
Application number: CN201610051547.3A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 陈景奇; 付刚; 朱玥明; 孙媛霞
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: CN105602879B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效分泌D-阿洛酮糖？3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。本发明首先获得了来源于瘤胃菌Ruminococcus？sp.？5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖？3-差向异构酶基因rdpe，构建重组表达质粒pMA5-RDPE并转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子P_xylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB？(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0%降低为0.5%。最终，采用分批补料方式，在7.5？L发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95？U/mL？和2.6？g/L。

Description

一株高效分泌D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株及其构建方法，以及将基因工程菌株用于发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的应用。

背景技术

稀少糖是存在于自然界中但含量极少的一类单糖及衍生物。随着人们对这类糖逐步了解，以阿洛酮糖与塔格糖为核心的功能性稀少糖研究得到迅速的发展，并引起众多研究者的关注。D-阿洛酮糖（D-Psicose）是一种稀有糖，它是D-果糖在C3位置的差向异构体。D-阿洛酮糖极其少量地存在于某些商业化的糖类和农产品中，并且很难通过化学方法进行合成。比如，D-阿洛酮糖存在于小麦、甘蔗和甜菜糖蜜中，也少量地存在于商业化的D-葡萄糖和D-果糖中。

D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%，然而其能量值仅为0.007kcal/g，且能量吸收效率仅为蔗糖的0.3%，所以D-阿洛酮糖是一种非常理想的低卡路里甜味剂。D-阿洛酮糖已经被证明具有降血糖的作用，还可以抑制肝脏脂肪合成酶肠道α-糖苷酶的活性，从而减少腹部脂肪的累积。D-阿洛酮糖针对6-羟多巴胺诱导的细胞凋亡具有神经保护作用，也可以抑制因高含量葡萄糖刺激产生的单核细胞趋化性蛋白-1的表达，因此D-阿洛酮糖在治疗神经退行性和动脉粥样硬化疾病方面有很高的医疗价值。在食品行业中，D-阿洛酮糖因为其甜度、高溶解度、极低卡路里和很低的血糖反应的特点而被视为一种理想的蔗糖替代品。向食物中添加D-阿洛酮糖可以增加食物的凝固作用，且阿洛酮糖可以通过与食物蛋白产生美拉德反应而使食物具有更好的味道。与D-果糖和D-葡萄糖相比，D-阿洛酮糖可以产生更多抗氧化的美拉德反应产物，以使食物维持较高的抗氧化状态，从而具有更长的保质期。此外，还有报道称D-阿洛酮糖可以提高蛋清蛋白的起沫性能以及黄油饼干的质量。总之，D-阿洛酮糖在食品、保健及医药品领域有着十分重要的应用价值。

2011年8月，D-阿洛酮糖被FDA认定为是安全的（GRAS），并且被允许在一定范围的食物和食品中用作添加剂。因此，D-阿洛酮糖具有广阔的市场前景。据我们所知，D-阿洛酮糖只在日本（MatsutaniChemicalIndustryCo.,Ltd,andRaresweetCo.Ltd.）和韩国（CJCheiljedang,Inc.）实现了工业化生产。目前，生产D-阿洛酮糖的技术主要包括提取法、化学合成法和生物转化法。但是D-阿洛酮糖在自然界中的含量极低，提取法明显不适宜D-阿洛酮糖的大规模生产；化学合成法不仅成本高、产量低，而且会产生比较严重的环境污染。生物转化法可以利用自然界广泛存在的单糖或某些单糖的加工副产物为原料，不仅成本较低，而且转化效率也远远高于提取法，是规模化制备D-阿洛酮糖的重要技术手段。使用DTEase家族的酶通过差向异构作用使D-果糖与D-阿洛酮糖之间进行相互转化是生物转化法生产D-阿洛酮糖的主要方法。DTEase家族酶类的基因有多种来源，但是目前只有少数几种酶得到比较系统的研究。1993年，Izumorietal(1993)首次报道了来源于PseudomonascichoriiST-24的一种新酶，发现该酶可以催化酮糖在C3位置的差向异构，其最适底物为D-塔格糖，因此将其命名为D-塔格糖3-差向异构酶。Kimetal(2006)报道了来源于Agrobacteriumtumefaciens的DTEase酶类的另一种特性，即可以特异性催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转化，因其对D-阿洛酮糖的底物特异性最高，遂将其命名为D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPEase）。近年来，来自RhodobactersphaerofidesSK011、ClostridiumcelluloyticmH10、Ruminocossussp.5_1_39BFAA、ClostridiumscindensATCC35704、Desmosporasp.8437和ClostridiumbolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因也陆续被克隆和表达，其酶学性质也被详细地研究。

到目前为止，文献和专利中的DPEase酶类主要在大肠杆菌中进行表达，大肠杆菌外膜包含脂多糖，是一种可以引起人类和哺乳动物发热的内毒素，而终产物中内毒素的去除则明显加大了产物纯化的复杂性；此外，在大肠杆菌中，蛋白的合成通常发生在细胞内，为了获得大量的目标蛋白，需要将细胞进行破坏以使细胞内的蛋白释放出来，这一附加的过程势必将增加蛋白的生产成本。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，是传统的工业生产菌。其生产的蛋白可以被大量释放到培养基中，从而大大缩减下游的蛋白纯化过程，显著降低目标蛋白生产成本；同时枯草芽孢杆菌细胞壁结构简单且不含内毒素，美国FDA已将其列为GRAS（GenerallyRecognizedAsSafe）级别的微生物。因此，采用枯草芽孢杆菌进行D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产比大肠杆菌具有更大的优势。

发明内容

本发明的目的之一是提供含有编码来源于瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的各种重组表达质粒。

所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的序列如SEQIDNO.1所示。

本发明的目的之二是提供一株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株1A751SD-XR，是将来源于质粒pMA5且包含木糖启动子P_xylA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的重组质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢杆菌168、1A751、WB600、WB700、WB800或以上菌株后代细胞中的一种。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是B.subtilis1A751。

本发明的目的之三是提供该高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因工程菌株的构建方法，主要包括以下步骤：（1）PCR扩增或化学合成rdpe基因序列；（2）将rdpe基因插入表达质粒pMA5，构建重组表达质粒pMA5-RDPE；（3）将pMA5-RDPE转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株1A751-HR；（4）以三个诱导型启动子P_xylA、P_glv和P_sacB替换pMA5-RDPE上的组成型启动子P_HpaII，分别构建重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE、pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE。（5）将pMA5-P_xylA-RDPE、pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE分别转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR。（6）敲除基因xylAB(xylA和xylB)，获得菌株1A751SD，导入重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE，从而获得基因工程菌株1A751SD-XR。

在本发明的一种实施方式中，重组表达质粒pMA5-RDPE上的启动子P_HpaII分别被诱导型启动子P_xylA、P_glv和P_sacB替换。

本发明的目的之四是提供应用上述基因工程菌分泌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以0.5%~5%接种量转入装液量50%~70%的发酵罐中，通气量1.0~2.0vvm，搅拌转速100~800rpm，pH不作控制，于37℃培养；待发酵液OD₆₀₀稳定后以恒定流速进行补料；发酵培养基成分为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物、0.3%~0.9%磷酸氢二钾和1.0%~3.0%可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为2.0%~8.0%可溶性淀粉。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以1.0%接种量转入装液量60%的发酵罐中，通气量2.0vvm，搅拌转速200~600rpm，pH维持在7.2，于37℃培养；发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氢二钾和2.0%可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为8.0%可溶性淀粉。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。

本发明的目的之五是提供一种高效表达分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，以重组表达了瘤胃菌来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE。

在本发明的一种实施方式中，构建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR、1A751-SR或1A751SD-XR；发酵培养基为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%~0.9%磷酸氢二钾；于37℃、200rpm摇瓶发酵。当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。

本发明相比现有技术的有益效果：本发明首次以枯草芽孢杆菌为表达宿主，实现了瘤胃菌来源D-阿洛酮糖3-差向异构酶的高效分泌表达，重组D-阿洛酮糖3-差向异构酶的分泌量达到2.6g/L，约占上清液总蛋白量的70%，酶活力约为95U/mL。该产量是国际上已有报道的最高表达分泌水平。目前D-阿洛酮糖3-差向异构酶的生产宿主大多采用大肠杆菌且在胞内表达，纯化蛋白前需要进行复杂的细胞破碎处理。本发明的枯草芽孢杆菌基因工程菌株高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶，大大简化了蛋白纯化流程且明显降低了生产费用。考虑D-阿洛酮糖3-差向异构酶的附加值，本发明的表达水平已达到工业化生产要求。

附图说明

图1为重组质粒pMA5-RDPE的构建流程。

图2为基因工程菌株B.subtilis1A751-HR分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的SDS-PAGE图谱。1A751为负对照；1A751C为将pMA5空质粒转化1A751得到的菌株，也作为负对照；1A751-HR为将pMA5-RDPE转化1A751得到的菌株。Marker表示蛋白分子质量标准。箭头所指示的条带为D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白。

图3为三个诱导型表达质粒的构建流程。P_xylA为来源于巨大芽孢杆菌的木糖诱导启动子；P_glv为来源于枯草芽孢杆菌的麦芽糖诱导启动子；P_sacB为来源于枯草芽孢杆菌的蔗糖诱导启动子。

图4为RDPE在枯草芽孢杆菌中诱导表达结果。A，木糖诱导RDPE分泌表达的结果。B，麦芽糖诱导RDPE分泌表达的结果。C，蔗糖诱导RDPE表达的结果。发酵时间为72h。

图5为基因工程菌株1A751SD-XR在不同木糖浓度诱导下分泌表达RDPE的结果。A，胞外酶活测定。B，SDS-PAGE分析。发酵时间为72h。

图6为采用分批-补料发酵工艺在7.5L发酵罐中（装液量3.0L）进行发酵。A：发酵曲线。B：SDS-PAGE分析。实验显示84hD-阿洛酮糖3-差向异构酶活性最高。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因片段的获得

根据来源于瘤胃菌（Ruminococcussp.5_1_39B_FAA）的DPEase编码基因rdpe序列进行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点，以方便后续的表达载体构建。合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-RDPE。

实施例2D-阿洛酮糖3-差向异构酶的组成型表达

将质粒pUC57-RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理；双酶切反应条件为37℃水浴3h。将双酶切产物分别进行胶回收，得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶在4℃冰箱中进行过夜连接；连接产物转化大肠感受态细胞DH5α，以氨苄霉素（100μg/mL）进行抗性筛选，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取质粒进行测序验证。质粒构建结果见图1，所构建的含有该rdpe基因的重组表达质粒命名为pMA5-RDPE。

将组成型表达质粒pMA5-RDPE通过Spizizen转化方法转入1A751感受态细胞，涂布于卡那霉素（50μg/mL）平板过夜培养，以菌落PCR筛选阳性克隆，得到重组菌株1A751-HR。将重组菌株1A751-HR接种于含5mLSR培养基（1.5%蛋白胨，3.0%酵母提取物和0.3%K₂HPO₄，pH7.2）的试管中，并添加50μg/mL卡那霉素用于维持质粒稳定，在37℃、200rpm条件下培养18h。随后，取300μL试管中菌液接种于装有30mL2×SR培养基（3.0%蛋白胨，6.0%酵母提取物和0.6%K₂HPO₄,pH7.2）的摇瓶（250mL）中，并添加50μg/mL卡那霉素，在37℃、200rpm条件下培养72h。随后取出发酵液，12000rpm离心5min得到发酵液上清，即为粗酶液；将离心后的菌体用PBS重悬，进行超声破碎，12000rpm离心5min得到破碎细胞上清。上述相关方法均采用常规操作步骤。

取粗酶液和破碎细胞上清分别进行酶活测定，结果显示胞外和胞内RDPE活性分别为17U/mL和4U/mL；SDS-PAGE分析显示胞内和胞外在相对分子质量约33kDa处均有明显的条带，与RDPE分子质量理论值大小一致，且胞外目标蛋白量明显多于胞内（如图2所示）。综上可知，大部分表达的RDPE被分泌到胞外。

实施例3D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导型表达

木糖启动子P_xylA序列、麦芽糖启动子P_glv序列和蔗糖启动子P_sacB序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示，设计引物xylA-F/xylA-R、glv-F/glv-R和sacB-F/sacB-R。以xylA-F/xylA-R为引物，以质粒pHCMC04为模板进行PCR得到P_xylA片段；分别以glv-F/glv-R和sacB-F/sacB-R为引物，以枯草芽孢杆菌1A751基因组为模板进行PCR得到P_glv和P_sacB片段。设计引物pMA5-RDPE-F/pMA5-RDPE-R，以pMA5-RDPE为模板进行PCR，获得线性化的pMA5-RDPE载体片段。以上所述引物序列如下：

XylA-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAAC-3’

XylA-R:5’-CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGATTTCCCCCTTTGATTTAAGTGATTTCC-3’

Glv-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCCGCGGATCCCTTTTGTCCCCTG-3’

Glv-R:5’-CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGCGGGGTACCATGACGACCTCCTTG-3’

sacB-F:5’-CAGCCTCGCAGAGCACACACTTTATGGGCGCGCCGATCCTTTTTAACCCATCACATATAC-3’

sacB-R:5’-CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGCGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTAC-3’

pMA5-RDPE-F:5’-CATATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTGG-3’

pMA5-RDPE-R:5’-AAGGCGCGCCCATAAAGTGTGTGCTCTGCGAGGCTG-3’

将P_xylA片段、P_glv片段和P_sacB片段分别与pMA5-RDPE载体片段进行POE-PCR（ProlongedoverlapextensionPCR），插入片段与载体片段摩尔比为1:1，延伸时间以载体长度为准，得到融合产物。将融合DNA产物直接转化大肠感受态细胞DH5α，涂布于含100μg/mL氨苄霉素的LB平板上，以菌落PCR筛选阳性克隆。将阳性克隆接种于LB液体培养基中过夜培养，提质粒进行测序验证。质粒构建结果见图3，所构建的含有该RDPE基因的重组表达质粒分别命名为pMA5-P_xylA-RDPE,pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE。

将诱导型表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE,pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE通过Spizizen转化方法分别转入1A751感受态细胞，涂布于卡那霉素（50μg/mL）平板上过夜培养，以菌落PCR进行验证，得到重组菌株1A751-XR,1A751-GR和1A751-SR。将以上重组菌株分别接种于含5mLSR培养基（50μg/mL卡那霉素）的试管中，在37℃、200rpm条件下培养18h。随后，取300μL试管中菌液接种于含30mL2×SR培养基（50μg/mL卡那霉素）的摇瓶（250mL）中，在37℃、200rpm条件下培养。待发酵液OD₆₀₀达到0.8时，分别添加不同浓度的诱导物（0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0%（w/v）木糖；0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0%（w/v）麦芽糖；0.0%，2.0%，4.0，6.0和8.0%（w/v）蔗糖）进行诱导表达。发酵72h，取出发酵液，分别进行酶活检测和SDS-PAGE分析（如图4所示），具体方法同于实施例2。

结果显示，三个诱导型启动子中，木糖启动子P_xylA的强度是最强的；在木糖的添加浓度为4.0%时，胞外的RDPE酶活最高，达到37U/mL，是RDPE组成型表达的2.2倍。SDS-PAGE分析也证实了以上结果。

实施例4木糖利用基因xylAB的敲除

1)木糖浓度变化测定

根据实施例3中的最终结果，对木糖诱导表达系统进行进一步分析。将重组菌株1A751-XR进行摇瓶发酵，具体方法同于实施例3。待发酵液OD₆₀₀达到0.8左右时添加4.0%木糖进行RDPE的诱导表达，每隔12h进行取样。对胞外木糖浓度进行测定，结果显示72h木糖浓度为0.2%。表明绝大多数木糖已被枯草芽孢杆菌消耗利用，从而会影响RDPE的诱导表达。因此，为了进一步提高RDPE的分泌水平，对木糖利用基因xylAB（xylA和xylB）进行敲除。

2）构建基因敲除菌株

以实验室所保存菌株1A751S（amyE::P_araR-spe）为出发菌株。设计合成引物UP-F/R、DN-F/R、CR-F/R和G-F/R，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，扩增DNA片段UP、DN、CR和G。以上所述引物序列如下：

UP-F:5’-GAATTGCGTCCAATGTTTGAAAACG-3’

UP-R:5’-TCTATTTTTTCCTCCTTTATGTTACCACTAC-3’

DN-F:5’-GTAGTGGTAACATAAAGGAGGAAAAAATAGAGCAAGCTGAAGAGACACAAGAAGAAC-3’

DN-R:5’-GTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAACGTTTGATTCCCTGAAGTTCTATATC-3’

CR-F:5’-TCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC-3’

CR-R:5’-TTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC-3’

G-F:5’-CCAGTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGAGTGATCGTCAGGCAGCCTTAG-3’

G-R:5’-TGCTGCACTACTCCGTTATTATCCAAG-3’

UP为待敲除区域上游序列；DN为待敲除区域下游序列；CR为氯霉素表达盒和AraR表达盒的融合片段；G为待敲除区域片段。通过融合PCR方法将四个片段融合为一个DNA片段UP-DN-CR-G，然后直接转化枯草芽孢杆菌感受态细胞1A751，涂布含氯霉素（12.5ng/μL）平板进行筛选，并以菌落PCR进行验证。挑选阳性克隆接种于无抗生素LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养12~14h，将菌液稀释涂布含壮观霉素（200ng/μL）平板进行筛选，以菌落PCR进行验证，获得重组菌株1A751SD。

3）将重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE转化基因敲除菌株1A751SD，涂布含卡那霉素（50ng/μL）平板进行筛选，以菌落PCR进行验证，获得基因工程菌株1A751SD-XR。

4）将所构建菌株1A751SD-XR进行摇瓶发酵，待发酵液OD₆₀₀达到0.8左右时分别添加0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%的木糖进行诱导。发酵72h，进行酶活检测和SDS-PAGE分析（如图5所示），具体方法同于实施例2。

结果显示，当添加木糖浓度仅为0.5%时，胞外的酶活便达到最高值63U/mL，为基因未敲除菌株的1.7倍；SDS-PAGE分析与以上结果一致。对胞外木糖浓度进行测定，72h剩余木糖浓度为3.6%。以上结果说明敲除基因xylAB阻断了枯草芽孢杆菌的木糖利用途径，提升了胞内木糖累积量，从而大大提高了RDPE的诱导表达水平。

实施例57.5L发酵罐发酵生产RDPE

采用分批-补料发酵方式对所构建工程菌株1A751SD-XR进行发酵评价。首先将甘油冻存管中工程菌株1A751SD-XR在平板上划线，挑取单菌落接种于装有5mL种子培养基（SR培养基）的试管中，37℃、200rpm条件下培养16~18h，然后转接于装有30mL种子培养基（SR培养基）的摇瓶（250mL）中，37℃、200rpm条件下培养16~18h。将种子液（1%接种量）转入7.5L发酵罐（NewBrunswickScientificcoInc,USA）中，装液量3.0L，发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、2.0%可溶性淀粉和0.6%磷酸氢二钾，初始调整为pH7.2。通气量2.0vvm，搅拌转速200~600rpm，溶氧维持在20~40%，pH维持在7.2。发酵3h后添加木糖使终浓度达到0.5%，以诱导目标蛋白的表达。待发酵液OD₆₀₀稳定时，开始按照恒定流速补入8.0%可溶性淀粉，直到最终可溶性淀粉浓度达到4.0%。接种72h后发酵结束，此时发酵液中RDPE的活性和产量最高，分别达到95U/mL和2.6g/L（如图6所示）。在此条件下，重组RDPE的表达量约占上清液总量的70%，全为可溶性状态。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株、构建方法及其应用

<130>2016

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>876

<212>DNA

<213>Ruminococcussp.

<400>1

atgaaatatggtatttattacgcttattgggaaaaggaatggaatggagattacaaatat60

tatatagataaaatttcaaaattaggttttgatattctggaaatttcttgcggcgctttt120

tctgactattacacgaaagatcaggagttaattgatattggaaaatatgcgaaagaaaaa180

ggcgtaacattgacagcagggtatggacctcattttaatgaaagcctgtcatcttcagaa240

cccaatacgcagaaacaagcaatcagtttttggaaagagacgctccggaaattgaagtta300

atggatattcatattgttggaggcgcactctatggttattggcctgtagattattccaaa360

ccttttgataagaaaagggatttagagaattccattaaaaacatgaaaattattagtcag420

tatgctgaagaatatgacataatgatggggatggaagttcttaaccgttttgaaggctat480

atgttgaatacatgcgatgaagcgttggcatacgttgaagaggttggctcttctaatgtt540

ggtgttatgttagatacttttcacatgaatatagaggaagataatatagcagcagccatt600

cgtaaagcaggagataggctttatcacttccatataggagaaggaaatcgtaaagtacca660

ggaaaaggtatgcttccttggaatgagataggacaggcattgcgagatataaactaccaa720

catgcagcagttatggagccatttgtaatgcagggaggaacagtagggcatgacattaaa780

atatggagagatatcattggaaactgttctgaagttacattagatatggacgctcaaagt840

gcgttgcactttgtaaaacatgtatttgaagtctaa876

<210>2

<211>1434

<212>DNA

<213>Bacillusmegatherium

<400>2

tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcctaacttataggg60

gtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcatttttt120

cctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaa180

acttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaag240

ataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaag300

ccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatc360

tcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaa420

gcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatc480

gtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaata540

acaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagtttttt600

gtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaacc660

ggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagtta720

ggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccg780

actagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaa840

atctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataata900

tttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatc960

gagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgc1020

cctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagaca1080

gtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttc1140

aaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatt1200

tgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttga1260

attagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattg1320

aaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaa1380

ctcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaagggggaaat1434

<210>3

<211>353

<212>DNA

<213>Bacillussubtilis

<400>3

cgcggatcccttttgtcccctgccttttctaaattcacgcacaattggatgttttatata60

aatgattataaataattcggcatgtatccgaatcgtacaaaagaaccttttcataagaat120

tggaagggcgtatattcacttaaaattcacagttggtgagactttaagattacaaaaaag180

gtaaaaaaaccaaatctctcagacataaggcaaatgagaaatttcccgctctatgggaaa240

aaacactaaagttgatcaaatgacctaagtgcgccaaacgtttgacaggacgagctatct300

catggtataattggaattgtaaaatttatcaaggaggtcgtcatggtaccccg353

<210>4

<211>463

<212>DNA

<213>Bacillussubtilis

<400>4

gatcctttttaacccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatat60

tatgatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactttatgcccatgcaacagaaactat120

aaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttaggcccgtagtct180

gcaaatccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgcaatccaa240

acgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagc300

aggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatat360

tttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaag420

aagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacg463

Claims

1.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）基因工程菌株1A751SD-XR。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，其是以来源于质粒pMA5且包含木糖启动子P_xylA和瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的重组质粒为表达载体，以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的基因工程菌株，所述宿主是枯草芽孢杆菌168、1A751、WB600、WB700、WB800或以上菌株后代细胞中的一种。

3.根据权利要求2所述的瘤胃菌D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因，其特征在于，其序列如SEQIDNO.1所示。

4.根据权利要求2所述的宿主，其特征在于，其是以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌改造而获得的基因工程菌株，命名为1A751SD。

5.一种构建权利要求1，2和4任一所述基因工程菌株的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）PCR扩增或化学合成rdpe基因序列；（2）将rdpe基因插入表达质粒pMA5，构建重组表达质粒pMA5-RDPE；（3）将pMA5-RDPE转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株1A751-HR；（4）以三个诱导型启动子P_xylA、P_glv和P_sacB替换pMA5-RDPE上的组成型启动子P_HpaII，分别构建重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE、pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE；（5）将pMA5-P_xylA-RDPE、pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE分别转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR；（6）敲除基因xylAB(xylA和xylB)，获得菌株1A751SD，导入重组表达质粒pMA5-P_xylA-RDPE，从而获得基因工程菌株1A751SD-XR。

6.按照权利要求5所述的方法构建的重组表达载体pMA5-RDPE、pMA5-P_xylA-RDPE、pMA5-P_glv-RDPE和pMA5-P_sacB-RDPE。

7.按照权利要求5所述的方法构建的基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR和1A751-SR。

8.权利要求1-7任一所述基因工程菌株在分泌生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶中的应用方法。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以0.5%~5%接种量转入装液量50%~70%的发酵罐中，通气量1.0~2.0vvm，搅拌转速100~800rpm，pH不作控制，于37℃培养；待发酵液OD₆₀₀稳定后以恒定流速进行补料；发酵培养基成分为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物、0.3%~0.9%磷酸氢二钾和1.0%~3.0%可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为2.0%~8.0%可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将重组菌用种子培养基活化后，将种子液以1.0%接种量转入装液量60%的发酵罐中，通气量2.0vvm，搅拌转速200~600rpm，pH控制在7.2，于37℃培养；发酵培养基成分为3.0%蛋白胨、5.0%酵母提取物、0.6%磷酸氢二钾和2.0%可溶性淀粉，初始pH7.2；补料培养基为8.0%可溶性淀粉；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。

11.一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法，其特征在于，以重组表达了瘤胃菌来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，构建基因工程菌株1A751-HR、1A751-XR、1A751-GR、1A751-SR或1A751SD-XR；发酵培养基为2.0%~4%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%~0.9%磷酸氢二钾，pH7.2；于37℃、200rpm摇瓶发酵；当基因工程菌株需诱导表达时，待发酵液OD₆₀₀达到0.8时添加一定浓度的诱导物。